Recherche appliquée

Un sérum toxique pour le rein, obtenu en immunisant des moutons contre des composants du glomérule de souris, est injecté sous anesthésie à toutes les souris du projet. 760 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, avec selon les protocoles un gavage ou une injection quotidienne pendant dix à quatorze jours et un recueil d'urine deux fois par semaine. Il s'agit de tester si l'inhibition d'une protéine de stress freine la formation des croissants cellulaires qui détruisent le filtre du rein. Le porteur décrit une prise de poids par ascite et par œdèmes après l'injection du sérum, puis conclut que les protocoles sont "relativement courts" et qu'il ne devrait pas observer de complications trop sévères.

Objectifs

Les maladies rénales affectent dix pour cent de la population mondiale avec une incidence croissante et elles représentent de nos jours un véritable enjeu de santé publique. Si ces maladies ne sont pas prises en charge, elles peuvent aboutir à une insuffisance rénale terminale (IRCT). L'IRCT est associée à une importante mortalité cardiovasculaire et à un coût élevé pour la société (environ 4 milliards d'euros par an en France). L'une des causes les plus sévère d'IRCT sont les glomérulonéphrites extracapillaires (GEC). Les GEC sont associées à une prolifération anormale de cellules rénales : les cellules épithéliales pariétales formant un "croissant" cellulaire dans le glomérule, unité de filtration du rein. Des données suggèrent l'implication des protéines de stress dans le développement de ces croissants. Il a été démontré que l'une de ces protéines de stress aurait un rôle délétère dans la GEC faisant de cette protéine une cible thérapeutique potentielle. Le principal modèle murin de GEC est caractérisé par l'injection d'un sérum toxique pour les reins (sérum obtenu après immunisation de mouton contre des composants du glomérule de la souris). Dans ce modèle, les animaux développent une atteinte rénale rapide dès le dixième jour, caractérisée par des lésions de croissants (reproduisant les caractéristiques histologiques et fonctionnelles des GEC humaines). Pour préciser le rôle in vivo de cette protéine de stress et l'intérêt thérapeutique éventuel de son inhibition, nous nous sommes fixés plusieurs objectifs : 1/ Etude de l'expression de la protéine de stress au cours du développement de la GEC expérimentale pour affiner le rôle in vivo de cette dernière 2/ Inhibition pharmacologique de la protéine à visée thérapeutique 3/Inhibition génétique de la protéine de stress dans plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées pour déterminer quelles cellules rénales sont impliquées dans la signalisation de cette protéine.

Bénéfices attendus

Les maladies glomérulaires représentent la première cause d'insuffisance rénale terminale. Le développement de thérapies ciblées agissant spécifiquement sur les cellules épithéliales glomérulaires (cellules locales) est donc essentiel afin de contrôler ces maladies glomérulaires. Ces travaux pourraient permettre de proposer la protéine de stress (étant déjà la cible de différents traitements) comme une cible thérapeutique prometteuse dans diverses maladies glomérulaires rénales. Comme nos premiers résultats l'indiquent, cette protéine pourrait être impliquée dans le développement de pathLaologies dévastatrices comme la glomérulonéphrite extracapillaire (GEC) aboutissant dans la majorité des cas à l'apparition d'une Insuffisance Rénale Chronique (IRC). De nos jours, l'insuffisance rénale chronique à des conséquences socio-économiques majeures. Son traitement représente l'un des couts les plus importants du budget de la santé pour une petite fraction de la population : il est urgent de disposer de davantage de biomarqueurs et de cibles thérapeutiques. De plus, actuellement, le traitement de la GEC repose principalement sur une thérapie qui a des effets nefastes importants pour les patients concernés. Ce projet a l'ambition de proposer des stratégies thérapeutiques inhibant les mécanismes physiopathologiques clés impliqués dans le développement des croissants.

Procédures

(1) Tous les animaux recevront une injection de sérum sous anesthésie environ 3 minutes par souris sur un plateau thermostaté à 37degrés. (2) Pour les protocoles, certains animaux recevront un gavage par jour sur les périodes de traitement soit dix jours ou quatorze jours sur animal vigile,environ 1 minutes par souris. (3) Pour un autre protocole, certains animaux recevront une injection d'un traitement soit dix jours ou quatorze jours sur animal vigile,environ 1 minute par souris. (4) L'ensemble des souris auront un recueil des urines pendant le protocole deux fois par semaines environ 1 minute par souris. (5) Prélèvement de sang sous anesthésie et analgésie (1 minute environ/souris).

Impact sur les animaux

Le stress et la douleur peuvent être générés par : 1.les différentes injections des medicaments. Les douleurs liées aux injections seront de courte durée mais les animaux peuvent developper une inflammation et un stress lors de la contention pour la bonne administration. 2. Les manipulations quotidiennes en particulier pour les pesées et les spots urinaires. Les animaux peuvent developper un stress lors de la contention pour le recueil d'urines quand elle est nécéssaire. 3. Les complications associées au modèle murin. Suite à l'injection du sérum toxique pour le rein, les animaux peuvent prendre du poids en raison de l'ascite et des oedemes développés lors de la mise en place des lésions rénales. 4. Complications liées à l'anesthésie au moment de l'euthanasie (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique). Les protocoles mis en place dans le projet sont relativement cours, nous ne devrions pas observer de complications trop sévères pour les reins (perte de poids, baisse de la température corporelle).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Remplacement

En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs est la fonction rénale, qui doit être mesurée par le dosage de la concentration plasmatique de créatinine et d'urée.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter-individuelle du phénotype étudié (lésions tissulaires rénales) dans nos deux modèles d'insuffisance rénale aigue. Des lots de 10 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux est de 760 souris. De plus, nous utiliserons des tests statitiques adaptés.

Raffinement

Les nuisances pour les animaux seront réduites au maximum grâce à l’application de mesures de raffinement appropriées. Avant le début de la procédure, les animaux seront acclimatés dans l’animalerie pendant au moins une semaine afin de les préparer à leur environnement. Leur bien-être sera assuré par un enrichissement optimal de leur environnement, comprenant une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments de tailles différentes. Cette litière, initialement compacte, sera décompactée par les animaux eux-mêmes. Des morceaux de bois à ronger et un dôme refuge en cellulose seront fournis dans chaque cage, offrant aux animaux des éléments pour explorer et se cacher, contribuant ainsi à leur confort. La gestion de la douleur sera une priorité, avec l’utilisation de méthodes d’analgésie et d’anesthésie adaptées pour minimiser toute souffrance. Des points limites ont été définis pour assurer une surveillance stricte du bien-être des animaux tout au long de l’expérience. Afin de garantir leur état de santé optimal, une surveillance quotidienne de leur aspect physique et du poids des animaux sera effectuée par le personnel qualifié de l'animalerie ou les responsables du projet. Les animaux seront hébergés dans des conditions strictement conformes à la réglementation en vigueur. Chaque cage contiendra un maximum de cinq animaux, et l’animalerie respectera des conditions de température, d’humidité et de renouvellement de l’air rigoureuses conformément à la réglementation en vigueur.Enfin, pour la mesure de certains paramètres, des efforts seront faits pour réduire au maximum le stress lié à la contention, garantissant ainsi le bien-être des animaux tout au long de la procédure

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans cette étude est bien maîtrisé par le personnel du laboratoire, qui possède une grande expérience avec cette espèce. De plus, de nombreuses données relatives à ce modèle sont déjà disponibles dans la littérature scientifique, ce qui en fait un choix particulièrement pertinent, surtout en comparaison avec d'autres espèces. Cette étude bénéficie également de la possibilité de tester l'implication de voies de signalisation spécifiques à certaines cellules, grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Les animaux sélectionnés pour cette étude seront à un stade adulte, entre 8 et 10 semaines. À cet âge, ils possèdent un système glomérulaire mature, tout en ne présentant pas encore de lésions dues au vieillissement, ce qui garantit des résultats plus fiables et représentatifs.

Trente et un prélèvements sanguins, neuf administrations sur chaise de contention d'environ quarante minutes, douze mois de régime riche en gras et en cholestérol : 16 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour que leurs artères soient prélevées. Il s'agit de tester si un candidat médicament réduit la plaque d'athérome. Une étude préliminaire du même établissement avait provoqué des fèces liquides abondantes et une insuffisance rénale aiguë chez trois animaux soumis au régime athérogène, ce qui a conduit à en changer la composition. Le porteur justifie le choix de l'espèce par sa proximité phylogénétique avec l'humain et par le fait que ce sont des "animaux facilement manipulables".

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’évaluer la capacité d’un candidat médicament à réduire la taille des plaques d’athérome dans un modèle physiopathologique d’athérosclérose précoce induit par l’alimentation chez le primate non humain

Bénéfices attendus

Les traitements actuels de l’athérosclérose sont capables de réduire efficacement le taux de cholestérol pour atteindre les niveaux recommandés par les lignes directrices. Cependant, ces traitements ne semblent pas efficaces pour diminuer la plaque d’athérome et des événements cardiovasculaires indésirables majeurs surviennent encore fréquemment. L’objectif de la molécule d’intérêt est de réduire rapidement et considérablement la plaque d'athérome dans les artères et donc de diminuer les événements cardiovasculaires chez l’homme.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux suivront un régime riche en gras et en cholestérol pendant 12 mois leur permettant de développer des plaques d’athéromes similaires à celles observées chez l’homme. L’évolution de la taille des plaques sera suivie par imagerie par résonnance magnétique chez des animaux anesthésiés. Deux sessions d'imagerie d'environ 1h seront réalisées. Pour cela le animaux seront mis à jeun la veille sur une durée n'exédant pas 16h. Tous les animaux recevront ensuite, à neuf reprises, un candidat médicament ou le contrôle. Les animaux seront vigiles lors des administrations. sessions d'imageries L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Les animaux bénéficieront d’une période de repos d’une semaine entre les administrations. Trente-un prélèvements sanguins par animal seront réalisés sur toute la durée du projet (temps de contention : environ 5minutes). Les animaux seront vigiles mais une sédation pourra être envisagée en cas de besoin. Des récoltes d’urine individuelles seront réalisées à intervalles de temps définis (1 fois tous les 2 mois pendant les 18 premiers mois puis 4 fois par semaine pendant les 8 dernières semaines). Ces collectes seront réalisées dans les modules d’isolement de manière non invasive. Durant toute la durée de la récolte (environ 4h), l’animal sera physiquement isolé de son groupe mais gardera un contact olfactif, visuel et sonore avec ses congénères. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les publications concernant l’induction du modèle d’athérosclérose chez le singe par l’alimentation riche en gras et en cholestérol ne montrent pas d’effet néfastes sur les animaux après plusieurs mois. En revanche, un régime hyperlipidique et riche en cholestérol est susceptible dans de très rare cas d’augmenter le risque d’infarctus. Bien que non décrit par le fournisseur, ce nouveau régime pourrait également créer un inconfort intestinal au cours des premières semaines ainsi que l’apparition de diarrhées. Les IRM seront réalisées chez les animaux anesthésiés. Pour cela une mise à jeun de moins de 16h sera effectuée la veille ou le jour des manipulations, et pourra engendrer un stress et un inconfort. La réalisation de prélèvements sanguins pourra également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction. La collecte d’urine pourra induire un stress et un inconfort car les animaux seront isolés dans le module pendant le temps de la récolte (environ 4 heures). Le contact visuel et olfactif avec les congénères sera gardé. Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les animaux auront accès à de l’eau et des friandises durant la manipulation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes d’intérêt (artères) et de confirmer l’absence de toxicité du traitement sur les autres organes.

Remplacement

La formation des plaques d’athérome est un processus complexe impliquant de nombreux phénomènes physiologiques. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex : in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 16 primates. Il a été réduit au minimum afin de tout de même obtenir des résultats fiables et interprétables. Afin de pouvoir répondre à l’objectif du projet, le nombre minimum d’animaux par groupe a été évalué à 7 par groupe (issues d’étude préliminaires sur d’autres modèles - données non publiées). Cette évaluation prend en compte la variabilité qu’il existe lors de l’induction des plaques d’athérome ainsi que la variabilité de réponse au traitement. Afin de pouvoir différentier les bénéfices liés au traitement des bénéficies liés à l’arrêt de l’alimentation riche en gras et cholestérol, un groupe contrôle de même taille sera nécessaire. Aussi, la mise en place du modèle d’athérosclérose précoce est longue et il existe un risque de perdre un ou deux animaux en cours d’étude (blessures sévères, pathologies sévères…), c’est pourquoi 2 animaux ont été ajoutés.

Raffinement

Bien que les animaux soient déjà acclimatés à l’environnement et aux manipulateurs plusieurs mois avant l’étude, une période d'habituation spécifique au projet, associée à du renforcement positif, sera mise en place avant le début de l’étude afin d’habituer les animaux aux manipulations et gestes techniques de l’étude (prise de sang, de température rectale, chaise à contention). Afin de faciliter le changement d’alimentation, l’alimentation riche en gras et en cholestérol sera introduite progressivement pendant 2 semaines afin que les animaux s’adaptent au nouveau régime. Afin de faciliter leur appétit et de maintenir l’intérêt des animaux pour la nourriture, la formulation de l’aliment riche en gras inclut un arome cacahuète. Cet arome pourra être changé au besoin. Une étude préliminaire réalisée au sein de l’établissement utilisateur avait mis en évidence la présence de fèces liquides abondantes ainsi qu’une insuffisance rénale aigüe chez trois animaux ayant suivi le régime athérogène. Afin de ne pas reproduire ces évènements, le fournisseur et la composition de l’aliment ont été changés et un travail sur la qualité de l’aliment a été réalisé : l’aliment fourni pour ce projet sera plus riche en fibre avec des fibres d’origine plus variées (incluant de l’inuline, fibre soluble fermentée par les bactéries présentes au sein du microbiote intestinal). Il sera également composé de moins de sucre et moins de cholestérol. Aucun évènement indésirable n’a été observé par le fournisseur avec ce type d’alimentation. Des points limites précoces ont été définis afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.

Choix des espèces

Le singe développe spontanément des lésions d’athérosclérose aortiques et coronaires sur plusieurs années, voire plusieurs décennies et est sensible aux régimes athérogènes. Le macaque cynomolgus présente des lésions d’athérosclérose comparables à l’homme au niveau anatomo-pathologique. De plus, le candidat médicament étudié dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, le primate non humain a été retenu dans le cadre de ce projet. En effet, les PNH partagent de nombreuses similitudes avec l'Homme et notamment une homologie de séquence de la cible thérapeutique permettant d’évaluer le candidat médicament. Par conséquent, les données obtenues avec ce modèle sont communément les plus prédictives des réponses observées chez l'Homme vis à vis d'un candidat médicament. Par ailleurs, l’espèce macaca fascicularis a été choisis car ce sont des animaux facilement manipulables. Des jeunes adultes seront utilisés dans ce projet. Dans la mesure du possible, les mâles les plus matures disponibles seront utilisés car plusieurs études montrent que les animaux juvéniles seraient plus résistants aux régimes athérogènes. Aussi, dans ce modèle la morbidité semble augmenter avec l’âge des individus et donc il est nécessaire de ne pas prendre des animaux trop âgés.

Contenus jusqu'à quatre heures pour des perfusions intraveineuses, parfois hébergés seuls pour éviter les contaminations, 302 macaques subissent des administrations quotidiennes ou hebdomadaires et des biopsies sous sédation. 256 macaques crabiers et 46 macaques rhésus sont concernés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur présente ces études exploratoires comme se faisant "avec peu d'animaux", au motif qu'elles sécurisent des études réglementaires plus lourdes. 70 d'entre eux pourront être gardés vivants et réutilisés dans un autre projet, les 232 autres sont tués, en partie pour l'analyse histopathologique de leurs organes.

Objectifs

Ces études permettent d’établir ou de confirmer les homologies biologiques entre le primate non humain et l'Homme (par exemple vérification de la liaison du candidat médicament à sa cible pharmacologique dans cette espèce), en préparation ou en complément des études réglementaires. Ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé pharmaceutique avec pour but d'assurer la santé des patients. Elles permettent également de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans l'espèce primate non humain. Ces études sont aussi utilisées pour choisir une voie d'administration efficace et adaptée chez le primate non humain. Lorsqu'elles sont réalisées avant le démarrage d'études réglementaires avec des conditions particulières (voie d'administration ou investigations particulières), ces études préliminaires avec peu d'animaux permettent d'assurer le succès des études règlementaires qui nécessitent des nombres plus importants d'animaux, en évitant ainsi le risque de devoir les répéter.

Bénéfices attendus

Ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé, et aussi de choisir les doses dans les premières études règlementaires. Elles permettent également, lors de criblages, de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans l'espèce primate non humain. Ces études sont aussi utilisées pour choisir une voie d'administration efficace et adaptée. Les études exploratoires peuvent également être conçues pour montrer l’efficacité d’un produit, s’il est possible de l’étudier dans un modèle animal sain. En amont des études règlementaires, ces études préliminaires, avec peu d'animaux, permettent souvent d'assurer le succès des études règlementaires qui nécessitent des nombres plus importants d'animaux, en évitant ainsi le risque de devoir les répéter.

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (ex : orale, injection intramusculaire) de façon journalière ou hebdomadaire avec le composé d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 4h maximum dans le cas de perfusion intraveineuse. Les prélèvements seront réalisés en respectant les recommandations éthiques en vigueur adaptées au type de prélèvement et en respectant une période de récupération adaptée pour l’animal entre deux prélèvements. Les prélèvements réalisés chez l’animal vigile sont peu invasifs (ex : sang, par les voies veineuses périphériques) et nécessitent une contention de courte durée (jusque 4h maximum pour des perfusions intraveineuses). Pour les prélèvements nécessitant une sédation et/ou une anesthésie (ex. biopsie), l’animal sera surveillé jusqu’à son réveil complet. Pour certaines études (rares), un hébergement individuel peut être requis pour collecter des données individuelles ou éviter les contaminations d'un animal à l'autre.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement : -aux effets du produit administré -à l’inconfort généré par les procédures -aux prélèvements sur animaux vigiles : stress provoqué par la contention et/ou l’hébergement individuel (contacts olfactifs, visuels, sonores… préservés), le cas échéant -à la sédation/anesthésie générale -aux prélèvements comme les biopsies - Stress lors de contraintes occasionnelles liées à la procédure d’administration (ex : administration répétée) et à l’hébergement, notamment lors d’hébergement individuel, et de contentions le cas échéant, pour la réalisation de certains examens (ex : ECG).

Devenir

Les études de toxicologie peuvent inclure une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus. Les animaux pour lesquels aucune analyse histopathologique n'est nécessaire, et pour lequels des effets limités du traitement ont été observés peuvent être gardés en vie, et possiblement être réutilisés dans un autre projet après une période de récupération et sous réserve d'accord du vétérinaire.

Remplacement

L'évaluation de la toxicité d'un candidat médicament et/ou d’un dispositif médical ne peut pas être réalisée in vitro. Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour ce type de procédure de traitement identique à celle utilisée chez l'homme, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Dans certains cas, l'espèce primate non humain est la seule espèce pertinente pour les essais pré-cliniques (similarités physiologiques ou métaboliques Homme-primate non humain), par exemple dans le cas de composés biologiques (protéines thérapeutiques, anticorps monoclonaux, vaccins thérapeutiques anti-cancer...).

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude. Le besoin de groupe contrôle, le nombre de doses nécessaires, ainsi que les prélèvements et la sensibilité des méthodes analytiques sont évalués systématiquement pour assurer une réduction du nombre d’animaux. En se basant sur des tests statistiques, comprenant à minima des tests de normalité, d’analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés est le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.

Raffinement

Les procédures, les conditions d’hébergement et matériel utilisés ainsi que les enrichissements fournis sont adaptés aux animaux utilisés dans ce projet. Des enrichissements variés (ex : graines dans des copeaux, tablettes à différentes hauteur) sont fournis aux animaux leur permettant d’exprimer les comportements physiologiques et activités qu’ils auraient dans leur habitat naturel (ex : recherche d’aliment, épouillage, temps d’isolement). L’attention portée aux animaux et leur surveillance clinique sont adaptées aux études, en tenant compte des points limites éthiques établis par procédure. Les actes pouvant engendrer du stress, de l’inconfort ou des douleurs importantes seront réduits au minimum nécessaire et seront réalisés sous sédation ou anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté dans le cas échéant. Dans le cas où l’anesthésie est jugée plus traumatisante pour l’animal et/ou si l’anesthésie est incompatible avec les prélèvements prévus, les prélèvements seront réalisés sur l’animal vigile, notamment les prélèvements sanguins et le recueil d’urine, par exemple. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a un signe d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux. Les mesures sont prises dès que possible pour réduire la souffrance des animaux. D’autres traitements peuvent être mis en place suivant les recommandations des vétérinaires, selon les observations, conditions d’expérimentation.

Choix des espèces

Le choix du primate non humain est justifié par : - les homologies avec l'homme - la disponibilité d'études préliminaires sur cette espèce, - les données de pharmacocinétique, pharmacodynamie… Certains composés biologiques ciblant le système immunitaire [anticorps monoclonaux, protéines et vaccins thérapeutiques (anti-cancer, anti-Alzheimer…)] doivent être testés chez le primate non humain (espèce non-rongeur avec le système immunitaire le plus proche de l'Homme). Le choix de l’espèce de primate (Macaca fascicularis, Macaca mulatta) est le plus souvent déterminé par des études in-vitro permettant de comparer le métabolisme de ces espèces avec celui de l’homme, ou de prouver que le candidat médicament a la même affinité pour sa cible chez le primate non humain et l’homme. La pharmacocinétique du candidat médicament est également prise en compte, ainsi que les connaissances acquises avec des produits de même classe pharmacologique. Les macaques (crabiers ou rhésus) sont les seules espèces de primates utilisées dans les études de toxicologie réglementaire. Les animaux sont généralement âgés de 2 à 4 ans. Pour certains composés, des animaux mâtures (d'un point de vue maturité sexuelle ou maturité du système immunitaire) doivent être utilisés (par exemple nouveau produit contraceptif, des anticancéreux, des immunomodulateurs). Dans ce cas les femelles ont en général au-moins 4 ans, et les mâles au minimum 4 à 5 ans. Pour certaines indications, il sera indispensable de tester le candidat chez un animal un peu plus jeune (20 mois minimums).

Tuées à la fin de chaque procédure, y compris celles dont la tumeur est jugée trop grosse, trop petite ou mal formée au moment de constituer les groupes, 7 920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit que la présence d'une tumeur, même petite, exclut toute réutilisation, tout replacement et toute adoption. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, trois injections de traitement et une de produit de contraste sur animal éveillé, jusqu'à six prises de sang réparties sur trois mois, des séances d'imagerie sous anesthésie et des mesures de tumeur deux à trois fois par semaine. Il s'agit d'occuper temporairement le foie avec une nanoparticule lipidique pour que les médicaments anticancéreux restent plus longtemps dans le sang, sans que la répartition de ces près de huit mille animaux soit détaillée.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’améliorer l’efficacité des traitements administrés par voie intraveineuse (IV) et de réduire leur toxicité périphérique en modifiant la biodistribution des agents thérapeutiques grâce à leur association à une nanoparticule lipidique. La biodisponibilité systémique des médicaments est essentielle à l’efficacité thérapeutique. Pour atteindre sa concentration maximale dans le tissu cible, comme la tumeur en oncologie, les médicaments doivent surmonter un obstacle biologique de taille : la clairance hépatique. Le rôle du foie est de filtrer le sang afin d’éliminer les composés toxiques, dont un grand nombre de médicaments. Ainsi, de nombreux candidats thérapeutiques prometteurs administrés par voie IV présentent une biodisponibilité faible ou suboptimale, qui se traduit par une accumulation faible ou nulle dans le tissu cible et par une toxicité hors cible potentiellement élevée. Par conséquent, si beaucoup de médicaments présentent un potentiel à l’échelle du laboratoire, la plupart n’ont pas d’avenir clinique. Afin de surmonter cet obstacle, une nanoparticule lipidique a été conçue pour augmenter de façon temporaire la biodisponibilité des thérapies administrées par voie IV et pour minimiser le risque d’effets en dehors de la cible. La nanoparticule lipidique utilisée dans ce projet, est destinée à occuper temporairement les voies hépatiques responsables de la clairance thérapeutique, afin de permettre à un médicament donné de plus fortement s’accumuler dans les tissus cibles pour augmenter son efficacité, tout en minimisant le risque de toxicité hépatique chez le patient. Dans ce projet, la pharmacodynamie, la biodisponibilité, l’innocuité, la biodistribution tumorale et l’efficacité anti-tumorale des compositions thérapeutiques (nanoparticule lipidique + agent thérapeutique) seront comparées à celles de l’agent thérapeutique seul. Le but est d’améliorer le ratio bénéfice – risque des médicaments.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’évaluer l’impact de la nanoparticule lipidique sur la biodistribution, l’efficacité et l’innocuité de plusieurs thérapies anti-cancéreuses. A court terme ce projet permettra de faire progresser les connaissances sur le design des nanomédecines. Il permettra d’optimiser les propriétés physico-chimiques des agents thérapeutiques et de cette nanoparticule lipidique pour obtenir un meilleur ratio bénéfice - risque des traitements associés. A plus long terme, cette nanoparticule pourrait permettre d'éliminer l'une des barrières biologiques majeures limitant l'accès à la clinique de certaines agents thérapeutiques prometteurs. De plus, en réglant le problème de la clairance dans le foie, il serait permis d’avoir une action plus efficace des médicaments déjà autorisés, et donc assurer de meilleurs résultats thérapeutiques pour les patients. Le cancer reste l'une des principales causes de morbidité et de mortalité à l'échelle mondiale. Selon les données les plus récentes, le cancer représente environ 1 décès sur 6 dans le monde. En 2020, environ 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués dans le monde, et 10 millions de personnes sont décédées des suites du cancer. Ce nombre est en constante augmentation et devrait continuer à croître dans les prochaines décennies, principalement en raison du vieillissement de la population mondiale et de l'adoption croissante de modes de vie associés à des facteurs de risque. Ainsi, développer une stratégie qui permet d’augmenter l’efficacité des thérapies administrées par voie IV offrirait de nouvelles perspectives aux patients.

Procédures

Trois injections d’agents thérapeutiques et une injection de réhausseur de contraste sont effectuées sur animaux éveillés (durée 1-4 min). Les souris sont également soumises à un exmaen d'imagerie médicale non invaif sous anesthésie générale (20-30 min). Au maximum 6 prélèvements de sang étalés sur 3 mois seront réalisés sur animaux vigiles (1-2 minutes par prélèvement). Une administration unique de cellules de cellules tumorales par voie sous-cutanée sera réalisée sur animaux éveillés (1-2 minutes). Une mesure de la taille de la tumeur sera réalisée sur animaux éveillés (1-2 minutes) 2 à 3 fois par semaine pendant maximum 3 mois.

Impact sur les animaux

Les injections ou prélèvements sanguins peuvent entrainer un léger inconfort transitoire et un bref stress. Dans certains cas, un hématome transitoire peut apparaitre à l’endroit de la ponction. Lors de la croissance des tumeurs, des blessures ou nécrose peuvent apparaître au niveau de la tumeur. L’anesthésie peut induire dans de très rares cas une dépression cardiorespiratoire de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes. Les animaux dont le volume tumoral ne correspondra pas aux prérequis seront mis à mort à la constitution des groupes d’animaux sélectionnés pour le traitement. Ils ne pourront pas être réutilisés car ils porteront une tumeur soit ne correspondant pas aux critères d’acceptabilité (nécrose/ulcération/bilobée/envahissant les tissus autour), soit déjà trop grosse pour l’étude avec un risque d’échappement thérapeutique, soit trop petite mais en cours de croissance. La présence d’une tumeur, même petite, exclut l’inclusion des animaux dans une autre étude, leur replacement ou leur adoption.

Remplacement

À ce jour, aucun modèle cellulaire existant ne permet de reproduire de manière exhaustive les caractéristiques complexes liées à la progression tumorale et aux interactions avec le système immunitaire. Parmi les modèles disponibles, les modèles de greffes de cellules tumorales se distinguent par leur pertinence scientifique et leur capacité à fournir des informations détaillées, ce qui explique leur utilisation extensive et leur documentation dans la littérature. Dans le cadre de ce projet, où l’un des principaux objectifs est d’évaluer l’efficacité de traitements innovants sur la croissance tumorale, le choix du modèle de souris greffées s’avère essentiel et incontournable. Ce modèle offre un environnement expérimental qui permet d'étudier à la fois les mécanismes d'action des nanoparticules lipidiques ainsi que leurs effets sur la dynamique tumorale. L’utilisation de souris est également essentielle pour explorer les mécanismes de biodisponibilité, de métabolisation, de pharmacodynamie, de tolérance des agents thérapeutiques testés, ainsi que leur distribution tumorale fournissant des données cruciales sur leur comportement in vivo et leur potentiel thérapeutique. Seuls les agents thérapeutiques ayant montré une innocuité et une bonne biodistribution seront testées dans les modèles d’efficacité.

Réduction

Pour minimiser le recours aux animaux dans les procédures expérimentales, les agents thérapeutiques candidats sont d'abord testées in vitro afin de ne retenir que ceux ne présentant aucune toxicité cellulaire. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé pour garantir une analyse statistique pertinente des résultats. Par ailleurs, certaines nanoparticules lipidiques peuvent être couplées à des molécules fluorescentes ou bioluminescentes, permettant un suivi longitudinal de leur biodistribution par imagerie in vivo. Un animal peut ainsi être étudié au cours du temps. Cette approche réduit la nécessité de mettre à mort des animaux à différentes étapes intermédiaires de l’étude.

Raffinement

Pour réduire le stress des animaux, une période d’acclimatation d’au moins 5 jours sera respectée. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées, avec un environnement contrôlé (hygrométrie, température, renouvellement d’air, cycle jour/nuit) et relié à un système d’alarme. Les animaux sont cinq par cage, et les groupes constitués pendant l’acclimatation seront autant que possible maintenus tout au long de l’étude. Un enrichissement adapté à l’espèce sera fourni dans toutes les cages, depuis l’arrivée des animaux jusqu’à la fin de l’étude (ex. : maisons en carton, coton). Les animaux et leurs conditions d’hébergement seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié. Un vétérinaire sera présent à l’animalerie plusieurs jours par semaine, et des soins vétérinaires d’urgence seront disponibles en dehors des horaires classiques, y compris les week-ends et jours fériés. Des points limites ont été définis et seront appliqués.

Choix des espèces

Les souris greffées avec des cellules cancéreuses murines ou humaines sont les modèles de référence pour l’étude des traitements dans la recherche en oncologie. La souris est l’espèce la plus documentée dans la littérature pour des modèles de greffes tumorales. C’est une espèce qui permet d’obtenir des résultats satisfaisants et reproductibles, d’où son intérêt pour ce projet. Les souris utilisées dans ce projet seront à un stade adulte afin d’évaluer l’efficacité des agents thérapeutiques sur des animaux ayant un système immunitaire et des organes matures et développés.

Les souris de ce projet sont porteuses de mutations qui détruisent progressivement leur rétine et les rendent aveugles. 80 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit, entre neuf et quinze jours de vie, une injection sous la rétine de chaque œil, cinq minutes par œil, avec un risque de décollement de rétine et de cataracte, puis passe un électrorétinogramme de quinze minutes. Le porteur évalue ainsi une thérapie génique, et les organes sont collectés après la mort pour analyses histologiques et moléculaires.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité d’une thérapie génique dans le traitement de la dégénérescence de la rétine dans deux modèles de souris génétiquement modifiés

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de tester l’efficacité d’une thérapie génique pour traiter la dégénérescence de la rétine liée à des mutations génétiques bien précises.

Procédures

- Contention et anesthésie (injection intrapéritonéale): 5 secondes, 2 fois/animal. - Injection intraoculaire sous-rétinienne : œil droit+œil gauche, 5 minutes/oeil, 1 fois/animal - Electrorétinogramme (ERG) : 15 minutes, 1 fois/animal

Impact sur les animaux

Cécité Contention : peut causer un stress léger de courte durée. Injection intraoculaire sous-rétinienne : risque de décollement rétinien et de cataracte transitoire Injection intra-péritonéale de l’anesthésie : douleur légère

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux sont mis à mort et les organes seront collectés en post-mortem pour analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Des recherches préliminaires in vitro ont validé le potentiel thérapeutique de la surexpression du gène d’intérêt, réduisant ainsi le recours à l’expérimentation animale. Cependant, ces travaux sont limités par la spécificité de l’expression du gène aux photorécepteurs, l’absence de protocoles pour leur culture, et la très grande complexité pour produire des organoïdes rétiniens, nécessitant l’utilisation des modèles murins développés pour ce projet thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum nécessaire pour atteindre des résultats statistiquement significatifs en utilisant un test approprié pour comparer les groupes d’animaux deux à deux.

Raffinement

Les souris seront surveillées par les membres qualifiés de l'animalerie et par les responsables du projet afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, du coton, des maisonnettes en carton et des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger seront ajoutés dans la cage. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Les injections de composé sont réalisées sous anesthésie et analgésie sur une surface chauffante. Les examens ophtalmologiques seront réalisés sur une surface chauffante, sous anesthésie générale. L’application de points limites stricts et spécifiques au projet conduira à prendre en charge la douleur et la souffrance éventuelle des animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce privilégiée pour ses facilités d’élevage et de reproduction ainsi que de modifications génétiques à façon permettant de modéliser les défauts génétiques identifiées chez l’homme pour en comprendre les mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, l’œil est un organe facilement accessible et l’organisation structurale de la rétine d’une souris est très proche de celle de l’Homme. La validation thérapeutique du composé sera initiée entre 9 et 15 jours de vie (avant le début de la dégénérescence rétinienne) et sera poursuivie jusqu’à un stade suffisamment évolué de la maladie pour différencier les souris contrôles des souris porteuses de la maladie, mais suffisamment précoce pour observer un effet thérapeutique, soit 4 semaines pour le modèle présentant une atteinte rétinienne précoce et 6 semaines pour celui présentant une atteinte rétinienne progressive.