Recherche appliquée

Ovariectomisées sous anesthésie, puis réopérées une semaine plus tard pour recevoir un fragment d'utérus hors de sa place, 72 souris femelles reçoivent ensuite une injection hormonale par semaine pendant onze semaines. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, avec des douleurs abdominales possibles pendant que les lésions se développent. Le porteur affirme qu'il n'existe "aucun modèle alternatif en culture cellulaire" pour l'endométriose et que la maladie ne peut s'étudier que dans un contexte "corps entier". Toutes sont tuées pour prélever les tissus et comparer les lésions.

Objectifs

L'endométriose est une maladie gynécologique inflammatoire chronique qui touche plus de 10 % des femmes en âge de procréer (190 millions). Elle se caractérise par la présence anormale de tissus/lésions endométrial(es) en dehors de l'utérus. Cette maladie touche le plus souvent des organes tels que les ovaires, les trompes de Fallope, la vessie, les intestins. Huit à 10 ans sont généralement nécessaires afin de poser un diagnostic pour maladie. L'endométriose a un impact considérable sur la qualité de vie des femmes et sur l'économie mondiale (environ 80 milliards de dollars par an). Les traitements disponibles actuellement servent uniquement à diminuer les symptômes mais ne sont pas curatifs (ne soignent pas). Dans certains cas, les lésions peuvent être enlevées par chirurgie cependant 30 % des femmes opérées ont de nouvelles lésions dans les 5 ans post chirurgie. La progression de la maladie fait intervenir de nombreux mécanismes cellulaires assez similaires à ceux observés dans le développement de cancers comme la prolifération et la migration des cellules de l’endomètre dans une région autre que leur organe d’origine. Récemment, une protéine connue pour son implication dans le développement du système nerveux central a été identifiée pour jouer un rôle potentiel dans l’endométriose. Notre objectif est de développer des modèles murins pertinents qui reflètent au mieux les caractéristiques de l’endométriose observées chez les patientes. En raison de la complexité de reproduire l'organisation, la progression de la maladie ainsi que les symptômes associés à l'endométriose, ce projet propose de développer deux modèles distincts chacun conçu pour répondre à des questions bien spécifiques et ciblées.

Bénéfices attendus

Selon les données de l'Organisation mondiale de la santé, environ 10 % des femmes en âge de procréer (190 millions) dans le monde sont diagnostiquées avec cette maladie. Les traitements disponibles actuellement servent uniquement à diminuer les symptômes mais ne sont pas curatifs. Dans certains cas, les lésions peuvent être enlevées par chirurgie. Cependant 30 % des femmes opérées ont de nouvelles lésions dans les 5 ans post chirurgie. En 2022, la France a décrété la lutte contre l’endométriose comme cause nationale. Cette année notre laboratoire a été sélectionné pour faire partie de consortium national de recherche sur l’endométriose (dans le cadre du PEPR Santé des femmes, santé des couples). Cette demande d’expérimentation a pour objectif le développement et la maîtrise de modèles pertinents d’endométriose permettant à la fois de tester l'efficacité des nouvelles thérapies et également d'accroître les connaissances sur cette maladie.

Procédures

Une grande partie des animaux subiront 2 interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie ; une ovariectomie (20 min/souris) qui vise à retirer les ovaires afin de contrôler la production d’hormones sexuelles, puis une semaine plus tard, seconde intervention sera réalisée afin d’induire l’endométriose (2 méthodes d’induction différentes ; la première 5 min/souris et la deuxième 15-20 min/souris). Toutes les souris recevront recevront une injection hebdomadaire d’hormone en sous-cutanée pendant 11 semaines. Les injections sous-cutanées nécessitent une contention d’environ 30 secondes.

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, les animaux seront soumis à différentes nuisances. La première des nuisances aura pour origine les procédures chirurgicales mais les douleurs post-chirurgies sont diminuées par la mise en place d'une analgésie spécifique et d’un suivi fréquent permettant de l’ajuster en cas de besoin. Les souris subiront différentes manipulations chaque semaine pour des pesées et des traitements hormonaux (injections sous-cutanées). Ces manipulations peuvent entraîner du stress durant le temps des contentions ainsi que pour l'anesthésie (endormissement et réveil). Durant les semaines de développement de la maladie, il est possible que des douleurs abdominales apparaissent également.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour collecter les tissus, puisqu'il faudra analyser les lésions générées par l'endométriose ou comparer aux animaux sans lésions.

Remplacement

L’endométriose est une maladie qui fait intervenir de nombreux processus cellulaires et de nombreuses interactions tissulaires entre organes. En effet, l’endométriose est une maladie qui a pour origine la présence de tissu endométrial en dehors de l’utérus. Le seul moyen de l’étudier est donc de mimer la pathologie dans un contexte « corps entier » en apportant expérimentalement un fragment d’utérus là où il ne devrait pas être. Il n’existe à ce jour aucun modèle alternatif en culture cellulaire ou autre.

Réduction

Dans un premier temps, nous avons décidé de réaliser 3 sessions par procédure pour la mise en place des 2 modèles murins. En fonction des résultats des premières expériences, le nombre d’animaux pourra être revu à la baisse soit en diminuant le nombre de souris par expérience ou le nombre d’expérience si les premières paraissent concluantes.

Raffinement

Les souris ont une période d’habituation aux expérimentateurs qui vont suivre le protocole. Les souris seront élevées et hébergées par groupes, avec un milieu enrichi pour améliorer leur bien-être (maison en carton, coton). Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux (pesées, suivi post-opératoire etc.) plusieurs fois par semaine permettra la recherche de tout signe de souffrance. Des points limites adaptés sont mis en place au-delà̀ desquels, si aucun moyen de correction de la douleur n’a été́ efficace, les souris sont mises à mort. Les procédures de chirurgie et les injections sont réalisées par du personnel qualifié afin de réduire au maximum le temps de manipulation et le stress des animaux avec anesthésie et analgésiques adaptés dès que nécessaire.

Choix des espèces

La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’homme que ce soit anatomiquement, physiologiquement et génétiquement. En effet, plus de 98% de ses gènes sont identiques à celui de l’homme. Cette proximité physiologique et génétique permet de récapituler les évènements cellulaires observés chez l’homme et donc de l’utiliser comme modèle d’étude. Dans notre cas, le modèle d’endométriose murin permet de se retrouver dans des conditions physiologiques très proches de celles observées chez les patientes atteintes d’endométriose. De plus, la protéine étudiée n'est pas exprimée dans certaines espèces mais on retrouve une forte ressemblance entre la forme humaine de cette protéine et la forme murine, justifiant encore l'usage des souris. Les souris utilisées dans ce projet sont des souris femelles vierges d’au moins 8 semaines, possédant un utérus mature et fonctionnel.

Brûlés en quatre points du dos sous anesthésie générale, 8 mini-porcs subissent ensuite huit renouvellements de pansement et seize biopsies cutanées de 8 mm. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur neuf jours de manipulation, et tous tués à l'issue pour prélever la peau brûlée. L'objet est de tester un pansement régénératif censé éviter les autogreffes chez les grands brûlés, avant tout essai clinique. Le porteur décrit un programme hebdomadaire de jeux, des fruits et légumes quotidiens et un pansement gastrique préventif, dans le même document qui prévoit quatre brûlures profondes par animal.

Objectifs

Le pansement que nous voulons tester est un dispositif médical innovant à 2 composantes : une composante physique et une composante biologique. Celui-ci est destiné au traitement des brûlures chez l'homme. Les 2 composantes physique et biologique ont par ailleurs été testées séparément en laboratoire et sur des brûlures cutanées de mini-pigs. Les objectifs de ce projet sont de tester le pansement dans sa forme finale (composantes combinées) sur les brûlures du mini-pig, en évaluant plusieurs critères : - La tolérance du pansement. - Sa protection contre les contaminations bactériennes. - Le maintien de son intégrité au cours du temps. - La réduction de l’inflammation locale et systémique. - L’impact sur la vitesse et la qualité de cicatrisation. La pertinence de cette étude repose sur la forte ressemblance entre le mini-pig et l’homme à l’échelle de la peau, ce qui est rend les données générées robustes pour une translation vers des études cliniques.

Bénéfices attendus

Les brûlures constituent un problème de santé publique majeur, avec près de 11 millions de personnes dans le monde subissant annuellement des brûlures suffisamment graves pour nécessiter des soins médicaux. Ce problème touche particulièrement les enfants qui représentent près de 50 % des brûlés, et pour lesquels la stratégie thérapeutique la plus souvent choisie est d'effectuer une autogreffe de peau. Le pansement que nous voulons tester est un dispositif médical régénératif innovant, destiné au traitement des brûlures du second degré profond chez l’homme, dans le but d'éviter, lorsque c'est possible, les autogreffes, et de restaurer rapidement l'intégrité du tissu tout en minimisant les infections, la douleur et la cicatrice résiduelle. Son intérêt est aussi d'améliorer la vitesse et la qualité de cicatrisation par rapport aux pansements traditionnels.

Procédures

Les interventions réalisées comprennent 9 jours de manipulation au total (20 à 30 minutes par animal et par jour), sous anesthésie générale : -4 brûlures au total par animal, réalisés en une seule fois (10 minutes). -8 renouvellements de traitement et pansements des brûlures (15-20 minutes). -2 prises de sang (6mL) au total par animal (1 minute). -4 biopsies de peau rondes de 8mm au total par plaie et par animal (5-10 minutes).

Impact sur les animaux

-Douleur due aux brûlures et aux biopsies. -Stress et gêne dus à la présence de plusieurs pansements sur le dos de l’animal. -Stress dû à la manipulation fréquente et à l’hébergement individuel. -Risque d’effets secondaires liés à l’anesthésie fréquente (mais de courte durée) et/ou à l’administration fréquente d’analgésiques. -Risque d’infection des plaies.

Devenir

Le sort des 8 animaux inclus dans cette étude est la mise à mort à la fin du protocole, pour cause de prélèvement d'organes post-mortem, notamment la peau au niveau des différentes brûlures pour analyses des tissus cutanés.

Remplacement

Les études de tolérance et d’efficacité d’un dispositif médical doivent être réglementairement réalisées sur des modèles animaux avant tout essai clinique chez l’homme. Les tests cutanés qu’il est possible de faire en laboratoire ont été appliqués avant d’envisager le modèle animal mais ceux-ci génèrent peu de données ; la peau est en effet un tissu complexe et la cicatrisation un mécanisme auquel participent une multitude de cellules et de facteurs, qui ne peut être reproduit dans un laboratoire.

Réduction

Après une étude pilote, le nombre d’animaux inclus dans cette étude a été validé par une méthodologiste statisticienne et assure un nombre optimal d’individus pour générer des résultats robustes et exploitables.

Raffinement

Dans la conception de ce projet, l’ensemble des procédures ont été bien étudiées afin de générer des données robustes et exploitables tout en respectant les critères du bien-être animal et en limitant sa douleur et son stress. Les animaux disposent de nourriture adaptée, diversifiée et enrichie quotidiennement (fruits et/ou légumes), d’eau en accès libre et d’un programme hebdomadaire de jeux et activités. De plus une attention particulière sera apportée au confort digestif des animaux 1- par continuité de l’alimentation entre élevage et animalerie et 2-par apport d’un pansement gastrique avant alimentation une fois par jour aux porcs pour diminuer le risque d’ulcère gastrique. Pendant toutes les manipulations, les animaux seront installés sur un tapis chauffant, et les interventions seront réalisées sous anesthésie générale, suivies d’un traitement approprié contre la douleur. Les animaux seront surveillés 3 à 6 fois par jour pour noter le moindre signe clinique apparent et lancer une prise en charge adaptée ; un suivi des points limites stricts et spécifiques au projet est donc réalisé tout au long de la procédure. Les animaux seront hébergés collectivement pendant la phase d’adaptation. Après début de la phase expérimentale à proprement parler, les animaux seront séparés pour permettre le déroulement des expérimentations dans de bonnes conditions. Un hébergement collectif n’est pas possible durant cette phase à cause des risques d’arrachement des pansements avec des comportements de grignotage des pansements entre congénères. Les porcs seront cependant hébergés au sein d’une même pièce, dans des boxes accolés avec contact olfactif, visuel et auditif.

Choix des espèces

Les nombreuses similitudes entre l’homme et le porc en termes d’anatomie et de physiologie cutanée en font un excellent modèle animal pour l’étude de l’efficacité du pansement sur la cicatrisation des brûlures cutanées. Les animaux sont adultes. La croissance d’un jeune animal pourrait affecter et probablement améliorer la cicatrisation, ce qui introduirait un biais dans l’analyse.

Douze rats vont être utilisés pour mettre au point au laboratoire une méthode d'isolement et d'analyse des microparticules sanguines, sans question scientifique posée sur l'accident de décompression lui-même. Ils sont soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tous tués à l'issue, pour prélever leur sang et leurs tissus. Chacun subit une contention et un prélèvement sanguin sous anesthésie, puis, un mois plus tard, 135 minutes en caisson hyperbare qui simulent une plongée. Le porteur range parmi les effets attendus la douleur provoquée par les symptômes d'accident de décompression, et indique que l'effectif de douze repose sur des expériences précédentes sans qu'aucun test statistique ait été réalisé.

Objectifs

Il est communément admis que le facteur déclencheur de l’Accident de Décompression est la formation de bulles subséquente à la réduction de la pression ambiante. Les microparticules sont des vésicules extracellulaires circulantes libérées par les cellules sanguines (plaquettes, leucocytes, cellules endothéliales). Par les protéines qu’elles arborent à leur surface mais aussi par les molécules (protéines, microARN, …) qu’elles renferment, les microparticules jouent un rôle important dans la transmission d’information et, notamment, l’inflammation. Ainsi, par exemple, leur nombre et leurs caractéristiques sont modifiés dans les pathologies vasculaires. Il a été montré (i) : que leur nombre augmente après la décompression et (ii) : qu’elles sont capables d’induire certains symptômes de l’accident de décompression. De plus, certaines d’entre elles contiennent du gaz et pourraient constituer un site de formation des bulles circulantes pendant la décompression. L’objectif principal de ce projet est de mettre en place, dans notre laboratoire, une méthode d’isolement, d’analyse et de caractérisation des microparticules dans le cadre d’études sur l’accident de décompression. Pour ce faire, nous avons besoin dans un premier temps, de récupérer chez des rats, des échantillons sanguins afin de valider le protocole d’isolement des microparticules à l’état de base et après l’exposition hyperbare. Dans un deuxième temps, la méthode d’analyse de ces microparticules nécessite de déterminer la concentration d’anticorps optimale pour le marquage des cibles d’intérêt, indispensable à leur détection et à leur analyse.

Bénéfices attendus

A court terme, le bon fonctionnement du protocole d’isolement des microparticules et de leur analyse permettra la mise en place d’une nouvelle expertise au laboratoire. A moyen terme, cette méthode sera utilisée pour la réalisation de projets nécessitant l’analyse de microparticules circulantes chez le rat. A plus long terme, cette méthode pourra être utilisée dans d’autres projets relatifs à l’accident de décompression dans notre laboratoire mais également dans des projets liés à l’inflammation ou à la dysfonction vasculaire.

Procédures

Les rats seront contentionnés une fois pour être anesthésiés/analgésiés (durée 1 min) afin de subir un prélèvement sanguin unique (durée 1 à 2 min). Un mois après, ils seront placés dans le caisson hyperbare pendant 135 min (30 min d’acclimatation + 105 min de plongée simulée).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : (1) : le stress lié à la pesée hebdomadaire (acte de gravité légère, d’une durée de 5 min/pesée) ; (2) : le stress lié à la contention et à l’anesthésie (acte de gravité légère, d’une durée estimée à 5 minutes, et réalisé 1 fois) pour la réalisation des prélèvements sanguins ; (3) : le stress et l’angoisse liés à la plongée (acte de gravité modérée, d’une durée totale de 2h30) ; (4) : La douleur induite par l’apparition de symptômes d’accident de décompression lors de la période d’observation (ces nuisances seront modérées, d’une durée moins de 1 minute).

Devenir

Les 12 animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure afin de procéder aux prélèvements de sang et de tissus pour les analyses prévues dans le projet.

Remplacement

Notre travail porte sur l’étude des mécanismes à l’origine de l’accident de décompression. Les connaissances actuelles ne nous permettent pas de travailler sur un modèle cellulaire car il n’existe pas encore de biomarqueur fiable permettant de définir une sensibilité accrue à l’accident.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans cette étude a été déterminé sur la base des expériences précédentes et aucun test statistique n’a été réalisé. Les effectifs demandés vont nous permettre de réaliser toutes les mises au point nécessaires à la mise en place de cette nouvelle méthode d’analyse. Les animaux seront intégrés progressivement par lot de 4. Nous commencerons par un premier lot de 4 animaux, puis, si besoin, nous passerons à un deuxième lot, puis à un troisième. Si les mises au point sont terminées avant d'utiliser tous les lots, le projet peut être arrêté, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés par rapport aux estimations initiales. Nous estimons à 12 le nombre d’animaux nécessaire au vu de la faible quantité de sang que nous pouvons prélever pour réaliser ces mises au point.

Raffinement

Une habituation au dispositif expérimentale (caisson hyperbare) sera réalisée avant l’entrée dans l’étude afin d’habituer les rats à l’environnement et de réduire le stress. Tout au long du projet, un suivi quotidien des animaux est réalisé avec une grille de score adaptée.

Choix des espèces

Le rat est un modèle très utilisé pour l’étude des mécanismes de l’accident de décompression. De fait, nous disposons d’un important corpus de données pour ce type d’étude. Nous possédons de nombreuses données biologiques concernant les effets de l’exposition hyperbare et une bonne connaissance des symptômes de l’accident de décompression. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ses résultats. Nos travaux précédents ont été effectués sur des animaux matures sexuellement. Nous souhaitons donc utiliser des animaux au stade de « jeunes adultes », matures sexuellement.

Des cellules cancéreuses humaines sont implantées sous la peau du flanc droit de souris anesthésiées, qui reçoivent ensuite une injection intraveineuse par semaine pendant deux à six semaines, avant une ponction intracardiaque terminale. 674 souris NMRI nude, dépourvues de système immunitaire fonctionnel, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles changent d'établissement entre la greffe et les irradiations. Le porteur écrit vouloir s'assurer que les animaux ne subissent aucune souffrance, dans un protocole qui repose sur la croissance d'une tumeur greffée, des injections hebdomadaires et une irradiation.

Objectifs

La sénescence est un processus biologique naturel qui intervient en protégeant les cellules contre des stress cellulaires comme le raccourcissement des télomères, les dommages à l’ADN ou encore le stress oxydatif. Durant certains processus naturels, comme par exemple l’embryogénèse, la senescence a un rôle fondamental. Cependant, l’accumulation de ces cellules sénescentes dans l’organisme au cours du temps conduit à l’émergence de pathologies que l’on retrouve majoritairement chez les personnes âgées. Par exemple, les fibroses comme celle du foie, des poumons, des reins ou du coeur, le cancer, les maladies neurodégénératives ou l'arthrose sont des pathologies directement liées à l’accumulation de ces cellules sénescentes. L'objectif de ce projet est la mise au point de thérapies innovantes capable d'éliminer les cellules sénescentes dans les tumeurs. Il s'agit d'un projet multisite.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de valider l'efficacité de nouveaux composés dans le traitement du cancer. Ces thérapies ciblées permettent d'éliminer spécifiquement les cellules sénescentes tumorales responsables des mécanismes de résistance aux drogues et de la formation des métastases. De plus, le ciblage des cellules sénescentes cancéreuses permettra de limiter les effets secondaires associés aux traitements classiques comme la radiothérapie comme par exemple la formation de tissus fibrotique.

Procédures

Les animaux seront greffés en sous-cutané avec des modèles de lignées cellulaire humaines tumorales. Au début du protocole, les souris seront anesthésiés puis des cellules cancéreuses seront implantées sous la peau au niveau du flanc droit. Puis, les animaux se verront injecter différents produits par intraveineuse, une par semaine, durant 2 à 6 semaines consécutives en fonction de la progression des tumeurs. En fin de protocole, les souris seront anesthésiées afin de permettre une ponction intracardiaque puis euthanasiées. L'EU1 sera en charge des xénogreffes sur les animaux ( environs 20 jours de charge) avant leur transfert vers l'UE2 qui prendra en charge les irradiations ainsi ques les injections d'AEDC (30 jours environ).

Impact sur les animaux

Plusieurs éléments peuvent nuire au bien être des animaux et engendrer un stress et une douleur notamment lors des greffes sous cutanées des cellules tumorales et lors des injections intraveineuses.

Devenir

Tous les animaux inclus dans le protocole expérimental seront mis à mort soit en fin de procédure. En effet, les animaux présentant une tumeur dans le flanc ne pourront être réutilisés ou inclus dans un autre protocole.

Remplacement

Ce projet a pour but le développement de potentielles thérapies ciblées pour la traitement du cancer. Ces études in vivo font suite à de nombreux résultats in vitro qui nous permettent d'affirmer que nos nouveaux ADC présentent un réel intérêt thérapeutique. Cependant, à ce stade du développement de nos recherches, l'utilisation de modèles complexes, comme des modèles de xénogreffes, est requise pour pouvoir prouver l'efficacité thérapeutique de nos candidats. De plus, pour le développement préclinique de nos ADC, nous devons apporté la preuve d'une efficacité sur des modèles complexes en plus d'étude de pharmacocinétique précise des molécules en développement.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum tout en maintenant la possibilité d'une analyse statistique des résultats. Etant donné que l'originalité de nos ADC, ces expériences n'ont jamais été faites précédemment dans la littérature.

Raffinement

Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin de s'assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance. L'apparition de signes évocateurs de souffrance, de mal-être comme la prostation, un comportement erratique ou une altération de l'état général de la souris permettra rapidement, en fonction de la gravité des observations, de procéder soit à une prise en charge de l'animal (administration d'un antalgique) soit à la mise à mort de l'animal concerné. Lors du transport des animaux de l'EU1 vers l'EU2, nous utiliserons des boîtes de transport de type Novopac opaque (1 seule fenêtre permettant de contrôler les souris ) contenant différents éléments d'enrichissement brique de bois, sciure et nourriture humidifiée (gel diet).

Choix des espèces

La souche NMRI nude athymique sera utilisée dans l'étude de modèles de xénogreffes de cellules humaines cancéreuses en greffées en sous-cutanée. Il s'agit d'un modèle immunodéprimé avec une courbe de poids homogène et couramment utilisée dans la littérature associée à la recherche en oncologie. Ce souche permettra l'évaluation de l'effiacité anti-tumorale de nos candidats médicaments dans des modèles de xénogreffes exprimant les cibles d'intérêts thérapeutiques. Les souris NMRI athymique nude seront âgées de 6-7 semaines lors de la greffe sous-cutanée pour garantir une prise tumorale homogène.