Recherche appliquée

5 212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées de cellules leucémiques après un pré-conditionnement, elles reçoivent trois injections de chimiothérapie puis des composés pharmacologiques, et subissent des prélèvements de sang et de moelle osseuse sous anesthésie générale. Le porteur indique que l'injection de lignées cellulaires provoque un développement rapide de la maladie conduisant à la mort de l'animal, avec amaigrissement, paralysie et prostration, alors que la gravité déclarée pour l'ensemble du projet reste modérée. Il conclut que les modèles in vivo sont "indispensables" pour étudier la résistance aux chimiothérapies, tout en annonçant des modèles de moelle osseuse in vitro censés réduire "à terme" le recours aux souris.

Objectifs

Les leucémies sont les cancers du sang et de la moelle osseuse les plus courants chez l’adulte, mais leur pronostic reste défavorable malgré des taux initiaux élevés de rémission. Cela s’explique par la rechute fréquente due à la survie de cellules résistantes au traitement. Ce projet vise à élucider et exploiter les mécanismes sous-jacents à la résistance des cellules leucémiques pour surmonter les limitations des traitements actuels. Les expériences sont menées sur des modèles murins greffés avec des cellules leucémiques et soumis à des protocoles de chimiothérapie. Notre objectif est d’identifier les mécanismes de résistance des cellules leucémiques et de proposer à terme de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter plus efficacement ces pathologies.

Bénéfices attendus

Le projet pourrait offrir des bénéfices significatifs en termes de compréhension et de traitement des leucémies. Sur le plan scientifique, il permettra de décrypter les mécanismes moléculaires régissant la résistance aux traitements. D’un point de vue clinique, ces découvertes pourraient conduire au développement de stratégies thérapeutiques visant à améliorer les réponses aux chimiothérapies intensives, réduisant ainsi les risques de rechute. Enfin, sur le plan sociétal, ces avancées pourraient améliorer à terme les taux de survie et la qualité de vie des patients atteints de leucémie.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injections : - Pré-conditionnement des animaux : une injection par animal, 24h avant injection des cellules. Durée : quelques secondes. Sur animaux vigiles. - Traitements par chimiothérapie : 3 injections Jours 1/3/5, durée : environ 1 minute. Sur animaux vigiles. - Composés pharmacologiques testés : leur fréquence d’administration sera déterminée selon la littérature , en respectant scrupuleusement les recommandations des volumes limites. Ce sont des procédures qui durent de quelques secondes à 1 minute. - Injection des cellules leucémiques : injection des cellules. Cette manipulation dure de quelques secondes à une minute. Sur animaux vigiles. Prélèvements : - Prélèvements sanguins. Cette procédure est réalisée alors que les souris sont anesthésiées. Durée : environ 1 minute. Le premier prélèvement sera effectué 8 semaines après injection des cellules, et ensuite toutes les 4 semaines si besoin. - Prélèvements de moelle osseuse (les prélèvements sont réalisés après anesthésie générale de la souris).

Impact sur les animaux

Les expériences utilisant des cellules de patients (ou dérivés) n’engendrent pas d’effets secondaires visibles sur les animaux. Les traitements par chimiothérapie ont été optimisés dans notre laboratoire, de manière à ne pas avoir d’effets toxiques visibles sur les animaux (pas de perte de poids, ni de modification du comportement, ni de mortalité). Par contre, l’utilisation de lignées cellulaires de leucémie injectées à des souris entraîne un développement rapide de la maladie qui conduit à la mort de l’animal. Les effets indésirables prévus sur les animaux incluent une détérioration rapide de l'état général des souris, en particulier lors de l'injection de lignées cellulaires, qui peuvent entraîner des effets notables sur le comportement et la santé des animaux. Aussi, dans le cadre des expériences utilisant ces cellules, les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de la zootechnie et les expérimentateurs. Ces observations quotidiennes porteront sur des indicateurs précis : amaigrissement, paralysie, perte d’activité, prostration, deshydratation). Si un animal atteint un certain score de détérioration, l’expérience sera stoppée pour cet animal.

Devenir

Tous les animaux des procédures sont euthanasiés à la fin des expériences.

Remplacement

Pour respecter la règle des 3R, il est important de chercher à remplacer l’expérimentation animale. Cependant, afin d’étudier la résistance aux traitements dans les leucémies, des études sur des modèles animaux sont indispensables. Les modèles in vitro, bien qu’utiles pour une première compréhension des mécanismes, ne reproduisent pas fidèlement les interactions complexes entre la tumeur et son microenvironnement ni son évolution dans un organisme vivant. Par exemple, nous avons observé une absence de corrélation entre les réponses in vitro et in vivo à la chimiothérapie utilisée dans les leucémies, ce qui souligne l’importance des études in vivo. Ces dernières sont essentielles pour valider nos résultats et envisager leur application clinique chez l’homme. Néanmoins, afin de réduire l’utilisation d’anmiaux dans le futur, notre laboratoire est engagé dans le développement de modèles de moelle osseuse in vitro. Nous espérons que ceci nous permettra à terme de réduire à terme notre utilisation d’animaux en vue de les remplacer au moins partiellement par ces modèles in vitro.

Réduction

Les effectifs des cohortes seront définis à l'aide d'un logiciel de simulation, en s'appuyant sur des études précédentes et en utilisant des tests statistiques visant à optimiser et réduire le nombre d'animaux et d'échantillons nécessaires.

Raffinement

L'expérimentation inclut un suivi adapté du bien-être des animaux, tenant compte du modèle et des éventuels effets indésirables. Les animaux seront observés quotidiennement, et leur environnement enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer leur confort. Les protocoles viseront à minimiser le stress et la douleur en optimisant les injections et la durée des traitements. Les études précédentes ont aidé à mieux définir les points limites, et la majorité des procédures ont déjà été approuvées par un comité d'éthique pour l'expérimentation animale. Les souris utilisées dans ce projet (NSG) étant des animaux hautement immunodéprimés, ils sont maintenus dans un hébergement au statut sanitaire strict. Les cages sont disposées sur des portoirs ventilés et toute personne pénétrant dans les hégerment doit porter des équipements de protection individuelle (masque chirurgical, charlotte, surchaussures, combinaison, gants).

Choix des espèces

Le modèle souris est essentiel pour comprendre la biologie des cancers. Dans cette étude, nous utilisons des souris immunodéficientes, qui sont les modèles murins les plus utilisés à ce jour pour réaliser des greffes de cellules humaines leucémiques. Le développement de la maladie est relativement fidèle à celui retrouvé chez les patients atteints de leucémie. Les animaux utilisés sont des animaux adultes, les leucémies aiguës myéloïdes étant des cancers affectant préférentiellement les sujets adultes.

Une greffe de tumeur sous la peau puis huit injections dans l'abdomen : 40 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour les analyses histologiques et la mesure de la progression tumorale. Le développement de la tumeur peut entraîner une perte de poids. Il s'agit de tester un anticorps dirigé contre une protéine appelée LVRF sur des tumeurs de médulloblastome, cancer cérébral de l'enfant, l'effectif de chaque groupe étant calé pour obtenir 80 % de chances d'un résultat statistiquement significatif. Les souris appartiennent à des lignées immunodéficientes, retenues parce qu'elles laissent se développer des cellules humaines greffées, et le porteur affirme qu'aucun système ne reproduit aujourd'hui la complexité du médulloblastome hors de l'animal vivant.

Objectifs

L’objectif est de tester in vivo l'efficacité d’un anticorps (anti-LVRF) sur la progression de tumeurs de médulloblastome. La validation in vivo de l'efficacité de ce composé sur le développement de la tumeur pourrait permettre la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les médulloblastomes.

Bénéfices attendus

Les médulloblastomes sont les tumeurs cérébrales malignes les plus fréquentes chez les enfants. Ils représentent 20% des tumeurs du système nerveux central chez l'enfant. Malgré les traitements standards (chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie), la plupart des patients récidivent. Le taux de survie à 5 ans varie de 80% à 50%. Il est donc important de proposer aux patients de nouveaux traitements médicamenteux pour améliorer le résultat clinique. La validation in vivo de l'efficacité d'un traitement ciblant la protéine LVRF permettrait la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les médulloblastomes.

Procédures

Les 40 animaux recevront une greffe sous-cutanée de cellules tumorales de médulloblastome (une seule intervention de 1 minute environ). Chaque animal recevra également un total de 8 administrations par voie intra-péritonéale (30 secondes/administration).

Impact sur les animaux

La manipulation, contention des animaux, les injections de cellules, d'anesthésiques ou d'analgésiques sont générateurs de stress pour les animaux. Les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. Le développement tumoral est susceptible d'entraîner une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés dans le cadre des études de survie, pour les analyses histologiques ou de progression tumorale.

Remplacement

L'efficacité thérapeutique de nouveaux médicaments sur la croissance tumorale des médulloblastomes nécessitent une approche expérimentale in vivo. En effet, il n’existe pas à ce jour de système suffisamment robuste pour mimer toute la complexité biologique et physiologique des médulloblastomes. Ce travail sur l'animal vivant s'inscrit dans la continuité d'expériences et de résultats que nous avons obtenu in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux prévu dans chaque groupe est basé sur un calcul d'effectif permettant de prédire que nous avons 80% de chance d’obtenir un résultat statistiquement significatif.

Raffinement

La détection de toute souffrance de l’animal sera assurée et le niveau de souffrance évalué en fonction d'une grille de score. En fonction des scores obtenus, il sera envisagé une analgésie ou l'euthanasie de l'animal. Pour le bien- être de l'animal, les souris seront logées selon les normes requises avec un enrichissement (copeaux de bois, dômes) et en groupes de 5 individus par cage afin d’éviter le stress de l’isolement. Les cages pourvues de couvercles filtrants seront disposées dans une armoire ventilée.

Choix des espèces

Le modèle murin est le plus adapté pour aborder les questions relatives aux tumeurs cérébrales. L'utilisation de lignées murines immunodéficientes permet la transplantation de cellules d'une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d'une espèce différente (souris). Les tumeurs de médulloblastome générées dans ce modèle animal sont particulièrement similaires aux tumeurs humaines. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 5 semaines et utilisées à l’âge de 6 semaines, en accord avec les protocoles décrits pour ces modèles physiopathologiques.

Déjà utilisées dans un projet antérieur, cinq macaques à longue queue femelles de trois à quatre kilos sont soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et pourront être réutilisées ensuite dans un autre projet après accord du vétérinaire. Chacune reçoit un anticorps antiviral radiotracé par le nez sous anesthésie légère, subit une imagerie scintigraphique, une intubation trachéale avec une heure d'assistance respiratoire, des lavages nasaux et des prises de sang répétées. L'étude porte sur cinq individus sans analyse statistique, le porteur admettant que l'effectif et l'hétérogénéité du dépôt dans les voies respiratoires ne s'y prêtent pas. Le renforcement positif est écarté pour les lavages nasaux, les zootechniciens jugeant qu'un macaque non coopérant fait courir au personnel un risque de morsure.

Objectifs

Selon l’organisation mondiale de la santé, les infections des voies respiratoires basses demeurent la maladie transmissible qui fait le plus de morts dans le monde, et se placent au quatrième rang des principales causes de mortalité. Ces infections dues, entre autres, à des virus respiratoires entraînent des millions d’hospitalisations chaque année et est une cause importante de décès chez les personnes fragiles (âgées, jeune enfant…). Face à l’hésitation vaccinale, la moindre efficacité des vaccins dans certaines populations et l’émergence et une propagation rapide des virus pharmaco-résistants, de nouveaux traitements sont nécessaires pour contrôler les infections virales respiratoires. Pour de nombreux virus respiratoires, comme celui de la grippe, le virus respiratoire syncitial et celui de la Covid-19, les cavités nasales sont le site d’entrée, de réplication primaire du virus, et constitue un réservoir pour la transmission du virus aux poumons, où l’infection peut provoquer une pneumonie potentiellement mortelle. Le contrôle de la réplication des virus respiratoires et de l’infection dans les cavités nasales offre donc une réelle opportunité de limiter les pneumonies lorsqu’une épidémie émerge. Aujourd’hui, de nombreuses biothérapies à visée intranasale (protéines et vaccins) sont en cours de développement ou commercialisés pour diverses applications. S’appuyant sur des décennies de recherche translationnelle en immunothérapie sur les infections respiratoires, en ingénierie des anticorps et en inhalation le but de ce projet européen est de développer des traitements inhalables (par voie intranasale), à base d’anticorps contre différents virus respiratoires (grippe, COVID) afin de bloquer l’infection dans les cavités nasales. Plus concrètement, cela implique : 1/ d’évaluer le dépôt de l’anticorps dans les voies respiratoires après inhalation par voie intranasale chez le primate non humain afin de déterminer la dose délivrée dans les cavités nasales et 2/ d’analyser le devenir et l’impact de l’anticorps inhalé dans l’organisme.

Bénéfices attendus

Les infections respiratoires représentent un lourd tribut en termes de morbi/mortalité, perte de productivité et coût pour le système de santé. L’impact sociétal potentiel du projet est immense. La prévention des décès et des hospitalisations dus aux virus respiratoires avec des anticorps inhalés aura un avantage direct pour la santé humaine et un potentiel économique et sociétal important. Cette approche anticorps/voie intranasale offrirait une opportunité de mieux contrôler les épidémies. L’approche par inhalation intranasale avec des anticorps capables de neutraliser différentes virus respiratoires est très attractive pour limiter la transmission entre personnes et pour prévenir des pneumonies sévères.

Procédures

- Pose des points de repère spatiale : sous anesthésie chimique légère- 10 minutes - Mesure du coefficient d’atténuation des cavités nasales : sous anesthésie chimique légère- 10 minutes - Administration par voie intranasale de l’anticorps radiotracé : sous anesthésie chimique légère - 1 minute au total - Imagerie scintigraphique du dépôt dans les voies respiratoires de l’anticorps radiotracé : sous anesthésie chimique légère - 15 minutes - Intubation par sonde intratrachéale : sera réalisée à l’occasion des gestes nécessitant l’anesthésie gazeuse à l’isoflurane- le geste lui-même dure environ 2 minutes mais les animaux seront intubés et sous assistance respiratoire pendant 1 heure. - Prélèvements sanguins : sous anesthésie–5-10 minutes par prise de sang Et sur animaux vigiles – 5-10 minutes par prise de sang. - Lavage nasal : sous anesthésie 5 -10 minutes par lavage.

Impact sur les animaux

Nous avons identifié quelques nuisances attendues/prévues : - Stress causé par la contention et manipulation des animaux, - Douleur causée par l’injection d’anesthésiques chimiques De plus, nous avons identifié des facteurs engendrant des potentiels effets indésirables/secondaires : l’utilisation d’anesthésiques pouvant éventuellement entraîner des troubles cardio-respiratoires, des hématomes lors des prises de sang, une irritation locale lors de l’inhalation par voie intranasale de l’anticorps radiotracé et lors des lavages nasaux.

Devenir

Au vu de l'espèce utilisé dans ce projet et de la classification de la gravité de la procédure (moderée), les animaux pourront être réutilisés dans un autre projet après accord du vétérinaire réferent.

Remplacement

Le principe de remplacement de la règle de bien-être animal est appliqué. En effet, les résultats in vitro préalables à l’utilisation des animaux, notamment l’utilisation de répliques anatomiques de cavités nasales macaques, nous permettrons de calibrer les différentes expériences in vivo afin de limiter le nombre d’animaux nécessaire et d’utiliser d’emblée des posologies et modalités d’administration adaptées.

Réduction

Les animaux seront réutilisés d’un autre projet, mais naïfs vis-à-vis de l’anticorps anti-viral. L'étude est réalisée sur un effectif réduit (n=5) et servira à obtenir des données qualitatives, sans analyse statistique, du devenir et de l’impact de l’anticorps inhalé. Comme indiqué dans la saisine, les temps de prélèvements (sanguin et nasal) pourront varier selon les animaux car ils seront ajustés, au cours de l'étude, sur la base des données issues des premiers animaux. Une analyse statistique n'apparaît donc pas compatible compte tenu du n faible à chacun des temps (n

Raffinement

Pour réduire au maximum l’utilisation d’anesthésiques, du renforcement positif est inclus pour les prélèvements sanguins (PS) à T3h-72h post-inhalation (PS sans lavage nasal concomitant). A ces temps les PS seront réalisés sur animaux vigiles sans contention uniquement sur les animaux répondants car, d’après des études, certains animaux n’adhèrent pas à ce type de démarche même après plusieurs semaines d’entrainement. Pour les animaux non réceptifs les PS seront réalisés sur animal vigile mais immobilisé par contention. Le renforcement n’est pas envisagé pour les PS aux temps T15min->T60min car le respect de ces temps précis est primordial pour l’analyse pharmacocinétique. Il n’est pas envisagé pour les lavages nasaux pour des questions de sécurité du personnel car, d’après les zootechniciens, il est difficile d’entrainer un PNH à accepter l’administration nasale d’un soluté et d’en récupérer un volume. Ce geste sur un animal non coopérant amène des questions de sécurité (risque morsures). La totalité des lavages nasaux se fera donc sur des animaux anesthésiés avec des molécules et dosages adaptés. Enfin, vu que les lavages nasaux impliquent une anesthésie nous réaliserons les PS aux temps T0, T1sem, T2sem, T3sem, T4sem durant l’anesthésie. Pour réduire la douleur et éviter des hématomes la taille de l’aiguille sera adaptée et un point de compression sera appliqué. Si insuffisance respiratoire des mesures d’oxygénothérapie et réanimation seront mis en place. Pour réduire le risque d’irritation locale, la taille des embouts narinaires sera adaptée et les lavages seront réalisés avec soin. Au cours de l’anesthésie prolongée : -Gel oculaire pour prévenir la sècheresse des yeux - Humidification et réchauffement des voies aériennes par filtre échangeur d’humidité chaleur - Sonde d’intubation de taille adaptée avec ballonnet pour éviter une lésion trachéale et garantir une bonne ventilation. - Tapis chauffant pour maintien d’une température - Fluides de remplacement (solution isotonique) après des PS multiples. Les animaux sont hébergés par groupe de 3 et de 2 dans 2 volières conformes aux normes en vigueur. Ils disposent dans leur hébergement de plateformes surélevées, de tunnels, de jouets et de piscine. L’alimentation couvre les besoins journaliers et est complétée par une distribution de friandises. La nourriture pourra être cachée dans des jouets pour stimuler la recherche alimentaire. Les friandises distribuées sont différentes d’un jour à l’autre.

Choix des espèces

Le primate non humain est une espèce de référence pour les études de dépôt de particules inhalées dans le tractus respiratoire, permettant de mettre en place différentes conditions de ventilation et d’utiliser des dispositifs à qui seront directement utilisés chez l’homme. Le choix de l’espèce macaque se justifie par : - La tenue bipède, la morphologie du nez et le volume des cavités nasales. La tenue assise lors de l’administration de la molécule et la taille du nez permet l’utilisation de dispositif à visée humaine avec un embout adapté. Le volume des cavités nasales est compatible avec les volumes administrés avec les différents dispositifs. - Proximité anatomique de l’espèce. Les cavités nasales des macaques sont plus similaires à celle de l’homme, que celles d’autres espèces. - Proximité physiologique de l’espèce. La morphologie et la distribution de l’épithélium nasal (où se réplique le virus de la grippe et cible de l’anticorps) chez le macaque est plus proche de celles de l’homme que celles d’autres espèces (rongeurs, chiens) - Similarité des réponses immunologiques et biologique avec l’humain, faisant du PNH une espèce de référence pour les études réglementaires avec des anticorps thérapeutiques. 5 animaux adultes de 3-4 kg réutilisés de projets précédents après accord du vétérinaire référent.

Injectées dans le cervelet au cours d'une procédure de 45 minutes à une heure sous anesthésie générale, 178 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées à la fin pour prélever leurs tissus. Elles sont d'abord génotypées par biopsie de queue à sept jours, puis passent jusqu'à deux tests comportementaux par jour, entre un et quatorze mois d'âge selon les groupes. L'objectif est de tester une thérapie génique contre l'ataxie récessive liée au gène COQ8A, une maladie rare sans traitement efficace. Le porteur affirme que le déficit de coordination motrice n'a "pas d'impact sur la vie normale des animaux" et qu'aucun signal de douleur n'a été détecté, tout en indiquant que ce phénotype apparaît à dix semaines et s'aggrave tout au long de la vie.

Objectifs

La CoQ10, également appelée ubiquinone, ubiquinol ou coenzyme Q10, est une molécule très connue. Vous avez probablement déjà vu ce nom sur l'emballage de crèmes pour la peau ou d'aliments de remise en forme. La CoQ10 a une fonction plus spécialisée, agissant à l'intérieur de nos cellules et contribuant à de nombreuses fonctions, comme un ouvrier qui aide d'autres molécules à faire leur travail. Même si nous pouvons consommer de la CoQ10 dans certains aliments tels que la viande, le poisson ou les noix, la quantité n'est pas suffisante. Nos cellules ont donc un moyen de fabriquer la CoQ10 pour nous. Lorsqu'il y a un défaut et que nos cellules ne sont pas en mesure d'effectuer cette construction correctement, les niveaux de CoQ10 diminuent à l'intérieur de notre corps. De faibles niveaux de CoQ10 conduisent à des maladies que nous appelons : déficiences primaires en CoQ10. L'une des déficiences en CoQ10 les plus connues est l'ataxie autosomique récessive de type 2 ou ARCA2, qui se caractérise chez les patients par une intolérance à l'exercice, une cardiomyopathie, une épilepsie, une déficience intellectuelle, une néphropathie et un déséquilibre. L'ARCA2 est considérée comme une maladie rare et il n'existe pas encore de traitement efficace. C'est pourquoi ce projet de recherche tente de trouver de nouveaux traitements qui, à l'avenir, pourront aider les patients atteints d'ARCA2 à avoir une vie meilleure.

Bénéfices attendus

Nous espérons que les résultats de ce projet apporteront à la communauté scientifique de nouvelles thérapies possibles et contribue également à clarifier de nouveaux mécanismes moléculaires concernant l'ataxie autosomique récessive. L'ataxie COQ8A est une maladie rare sans traitement efficace. La supplémentation en CoQ10 est utilisée par les patients pour atténuer les symptômes, cependant tous les patients ne répondent pas de la même manière à ce traitement, donc notre projet de recherche peut apporter une nouvelle perspective thérapeutique et accélérer le processus de traitement, ce qui pourrait à l'avenir donner aux patients une meilleure qualité de vie grâce à de nouvelle approches thérapeutiques.

Procédures

Ce projet comprend : • Un protocole de génotypage par biopsie de la queue sera effectué à 7 jours de vie, ce protocole provoquera une légère douleur de courte durée. La durée du protocole sera d'environ 2 minutes par animal • Une étape incluant des tests comportementaux sera réalisée sur les animaux vigiles. La durée de ces tests est comprise entre 30 secondes et 5 minutes par souris, un maximum de deux tests comportementaux différents sera effectué par jour. • Un protocole d'injection intracérébral se fera sous anesthésie générale pour la délivrance du vecteur exprimant la protéine d’intérêt dans le cervelet. La durée totale de la procédure est de 45 minutes à 1 heure par souris.

Impact sur les animaux

Les nuisances et les effets indésirables pour les animaux seront décrits en termes de 5 libertés et de la manière dont le phénotype et les procédures affectent chacun de ces paramètres : (1) Liberté de faim et de soif : selon nos résultats précédents concernant la caractérisation des animaux, ceux-ci n'ont pas présenté de problèmes pour manger et boire de l'eau tout au long de leur vie. Les protocoles utilisés pour le comportement et l'injection ne modifient pas non plus ces paramètres. (2)Liberté d'inconfort : un certain niveau d'inconfort peut être causé par les tests de comportement. Nous prévoyons de l'atténuer grâce à des séances d'entraînement et à l'adaptation préalable des animaux à tout test. L'inconfort éventuel causé par l'injection intracrânienne sera contrôlé par l'application d'analgésiques. (3)Liberté en cas de douleur, de blessure ou de maladie : Le processus de génotypage peut provoquer des douleurs légères et de courte durée. Le protocole d'injection intracérébral peut provoquer des douleurs chez les animaux. Pour atténuer cet effet, nous prévoyons d'administrer des analgésiques au moins 4 jours après les injections afin d'éviter l'inflammation et la douleur. En ce qui concerne le phénotype de la maladie, aucun signal de douleur ou de lésion n'a été détecté conformément aux caractérisations précédentes. Les tests comportementaux ne provoquent pas de douleur. (4)Liberté d'exprimer un comportement normal : Comme nous mentionné précédemment, le phénotype de la maladie (déficience de la coordination motrice) n'a pas d'impact sur la vie normale des animaux, puisqu'ils peuvent se déplacer, manger et boire normalement tout au long de leur vie, en présentant un comportement normal par rapport aux animaux de contrôle. Le phénotype est simplement constaté à l'aide de tests comportementaux spécifiques. Les tests comportementaux ne modifient pas ces paramètres et la douleur ou l'inconfort éventuels causés par l'injection intracrânienne seront contrôlés par l'application d'analgésiques. (5)Liberté face à la peur et à la détresse : Pour réduire le stress, nous prévoyons d'enrichir l'environnement de chaque cage et de réduire autant que possible le bruit. Les animaux seront surveillés tous les jours et tout signal de stress ou de peur sera signalé. Pour soulager les stress éventuels des tests comportementaux et de la douleur de l'injection intracranienne, une séance d'adaptation sera organisée avant chaque test et des analgésiques seront utilisés.

Devenir

Dans ce projet, les animaux seront étudiés à différents âges afin d’assurer l’étude longitudinale sur un même lot d’animaux. A la toute fin des études, les animaux seront mis à mort pour le prélèvement de tissus.

Remplacement

Comme la maladie présente comme phénotype une perte générale de coordination motrice dans des tests comportementaux spécifiques, il est difficile d'étudier la maladie en utilisant d'autres modèles que ceux de la souris. La reproduction des symptômes ainsi que l'efficacité du traitement peuvent être mieux visualisées sur ce modèle. Toutefois, parallèlement aux tests in vivo, nous allons travailler sur des stratégies in vitro pour contribuer à la découverte de nouveaux mécanismes concernant la maladie, ce qui nous aidera à clarifier et à mieux cibler notre analyse in vivo et peut également nous aider à réduire le nombre d'animaux par rapport à l'étude générale.

Réduction

Toutes les procédures sont conçues pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, tout en tenant compte du nombre minimum nécessaire pour appliquer les tests statistiques adaptés. Les travaux de notre équipe et les données préliminaires nous permettent d’estimer le nombre de souris pour avoir une valeur statistique suffisante (10 souris de même sexe et génotype par condition). Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, autant que possible, nous effectuerons une étude sur un même lot d’animaux à différents âges et les mêmes animaux seront utilisés pour réaliser les différents tests de comportement, les analyses fonctionnelles, histologiques, moléculaires et biochimiques. Pour l'optimisation du promoteur, nous avons choisi de travailler uniquement avec des mâles, sinon, comme nous avons trois vecteurs différents et deux concentrations différentes, l'optimisation utilisant les deux sexes devrait utiliser le double du nombre d'animaux.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans les conditions standard d’hébergement et l’environnement sera enrichi (igloo polycarbonate, rouleau de cellulose,...). Les animaux controles seront hébergés dans les mêmes cages que les animaux atteints. Un accès facilité à l’alimentation et à la boisson sera mis en place en fond de cage. Mesures pour soulager la douleur : Les animaux seront observés quotidiennement et les signaux de douleur seront signalés. Les signaux peuvent inclure : posture voûtée, toilettage réduit et fourrure ébouriffée, niveau réduit d’activité spontanée, consommation réduite de nourriture et d’eau, séparation des compagnons de cage, yeux louches agressivité accrue lors de la manipulation. En présence de ces signaux, la buprénorphine sera administrée et le vétérinaire sera informé pour décider des meilleures solutions. Mesures pour soulager l'anxiété et l'inconfort : En cas d'inconfort ou de signaux d'anxiété tels que : vigilance accrue, freezing et/ou hypoactivité, fréquence cardiaque élevée et consommation alimentaire supprimée, Les animaux présentant ces signaux ne vont pas effectuer les tâches comportementales. Pour les tests comportementaux, nous disposons d'un programme d'adaptation et d'apprentissage préalable. Pour chaque comportement, les animaux seront préalablement adaptés pendant au moins une semaine, à la salle de comportement et aussi à chaque équipement utilisé. Tout au long des procédures, un suivi régulier des animaux sera réalisé. Il nous permettra de s’assurer du bon vieillissement des animaux au fil des mois. Ce suivi est basé sur la mise en place de points limites et méthodes de prise en charge d’éventuel stress et douleur spécifiques à notre projet.

Choix des espèces

AAvec 98% d’identité protéique avec l’Homme, la souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues. Les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d'utiliser des souris génétiquement modifiée est liée à l'absence de modèle mammifère naturel correspondant à la maladie humaine. Par ailleurs, nos données de l’étude du modèle murin KO montrent que ce modèle reproduit les caractéristiques pathologiques nécessaires pour tester des solutions thérapeutiques. Les souris étudiées dans le cadre de l’injection du vecteur seront étudiées de l’âge de 1 mois à l’âge de 11 mois (tests comportementaux) dans la condition pré-symptomatique. Les souris étudiées dans le cadre d’une administration post-symtomatique de l’injection du vecteur seront étudiées de l’âge de 4 mois à l’âge de 14 mois (tests comportementaux). La fenêtre temporelle pour les tests comportementaux est choisie en tenant compte du fait que le phénotype chez les animaux commence à apparaître à 10 semaines et s'aggrave tout au long de la vie. A un mois (dans la condition pré-symptomatique), nous effectuons une séance comportementale pré-symptomatique comme preuve de concept que les animaux sont réellement pré-symptomatiques à ce stade.

À J0, une injection d'iodoacétate de sodium dans l'articulation de la mâchoire, sous anesthésie générale, déclenche l'arthrose. À J60 vient une injection d'hydrogel, à J120 la pose d'une prothèse articulaire au cours d'une chirurgie de deux heures, le tout entrecoupé de trois à quatre scanners exigeant chacun deux heures d'anesthésie. 35 cochons adultes de 40 à 80 kilos traversent ces six mois dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une douleur mandibulaire persistante, une ouverture de bouche réduite, une gêne à la mastication et une perte de poids attendues, le porteur affirmant que ces études sont "indispensables" au dossier de mise sur le marché du dispositif et qu'elles ne peuvent être remplacées ni légalement, ni techniquement, ni éthiquement. Tous sont tués à la fin pour des analyses post-mortem.

Objectifs

Ce projet vise à créer un modèle d'arthrose de l'articulation temporomandibulaire chez le porc en utilisant une substance chimique, appelée iodoacétate de sodium. Ce modèle permettra ensuite de tester un nouveau gel médical contenant un anti-inflammatoire, afin d'en évaluer l'efficacité et la sécurité. Des tests ont déjà été faits sur des rats, avec des résultats encourageants, mais nous voulons maintenant utiliser ce modèle chez le porc, car son articulation temporo-mandibulaire est plus proche de celle des humains, tant en taille qu'en fonctionnement. En parallèle, nous allons tester une nouvelle prothèse innovante par son aspect « mini-invasif » et « sur mesure ». En effet, le concept de cette prothèse est réalisé à partir d’un scanner du patient (ici un notre mini-porc) afin de s’adapté à sa morphologie et ainsi de pouvoir être miniaturisé. Cela permettrait d’avoir une prothèse plus fonctionnelle et une intervention moins lourde. Cette prothèse sera implantée chez les porcs afin de vérifier si elle est bien tolérée par l'organisme et si elle fonctionne correctement. Ce test nous permettra de valider si ce concept peut être utilisé dans le futur chez l'homme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont les suivants : 1. Bénéfices scientifiques : • Création et validation d’un modèle d’ostéoarthrite (OA) chez le porc : Ce modèle d’OA de l’articulation temporomandibulaire (ATM) chez un grand mammifère est essentiel pour le développement de nouveaux dispositifs médicaux avant leur application clinique. La validation de ce modèle va au-delà de l'évaluation de l'hydrogel ou de la prothèse dans ce projet. Elle propose un modèle simple et reproductible d’OA de l’ATM, utilisable pour toute recherche ultérieure, notamment pour tester d'autres dispositifs médicaux dans la prise en charge des dysfonctionnements temporomandibulaires (DTM). • Acquisition de connaissances scientifiques sur l’hydrogel et la prothèse : Cette étude permettra de mieux comprendre l’efficacité de l’hydrogel chitosan/naproxène ainsi que celle de la prothèse "mini-invasive" et "sur mesure" pour l’ATM, développée dans le cadre de ce projet. En fonction des résultats obtenus in vivo, la conception de la prothèse et la formulation de l’hydrogel pourront être ajustées et optimisées. 2. Bénéfices cliniques : • Validation de l’hydrogel et de la prothèse : En validant l’efficacité de l’hydrogel chitosan/naproxène et la biocompatibilité de la prothèse "mini-invasive" et "sur mesure" pour l’ATM, ces dispositifs médicaux ont des implications cliniques potentielles importantes. Ils pourraient représenter des avancées significatives dans la prise en charge des DTM, en réduisant la douleur et en restaurant la fonction de l’appareil manducateur. • Perspectives de recherche clinique : Des résultats concluants obtenus sur grand mammifère concernant l'hydrogel pourraient ouvrir la voie à des essais cliniques à moyen terme, permettant ainsi de tester ces avancées directement sur l'homme.

Procédures

Pour la réalisation du projet, les animaux subiront quatre types d'interventions distinctes : 1. Scanners (3 scanners par animal sur 6 mois) : o Cette intervention est peu invasive et consiste en la réalisation de quatre scanners au total. o Le premier scanner sert de référence et sera utilisé comme comparateur (uniquement pour les animaux faisant parti du groupe induction du modèle). o Le deuxième scanner a pour but de confirmer la bonne induction de l'ostéoarthrite et sert de comparateur pour l’évaluation de l’hydrogel. o Le troisième scanner sera utilisé pour évaluer l’efficacité de l’hydrogel dans la deuxième procédure (uniquement pour les animaux faisant parti du groupe évaluation hydrogel). o Le quatrième scanner est réalisé pour vérifier la bonne ostéointégration de la prothèse. o Chaque scanner nécessite le transport de l’animal sous anesthésie générale jusqu’à l’appareil, suivi de l'acquisition des images. La durée totale de la procédure est d’environ 2 heures. 2. Injection de MIA : o Cette intervention vise à induire le modèle d’ostéoarthrite (OA) par une injection de iodoacétate monosodique (MIA) sous anesthésie générale. o Il s'agit d'une procédure peu invasive, réalisée par voie percutanée à J0. o La durée totale de la procédure est d'environ 30 minutes. 3. Injection de l'hydrogel (uniquement pour les animaux faisant parti du groupe évaluation hydrogel) : o Sous anesthésie générale, cette intervention permet d'évaluer la performance de l'hydrogel médical par une injection percutanée à J60. o Cette procédure, également peu invasive, est réalisée en une seule fois. o L’ensemble de la procédure dure environ 30 minutes. 4. Pose de la prothèse : o Cette procédure, réalisée sous anesthésie générale, est plus invasive. Elle consiste en la pose d’une prothèse articulaire. o En raison de son caractère invasif, les animaux bénéficieront d’un traitement analgésique ainsi que d'une antibiothérapie. o Cette intervention est réalisée à J120 et dure environ 2 heures.

Impact sur les animaux

Le projet présente plusieurs nuisances et effets indésirables potentiels, principalement liés à l’induction du modèle d’ostéoarthrite et à la chirurgie prothétique. Les principaux effets indésirables sont les suivants : • Douleur persistante au niveau de l'articulation temporomandibulaire (ATM) : La douleur, généralement légère, est due à l'inflammation initiale provoquée par l'injection intra-articulaire de MIA, suivie du développement de l'arthrose débutante. Cette douleur pourrait persister au fil du temps, en lien avec la progression du modèle d’ostéoarthrite. • Limitation des amplitudes mandibulaires : Une diminution de l'amplitude de l'ouverture buccale est attendue, en raison de l’inflammation et de la progression de l’ostéoarthrite, ce qui affecte la mobilité mandibulaire des animaux. • Perte de poids : Plusieurs facteurs peuvent contribuer à une perte de poids, notamment le stress expérimental, la limitation des amplitudes mandibulaires et la douleur à la mastication, qui pourrait affecter l'alimentation des animaux. • Complications per-opératoires lors de la pose de la prothèse (ces complications ne sont pas attendues mais possible) : o Perte sanguine : Les saignements per-opératoires sont possibles durant la chirurgie, en raison de la nature invasive de l’intervention. o Complications anesthésiques : Des complications respiratoires ou vasculaires liées à l’anesthésie générale pourraient survenir pendant la pose de la prothèse. • Complications post-opératoires suite à la pose de la prothèse (ces complications ne sont pas attendues mais possible) : o Infection et hyperthermie : Une infection au niveau de la zone opérée pourrait entraîner de la fièvre (hyperthermie) chez les animaux. o Désunion de la cicatrice pré-tragienne : Une mauvaise cicatrisation ou une désunion de la cicatrice au niveau de la zone pré-tragienne peut également constituer une complication post-opératoire.

Devenir

A la fin de la procédure, l’ensemble des animaux sont euthanasiés pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Cette étude porte sur le développement préclinique de dispositifs médicaux destinés à l'articulation temporomandibulaire (ATM) dans la prise en charge des dysfonctionnements temporomandibulaires (DTM). Ces études animales sont indispensables pour constituer le dossier de demande d'autorisation de mise sur le marché (AMM) du futur dispositif médical et ne peuvent être remplacées légalement, techniquement ou éthiquement par d'autres méthodes (tests in vitro, essais cliniques, etc.). Le modèle porcin est le plus approprié et couramment utilisé dans le cadre de l'ostéoarthrite en raison de la similitude anatomique avec l'homme, permettant ainsi une transposition fiable des résultats. De plus, les caractéristiques fonctionnelles et mécaniques de l'ATM du porc sont proches de celles de l'humain. Les tests préliminaires effectués sur des petits animaux pour l'hydrogel ont montré qu'ils ne peuvent se substituer aux études sur les grands mammifères, et la pose de prothèse ne peut techniquement pas être réalisée sur de petits animaux à cause de leur taille.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires a été optimisé. Ainsi, les 35 animaux utilisés pour la création du modèle ou pour tester l’hydrogel seront également réutilisés lors de la pose de la prothèse. Cependant, il est prévu d’interrompre la dernière étape (étape 3) dès que la validation de la prothèse est obtenue chez 6 animaux consécutifs. La validation de la prothèse est considérée acquise lorsqu'elle respecte les réglementations européennes en matière de mise sur le marché des dispositifs médicaux (Règlement (UE) 2017/745 relatif aux dispositifs médicaux). De plus, avant les expérimentations sur les porcs, les hydrogels ont été testés chez des rats, permettant ainsi de sélectionner les meilleurs hydrogel-candidats. Cette approche préliminaire a permis de ne retenir que les formulations les plus prometteuses, réduisant ainsi le nombre de porcs nécessaires aux tests, car seules les versions les plus performantes seront évaluées. Des moyens d’évaluation peu invasifs de l’OA, tels que le scanner ou l’examen clinique, seront utilisés afin de limiter le nombre d’animaux sacrifiés pour les analyses histologiques intermédiaires. Le nombre d’animaux du groupe témoin négatif a également été réduit, car la littérature a validé l’utilisation de sérum physiologique comme contrôle. Pour limiter le nombre d'essais par animal, la prothèse a été créée par Conception Assistée par Ordinateur (CAO), suivie d’un prototypage et réalisation d'essais mécaniques expérimentaux, permettant d'obtenir rapidement un modèle performant et adapté limitant une expérimentation animale « empirique ». Cette simulation numérique, associée à l’expertise d’une équipe chirurgicale expérimentée dans le domaine, nous permet d’optimiser les résultats attendus et de réduire encore le nombre d’animaux nécessaires, en limitant les risques d’échec lors des premières expérimentations. Le nombre d'animaux dans le groupe contrôle a été réduit, car la littérature valide l'utilisation de sérum physiologique comme contrôle. De plus, les études sur petits animaux (rats) menées sous le protocole Apafis 25897 ont permis de sélectionner les matériaux optimaux, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires pour les études chez le porc. Après euthanasie, des tissus pourront être prélevés par des utilisateurs du site pour leurs travaux nécessitant du matériel biologique porcin.

Raffinement

Le principe de raffinement sera appliqué à travers plusieurs mesures visant à améliorer le bien-être des animaux tout en garantissant la qualité des données expérimentales : • Conditions de vie optimales : Les animaux seront logés à deux par box pour leur bien-être, dans une salle à flux d’air contrôlé. Bien qu'aucune modification alimentaire ne soit prévue pendant l'induction du modèle, une attention particulière sera portée à leur capacité à s'alimenter correctement. En cas de fortes chaleurs, un glaçon enrichi sera mis à leur disposition dans le box. Une période d’acclimatation de 10 jours sera observée pour habituer les porcs aux manipulations et à la présence des soignants. • Intervention sous anesthésie générale : Toutes les interventions (injections intra-articulaires, mesures de l'ouverture buccale, scanners, pose de prothèse) seront réalisées sous anesthésie générale, précédées d'une prémédication. Lors des interventions chirurgicales, des protocoles stricts d'asepsie seront suivis pour minimiser les risques d'infection post-opératoire. • Surveillance du bien-être des animaux : Plusieurs indicateurs seront surveillés pour s'assurer du bien-être des porcs : o Poids : Le poids sera mesuré quotidiennement les jours post-opératoires, puis une fois par semaine après chaque intervention (induction et pose de la prothèse). o Température corporelle : La température sera mesurée quotidiennement en post-opératoire pour détecter toute hyperthermie, signe potentiel d’infection post-opératoire. o Plaie post-opératoire : La plaie chirurgicale sera examinée quotidiennement durant les 7 premiers jours post-opératoires, pour surveiller la présence de désunion, de saignement ou d'hématome. o Analyse comportementale : Une observation régulière du comportement des animaux sera effectuée, avec une attention particulière portée à la posture, la sociabilité et la déambulation, pour détecter tout signe de détresse ou de souffrance.

Choix des espèces

Le porc a été choisi comme modèle animal de référence pour cette étude. Parmi les grands mammifères, il est le plus couramment étudié dans le cadre de l’ostéoarthrite temporomandibulaire, en raison de sa proximité anatomique et histologique avec l'homme, permettant ainsi une transposition fiable des résultats vers l'application clinique chez l'humain. De plus, l'articulation temporomandibulaire (ATM) du porc présente des similarités fonctionnelles et mécaniques importantes avec celle de l'être humain, ce qui en fait un modèle pertinent pour les études sur les dispositifs médicaux liés aux dysfonctionnements temporomandibulaires (DTM). Les modèles murins, bien qu’utiles dans d’autres types d’études, sont jugés trop petits pour la pose d'une prothèse de l’ATM. En conséquence, ils ne sont pas adaptés pour obtenir des données transférables à l’homme dans ce contexte. L'utilisation de brebis a été envisagée, mais ce modèle présente plusieurs inconvénients, notamment un manque de données préexistantes et une fragilité apparente lors des expérimentations périmandibulaires, difficultés partagées par l'équipe de la plateforme d'expérimentation animale. Les porcs seront utilisés à l’âge adulte, avec un poids situé entre 40 et 80 kg. Cela garantit que l’articulation est pleinement mature et que la croissance est terminée, évitant ainsi des biais dans les résultats liés à des modifications anatomiques dues à la croissance.

2 680 souris et 2 680 rats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une surcharge d'hormones androgènes leur est administrée chaque jour pendant une à vingt-quatre semaines, par voie orale, par injection ou par implant sous-cutané à libération prolongée, pour reproduire un syndrome des ovaires polykystiques. Les femelles subissent en plus un frottis vaginal quotidien pendant quatorze à vingt-huit jours consécutifs, des prélèvements de sang et d'urine hebdomadaires, et pour certaines une mise à l'accouplement de deux semaines suivie d'une gestation menée à terme. Provoquer l'infertilité ne devrait pas, selon le porteur, entraîner d'autres effets indésirables, et tous les animaux seront tués parce que le prélèvement des ovaires est jugé "indispensable" pour établir l'effet d'un traitement.

Objectifs

Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) est la maladie hormonale la plus fréquente chez les femmes en âge de procréer, touchant environ une femme sur dix dans le monde. Il se caractérise par un dérèglement hormonal, une production excessive d’androgènes (comme la testostérone), des règles irrégulières et la formation de follicules inachevés dans les ovaires. Le SOPK est l’une des principales causes d’infertilité. L’origine du SOPK n’est pas clairement identifiée, mais elle est probablement multifactorielle (génétique, épigénétique, environnementale). Un lien est souvent rapporté entre l’excès d’androgènes, la résistance à l’insuline et l’obésité, avec environ 35 à 50 % des patientes avec un SOPK qui sont obèses. Les symptômes varient selon les personnes : pilosité excessive, perte de cheveux, acné, règles irrégulières ou absentes. Ces symptômes évoluent avec l’âge, l’hypersécrétion des androgènes aggravant la résistance à l’insuline. Le SOPK augmente aussi le risque de syndrome métabolique (surpoids, dyslipidémie, hypertension, troubles de la glycémie), conduisant à l’insulinorésistance, au diabète de type 2 et aux maladies cardiovasculaires. Il accroît également le risque de cancer de l’endomètre. Le SOPK est une maladie chronique, et actuellement incurable. La prise en charge des patientes vise à améliorer les symptômes par des changements de mode de vie et ou des traitements médicamenteux. La recherche médicale est donc très active, cherchant à comprendre les dysfonctionnements et à développer de nouveaux traitements, notamment des traitements curatifs. Des modèles animaux de SOPK sont décrits dans la littérature, principalement chez les rongeurs. Ceux-ci sont développés via des modifications génétiques, des manipulations environnementales (exposition au stress ou lumière constante) ou l’induction de taux élevés d’hormones sexuelles, parfois combinée à l’induction du diabète (lignée de rongeurs diabétiques ou alimentation riche en graisses (type Western ou High-fat-diet, HFD). Ce projet vise à développer des modèles animaux de SOPK spontané (certaine souche de rat) ou induit par surcharge androgénique, afin de mieux comprendre la physiopathologie du SOPK et de contribuer à la recherche de nouveaux traitements, curatifs ou symptomatiques. Ces modèles animaux chez les rongeurs sont décrits comme mimant le SOPK chez la femme, et répondant aux critères diagnostic de la maladie (critères de Rotterdam).

Bénéfices attendus

Selon l’Organisation mondiale de la santé, le SOPK est un problème de santé publique important et l’un des troubles hormonaux les plus courants chez les femmes en âge de procréer. La maladie touche environ 8 à 13 % des femmes en âge de procréer. Les effets biologiques et psychologiques du SOPK, en particulier ceux liés à l’obésité, à l’image du corps et à l’infertilité, peuvent entraîner des problèmes de santé mentale et une stigmatisation sociale. D’après l’Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm, dossiers SOPK), un des enjeux de la recherche sur le SOPK est le développement de nouveaux traitements qui permettraient de résoudre toutes les complications à la fois, en s’attaquant à la cause du problème et non à chacun des symptômes séparément. Ce projet de recherche permettrait la mise en place d’un modèle robuste et valide de SOPK chez le rat et la souris. Ensuite, l’évaluation de nouveaux traitements du SOPK sur ces modèles animaux, donc une preuve de concept préclinique, avant les essais chez l’homme.

Procédures

Pour l’induction du SOPK, les animaux vont recevoir un traitement par des hormones sexuelles ou autres molécules entraînant un déséquilibre hormonal. Ce sera une administration par jour par voie orale ou parentérale, ou via un dispositif sous-cutané permettant une libération prolongée, pendant 1 à 24 semaines. En plus, les animaux vont aussi recevoir une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à analyser, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et d’une molécule de référence. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour pendant 1 à 24 semaines). Des frottis vaginaux seront réalisés chez les animaux, une fois avant le début des traitements, puis une fois par jour pendant au moins 14 jours consécutifs (28 jours au maximum) afin de déterminer la présence de SOPK. Un test de fertilité par accouplement peut être réalisé afin d’observer le déroulement de la gestation. Les femelles seront mis en accouplement pendant 2 semaines au maximum et la gestation sera mené à terme (environ 3 semaines). Enfin, si le protocole le requiert, des prélèvements de sang et d’urines pourront être envisagés jusqu’à une fois par semaine pendant la durée de l’étude. Chaque prélèvement, réalisé par des personnels tutorés, durera moins de 3 minutes

Impact sur les animaux

L’administration des composés, la réalisation des frottis vaginaux et les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress et/ou une sensation d’inconfort passager chez les animaux. L’excès d’hormones androgènes et la formation des petites follicules ovariens immatures entraîneraient une infertilité mais ne devraient pas provoquer d’autres effets indésirables chez les animaux. Le test d'accouplement peut engendrer un léger stress et anxiété au début, lors de l'acclimatation avec le mâle.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure. En effet, un prélèvement des ovaires est indispensable pour mettre en évidence le SOPK et l’efficacité ou non d’un traitement.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant d’évaluer l’efficacité d’un principe actif sur le SOPK. En effet, le syndrome est le résultat d’un ensemble de désordres hormonaux et tissulaires, faisant appel à l’axe hypothalamo-hypophysaire et atteignant en même temps le cerveau et les organes.

Réduction

La réalisation des études se fera de façon à limiter le plus possible le nombre d’animaux utilisés. Une étude pilote sera réalisée pour la validation du modèle. L’évaluation d’un nouveau traitement se fera seulement lorsqu’un modèle robuste et valide sera obtenu. Comme utilisé par les autres équipes de recherche dans la littérature, le nombre d’animaux par groupe sera entre 5 et 8 au début du projet. Ce nombre sera ensuite affiné après la récolte des premières données avec des tests statistiques. Si un test d’accouplement est réalisé, les rats mâles seront réutilisés dans la mesure du possible afin de limiter leur nombre. Une réduction du nombre d’animaux en testant 2 composés à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence. Des tests statistiques seront aussi réalisés pour comparer les paramètres mesurés dans les groupes d’animaux étudiés. Pour une petite population, le t-test non apparié sera utilisé pour les comparaisons 2 à 2 et une analyse de variance à 1 ou 2 facteurs pour les comparaisons multiples.

Raffinement

Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible. Les animaux sont hébergés en groupe dans les cages (2 rats et jusqu’à 5 souris) afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un suivi quotidien de tous les rats sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Des points limites adaptés ont été fixés pour la réalisation du projet. L’atteinte d’un point limite sera signalé par le zootechnicien à un responsable des soins et au responsable du projet. Le cas échéant, si les symptômes sont réversibles, l’animal sera sorti de l’expérience et des procédures de soins peuvent être mis en place avant une éventuelle ré-inclusion dans l’étude. Si les symptômes sont irréversibles, l’animal sera euthanasié. Toute décision (sortie de la procédure en cours, soins ou euthanasie) sera prise en concertation avec le responsable du projet, le vétérinaire référent, et/ou le responsable de la structure du bien-être animal (SBEA) et/ou le responsable de la plateforme animalerie.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les rongeurs, que ce soit le rat ou la souris, sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche dans les modèles de SOPK. En effet, les rongeurs ont aussi un axe hypothalamo-hypophysaire qui régule le taux hormonal, qui est essentiel dans l’étiologie du SOPK. Malgré l’absence de menstruation chez la femelle, le suivi du cycle œstral permet d’observer une perturbation de l’ovulation. De plus, le cycle oestral dure seulement 4 à 5 jours chez les rongeurs, permettant d’observer rapidement une perturbation ou l’efficacité d’un traitement. Les animaux seront utilisés à l’âge prépubère (3-4 semaines d’âge) ou à l’âge adulte. En effet, il a été décrit que l’excès d’hormones androgènes à l’âge prépubère, voire intra-utérin, reproduirait mieux les symptômes du SOPK qu’à l’âge adulte.

Une greffe de cellules tumorales directement dans le pancréas ou dans la rate, opération de dix minutes, ouvre le protocole pour chacune des 880 souris utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements terminaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent quatre semaines de traitement, à raison de deux injections intrapéritonéales par semaine, pour mesurer l'effet d'une chimiothérapie associée à un inhibiteur de la réparation de l'ADN sur des métastases hépatiques. L'efficacité de cette association a déjà été montrée in vitro et sur deux modèles murins de tumeurs sous-cutanées, ce qui n'empêche pas de recommencer en greffe orthotopique. Le porteur justifie l'effectif par une variabilité de prise de greffe qui impose des groupes de dix animaux, sans expliquer comment on passe de dix à 880.

Objectifs

Le cancer du pancréas est un cancer digestif diagnostiqué à un stade avancé avec un des plus mauvais pronostics, moins de 8% des patients survivent au-delà de 5 ans. Au moment du diagnostic, 80% des patients ont déjà des métastases, rendant la chirurgie impossible. Actuellement, très peu de thérapies sont proposées. De plus, ce cancer résiste à la chimiothérapie. Ces échecs peuvent être expliqués par les caractéristiques de la maladie ainsi que par le manque de biomarqueur permettant la sélection des patients traités. Pour augmenter les chances de survie des patients, de nouvelles thérapies plus ciblées sont en développement. C’est dans ce contexte que nous avons montré un très fort effet anti-cancéreux de l’association de médicaments existants avec ces nouvelles molécules ciblées. Il s’agit maintenant d’évaluer la thérapie in vivo.

Bénéfices attendus

Il a déjà été démontré in vitro l’efficacité de l’association d'un chimiothérapeutique avec un inhibiteur spécifique de la réparation des lésions de l'ADN, dans différents modèles de cancer du pancréas et ceci à de faible dose de drogue. Cette synergie a aussi été démontré dans 1 modèle de souris immuno-déprimé et 1 modèle de souris compétentes sur des tumeurs sous-cutanées. Il s'agit maintenant d'étudier à la fois l'efficacité du traitement sur le même modèle immunocompétent mais en greffe orthotopique, ainsi que sur les métastases hépatiques obtenus lors de greffe intrasplénique, et de mettre en évidence les mécanismes immunitaires impliqués dans la réponse.

Procédures

Tous les animaux subiront une procédure chirurgicale d'environ 10 minutes par animal. Les traitements se déroulent sur 4 semaines à raison de deux injections intrapéritonéales par semaine (d'une durée d'une trentaine de secondes environ).

Impact sur les animaux

Effets indésirables directs : - douleur associée à une injection intra péritonéale lors des traitements ou lors de l'implantation de cellules en intra-pancréatique. Effets indésirables indirects, conséquence des produits injectés : - croissance tumorale - perte de poids. Les nuisances qui pourront être engendrées par la croissance tumorale chez ces animaux seront parfaitement surveillées et maîtrisées afin de limiter toute souffrance animale. Concernant les traitements, de nombreuses études ayant déjà été élaborées, les doses administrées aux animaux sont maîtrisées et de ce fait aucun effet indésirable dû au traitement est attendu.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements terminaux.

Remplacement

Il n’existe pas encore de vrai modèle in vitro reproduisant la complexité de la tumeur et permettant de déterminer l'efficacité thérapeutique d'un traitement. En revanche on assiste à une transition des modèles cellulaires en 2 dimensions vers des modèles cellulaires en 3 dimensions, les organoïdes, qui reproduisent un peu plus fidèlement l’environnement humain in vivo. L’utilisation d’organoïdes est encore très complexe et ne permet pas encore de se passer d'expérimentation in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat. L’analyse statistique sera réalisée en collaboration avec une unité de biométrie. Les différentes analyses statistiques seront réalisées à l’aide d’un logiciel. D’après nos expériences précédentes et la littérature, la variabilité de prise de greffe nécessite des groupes de 10 animaux

Raffinement

La première mesure prise afin de limiter le stress chez nos animaux est une semaine de stabulation à leur arrivée sur la plateforme, ceci afin de les habituer à leurs nouvelles conditions d'hébergement. Le milieu est enrichi à l’aide de litière mélangée à des copeaux, ainsi que de briques de peuplier et dôme en plastique opaque. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Une grille de scoring ayant été établie, tous les soins nécessaires pour apaiser le stress ou la douleur seront mis en place, jusqu’à l’euthanasie si besoin.

Choix des espèces

L’étude de l’effet des thérapies des modèles possédant un système immunitaire demande l’utilisation de souris immunocompétentes greffées avec une tumeur murine. Age 6-7 semaines, âge ou l’on observe une forte incidence de prise de greffe et une forte homogénéité.