Recherche appliquée

Suivre où se logent des agents de transfection synthétiques grâce à un ADN codant une protéine luminescente : 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le travail est présenté comme une étape vers le traitement de maladies génétiques comme la mucoviscidose, alors que la séquence injectée ne sert qu'à produire de la lumière. Chaque souris reçoit quatre injections, un prélèvement sanguin, trois pesées et quatre anesthésies, les seules atteintes décrites étant un stress de trente secondes et une douleur d'une quinzaine de secondes au point d'injection. Le porteur indique que le pouvoir transfectant de ces agents a déjà été vérifié sur plusieurs lignées cellulaires, et affirme que la biodistribution "nécessite le passage à un modèle souris".

Objectifs

Ce projet a pour but de développer et d’optimiser de nouveaux agents thérapeutiques pour des maladies génétiques comme la mucoviscidose. Ces agents non-viraux permettent le transport d'une séquence d'ADN de grande taille. Des tests in vitro d’efficacité et de toxicité de nos agents thérapeutiques ont été effectués sur des modèles cellulaires complexes et nous souhaitons maintenant tester leur efficacité et leur toxicité chez la souris. L'objectif de ce projet est de pouvoir évaluer la biodistribution de nos formulations pour en déterminer les organes cibles, pour ce faire, nous utiliserons une séquence d'ADN codant un gène permettant de générer de la lumière chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de déterminer la biodistribution et l'efficacité de transfection de nos nouveaux agents synthétiques grâce à l'introduction d'un gène de bioluminescence. Ce gène nous permet de suivre la diffusion de nos agents dans l'organisme de la souris et de valider le transfert de gènes. Les résultats obtenus nous permettront d'optimiser nos formulations actuelles afin d'obtenir les meilleurs résultats et d'en déterminer les organes cibles. De plus, ces tests nous permettrons de détecter d'éventuels effets toxiques jusqu'à 48h après injection par le dosage des enzymes du foie.

Procédures

Chaque animal sera pesé 3 fois en vigile lors de la procédure (~30 secondes par pesée). Au total, chaque animal recevra : -1 injection sous anesthésie de nos agents de transfection (~30 secondes) -2 injections sous anesthésie de notre solution de marquage (~30 secondes) -1 injection de solution de réhydratation en vigile (~30 secondes) -1 prélèvement de sang en vigile (~1 minute) -1 injection d'anesthésie et d'antidouleur (~30 secondes).

Impact sur les animaux

Un stress d’intensité légère peut être induit lors de la préhension des animaux pour la pesée par exemple (~30 secondes) et lors de l’induction de l’anesthésie (~1 minute). Les différentes injections peuvent engendrer aussi un stress ainsi qu'une légère douleur d'environ 15 secondes au niveau du site d'injection.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements de tissus.

Remplacement

Des études préliminaires afin de déterminer le pouvoir transfectant de nos agents synthétiques ont préalablement été réalisées sur différentes lignées cellulaires. Cependant, la complexité du vivant et la biodistribution ne peuvent pas être obtenu in vitro et nécessitent le passage à un modèle souris.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au maximum pour réaliser cette étude sans nuire aux objectifs initiaux et à l'obtention de tests statistiques robustes. Le nombre d'animaux par lot est un effectif nécessaire et suffisant, permettant d'utiliser des tests statistiques non paramétriques afin de pouvoir mettre en évidence, le cas échéant, des différences d'efficacité entre les agents de transfections utilisés.

Raffinement

Les animaux seront anesthésiés le temps de réaliser l'injection systémique ou d'acquérir l'image (soit environ 20 minutes) puis remis dans leur cage afin qu'ils puissent récupérer. Sur l'ensemble du projet, les animaux sont anesthésiés 4 fois. Les animaux seront surveillés tout le long de la procédure à l'aide d'une grille de soin adaptée. Durant la phase d'acclimatation, les souris seront habituées à la présence des manipulateurs pour diminuer les stress engendrés lors de la procédure. Des analgésies seront réalisés sur les animaux et ils seront suivis en appliquant des points limites strictes et spécifiques du projet.

Choix des espèces

Il s’agit d'une espèce de référence au sein du laboratoire pour ce type d'étude. Lors des études précédentes, ces dernières étaient agées de 7 semaines, afin de pouvoir comparer les études entre elles, nous préfeérons garder le même âge pour les animaux.

Douze semaines de cage sans aucun enrichissement physique, privation destinée à installer un état anxio-dépressif : 1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse histologique des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection intrapéritonéale quotidienne pendant vingt-huit jours, subit quatre séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse pouvant durer deux heures, et jeûne douze heures avant chacune. Le porteur qualifie l'induction du phénotype dépressif de nuisance légère. Cinq tests comportementaux par animal sont annoncés, censés mesurer l'activité motrice, la dépression et l'anxiété, sans qu'aucun soit nommé ni décrit.

Objectifs

Même si les antidépresseurs actuels sont des traitements efficaces, ces thérapies peuvent encore être améliorées pour réduire en particulier le risque de rechute ou encore la fraction de patients qui demeurent non répondeurs et pour qui le risque de suicide est très important. La compréhension des mécanismes exacts par lequel les antidépresseurs agissent ainsi que le test de nouvelles molécules sont donc d'une importance majeure. L’objectif de ce projet préclinique est de mesurer les effets de différents antidépresseurs (candidat médicaments) par une approche d’imagerie non-invasive, la tomographie par émission de positons (TEP), chez un modèle murin de dépression. En effet, l’imagerie TEP offre la possibilité d’explorer in vivo les mécanismes moléculaires impliqués dans le fonctionnement cérébral qui, associés à des tests comportementaux, permettront de mieux caractériser ces mécanismes, impliqués chez des animaux modèles d'anxiété-dépression.

Bénéfices attendus

Cette étude examinera les mécanismes moléculaires associés à des mesures comportementales impliqués dans le fonctionnement cérébral de type anxiolytic-antidépressif de différents candidats médicaments chez des souris rendues anxio-dépressives. Les résultats de cette étude fourniront de nouvelles informations sur l’intérêt potentiel de l'utilisation de certains candidats médicaments pour le traitement de pathologies de type anxiété et dépression.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : • Réalisation de sessions d’imagerie (4 par animaux) sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum) • Les rongeurs seront soumis à des tests comportementaux (5 par animaux) afin de mesurer l'activité motrice qui dure 30 minutes, la dépression qui dure 5 minutes et l’anxiété qui dure 5 minutes. • Mise à jeun 12h avant l’imagerie/test comportemental • Administration quotidienne d’un candidat médicament par injection intrapéritonéale (réalisée en 10 secondes) pendant 28 jours.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : • Induction d’un phénotype dépressif (considéré comme une nuisance légère) • Administration de médicaments par injection, ce qui induit une douleur suite à la piqure inférieure à 3 secondes. • Absence d’enrichissement physique dans les cages afin de favoriser le modèle d'anxiété-dépression (12 semaines), les enrichissements environnementaux de type sensoriel et social sont maintenus. • Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue lors de l’examen d’imagerie. Afin de minimiser ce stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage. Si un changement de cage est prévu, le transfert d’un peu de litière (généralement un papier absorbant) sera prévu dans la cage propre. • Stress possiblement induit par les tests de comportement mais tests réalisés sous étroite surveillance et interrompus en cas de stress trop important.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin d’extraire les organes et réaliser des études histologiques permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.

Remplacement

Dans l’état actuel des connaissances modéliser in vitro ou in silico des pathologies de type anxiété et dépression n’est pas possible. Le recours à l’expérimentation animale est donc indispensable pour étudier ces pathologies et les altérations au niveau cérébral.

Réduction

L'élément le plus important pour la réduction est l'utilisation des mêmes animaux tout au long de l'expérience. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique.

Raffinement

Les rongeurs seront hébergés par groupe. Les animaux seront observés quotidiennement par les zootechniciens en charge de leurs soins et par les expérimentateurs. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance animale. Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse, complétées par une anesthésie locale. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

L’utilisation de souris est nécessaire pour ce projet. En effet, cette espèce a été choisie puisqu'elle permet de modéliser la pathologie dépressive ainsi que d'évaluer les différents effets des médicaments testés. Les animaux seront des adultes âgés de 6-8 semaines au moment de la réception, comme nous sommes intéressés aux effets comportementaux à l'âge adulte.

Mesurer où va un candidat médicament dans le corps et pendant combien de temps : 8 660 souris, 695 rats et 28 cochons d'Inde vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut subir jusqu'à sept prélèvements sanguins en quarante-huit heures sur animal vigile, une administration orale quotidienne pendant un mois, et des injections intraveineuses sous anesthésie profonde. Le cerveau et le cœur au minimum sont récupérés sur chaque individu, ce qui impose la mise à mort. L'entreprise qui porte le projet affirme avoir "besoin" de ces données d'exposition dans les tissus avant le passage à l'humain, étape d'un développement pharmaceutique commercial.

Objectifs

L'entreprise développe des médicaments pour l'homme qui ciblent certains récepteurs, en particulier ceux du cerveau. Il est donc important de connaître la distribution du produit en cours de recherche dans le corps entier, en particulier dans les organes cibles. C'est pour cela que nous avons besoin de faire des études chez l'animal afin de voir comment le médicament se distribue après son administration (orale ou injection). Ainsi, l'objectif de ce projet est de déterminer l'exposition dans le temps d'un futur médicament dans les divers organes chez différentes espèces animales rongeurs (rat, souris, cobaye) après un traitement unique ou repété (maximum 1 mois par oral avec un traitement 1 fois par jour). Les dosages dans les tissus et dans le sang nous donneront alors une bonne indication quant à l'exposition au composé dans le temps et nous aideront à relier les expositions aux effets bénéfiques et toxiques de la molécule. Ce projet d'utilisation des animaux s'intègre dans un projet de recherche plus global de la molécule au profit de la santé humaine qui sera en complément d'autres études au laboratoire.

Bénéfices attendus

L'implication des animaux dans ce projet va nous permettre d'avoir une meilleure connaissance du devenir du médicament dans un organisme proche de l'homme et de déterminer les expositions du médicament dans les tissus et le sang avant de passer chez l'homme.

Procédures

Prélèvement sanguin (environ pendant 2 minutes, maximum 7 fois par animal en 48 heures si prélèvement repété sur animal vigile). Administration du produit : orale ou injection d'une durée d'environ 1-3 minutes et si administration répétée par oral : pendant 1 mois maximum à hauteur d'une fois par jour. Les intravéneuses seront réalisées sous anesthésie profonde pendant maximum 5 minutes. Anesthésie générale profonde pour les prélèvement terminaux.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors de ce protocole sont celles liées à la contention, aux prélèvements sanguins, à la mise en boite pour l'anesthésie gazeuse et dans la boite chauffante (avant les injections intravéneuses) pouvant induire un stress chez l'animal, l'administration du produit à tester et aux effets indésirables du produit.

Devenir

Le cerveau et le coeur (a minima) étant récupérés pour analyse, chaque animal sera donc mis à mort.

Remplacement

L'utilisation d'animaux pour des évaluations de distribution d'un médicament dans un corps entier est justifiée par la nécessité de pouvoir déterminer les effets de la molécule à tester sur un organisme entier reflétant l'humain. La complexité et des interactions organes-médicament ne nous permettent pas d'utiliser des modèles avec des cellules isolées car ils ne représentent pas assez finement l'ensemble des mécanismes biologiques.

Réduction

Le nombre d'animaux par temps est de minimum 3 et maximum 5 individus pour avoir une bonne fiabilité dans nos résultats. 5 à 9 points de temps sont nécessaires pour avoir assez de points pour le calculs des paramètres d'exposition.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie et sont acclimatés au minimum 5 jours avant l'expérimentation pour s'habituer à leur nouvel environnement et diminuer le stress. Pour le bien-être de l'animal, chaque cage dispose d'un bloc de lanières de papier pour aider à la nidation et d'un enrichissement (igloo ou tunnel pour se cacher). Tout mal être identifié aboutira à une surveillance accrue de l'animal et à des soins si besoin. Le personnel zootechnicien est sensibilisé pour remonter tout comportement suspect d'un animal soit durant le temps d'acclimatation, soit durant l'expérimentation. Les traitements se feront par du personnel formé et avec du matériel adéquat pour chaque espèce (canule pour gavage, taille cage, ...)

Choix des espèces

Les espèces rongeurs sont des espèces relativement proches de l'homme, les données obtenues seront pertinentes afin d'extrapoler les résultats à l'homme. Les animaux seront utilisés au stade adulte, cela nous permettra de refléter un organisme mature et développé (en particulier au niveau du foie).

Section définitive du nerf sciatique pour une partie, pincement du nerf par mini clamp pour l'autre : 54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'opération vise à savoir si le stress oxydatif lié à la dénervation altère la capacité des cellules satellites à régénérer le muscle. Le porteur décrit cette chirurgie comme "modérément invasive" comparée à une chirurgie abdominale, et souligne que les souris, quadrupèdes vivant à ras du sol, sont peu invalidées par la perte d'usage d'une patte arrière. Il conclut que le recours à la souris est "indispensable", la mise en culture des cellules satellites leur faisant perdre l'état de quiescence qu'il veut étudier.

Objectifs

Il a été décrit que pendant la dénervation, les cellules musculaires subissent un fort dommage oxydatif et nous avons récemment montré que le dommage oxydatif peut modifier les capacités régénératives des myoblastes. Notamment, un dommage oxydatif chimiquement induit diminue la capacité de fusion et d’accrétion de cellules dérivant des cellules satellites musculaires. Les cellules satellites sont quiescentes in vivo et elles peuvent être isolées du muscle adulte. Une fois en culture, elles perdent leur statut quiescent pour proliférer en myoblastes. Actuellement les conséquences sur les cellules satellites du stress oxydatif lié à la dénervation sont peu connues. Nos travaux sont destinés à comprendre si et comment l’activité régénérative des cellules satellites est altérée pendant le processus de dénervation. La base du matériel biologique étudié correspond aux muscles innervés par le nerf sciatique. Notre projet a donc 3 objectifs principaux : 1. Évaluer l’ampleur du dommage oxydatif dans les cellules satellites et les myotubes après dénervation par marquage des espèces réactives de l’oxygène (ROS), mais aussi à l’aide de marquages fluorescents spécifiques visualiser les modifications chimiques de l’ADN, et les modifications des protéines impliquées dans la réponse aux dommages de l’ADN en particulier au niveau des nucléoles lieu de synthèse des ARN ribosomiques. 2. Évaluer la réparation des dommages oxydatifs dans les cellules satellites et les myotubes après dénervation à différents temps après la dénervation. La réparation sera évaluée par la disparition des signaux observés dans le point 1 3. Mesurer l’index de fusion des cellules satellites après dénervation, par mise en culture et différentiation. 4. Mesurer l’accrétion des cellules satellites après dénervation, par marquage fluorescent de leur ADN et co-culture avec des myotubes non marqués. L’ensemble des tissus prélevés seront soumis à des analyses, en imagerie à fluorescence, éventuellement biochimiques par extraction de protéines et d’extraction/isolement des cellules satellites pour leur mise en culture in vitro

Bénéfices attendus

Ce projet a deux volets qui ont un intérêt scientifique général : Tout d’abord nous allons évaluer comment le dommage oxydatif conséquence de la dénervation va affecter les fibres musculaires et les cellules satellites. Nos résultats dans les cellules en culture nous laissent présager que ce dommage va impacter la capacité régénérative des cellules satellites et contribuer au processus d’atrophie musculaire post-dénervation. Une étude aussi complète de l’effet des dommages oxydatifs dans la problématique de la dénervation n’a jamais été effectuée. Quelques études montrent que le nombre de cellules satellites musculaires ne change pas après dénervation, néanmoins il n’y a aucune étude qui montre que leur capacité à fusionner ou à accomplir l’accrétion est la même. Cette investigation est d’autant plus importante car ses conclusions pourraient être applicables aux accidents de dénervation ou pincements des nerfs qui peuvent survenir chez l’humain. Il est important de connaitre les conséquences du dommage oxydatif induit par la dénervation pour pouvoir chercher des thérapies adaptées pour soulager la conséquente atrophie musculaire (détoxification des ROS, thérapies anti-oxydants, lignes directrices nutritionnelles). De plus, il est essentiel de vérifier si l’activité de régénération des cellules satellites est conservée après dénervation et comprendre comment la préserver pour limiter l’atrophie musculaire. Au vu des bénéfices attendus en termes scientifiques et médicaux et de l’impact très limité sur les souris, nous estimons que cette étude sera extrêmement rentable pour la société.

Procédures

Une partie des souris subira par chirurgie une dénervation définitive par section du nerf sciatique et une autre partie un pincement du nerf permettant une dénervation réversible.

Impact sur les animaux

La technique de dénervation définitive, par section du nerf sciatique présente l’avantage d’être une intervention chirurgicale modérément invasive si on la compare par exemple à une chirurgie abdominale. Les conséquences de la dénervation permettent une vie quasi-normale en captivité des animaux traités, la cage d’élevage comprenant de la litière adaptée ainsi qu’un enrichissement sous forme de petite cabane. La technique microchirurgicale de dénervation est effectuée avec le maximum de précautions pour limiter les douleurs post-opératoires des animaux (anesthésie générale et locale du nerf et administration d’antalgique en pré-opératoire et anti-inflammatoire en post-opératoire). La dénervation est effectuée sur l’une des pattes arrière de la souris et ne concerne pas tous les muscles, d’autres afférences nerveuses permettent à la souris de se relever ainsi que ses déplacements sans difficulté sur la litière de la cage. La dénervation par pincement du nerf sciatique reprend les éléments de chirurgie de la dénervation définitive, la section du nerf étant remplacé par son pincement à l’aide d’un mini clamp hémostatique. 15 jours après pincement du nerf les souris commencent à retrouver une mobilité quasi normale qui est complète à 30 jours, seule persiste une atrophie musculaire comme observée lors de la dénervation définitive. Il est par ailleurs à considérer que les souris étant quadrupèdes et vivant à ras du sol, elles sont par conséquent peu invalidées par cette opération pour une vie en captivité.

Devenir

Mise à mort pour prélèvements d’organes

Remplacement

Le recours à des souris est indispensable parce que la dénervation induit des modifications physiologiques sur l’ensemble du muscle qu’il est impossible de reproduire sur des cellules en culture. De plus, la mise en culture des cellules satellites modifie leur état de quiescence, ce qui peut modifier leur réponse au stress et aux dommages à l’ADN. En effet, la réparation de l’ADN n’est pas la même dans des cellules qui se divisent, des cellules qui ne se diviseront plus ou des cellules quiescentes qui ont toujours une possibilité de se diviser. Nous avons réalisé, en amont de ce projet, des tests préliminaires sur cellules en culture pour certaines mises au point de nos analyses (Immunofluorescence, colorations, traitement aux agents oxydants) permettant de ne recourir aux animaux que lorsque c’est absolument nécessaire.

Réduction

La première phase du projet portant sur le comportement des cellules souches musculaires à fusionner ou s’agréger in vitro après dénervation a pu être réalisée en limitant à 18 le nombre de souris initialement prévu et a permis une bonne robustesse de nos observations. Dans la deuxième phase, où nous nous sommes rendu compte de la faible durée de conservation des muscles fixés pour des signaux histologiques de qualité, nous estimons nécessaire l’utilisation de 36 souris pour satisfaire l’ensemble des analyses à réaliser comprenant des analyses histologiques en immunofluorescence sur des fibres musculaires isolées. Ces considérations nous permettent de maintenir à 54 le nombre de souris.

Raffinement

Grâce aux précautions prises lors de l’anesthésie générale ainsi que les mesures médicamenteuses analgésiques et anti-inflammatoires pratiquées en pré et post-opératoire, les souris traitées retrouvent très rapidement un comportement similaire à leur congénère non traités Les animaux seront élevés en groupe avec une litière adaptée et quelques éléments d’enrichissement avec pas plus de 5 individus par cage aux dimensions adaptées, et observés quotidiennement par les personnels de l’établissement utilisateur de façon à pouvoir intervenir le plus rapidement possible pour limiter la douleur ou souffrance e. Par ailleurs, pour faciliter l’alimentation des souris dénervées qui pourraient présenter une difficulté en raison de l’absence temporaire de réactivité de la patte dénervée, la nourriture sera placée de façon plus accessible dans la cage. Pour respecter le mode de vie grégaire de l’espèce, des souris compagnons de même lignée, âge et sexe seront ajoutés quand ce sera nécessaire pour éviter l’isolement des souris en expérimentation.

Choix des espèces

La souris est le modèle idéal pour cette analyse car les processus étudiés sont très conservés au cours de l’évolution en particulier chez les mammifères. Nous avons choisi le stade jeune adulte de 8 semaines pour notre étude car la croissance musculaire est terminée et les cellules satellites ne se divisent plus dans les conditions d’élevage pratiquées.

1 920 souris portant une mutation qui reproduit un variant génétique humain vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, certaines isolées jusqu'à deux semaines dans une cage de calorimétrie. Elles subissent une chirurgie abdominale pour implanter une puce de température ou une chirurgie du crâne, portent des fibres optiques fixées sur la tête pendant les enregistrements, reçoivent un régime engraissant jusqu'à trois mois et sont maintenues à 90 % de leur poids normal pendant l'apprentissage des tâches de motivation. Des mesures à 30 et à 13 degrés complètent le protocole. Le porteur annonce à terme des approches nutritionnelles et pharmacologiques personnalisées contre les troubles alimentaires et l'obésité, quand ce qui est certain ici est l'isolement, la restriction alimentaire et la mort de 1 920 souris.

Objectifs

La surconsommation d'aliments à forte densité énergétique est aujourd'hui clairement identifiée comme l'un des principaux responsables de l’obésité. Cependant, dans ce contexte, tous les individus ne deviennent pas obèses, suggérant que nos gènes entrent également en interaction avec notre environnement et influencent notre santé. C’est dans ce contexte que l’on porte de plus en plus d’attention aux facteurs génétiques qui pourraient influencer nos comportements. Le polymorphisme génétique correspond aux variations naturelles dans la séquence d’ADN qui existent dans la population ; l’un des plus étudiés dans les maladies psychiatriques est appelé TaqIA. Affectant environ 50% de la population, ce polymorphisme est corrélé à une vulnérabilité accrue au développement de comportements addictifs, mais également aux troubles des comportements alimentaires et à l’obésité. Cependant, ce polymorphisme n’est observé que chez l’espèce humaine, ce qui empêche de comprendre son rôle causal dans les troubles neuropsychiatriques et métaboliques. Nous avons ainsi généré une mutation ponctuelle chez le rongeur reproduisant le contexte humain du polymorphisme TaqIA et permettant d’enfin étudier son rôle causal dans le développement de l’addiction, des troubles du comportements et de l’obésité. Un total de 1920 animaux sur 5 ans sera utilisé pour répondre à ces questions. La règle des trois R sera respectée, le nombre d’animaux sera réduit au minimum en optimisant au maximum les groupes expérimentaux (réutilisation des animaux dans différentes procédures n'entrainant pas de douleur ou de stress) et en raffinant les procédures pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à court terme une meilleure connaissance du rôle du système de la récompense dans le contrôle du comportement et du métabolisme, ainsi que du rôle du polymorphisme TaqIA dans la modulation de l’activité des neurones dopaminergiques dans un environnement alimentaire normal ou obésogène. A moyen et long terme, l’objectif sera de développer et valider des approches nutritionnelles et/ou pharmacologiques personnalisées basées sur le polymorphisme génétique humain pour traiter les troubles psychiatriques, alimentaires et métaboliques.

Procédures

- Pour deux lots, les animaux seront soumis à des études de calorimétrie et/ou de métabolisme du glucose. Pour les études calorimétriques, les animaux resteront isolés au maximum 2 semaines lors d'une première exposition aux cages. Ces mesures en cages de calorimétrie indirecte pourront être répétées plusieurs fois sur un même animal, mais la durée d'exposition aux cages sera limitée à une semaine maximum dans ce cadre. Une partie des animaux sera également exposée à une chirurgie abdominale (15 min) pour implanter une puce de relevé de température. Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles pourront également être également réalisés après un gavage de glucose ou l’injection d’insuline (environ 4h pour chaque test). Enfin la moitié de ces animaux réaliseront ces tests après l’exposition à un régime hyperlipidique (maximum 3 mois). - Pour deux lots, les animaux seront soumis à des études comportementales visant à étudier les comportements alimentaires, les comportements motivés et les comportements de type anxieux. Dans le cas où les animaux sont évalués dans plusieurs tests, chaque test est espacé a minima de 7 jours. Enfin la moitié de ces animaux réaliseront ces tests après l’exposition à un régime hyperlipidique (maximum 3 mois). - Enfin, pour deux lots, les animaux seront soumis à une chirurgie (1 h), suivie d'une période de repos. Les animaux effectueront ensuite des tâches comportementales visant à étudier les comportements alimentaires, les comportements motivés et les comportements de type anxieux. Dans le cas où les animaux sont évalués dans plusieurs tests, chaque test est espacé a minima de 7 jours. Enfin la moitié de ces animaux réaliseront ces tests après l’exposition à un régime hyperlipidique (maximum 3 mois).

Impact sur les animaux

- La prise de poids induite par l'exposition chronique au régime hyperlipidique et les désordres métaboliques associés pourront être cause de nuisance pour les souris (nuisance modérée). - La calorimétrie indirecte demande un hébergement individuel des animaux pendant 7 jours maximum (nuisance modérée). Une partie des expérimentations se fera à 30°C et 13°C pour évaluer l'adaptation themrique des animaux pendant 3 jours au maximum (nuisance modérée). - Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux (nuisance légère). Enfin, les procédures de conditionnement opérant nécessitent une restriction alimentaire légère limitée à la phase d’apprentissage (maintien à 90% du poids ad libitum, nuisance modérée). - Les nuisances attendues suite à la chirurgie (badominale ou stéréotaxique) sont bien identifiées au laboratoire, après plusieurs années d'expérience de cette procédure (nuisance modérée). Notamment, la baisse de température corporelle induite par l’anesthésie est contrôlée par l’installation des souris sur un tapis chauffant assurant le contrôle de température. Ainsi, la température est maintenue en permanence à 37°C. Le dessèchement oculaire potentiel est prévenu par l’application d’un gel ophtalmique. - Le fait de porter des fibres optiques sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress (nuisance modérée). Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement initialement indésirable. Cependant les fibres étant légères, les animaux s'habituent très rapidement. De plus avant d'imager l'activité neuronale, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 30 min pendant 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer aux procédures d'enregistrement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet , nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. Nous nutiliserons pas également les invértébrés, car ils ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et la régulation de la récompense alimentaire.

Réduction

Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Afin d'optimiser nos cohortes et réduire le nombre d'animaux transgéniques générés par croisements, nous utiliserons l'ensemble des portées (mâles et femelles). De même, un maximum de mesures biologiques (périphériques et cérébrales) sera réalisé sur chaque animal dans la limite de compatibilité entre les différentes techniques.

Raffinement

Les soins apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, des bâtons de bois ou des tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé : notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée ici est la souris, dont la petite taille et la facilité de manipulation permettent un hébergement facile au sein de l’animalerie du laboratoire, dans le respect des règles d’éthique. Les manipulations nutritionnelles sont également faciles à conduire chez la souris et les expériences de comportement sont faciles à mettre en œuvre et très bien maitrisées au laboratoire qui possède tout l’équipement dédié. De plus, ce projet nécessite l'utilisation de stratégies transgéniques et virales disponibles uniquement dans des modèles murins. Toutes les souris seront utilisées à l’âge adulte (au moins 9 semaines) afin que les réseaux neuronaux soient bien en place.

Des souris âgées subissent une insuffisance circulatoire aiguë provoquée par chirurgie, sous anesthésie, pendant trois heures au maximum et sans réveil, après un test de force des pattes. 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, leurs muscles, reins, foie et cerveau étant prélevés. L'objectif déclaré est d'établir une signature métabolique du muscle âgé, pour repérer plus tard les patients de réanimation exposés à des complications. Les nuisances attendues se résument, selon le porteur, au stress du test de force et aux quelques secondes précédant l'endormissement, sans que le geste chirurgical lui-même soit décrit ni les niveaux d'hypotension retenus, encore non arrêtés.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’explorer la signature métabolique du muscle squelettique âgé préalablement exposé à une insuffisance circulatoire aigue (ICA) et d’en comprendre l’éventuel impact à distance sur les autres organes. In fine, il s’agit de positionner le muscle squelettique comme une possible cible thérapeutique afin d’améliorer le devenir des patients en réanimation et en péri-opératoire.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet présente un intérêt important pour le laboratoire de recherche puisqu’il permettra la mise en place d’un modèle d’insuffisance circulatoire aigue chez la souris dont l’objet principal sera l’étude du métabolisme musculaire. Ce modèle est conçu pour être au plus proche de la présentation et la prise en charge de l’ICA chez l’humain. Par ailleurs, ce modèle s’intègre dans une démarche translationnelle puisqu’il viendra compléter un essai clinique sur l’ICA en chirurgie cardiaque. Ce projet scientifique pourrait constituer une avancée importante dans la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques en anesthésie et réanimation, centrées sur le muscle squelettique. Grâce à la meilleure compréhension physiopathologique du rôle du muscle dans la récupération après une agression, nous souhaitons mettre en évidence des cibles métaboliques pour identifier les patients à risque de présenter des complications post-opératoires ou une hospitalisation prolongée en réanimation. Cela permettra d’améliorer la qualité des soins et la sélection des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à un grip test (3 répétitions du test d'une durée de quelques secondes chacune, entrecoupées de 2 à 3 minutes de repos) ainsi qu'à une procédure chirurgicale (ICA) de 3 h maximum, sans réveil.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues se résument au stress lors du grip test (maximum 10 minutes au total) et de l'anesthésie générale (quelques secondes avant endormissement).

Devenir

A la fin de chacune des procédure, l'ensemble des animaux est mis à mort, par des personnes formées et compétentes, dans le but de collecter et d'analyser les tissus d'intérêt (sang, muscle squelettique, rein, foie, cerveau). Ces analyses (biochimie, expression genique, histologie) permettront d'explorer la signature métabolique du muscle squelettique âgé préalablement exposé à une insuffisance circulatoire aigue (ICA) et d’en comprendre l’éventuel impact à distance sur les autres organes.

Remplacement

L’étude de l’insuffisance circulatoire aigue et de la communication inter-organes qui lui succède nécessite un modèle intégratif permettant la prise en compte de l’action à distance de tous les organes après une ICA. De ce fait l’analyse ne peut être réalisé qu’in vivo pour garde un niveau d’information suffisant. L’intérêt de cette recherche réside aussi dans son potentiel applicatif et l’utilisation de critères de jugement fonctionnels. Il n’existe à ce jour pas d’autre méthode fiable d’analyse systémique de la communication inter-organe.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux différentes problématiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant sur les données bibliographiques actuelles. Compte tenu de la variabilité des réponses individuelles et du risque de décès durant l'ICA tant que les conditions expérimentales ne sont pas arrêtées, des groupes de 15 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. De plus, une veille bibliographique a été effectuée afin d'éviter de refaire des expérimentations déjà réalisées par d'autres équipes de recherche et pour utiliser les travaux susceptibles de nous aider dans notre démarche (définir les niveaux d'hypotension à tester, les durées d'ICA notamment). Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les cages sont passées en revue quotidiennement pour repérer les blessures éventuelles, comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l'on vient attraper l'animal), maigreur, problème de dentition, et pesés 1 fois par semaine. De plus, toutes les procédures engendrant de la douleur sont réalisées sous anesthésie chirurgicale et un analgésique est utilisé en parallèle de ces procédures. Les chirurgies sont réalisées par du personnel formé. Lors de l'ICA, si la pression artérielle moyenne chute en deçà de la valeur définie dans le protocole, une perfusion du sang de l'animal (prélevé pour l'ICA et hépariné) sera réalisée pour maintenir la pression à la valeur choisie.

Choix des espèces

Les souris représentent un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et la souche choisie pour ce projet a déjà été utilisée pour la réalisation d’un modèle d’ICA permettant l'étude de la fonction renale dans la littérature. Notre modèle s'intéresse à l'altération musculaire. Nous prenons donc exemple sur ce premier modèle publié et l'adaptons pour l'étude du muscle squelettique. Les animaux seront étudiés à l’âge adulte, à partir de 8 semaines, pour ne pas interférer avec les mécanismes mis en jeu au cours du développement.

À partir d'un score clinique de 6 sur la grille de suivi, la souris est tuée, et dès le score 3 dans le modèle de tumeur sous-cutanée. 6 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses humaines ou murines leur sont injectées dans le poumon après ouverture de la plèvre, puis viennent les traitements, jusqu'à cinq gavages par jour, des irradiations, des anesthésies gazeuses jusqu'à trois fois par semaine pour l'imagerie et jusqu'à dix prélèvements sanguins par jour par une incision de la queue, les difficultés respiratoires étant attendues puisque le poumon est opéré. Le porteur annonce environ 80 molécules testées grâce à ce projet, une partie des prélèvements dépendant des "demandes clients".

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer de nouveaux traitements pour les cancers du poumon, dont les besoins sont non satisfaits, chez la souris dans des modèles orthotopiques (i.e. injection de cellules cancéreuses au site correspondant à celui de la tumeur d’origine). Pour ces modèles, des lignées cellulaires cancéreuses du poumon soit d’origine murine (syngénique) soit d’origine humaine (xénogreffe) seront inoculées directement dans le poumon par injection transpleurale. En fonction des cellules injectées, des souris immunocompétentes, immunodéficientes ou humanisées pour le système immunitaire seront utilisées. Les études consistent à administrer des traitements à potentiel thérapeutique à des souris porteuses de tumeur, puis à mesurer les niveaux de biomarqueurs, les concentrations sanguines ou tissulaires du composé d’intérêt et/ou la croissance tumorale. Les mesures de concentrations du composé permettront d’établir un modèle entre la pharmacodynamie et pharmacocinétique du composé, indispensable pour la détermination des doses à utiliser dans les études d’efficacité, de toxicologie réglementaire et enfin de prédire les doses des phases de preuve de concept en développement clinique chez l’homme. Le suivi de croissance tumorale permettra d’évaluer l’efficacité du ou des traitements Celui-ci sera réalisé par imagerie non-invasive de bioluminescence sur animal anesthésié. Des prélèvements tissulaires post-mortem pourront être réalisés pour des analyses ex vivo complémentaires (histologie, cytométrie en flux par exemple). Grâce à ce projet envron 80 molécules pourront être testées et aboutir à de nouvelles thérapies pour le cancer du poumon.

Bénéfices attendus

Le cancer du poumon est la principale cause de décès liés au cancer dans le monde, avec le taux de mortalité le plus élevé chez les hommes et les femmes. Avec près de 50 000 nouveaux cas et 30 000 décès par an en France, il est le 3ème cancer le plus fréquent et la première cause de mortalité par cancer. Le traitement du cancer pulmonaire repose aujourd’hui principalement sur la chirurgie (exérèse partielle) lorsqu’il est à un stade précoce, puis des chimiothérapies associées à des radiations. Malheureusement ce cancer est souvent diagnostiqué à un stade avancé lorsque les possibilités de traitement sont limitées. Le pronostic vital reste particulièrement défavorable, notamment pour les formes métastatiques (survie à 5 ans inférieure à 5%) comparé aux formes localisées (survie à 5 ans de 20%) ce qui souligne l’inefficacité des traitements actuels et la nécessité de développer de nouvelles thérapies. Les procédures qui constituent ce projet s’inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront de prédire l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. A plus long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l’Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.

Procédures

1) Les gestes techniques concernent tous les animaux :• Greffe des cellules tumorales par voie transpleurale : chirurgie d’une durée de 15 minutes incluant l’anesthésie, 1 seule fois pendant l’étude. • Mesure des tumeurs avec l’appareil de bioluminescence : durée 15 minutes sous anesthésie gazeuse maximum 3 fois par semaine. • Administrations des composés à potentiel thérapeutique - par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique, (max5xjour), intrapéritonéale (max4xjour), sous-cutanée (max4xjour), intramusculaire (max2xjour) ou intradermique (1 injection/jour) : durée 30 secondes sur animaux vigiles, d’un seul traitement à plusieurs semaines de traitement selon la procédure réalisée. - par voie intraveineuse à la veine caudale : durée 2 minutes sur animaux vigiles, maximum 2 fois par jour pendant 3-4 jours (dépendant des veines de l’animal). L’installation d’un cathéter sera nécessaire pour des administrations plus longues. - par voie intranasale : durée 30 secondes sur animaux anesthésiés (anesthésie gazeuse flash) (max 1 fois par jour). - par voie intratracheale : durée 30 secondes sur animaux anesthésiés par anesthésie gazeuse ou à l’aide d’anesthésique systémique (max 1 fois/jour). • Traitement par irradiation pendant maximum 5 min une seule fois pendant l'étude. • Administration de produit pour imagerie de bioluminescence par voie intrapéritonéale : durée 30 secondes sur animaux vigiles (maximum 3 fois par semaine pendant une à plusieurs semaines selon la procédure réalisée). 2) Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Prélèvements de sang sur animal vigile - via la veine saphène : durée 30 secondes (max 4xjour) o via la veine mandibulaire : durée 30 secondes (max 2xjour) - via une incision de la veine latérale de la queue (1 seule incision d’environ 2 mm réalisée pour la totalité des prélèvements) durée 1 min (max 10xjour). • Prélèvements de sang sur animal anesthésié à l’isoflurane o via la veine sublinguale (max 1x/jour).

Impact sur les animaux

Nuisances des animaux : pour chacune des procédures, les animaux seront opérés pour pouvoir injecter les cellules tumorales directement dans le poumon sous anesthésie par injection intrapéritonéale d’un mélange de produits anesthésiques en addition d'analgésique pour éviter la douleur. Pour les procédures 2 et 3, les animaux seront traités avec des thérapies pendant quelques jours à plusieurs semaines qui peuvent parfois être mal tolérées (dose du traitement importante ou traitement à long terme). Ces effets apparaissent potentiellement au fur et à mesure de la croissance tumorale. Les animaux seront également soumis à des anesthésies gazeuses répétées (isoflurane) pour le suivi de la croissance tumorale par imagerie mais également lorsque les traitements nécessitent une anesthésie. Ils pourront également être sujets à plusieurs prélèvements sanguins durant les études. Effets indésirables : ces procédures peuvent engendrer une dégradation de l'état de santé de l'animal pouvant se traduire par une perte de poids, une hypo- ou hyperthermie, un comportement anormal (animal prostré, ne répondant pas aux stimuli), des vocalisations. Les animaux étant opérés du poumon, il est possible que les animaux présentent des difficultés respiratoires. Les traitements répétés par voie intra-trachéale pourraient également être irritant si la durée de traitement est importante. Les animaux sont observés quotidiennement à minima et jusqu’à 2 fois par jour lors des traitements pour réagir au plus vite à l’inconfort des animaux et y apporter des solutions (arrêt des traitements, réhydratation, raffinement).

Devenir

Les animaux utilisés pour le développement des modèles orthotopiques du poumon peuvent parfois être utilisés pour effectuer une étude de pharmacocinétique/pharmacodynamie (PK/PD) à la fin pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Ces animaux seront mis à mort à la fin de cette 2ème procédure. Les animaux utilisés pour une étude de PK/PD ou d'efficacité seront mis à mort à la fin de leur procédure. Quelle que soit la procédure, des prélèvements de sang et de tissus pourront être réalisés et feront l’objet d’analyses ultérieures.

Remplacement

Deux approches sont principalement utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basé sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux de laboratoire, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les modèles in vitro ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorale. De plus, à notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.

Réduction

Dans le modèle orthotopique, la croissance tumorale sera suivie au cours du temps par imagerie de bioluminescence. L’utilisation de cette technique non-invasive permet d’observer au cours du temps un seul animal simplement anesthésié, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, d’une manière générale, les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in sillico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex : un récepteur, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux.

Raffinement

Les locaux d’hébergement font l’objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d’hébergement et d’animaux sentinelles. Les animaux seront groupés dans des cages contenant de l’enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire. Les procédures générant douleur, inconfort ou stress se feront systématiquement sous anesthésie. Pour les anesthésies longues (instillation des cellules tumorales ou traitement des animaux) les animaux seront placés sur un tapis chauffant avec contrôle de la température corporelle pour éviter toute hypothermie. A noter qu’afin de protéger la sécheresse oculaire durant la phase d’anesthésie, du gel ophtalmique type Lacryvisc est déposé sur les yeux de l’animal à l’aide d’un coton-tige. Pour éviter l’apparition de potentielle douleur lors de l’instillation des cellules cancéreuses, une injection en sous-cutanée d'analgésique sera réalisée 30 minutes avant l’instillation des cellules. Cette injection sera répétée en cas d’apparition de signe de douleur. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Une fiche de suivi des signes cliniques a été mise en place spécifiquement pour ce modèle (évaluation de l’hématurie, de la capacité à uriner…). Elle permet d’établir un score pour évaluer l’état général de l’animal et en fonction du total des scores des mesures sont appliquées. Ainsi, à partir d’un total de 4, les animaux seront observés par un vétérinaire et à partir d’un total de 6, l’animal sera euthanasié. Dans le cas du modèle abscopal, une fiche de suivi de l’évolution de la tumeur sous-cutanée sera également utilisée. Dans ce cas, si le score 3 est atteint, l’animal sera euthanasié. De plus, si un animal atteint un des points limites établi, il sera immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. De nombreuses données sur les modèles orthotopiques de cancer du poumon chez la souris existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références etc.). La souris est un modèle d’étude de choix car : 1/ sa petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (ou plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie), et 2/ la biodisponibilité des souris immunodéficientes (nécessaires pour l’utilisation de cellules humaines). Les données de la littérature indiquent clairement que les rongeurs adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine du cancer, c’est pour cela que nous utiliserons des souris adultes.

Le protocole dépend de la molécule testée et de sa pharmacologie, dans un travail de tri de candidats médicaments mené en amont d'études d'efficacité plus longues. 1 550 souris et 1 250 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un traitement une ou deux fois par jour, par voie orale, sous-cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale selon le composé, puis un prélèvement sanguin sous anesthésie sans réveil. Le porteur indique n'attendre aucun signe clinique, tout en reconnaissant que les molécules administrées pourraient avoir des effets indésirables non connus, et justifie la mise à mort par le volume de sang requis, les animaux ne pouvant "survivre décemment à une grosse ponction sanguine".

Objectifs

L’objectif est de mettre en place un modèle de pharmacocinétique/pharmacodynamique inflammatoire. Pour cela, nous quantifierons les cytokines inflammatoires sécrétées ex vivo, en réponse à des stimuli ex vivo, par les cellules immunitaires sanguines exposées aux composés in vivo ou par des cellules immunitaires sanguines de culture exposées au plasma des souris traitées in vivo.

Bénéfices attendus

Ce modèle permettra une meilleure caractérisation de nos composés thérapeutiques en établissant une relation entre la pharmacocinétique in vivo (concentration en fonction du temps) et la pharmacodynamique (effet pharmacologique en fonction du temps). Ce modèle nous aidera à mieux sélectionner nos composés avant une évaluation dans des modèles d’efficacité in vivo plus longs et plus complexes.

Procédures

Une contention douce permettra la pesée et le traitement 1 ou 2 fois par jour selon la molécule testée et sa pharmacologie. Pour la même raison, l’administration pourra se faire par voie orale ou sous-cutanée ou intraveineuse ou intrapéritonéale. Le prélèvement sanguin sera réalisé soit sous anesthésie et sans réveil avant mise à mort, soit après que les animaux aient été euthanasiés.

Impact sur les animaux

La douce contention des animaux nécessaire pour la pesée et le traitement, ainsi que l'anesthésie pour le prélèvement sanguin, pourront engendrer un stress et un inconfort. Malgré la très bonne formation du personnel technique, il pourrait dans de rares cas y avoir des conséquences dues aux administrations ou aux prélèvements. Les molécules administrées pourraient avoir des effets indésirables non connus.

Devenir

Les analyses ex vivo nécessitent beaucoup de sang total. Les animaux seront mis à mort car ils ne pourraient survivre décemment à une grosse ponction sanguine.

Remplacement

En amont des tests chez l’animal, les composés sélectionnés sont évalués sur des tests in vitro, permettant d’identifier les composés les plus prometteurs, de comprendre leurs mécanismes d’action et d’éliminer les molécules inactives ou pouvant entrainer des nuisances ou effets indésirables chez les animaux (via les tests de toxicologie cellulaire). L’intérêt de ce projet étant d’étudier l’effet du composé sur les cellules sanguines, nous ne pouvons utiliser à ce stade de modèle in vitro pertinent.

Réduction

La sélection des composés est faite en utilisant des tests in vitro puis cellulaires. Seules les molécules présentant une activité sur les tests cellulaires sans toxicité apparente et ayant des caractéristiques pharmacocinétiques adéquates seront étudiées avec les animaux. Ce modèle a déjà été publié pour la molécule de référence de ce projet et a prouvé son intérêt scientifique. Nous utiliserons les données et les conditions utilisées pour cette molécule afin d’ajuster le nombre minimal d’animaux nécessaires. Des tests statistiques seront utilisés afin de comparer l’efficacité de notre composé par rapport à un contrôle.

Raffinement

Toutes les dispositions nécessaires en matière d’hébergement, d’enrichissement, d’observation et de soins aux animaux sont prises afin d’assurer les meilleures conditions de vie aux animaux. La Structure Chargée du Bien-être Animal émet ses recommandations en matière de prévention de la douleur, souffrance et détresse des animaux. Après réception, les animaux seront placés dans des cages par 4 à 5 souris ou par 2 à 3 rats. Un programme d’enrichissement permet de varier les éléments de la cage afin d’encourager leur comportement de rongeur : coton pour la construction de nid, dôme rouge ou tunnel en carton pour se cacher, bois à ronger… La nourriture et l’eau seront en libre accès tout au long de l’étude. Les pièces d’hébergement disposent d’un cycle lumière obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. Nous n’attendons pas de signes cliniques dans ce projet. Néanmoins, des critères cliniques et des points limites sont définis dans une liste pour determiner un score de suivi des signes cliniques. En cas d'atteinte de points limites et/ou d’observation de comportement non attendu, des mesures seront prises en accord avec le vétérinaire pour arrêter toute souffrance.

Choix des espèces

Les rats et souris entrent dans la plupart de nos études précliniques sur nos candidats médicaments. La concentration dans le sang des composés testés sont bien connus grâce aux études de pharmacocinétiques préalablement réalisées chez ces espèces ; ces données seront utilisées pour planifier les temps de prélèvements sanguins. Le choix de l’espèce sera choisi en fonction des caractéristiques intrinsèques des composés, selon les résultats de pharmacocinétique plus ou moins favorables entre rats et souris (des métabolismes différents induisent parfois des expositions et des cinétiques différentes). Il n’y a pas d’indication spécifique sur le choix de l’âge autre qu’une maturité immunitaire. Les animaux seront de jeunes adultes de 8 à 12 semaines pour les souris et 7 à 10 semaines pour les rats.