Recherche appliquée

Une chirurgie d'environ dix heures implante une électrode dans le noyau subthalamique et un neurostimulateur sous la peau de quatre macaques à longue queue, auxquels sont ensuite injectées des neurotoxines pour provoquer un syndrome parkinsonien qui persistera jusqu'à la fin de l'étude. Tous sont tués à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, pour vérifier après leur mort que l'électrode était bien placée. Ils réalisent une tâche de vigilance trente minutes par jour cinq jours sur sept, passent jusqu'à cinq séances de trois heures en cage de sieste par condition, subissent des ponctions lombaires sous anesthésie générale et restent isolés pendant les injections de toxine et les soixante-douze heures suivantes. Le porteur indique que deux animaux suffisent, deux autres étant commandés en cas de problème, et retient le macaque parce que sa taille permet d'évaluer un implant destiné aux patients, contrairement aux rongeurs dont les cycles de sommeil sont inversés.

Objectifs

Avec une incidence d’environ 60 à 70%, les troubles du sommeil sont très fréquents chez les patients parkinsoniens. Les patients présentent des insomnies associées à une désorganisation de l’architecture du sommeil. De plus dans la journée, les patients sont somnolents et ont du mal à rester éveillés ce qui se traduit par un temps excessif diurne passé à dormir avec des endormissements irrépressibles. Les somnolences diurnes excessives sont très invalidantes car incompatibles avec la réalisation d’activités quotidiennes nécessitant de l’attention, comme la conduite automobile, et de ce fait, elles contribuent à fortement limiter l’autonomie des patients. Ces troubles ne sont pas du tout diminués par les traitements disponibles et sont même souvent aggravés. La prise en charge de ces troubles du sommeil peut donc considérablement améliorer la qualité de vie des patients. La stimulation cérébrale profonde d’une structure cérébrale appelée noyau subthalamique est devenue un traitement chirurgical de choix pour améliorer les symptômes moteurs de la maladie de Parkinson. Il serait intéressant de pouvoir utiliser ce traitement à la fois sur les troubles moteurs et sur les troubles du sommeil. L'objectif de cette étude est donc de déterminer de nouveaux paramètres de stimulation du noyau subthalamique pour réduire les troubles du sommeil dans le cadre de la maladie de Parkinson. Nous ne pouvons pas tester ces nouveaux paramètres sur des patients déjà implantés. En effet ceux-ci font partie d'un programme de stimulation bien définit, adapté pour traiter au mieux leurs symptômes moteurs. De plus nous utiliserons une nouvelle génération d'implants, avec laquelle les patients ne sont pas implantés. Le primate non humain est le modèle qui a permis la mise en place de la stimulation cérébrale profonde. C’est un modèle qui permet de reproduire un syndrome parkinsonien s'accompagnant d'un trouble de sommeil comme chez le patient parkinsonien.

Bénéfices attendus

Ce projet propose de définir des paramètres de stimulations du noyaux subthalamique pour traiter les troubles du sommeil dont souffrent la majorité des patients parkinsoniens. Cela permetterait d'utiliser la stimulation cérébrale profonde pour traiter non seulement les symptomes moteurs mais également les troubles du sommeil des patients.

Procédures

Tout au long du projet, les animaux réaliseront une tâche comportementale de vigilance qui prendra au maximum 30min par jour, à heure fixe et 5j sur7. Elle se déroulera à l’état conscient dans leur cage d'hébergement. La chirurgie d’implantation durera environ 10h. Une électrode de stimulation sera implantée dans le noyau subthalamique et connectée à un neurostimulateur implanté sous la peau. De l’équipement, pour des enregistrements de sommeil, sera placé sur le crâne et sous la peau. Des enregistrements de sommeil, sans fil, se feront dans la cage d’hébergement de l’animal sans manipulation. Un maximum de 5 nuits et de 5 jours de 12h pourra être enregistré dans chaque condition : animal sain, animal sain avec stimulation la nuit, animal parkinsonien, animal parkinsonien avec stimulation la nuit. Des tests pour mesurer le temps d’endormissement des animaux seront réalisés dans une cage de sieste, à laquelle ils sont habitués. Le test dure 3h et sera effectué au maximum 5 fois dans chaque condition. Les animaux seront rendus parkinsoniens par des injections de neurotoxine. Les animaux seront isolés pendant les injection et 72h après la dernière injection jusqu’à l’élimination de la toxine. Les injections permettent l’obtention d’un syndrome parkinsonien modéré et stable. Cette phase dure 1 semaine. Des ponctions lombaires seront réalisées sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut engendrer une douleur post-opératoire pouvant durer jusqu’à 1 semaine après l’implantation et potentiellement une hemoragie non détectable. L'implant peut être mal toléré par l'animal pouvant engendrer des irritations au niveau du site d'implantation, nécessitant des soins/reprises. Lors de la chirurgie un produit pouvant parfois induire des crises d’épilepsie est injecté. La mise place du modèle engendrera un syndrome parkinsonien modéré présent jusqu’à la fin de l’étude. Lors de la mise en place du modèle, les injections nécessiteront un isolement pour ne pas contaminer les autres animaux ainsi que le personnel. Les ponctions lombaires peuvent engendrer des maux de tête.

Devenir

A la fin du projet il est nécessaire de mettre à mort tous les animaux ayant participé à l'étude, afin d’effectuer une étude post-mortem du cerveau pour confirmer la bonne implantation de l'électrode de stimulation.

Remplacement

Cette étude du comportement de veille/sommeil nécessite une analyse des cycles du sommeil. Il nous est donc impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. Il est aussi impossible de tester de nouveaux paramètres de stimulation sur les patients déjà implantés. Le recours à des animaux est donc nécessaire dans cette étude qui constitue une étape vers la validation d’un traitement chirurgical applicable à l’humain.

Réduction

C’est une étude dans laquelle l’animal est son propre contrôle. Peu d’animaux seront donc nécessaires, 2 sont suffisants. La répétition des mesures dans les différents états (sain avec ou sans stimulation, parkinsonien avec ou sans stimulation) permettra d’évaluer l’impact de la stimulation cérébrale profonde du noyau subthalamique avec un test statistique. Le nombre utilisé espéré d'animaux est de 2, et 2 autres sont prévus et seront commandés uniquement en cas de problème.

Raffinement

Durant la chirurgie et pour les prélevements, des analgésiques, anesthésiques et antibiotiques seront administrés aux animaux afin de supprimer les douleurs. En post-opératoire il sera aussi administré des analgésiques afin de réduire au maximum les douleurs et en cas de signe d'infections, des antibiotiques seront administrés aux animaux. Du doliprane pédiatrique sera donné après les ponctions pour éviter les maux de tête. Lors de la mise en place du modèle, les animaux seront isolés, mais auront un contact visuel avec leurs congénaires. Le syndrome Parkinsonien sera surveillé et des traitements adaptés seront donnés en cas de détection de mal être de l'animal.. Afin de diminuer le stress des animaux, un programme d’habituation aux conditions expérimentales est mis en place dans l’animalerie. Ces habituations consistent en des entrainements et se feront selon un protocole progressif, dans lequel chaque étape est apprise progressivement et est récompensée par un petit volume de liquide (jus, sirop) ou solide (bonbons, fruits secs) selon leurs préférences. Un tableau de progression sera utilisé pour suivre les progrès des animaux. Les techniciens de l’animalerie et les membres de la cellule bien-être animal s’assureront par des visites régulières qu’aucune souffrance ou mal être n’est ressenti par l’animal au cours de l’expérimentation. Le personnel impliqué sur le projet est formé au bien-être animal. Des points limites suffisamment précoces et adaptés à la procédure expérimentale sont mis en place pour intervenir le plus rapidement possible afin de limiter la souffrance animale.

Choix des espèces

L'anatomie cérébrale du macaque est très proche de celle du cerveau humain. En effet ces primates non humains, qui ne sont pas une espèce menacée d’extinction, possèdent des circuits neuronaux sous-corticaux proches de ceux de l’humain et permettent ainsi la compréhension des circuits neuronaux impliqués dans les mécanismes du comportement de veille/sommeil. Ce qui n’est pas le cas des rongeurs qui ont un rythme inversé avec des cycles plus courts. Il est possible de reproduire chez cet animal un syndrome parkinsonien similaire à celui observé chez les patients s'accompagnant d'un trouble de sommeil comme chez le patient parkinsonien. De plus la taille de cet animal et de son cerveau permettent l'utilisation et l'évaluation d'un système enregistreur/stimulateur implantable qui est prévu pour être utilisé chez le patient. Des adultes seront utilisés, car les traitements évalués dans cette étude ciblent des patients adultes. De plus l'utilisation d'animaux adultes assure que le dévelopement du cerveau soit achevé.

400 souris génétiquement modifiées pour développer une néphropathie à IgA vont être utilisées, toutes tuées à seize semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant douze semaines des croquettes enrichies en algues ou dépourvues de vitamine A, des antibiotiques dans l'eau de boisson trois fois par semaine pendant huit semaines, puis un gavage de bactéries trois fois par semaine pendant quatre semaines. Chaque semaine elles sont isolées cinq minutes dans une cage sans litière pour récupérer leurs urines et leurs fèces, l'opération étant répétée dans la journée si la quantité recueillie ne suffit pas. Le porteur écrit que la maladie ne leur cause aucune nuisance et que l'utilisation de la souris est "indispensable" pour apporter la preuve du concept avant des essais chez les patients.

Objectifs

La néphropathie à IgA (NIgA), une maladie rénale inflammatoire, est la plus courante en France et dans le monde. Elle a été décrite en 1968 par le professeur Berger. À ce jour, il n’existe pas de traitement pour guérir cette maladie, qui est devenue l’une des principales causes de perte de fonction rénale. Cela nécessite des traitements comme la dialyse (qui remplace la fonction des reins en filtrant le sang pour éliminer les déchets et l'excès de liquide) ou la transplantation de rein. La NIgA se produit lorsque le système immunitaire ne fonctionne pas correctement et attaque par erreur certaines protéines du corps. Cela entraîne une accumulation anormale d’une protéine (l'IgA) dans les reins. Avec le temps, cette accumulation provoque une inflammation qui peut endommager les reins et les empêcher de filtrer correctement le sang. Des modèles des souris génétiquement modifiées ont montré qu’elles développent une forme de la NIgA similaire à celle des humains. L'absence d’une protéine spécifique favorise l’accumulation de ces protéines dans les reins, ce qui accélère la progression de la maladie. Les causes exactes de la NIgA ne sont pas encore totalement comprises, mais des facteurs comme l’alimentation et la flore intestinale (l'ensemble des micro-organismes vivant dans notre corps, comme les bactéries) semblent jouer un rôle important. Ce projet de recherche cherche à mieux comprendre l’impact des régimes alimentaires et de la flore intestinale sur l’évolution de la NIgA. Par exemple, il étudie l’effet d’un régime riche en algues, qui modifie la flore intestinale et favorise des bactéries spécifiques. Ces bactéries sont retrouvées en plus grande quantité chez les patients atteints de NIgA. D’autres recherches montrent que l’élimination de la vitamine A de l’alimentation des souris améliore les symptômes de la maladie, en réduisant l’accumulation de protéines du système immunitaire dans les reins. L’objectif global de cette étude est d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques basées sur l’alimentation et la flore intestinale. Ces résultats, encore en phase préclinique, pourraient permettre le développement de nouvelles stratégies pour ralentir ou prévenir la progression de la NIgA, ouvrant ainsi la voie à de futurs essais cliniques chez les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués, tels que l’effet de l’alimentation (riche en algues et déficiente en vitamine A) et de la flore intestinale dans une maladie inflammatoire rénale, la NIgA, afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de la NIgA.

Procédures

Pour étudier l'effet de l'alimentation (riche en algues ou carencée en vitamine A) sur la maladie de la NIgA, les souris seront nourries pendant 12 semaines avec des croquettes contenant des algues ou des croquettes dépourvues de vitamine A, disponibles en libre accès. Le poids des souris sera mesuré une fois par semaine pendant 16 semaines. Des prélèvements seront réalisés toutes les deux semaines pour les urines et chaque semaine pour les fèces pendant 16 semaines. Afin d'étudier l'interaction entre l'alimentation et les bactéries de la flore intestinale dans la maladie de la NIgA, les souris recevront des antibiotiques dans leur eau, trois fois par semaine pendant 8 semaines. A l’âge de 8 semaines, elles seront gavées avec des bactéries, trois fois par semaine pendant 4 semaines. Le poids des souris sera également mesuré chaque semaine dès le début de l'étude pendant 16 semaines. Les prélèvements seront effectués toutes les deux semaines pour les urines et toutes les quatre semaines pour les fèces pendant 16 semaines. Dans les deux cas, les prélèvements d'urine et de fèces seront réalisés sur des souris vigiles. Les souris seront isolées pendant 5 minutes dans des cages sans litière pour effectuer le prélèvement. Les échantillons d'urine seront collectés à l'aide d'une pipette dans la cage, après que les souris aient uriné d'elles-mêmes. Les échantillons de fèces seront également prélevés dans la cage après que les souris aient fait leurs besoins. Si les échantillons sont insuffisants, l'opération sera répétée au cours de la journée. Les prélèvements d'urine et de fèces seront réalisés le même jour. A l’âge de 16 semaines, les animaux seront euthanasiés conformément aux réglementations en vigueur. Un prélèvement sanguin sera effectué directement au niveau du cœur après la mort des animaux, et les reins, le foie, la rate et l’intestin seront récupérés pour analyse.

Impact sur les animaux

Toutes les souris utilisées ne présentent pas de problème de santé lié à la maladie. La NIgA ne cause pas de nuisances pour elles. Les bactéries ne sont pas des bactéries infectieuses. L’administration des antibiotiques n’a pas d’effet négatif sur les souris. Celles-ci ont bien toléré l’alimentation riche en algues. Les seules nuisances possibles pourraient être liées aux gestes du gavage, comme un stress temporaire ou un léger inconfort dû à l’introduction de la sonde gastrique.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever le sang et différents organes pour réaliser les analyses et répondre à la question scientifique.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude ne peuvent pas être obtenues actuellement par d'autres méthodes de remplacement compte-tenu de la complexité de l’interaction entre le microbiote intestinale et la réponse inflammatoire (L’organisme fabrique des substances chimiques qui produisent une réponse immunitaire pour lutter contre l'infection ou guérir les tissus endommagés), et les effets rénaux qui nécessitent de travailler à l'échelle d'un organisme entier vivant. L'utilisation de modèle murin est donc indispensable pour montrer le rôle du microbiote apportant ainsi la preuve du concept et permettrait d'envisager des essais cliniques chez des patients.

Réduction

Les souris utilisées présentent un faible taux de mortalité. Nous avons déterminé le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables et statistiquement significatifs. Le nombre de souris par groupe a été fixé en tenant compte des différences possibles dans les effets de la NIgA. Ce calcul a été basé sur des résultats préliminaires et sur un calcul statistique.

Raffinement

Dans le respect de la loi des 3R et dans un souci de bien-être animal, des matériaux comme du coton et du kraft seront ajoutés dans les cages pour permettre aux animaux de faire des nids et éviter les comportements stéréotypés. Nous nous assurerons qu'aucun animal ne soit isolé durant l'expérience afin de préserver leurs groupes sociaux. Des seuils de sécurité, définis de manière précoce, ont été établis pour éviter toute douleur, souffrance ou angoisse chez les animaux. Ces seuils, basés sur des critères comme la variation du poids, l’apparence extérieure et les changements de comportement, permettront d’adapter les mesures prises : augmentation des observations, administration d'antalgiques renouvelables toutes les 12 heures, ou euthanasie anticipée si nécessaire. Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel responsable, et les seuils de sécurité seront vérifiés une fois par semaine (état général et pesée). Lorsqu'un geste comme le gavage est effectué, les souris seront surveillées le lendemain pour vérifier leur état général. À la fin de l’expérience, tous les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le modèle murin est le meilleur choix pour développer le modèle de néphropathie à IgA, similaire à celle de la NIgA chez l'homme. Cela nous permettra d'analyser et d'étudier les effets de la maladie avec des interactions entre le régime alimentaire et le rôle du microbiote. Cette espèce présente l'avantage d'être un petit mammifère dont la génétique est bien connue ce qui nous permet d'utiliser un modèle génétiquement modifié bien établi. Pour ce faire, nous utiliserons des souris âgées de 4 semaines, car l'alimentation a un impact sur la composition de la flore intestinale comme montré chez l'homme, dès le plus jeune âge.

Toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, 1 515 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, afin d'établir un modèle d'hépatoblastome, cancer du foie de l'enfant, chez des souris au système immunitaire intact. Une partie subit une chirurgie abdominale ou lombaire pour une injection dans le foie ou la rate, ou la greffe d'un fragment tumoral dans le foie. Toutes subissent jusqu'à dix prélèvements sanguins, vingt échographies sous anesthésie et deux séances d'IRM qui imposent un transport vers un autre établissement, et des vecteurs viraux sont injectés à des souriceaux avant la naissance puis à deux, cinq et quinze jours de vie. Le porteur écrit que le développement des tumeurs hépatiques n'entraîne pas de nuisances en soi, parce que les souris seront tuées avant que ces tumeurs ne dégradent leur état général.

Objectifs

L’hépatoblastome (HB) est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. La survie globale à 5 ans actuellement est de 80 pour cent. Le traitement associe de la chimiothérapie à base de Cisplatine à une résection chirurgicale de la tumeur. Mais 20 pour cent des enfants traités vont développer une résistance au Cisplatine au cours de la chimiothérapie néoadjuvante ou au cours de la récidive de la maladie. Il existe actuellement peu d’alternatives thérapeutiques, avec des données insuffisantes sur les alternatives proposées. Il est donc crucial de pouvoir tester de nouvelles associations de traitement ou de nouveaux traitements. Les modèles pré-cliniques d’hépatoblastome qui existent aujourd’hui sont réalisés sur des souris nude, souris immunodéprimées, chez qui un fragment d’HB humain, ou des suspensions cellulaires issues de culture cellulaires d’HB sont implantés en sous cutané ou en situation orthotopique, c’est-à-dire directement dans le foie. Cependant le système immunitaire a un rôle primordial dans la réponse anti-tumorale. Il est donc très important de développer des modèles syngéniques d’hépatoblastomes chez la souris immunocompétente afin de pouvoir, une fois le modèle établi, étudier l’effet de nouveaux traitements et également étudier la réponse immunitaire impliquée dans la réponse anti-tumorale. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Notre équipe s’intéresse à deux grands types de tumeurs malignes du foie : les carcinomes hépatocellulaires (CHC) principalement développés chez l’adulte et les hépatoblastomes (HB) qui se développent chez l’enfant de moins de 5 ans. L’HB est une maladie rare mais c’est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. L'incidence est de 1 à 1,5 /1000000 d'enfant de moins de 15 ans, et cette incidence est en cours d'augmentation. Il touche 20 enfants par an en France. Dans le cas des HB, bien que la majorité des patients répondent aux traitements conventionnels, environ 20 pour cent sont réfractaires et décèdent. Les modèles de xénogreffes de lignées tumorales ou de greffes orthotopiques de tumeurs dérivées de pièces opératoires de patients représentent les modèles précliniques les plus pertinents actuellement pour étudier la réponse thérapeutique. Mais ces modèles sont développés chez des souris immunodéficientes et ne permettent pas d’étudier le rôle du système immunitaire. Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, et notamment les mécanismes immunitaires, et de tester de nouvelles approches thérapeutiques pouvant être bénéfiques aux patients réfractaires aux traitements habituels.

Procédures

Les animaux pourront être soumis, selon les cas, à l’un des gestes suivants : 1) une chirurgie abdominale ou lombaire pour injection dans le foie ou la rate (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (réalisé dans l'établissement utilisateur 1 (EU1), 2) injection percutanée (animal vigile, 1 fois maximum, 15sec) (EU1), ou 3) une chirurgie abdominale pour greffe d’un fragment tumoral dans le foie (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (EU1). L’ensemble des animaux seront amenés à avoir : des prélèvements de sang de faible volume (animal anesthésié, 10 fois maximum avec une intervalle d’une semaine minimum entre chaque, 1min) ; un suivi par échographie abdominale (animal anesthésié, 20 fois maximum, 15 min) (EU1) ; pour certains un transport dans un autre établissement afin d’effectuer une imagerie non invasive par IRM (animal anesthésié, 2 fois, 30 min) (réalisé dans l'établissement utilisateur 2 (EU2)). En fin de période de maintien les animaux seront anesthésiés, un dernier prélèvement sanguin (1 min) sera réalisé et ils seront immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances prévues sont principalement celles engendrées par les procédures chirurgicales réalisées, qui peuvent engendrer une douleur au niveau de l’incision au réveil de l’animal et avoir une incidence sur l‘état général de santé de l‘animal (perte d‘appétit, baisse de l‘activité, infection de la cicatrice, détresse de l’animal dans les cas les plus grave), ainsi qu’entrainer une légère gêne dans la locomotion. Un risque anesthésique est également à prendre compte (détresse respiratoire, réveil intempestif). L’utilisation d’animaux à des âges précoces peut engendrer un abandon de la part de la mère, voir du cannibalisme dans le cas des nouveau-nés. Un stress de l’animal peut aussi être constaté lors des contentions, ainsi qu’un inconfort lors des injections. Le développement des tumeurs hépatiques est généralement asymptomatique et n’entraîne donc pas de nuisances en soit, car les animaux seront euthanasiés avant que les tumeurs entrainent une dégradation de l’état général des animaux. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance du fait du stress lié à la néophobie des rongeurs. Un risque anesthésique est également à prendre compte car l'IRM est effectuée sous anesthésie générale (détresse respiratoire, risque d'hypothermie, réveil intempestif).

Devenir

Le prélèvement des tissus d’intérêt étant nécessaire pour la réalisation de nos analyses, l’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin des procédures grâce à une méthode réglementaire, et dans le respect des bonnes pratiques.

Remplacement

Les modèles in vitro ne miment que partiellement la pathologie humaine car ils ne permettent pas de modéliser certains paramètres biologiques pouvant influencer le développement tumoral ou la réponse thérapeutique, tels que les interactions des cellules tumorales avec leur environnement ou encore l'hétérogénéité intra-tumorale. Il est donc essentiel de disposer de modèles in vivo reproduisant le plus fidèlement possible les caractéristiques de la pathologie humaine. Le recours à des modèles animaux est donc indispensable pour mieux comprendre l'histoire naturelle de la maladie et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Les effectifs ont été réduits au maximum et les groupes seront composés de 8 à 12 animaux. Cet effectif a été déterminé grâce à un calcul de puissance, afin d’utiliser le moins d’animaux possibles tout en permettant d’obtenir des résultats suffisamment robustes, et les expériences pourront être réitérées jusqu’à 3 fois si nécessaire. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Afin de limiter au maximum les éventuelles variations entre les expériences, les paramètres d’hébergement et de soin des animaux seront contrôlés. Le suivi tumoral hépatique sera réalisé grâce à une méthode non invasive, l’imagerie par échographie et par IRM, ce qui diminue également le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d'animaux utilisés sur la totalité du projet s'élève à 1515.

Raffinement

Les paramètres d'hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur. Les cages seront enrichies avec du coton de nidification, des maisonettes en plastique ainsi que des batônnets à ronger. Les femelles gestantes seront regroupées à 2 par cages afin d’éviter leur isolement, et ne seront séparées qu’après avoir mis bas afin d’éviter la surpopulation au sein d’une même cage. Les animaux issus d’établissement fournisseur observeront une durée d’acclimatation de 7 jours minimum avant toute utilisation. Un change sera réalisé par le personnel de l’animalerie une fois par semaine (sauf indication contraire) et une surveillance quotidienne rigoureuse des animaux sera réalisée tout au long de leur vie. Des pesées seront également réalisées à intervalles réguliers et une grille de suivi est utilisée. Les procédures seront raffinées afin de limiter au maximum la douleur et l’inconfort des animaux (personnel formé et compétent, anesthésie et analgésie adéquate suite aux procédures chirurgicales puis surveillance rapprochée des animaux avec étiquetage spécifique des cages concernées), et des points limites précis seront établis. Si un animal présente des signes de douleur ou de détresse, il sera immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire afin d’éviter toute souffrance animale. La Structure chargée du Bien-Etre Animal et/ou le vétérinaire pourront être sollicités pour conseil si besoin. Les transposrts des animaux entre l'EU1 et l'EU2 est assuré par un transporteur agréé, dans des boîtes de transport appropriées, ventilées, sécurisées et suffisament spacieuses. Un apport en nourriture et en eau gélifiée sera fourni durant le transport. Le temps de transport est de moins de 20 minutes entre les 2 EU.

Choix des espèces

La souris est un modèle expérimental de choix pour l'étude des pathologies humaines car c'est un petit mammifère qui se reproduit rapidement, est facile à manipuler, et dont nous avons une bonne connaissance du comportement et de la génétique. De plus, le génome de la souris est identique à plus de 95 pour cent à celui du génome humain, ce qui suggère une bonne homologie des mécanismes observés. On peut également facilement apprécier les modifications physiques et/ou comportementales traduisant une souffrance et/ou douleur, ce qui conduirait à l’euthanasie de l’animal. De nombreux outils moléculaires sont également disponibles chez ce modèle animal. La première procédure sera réalisée sur des femelles gestantes âgées de 2 à 3 mois, ce qui correspond à l’âge adulte et également à l’âge optimal permettant le bon déroulement de la gestation d’une part, et une bonne récupération de l’acte chirurgical d’autre part. Les vecteurs viraux seront injectés à différents âges (prénatal, 2, 5 et 15 jours de vie post natal), présentant un foie encore immature et en prolifération, afin de développer un hépatoblastome.

Jusqu'à 40 ml de sang prélevés chaque mois sur animal conscient, ou une heure de contention sous des cages de moustiques qui se gorgent directement sur leurs oreilles, jusqu'à trois fois par semaine : 44 lapins vont être utilisés ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur sang entretient des élevages de moustiques, de phlébotomes et de tiques, et alimente les tests d'insecticides et de répulsifs menés en santé publique. Le porteur indique que la contention peut mettre les lapins en état de stress, avec yeux exorbités, râle et souffle court, et que des lésions aux oreilles apparaissent quand les tentatives de prélèvement échouent. Ceux qui atteignent quatre ans sont proposés à l'adoption, soit la moitié de l'effectif, les autres restant en vie pour la reconduction du même projet. L'espèce a été retenue notamment parce que les lapins cessent vite de réagir aux piqûres de moustiques, à la différence de l'être humain.

Objectifs

Nos travaux portent sur les insectes et arachnides responsables de la transmission de maladies infectieuses. De ce fait, nous avons des élevages de moustiques, de phlébotomes et de tiques. Nous avons besoin d'avoir accès à une source de sang pour maintenir ces élevages car cela permet à ces animaux de produire leurs œufs ou de croître. De plus, les moustiques, phlébotomes et tiques sont également utilisés sur des projets de recherche dans divers domaines. Ainsi, les prélèvements sanguins peuvent également servir pour infecter ces insectes et archnides avec des virus ou des parasites et ainsi simuler la transmission de maladies. Egalement, dans le cadre des évaluations d’insecticides et/ou répulsifs utilisés en santé publique, l'efficacité de ces produits peut être démontré parce qu’ils empêchent la piqûre ou permettent de contrôler la population de vecteurs. L’objectif global de ce projet est le gorgement des moustiques, pblébotomes, tiques : - à des fins de production - à des fins d’expérimentations

Bénéfices attendus

La reproduction des insectes et archnides effectuée en laboratoire permet de maintenir les souches et ainsi de les utiliser dans les différents projets. Les élevages sont utilisés sur des projets de recherche dans divers domaines : 1. évaluation des insecticides utilisés en santé publique dans le cadre d’expertise ou de recherche. 2. évaluation de nouvelles formules d’insecticides pouvant donner lieu à des dépôts de brevets 3. recherche sur les maladies infectieuses transmises par ces insectes et arachnides 4. études sur le comportement de ces insectes et arachnides 5. autre objectif : fournir d'autres laboratoires et instituts pour des expérimentations et/ou des modules d'enseignement. Ces axes de recherche sont des voies importantes pour mettre en œuvre des moyens de protection efficaces contre les maladies transmissibles via ces insectes et archnides, tel le paludisme, transmis par les moustiques, qui fait chaque année de 1 à 3 millions de morts.

Procédures

Un prélèvement sanguin régulier sur animal conscient sera effectué sur une partie des lapins. Ils seront prélevés entre 1 à 2 fois par mois selon les demandes. Généralement, les lapins seront prélèvés mensuellement de maximum 40 ml de sang puis mis en repos pour 4 semaines. La durée du prélèvement en lui-même est d’une dizaine de minutes. L’autre partie des lapins sera mis régulièrement en contention pendant 60 min maximum afin que les moustiques (disposés en cages) puissent se gorger directement sur les oreilles des lapins. La fréquence sera entre 0 et 1 fois/semaine pour les gorgements simples (annuel) et entre 1 à 3 fois/semaine pour les gorgements liés aux évaluations insecticides utilisés en santé publique (entre 3 à 6 mois d’évaluation/an maximum). Il n’y a pas de gorgement direct pour les phlébotomes et tiques.

Impact sur les animaux

Pour les procédures de gorgement direct sur lapin, celui-ci peut être en situation de stress (yeux exorbités, râle, souffle court…). De plus, la piqûre par des moustiques en direct représente également une nuisance, même sans effet visible d’inflammation ou de grattage. Les lapins prélevés, quant à eux, peuvent présenter des lésions au niveau des oreilles si les tentatives de prélèvements sont infructueuses.

Devenir

les animaux ayant atteint environ 4 ans seront mis à la retraite et proposés à l’adoption soit la moitié de l'effectif prévu. Les animaux ayant moins de 4 ans seront maintenue en vie en vue d'un nouveau dépôt du même projet scientifique (utilisation continue).

Remplacement

Les élevages de moustiques, phlébotomes et tiques nécessitent du sang pour produire des œufs ou leur croissance. À ce jour, il n’existe pas d’alternative totalement sans sang ou utilisant un sang artificiel, bien que des projets soient en cours pour explorer d’autres options, notamment pour les moustiques. Gorgement sur lapin : Les signaux émis par un animal permettent de reproduire les conditions naturelles et d’assurer un gorgement efficace. Les systèmes de gorgement artificiel (sang prélevé) ne conviennent pas toujours, notamment pour des études comportementales ou des tests de répulsifs/insecticides, car ils ne reproduisent pas tous les facteurs naturels nécessaires (comme le CO₂ ou l’acide lactique). Gorgement artificiel : Le sang acheté auprès de fournisseurs externes comporte un faible risque de contamination par des pathogènes ou des molécules (médicaments, vermifuges), ce qui peut nuire aux élevages. En revanche, le sang prélevé sur des lapins dans l’animalerie est contrôlé, exempt de pathogènes et sécurisé. Lors de traitements, les lapins concernés sont temporairement exclus. De plus, le sang prélevé destiné aux infections expérimentales doit être prélevé dans les 24 heures avant l’expérimentation.

Réduction

Pour les gorgements direct de moustiques avec lapin en contention, nous avons optimisé l'utilisation des lapins en limitant à deux lots de trois lapins, chaque lot utilisé une seule fois par semaine (lundi et vendredi). Nous n'utilisons qu'un lapin par insectarium (souches sensibles et résistantes), soit deux lapins, avec un troisième en réserve en cas d'agitation. Cela minimise le nombre de lapins. Nous avons également adopté des pratiques pour réduire le nombre de prélèvements. Pour les moustiques sains, le sang est réutilisé une seconde fois, diminuant les prélèvements. Bien que cela ne soit pas applicable aux repas infectieux, cela réduit la fréquence d’utilisation des lapins. Nous privilégions le gorgement artificiel sur membrane lorsque possible, réduisant ainsi le besoin de lapins en contention chaque semaine. Nous jugeons que le stress hebdomadaire de la contention est plus important que celui d’un prélèvement mensuel, d’où notre effort de réduction. Trois lapins par semaine suffisent pour obtenir 120 ml de sang, avec un roulement de 12 lapins pour leur repos et un lapin en cas de prélèvement infructueux, soit un lot total de 13 lapins. Pour l’évaluation des insecticides sur moustiques, trois lapins sont utilisés par lot : un pour les moustiques témoins, un pour les moustiques traités, et un troisième en réserve. Chaque lapin peut être utilisé une à trois fois par semaine, réduisant ainsi la nécessité d'en introduire de nouveaux. De plus, après deux jours, la majorité des résidus absorbés est excrétée, permettant de réutiliser les mêmes lapins sans risque de contamination. Enfin, l'expérience montre que les lapins peuvent être utilisés pour les prélèvements et les piqûres de moustiques jusqu'à un âge avancé (mais nous procéderons à une mise à la retraite aux alentours des 4 ans). Cela prolonge leur utilisation et évite le renouvellement fréquent des lots, participant ainsi à la réduction globale du nombre de lapins utilisés pour nos élevages et études.

Raffinement

Cliquez ou appuyez ici pour entrer du texte. Bien-être des lapines en animalerie : Des enrichissements comme des rondins de bois et blocs de sel (moins appréciés) ont été introduits pour permettre aux lapines de jouer ou ronger. Deux parcs ont été installés, offrant à chaque lapine une sortie hebdomadaire d'une demi-journée en rotation. Les lapines, hébergées par deux, sont regroupées dès leur arrivée, mais en cas d’agressivité, elles sont logées individuellement tout en pouvant se voir et se sentir à travers des parois en plexiglas. Dans ce cas, des enrichissements variés et des sorties fréquentes au parc favorisent leur sociabilisation. Gorgement direct : Les lapines destinées au gorgement direct sont installées dans une pièce calme, éloignée des bruits et du passage du personnel. Des panneaux signalent leur présence pour limiter les perturbations. Les gorgements se déroulent dans une pièce sombre afin de maintenir leur calme, et des friandises leur sont offertes après la contention. Prélèvements sanguins : Les prélèvements se font sur des animaux conscients, évitant l'anesthésie générale. Un délai de récupération de 2 à 4 semaines est respecté entre chaque prélèvement, selon la quantité de sang prélevée. Une crème anesthésiante (lidocaïne) est appliquée sur leurs oreilles 15 à 30 minutes avant le prélèvement. Après l’intervention, les oreilles sont nettoyées avec un antiseptique, puis une crème cicatrisante est appliquée avant de replacer les lapins dans leur hébergement. Retraite et adoption : Une mesure de raffinement envisagée est de fixer une mise à la retraite des lapines à l’âge de 4 ans, avec une proposition pour leur adoption

Choix des espèces

Cette espèce a été choisie pour sa taille et facilité de manipulation. Les lapins sont suffisamment gros pour supporter la prise de sang par les femelles moustiques contrairement aux petits rongeurs et sont plus faciles à manipuler et élever que des gros mammifères. De plus, ils permettent des prélèvements sanguins d'un volume plus important par rapport aux rongeurs. Leur facilité de mise en contention évite également le recours à l'anesthésie. Il est également à noter que les lapins ne présentent rapidement plus de réaction inflammatoire suite aux piqûres de moustiques (désensibilisation rapide), contrairement à l'Homme. Les lapins arrivent généralement à l'animalerie lorsqu’ils sont agés de 19 semaines. Ils ne sont utilisés que lorsqu'ils atteignent le poids de 3,5kg.

270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie générale une injection dans les deux chevilles arrière pour déclencher une arthrite, puis une injection de traitement par voie générale et deux injections quotidiennes d'analgésique pendant trois jours. Le porteur indique que l'inflammation de la patte sera potentiellement douloureuse selon son intensité, et qu'une perte de poids modérée peut survenir. L'imagerie photoacoustique au chevet du patient est renvoyée à un futur formulé au conditionnel, tandis que le recours à l'animal est déclaré "incontournable" au motif que la réponse immunitaire serait difficile à modéliser hors de l'organisme.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans l’axe de développement de nano-objets innovants pour la santé . La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune invalidante très répandue qui induit une inflammation chronique des articulations, avec une érosion des cartilages et des os. En Europe, elle touche déjà 3 millions de patients et ce nombre devrait encore augmenter. Les nanoparticules en tant que transporteurs de médicaments devraient modifier profondément les traitements thérapeutiques en permettant une médecine plus personnalisée. Nous souhaitons évaluer par des techniques non invasives d’imagerie l’accumulation in vivo des nanoparticules dans les tissus cibles. Les principales modalités d’imagerie conventionnelles ne permettent pas de détecter des éléments dont la dimension est inférieure au millimètre. L’imagerie photoacoustique est une technologie émergente qui s’appuie sur l’utilisation d’agents de contraste pour améliorer la qualité des images en augmentant l'absorption de la lumière dans les tissus ciblés, permettant une meilleure visualisation et un diagnostic plus précis des structures biologiques. Nos nanoparticules marquées avec un agent de contraste pourront ainsi être détectées au niveau intratissulaire et cellulaire. Nous souhaitons donc développer une nouvelle famille de nanoparticules multifonctionnelles pour i) l’imagerie photoacoustique avec le marquage des nanoparticules avec un agent de contraste et ii) l’administration de médicaments. Une bibliothèque de nanoparticules cliniquement pertinentes ont été greffées avec différents agents de contraste pour générer une réponse photoacoustique permettant d’évaluer leur accumulation dans les tissus et les cellules. L’objectif du projet est d’établir la faisabilité de cette approche au niveau préclinique en évaluant in vivo par imagerie photoacoustique l’accumulation des nanoparticules dans les articulations de souris atteintes d’arthrite, puis de mettre en évidence une corrélation entre l’accumulation des nanoparticules et la réponse thérapeutique.

Bénéfices attendus

L’objectif du projet est de développer une nouvelle famille de nanoparticules multifonctionnelles pour l’imagerie photoacoustique et l’administration de médicaments, dans le but d’une médecine plus personnalisée et efficace. L’échographie est déjà couramment utilisée par les rhumatologues pour le suivi de la PR. L’imagerie photoacoustique au chevet du patient serait un complément pour une imagerie rapide et spatialement résolue pour évaluer l’accumulation des nanomédicaments, à condition qu’ils soient marqués avec un agent de contraste visible en photoacoustique. L’imagerie photoacoustique a des avantages non négligeables en termes de santé et de coût car elle est non invasive, non ionisante et moins cher que l’IRM. Elle permettrait une détection plus fine des nanomédicaments marqués tant au niveau tissulaire que cellulaire. A plus long terme, alors qu’actuellement les applications cliniques de la photoacoustique se concentrent sur la cartographie de l’oxygénation du sang dans les tissus à des fins diagnostiques, elle pourrait contribuer au développement d’une nouvelle gamme d’applications dans le domaine de la thérapie personnalisé par la nanomédecine.

Procédures

TTous les animaux subiront sous anesthésie générale une injection intra-articulaire au niveau des deux chevilles des pattes arrières, une injection du traitement par voie générale et deux injections par jour d’analgésique pendant 3 jours (durée de chaque injection : une minute).

Impact sur les animaux

Les souris développeront une inflammation de la patte arrière injectée qui sera potentiellement douloureuse en fonction de l’intensité de l’inflammation. Une perte modérée de poids peut survenir.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser le prélèvements post-mortem des pattes arrières afin d’analyser finement les tissus des articulations (analyses anatomopathologiques).

Remplacement

Le recours à l’animal est incontournable car cette maladie met en jeu une réponse immunitaire complexe qu’il est difficile de modéliser in vitro ou in silico car elle fait intervenir différents acteurs cellulaires (cellules de l’immunité) et de nombreux médiateurs de l’inflammation (cytokines). Ce modèle d’arthrite chez la souris est un modèle pertinent d’inflammation arthritique aiguë car il partage de nombreuses caractéristiques avec la polyarthrite rhumatoïde humaine au niveau des signes cliniques et de la pathogénie. De plus, le projet vise à étudier une technique d’imagerie et l’étude chez l’animal est nécessaire.

Réduction

L’objectif de l’étude est d’évaluer l’accumulation des nanomédicaments dans la cheville inflammée et de corréler cette accumulation à une efficacité thérapeutique. Les critères de jugment seront donc i) le score clinique attribué à la patte (entre 0 et 4) et ii) l’accumulation des nanomédicaments mesurée via la réponse photoacoustique de l’agent de contraste. L’étude en imagerie permet de suivre dans le temps un même animal et ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé à l’aide d’un logiciel de statistique qui permet de déterminer le nombre juste et minimal d’animaux qui garantira la validité statistique de l’étude.

Raffinement

Les injections se feront sous anesthésie générale gazeuse afin de réduire au maximum la douleur et le stress que pourraient subir les animaux lors du geste technique. La douleur inflammatoire sera prise en charge tout au long de la procédure par un protocole analgésique adapté. Les animaux seront observés quotidiennement selon une grille d’évaluation qui suivra le poids, l’évolution de l’inflammation et permettra de mettre en place des points limites qui seront strictement appliqués en cas de souffrance avérée. Les animaux seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi de tubes en cartons et de matériaux de nidification (type sizzle nest ou cocon) afin de favoriser les comportements naturels tels que l’activité et la fabrication d’un nid. Des biberons à tétine longue seront utilisés pour faciliter l’accès à l’eau des animaux dont la mobilité sera réduite du fait de l’inflammation de la patte et des aliments appétents seront disposés dans la cage. Ces dispositions simples permettront de limiter significativement la perte de poids des souris.

Choix des espèces

Ce modèle est efficace dans de nombreuses souches de souris. Nous utiliserons des souris blanches qui ont l’avantage d’être dépourvues de mélanine qui est un agent endogène de contraste en photoacoustique et qui pourrait gêner nos mesures de photoacoustique. Les souris seront utilisées à l’âge adulte soit à partir de 7-8 semaines car la polyarthrite rhumatoïde met en œuvre une réaction inflammatoire qui nécessite un système immunitaire mature. C’est une maladie qui touche les adultes.

Dix-huit injections en neuf semaines, une vingtaine de mesures de l'épaisseur des articulations, neuf tests de répartition du poids sur les pattes et neuf tests de force de préhension : voilà le programme de chacune des 2 700 souris de ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une arthrite leur est induite par deux injections, avec douleurs articulaires, gonflements et raideurs apparaissant entre 21 et 28 jours, une mobilité réduite et des difficultés à s'alimenter. Le projet cherche à savoir si moduler un mécanisme de recyclage cellulaire ralentit la polyarthrite rhumatoïde, toutes les souris étant tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur justifie l'espèce par l'expertise disponible en élevage et manipulation, et conclut qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne reproduit cette complexité.

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie inflammatoire chronique qui touche les articulations. Elle concerne environ une personne sur cent, avec une fréquence plus élevée chez les femmes. Cette maladie provoque des douleurs persistantes, une raideur articulaire et des déformations progressives des articulations. À long terme, elle peut aussi entraîner des complications touchant d’autres organes et réduire l’espérance de vie. La maladie apparaît généralement autour de l’âge de 45 ans et sa fréquence augmente avec l’âge. En plus de ses effets sur la qualité de vie, elle a un fort impact professionnel, puisqu’environ la moitié des personnes touchées arrêtent de travailler dans les cinq ans suivant le diagnostic. L’objectif de ce projet est d’étudier si la modulation d’un processus naturel de recyclage des composants cellulaires, impliqué dans la régulation de l’inflammation, pourrait aider à prévenir ou à traiter cette maladie. En agissant sur ce mécanisme, nous espérons diminuer l’inflammation au niveau des articulations, limiter les dommages causés aux os et améliorer les symptômes ressentis par les patients. À terme, ce projet pourrait contribuer à identifier de nouvelles pistes pour mieux prendre en charge cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’explorer l’effet d’un modulateur de l’autophagie dans des modèles murins de polyarthrite rhumatoïde (PR), avec des bénéfices attendus à la fois pour mieux comprendre la maladie et pour développer de nouveaux traitements. Sur le plan fondamental, cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de l’autophagie dans l’évolution de l’inflammation et des lésions articulaires caractéristiques de la PR. Elle analysera comment un déséquilibre de ce processus peut favoriser la survie des cellules inflammatoires et aggraver la maladie. Cette recherche vise à identifier les étapes clés du développement de la PR et à repérer de nouvelles cibles pour de futurs traitements. D’un point de vue thérapeutique, si l’inhibition ciblée de l’autophagie s’avère efficace pour ralentir la progression de la PR, cette approche pourrait déboucher sur de nouvelles solutions médicamenteuses. Ces traitements seraient particulièrement utiles pour les patients qui ne répondent pas bien aux thérapies actuelles ou qui ne les supportent pas, en offrant un meilleur contrôle de la maladie avec moins d’effets secondaires liés à l’immunosuppression. Les retombées de ce projet sont donc doubles : il contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes en jeu dans la PR et ouvrira la voie à des stratégies thérapeutiques innovantes. À terme, ces avancées pourraient améliorer la qualité de vie des patients tout en réduisant l’impact économique et social de la maladie.

Procédures

Certaines souris possédant un fond génétique particulier recevront, en plus des autres actes, 5 injections successives d’un agent chimique destiné à réduire la quantité d’une protéine spécifique. Ces injections seront administrées sur animaux vigiles une fois par jour pendant 5 jours et dureront quelques secondes chacune. Pour induire l’arthrite, les souris recevront deux injections également sur animal vigile, chacune durant environ 15 secondes. Les traitements expérimentaux comprendront un total de 18 injections, d’une durée d’environ 10 secondes chacune (2 injections par semaine) sur une durée de 9 semaines sur animaux vigiles. Afin de surveiller l’évolution de l’inflammation articulaire, des mesures de l’épaisseur des articulations seront réalisées sur animaux vigiles tous les 2 à 3 jours à l’aide d’un instrument de précision. Cette procédure prendra environ une minute par animal, avec un total d’environ 20 mesures par souris. L’état de l’arthrite sera évalué chaque semaine selon une grille d’observation spécifique, une évaluation prenant environ 2 minutes par animal et réalisée 9 fois par souris sur toute la durée de l’étude sur animaux vigiles. Des échographies des articulations seront effectuées toutes les deux semaines sous anesthésie légère. Chaque session durera environ 20 minutes et chaque souris passera 4 séances au total. Un test permettant d’évaluer la répartition du poids entre les pattes avant et arrière sera réalisé une fois par semaine sur animaux vigiles. Cette analyse, qui dure environ 5 minutes par animal, permettra de mesurer l’impact de l’arthrite sur l’appui des pattes. Chaque souris passera ce test 9 fois. Enfin, un test mesurant la force de préhension des pattes sera effectué une fois par semaine sur animaux vigiles, afin d’évaluer d’éventuelles faiblesses musculaires liées à la maladie. Ce test, d’une durée d’environ 5 minutes par animal, sera répété 9 fois par souris.

Impact sur les animaux

Les souris impliquées dans ce projet recevront des injections de molécules. Cette procédure peut provoquer une douleur locale légère et temporaire ainsi qu'une irritation à l'endroit de l'injection. Une inflammation cutanée temporaire peut également apparaître en raison des molécules injectées. Des symptômes d'arthrite, tels que des douleurs articulaires, gonflements et raideurs, surviennent généralement entre 21 et 28 jours après l'injection. Dans certains cas, des changements comportementaux, comme une réduction de l'activité ou un isolement, ainsi qu'une perte de mobilité, peuvent être observés. Certaines souris recevront des injections d'anticorps. Cette procédure peut entraîner une irritation locale temporaire et un stress dû à la manipulation. Dans les 24 à 48 heures suivant l'injection, une inflammation aiguë des articulations peut se développer, accompagnée de douleurs, de gonflements et de raideurs. Ces symptômes peuvent réduire la mobilité, entraîner des difficultés à s'alimenter et causer un inconfort général. Une perte de poids modérée peut également être observée. Les injections administrées au cours du traitement peuvent causer une douleur passagère au site d'injection et un stress lié à la contention. Une manipulation incorrecte pourrait entraîner des effets indésirables, tels qu'une irritation ou une hémorragie mineure. Effets secondaires généraux : La progression de l’arthrite peut entraîner des douleurs chroniques persistantes, provoquant des comportements de retrait, une diminution de la mobilité et un état général altéré. Des troubles alimentaires et un pelage abîmé peuvent également apparaître.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques afin de répondre à la question scientifique.

Remplacement

L’utilisation d'animaux dans les études sur l'arthrite induite est indispensable en raison de l'absence de méthodes alternatives capables de reproduire la complexité du développement et de la progression de ces maladies auto-immunes. Ces études permettent de mieux comprendre les interactions complexes entre les cellules immunitaires, le collagène et les composants du cartilage, ainsi que les réponses inflammatoires spécifiques à l'arthrite rhumatoïde. Les réponses immunitaires, impliquant des interactions entre les cellules T, les cellules B, les anticorps et le collagène de type II, ne peuvent être pleinement explorées que dans un organisme vivant. Actuellement, les alternatives in vitro ou ex vivo ne permettent pas de reproduire l'ensemble des paramètres biologiques observés in vivo, notamment la réponse systémique à l'inflammation auto-immune.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 2700 souris, un nombre déterminé à l’aide d’une analyse statistique rigoureuse pour s’assurer qu’il est suffisant pour obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Les expériences seront organisées de manière à optimiser le nombre d’animaux impliqués, en réduisant au maximum le recours à des groupes témoins tout en garantissant la validité scientifique des résultats. Si les premières expériences montrent que l’hypothèse de départ est invalide, l’étude sera immédiatement arrêtée afin d’éviter l’utilisation inutile d’animaux. Lors des prélèvements, plusieurs types d’analyses seront réalisés sur les tissus collectés (études immunologiques, observation des cellules et des tissus, analyses moléculaires), ce qui permettra d’exploiter au maximum les données obtenues à partir de chaque animal. Ces échantillons pourront également être partagés avec d’autres chercheurs pour éviter de multiplier les expériences et ainsi réduire encore l’utilisation d’animaux. Enfin, les résultats obtenus seront analysés à l’aide de méthodes statistiques adaptées afin d’en tirer des conclusions solides et fiables.

Raffinement

Les conditions d’hébergement respecteront les normes réglementaires en vigueur, en collaboration étroite avec le personnel de l’animalerie. Les souris auront un accès libre à la nourriture et à l’eau, ainsi qu’à un environnement enrichi (matériaux de nidification, tunnels) afin de favoriser leur bien-être et de limiter le stress. Une surveillance quotidienne sera effectuée pour détecter précocement tout signe d’altération de l’état de santé. Une stratégie progressive de prise en charge de la douleur sera mise en place pour chaque modèle. Ce protocole permettra d'adapter l'analgésie à l'état clinique de l'animal. Le recours à des méthodes d'administration non invasives (eau de boisson enrichie en analgésique) sera privilégié chaque fois que possible. En cas de complication (plaie, réaction locale, difficulté alimentaire), des soins de support seront prodigués : application d’antiseptiques locaux, ajout de gel nutritionnel, et adaptation de l’enrichissement. En cas de comportement agressif, notamment chez les mâles, les animaux seront hébergés individuellement pour empêcher l’aggravation de blessures suite à des bagarres (blessures qui seront immédiatement soignées). Le personnel impliqué dans les procédures est formé aux bonnes pratiques en expérimentation animale et veillera à limiter le stress lors des manipulations. Les injections seront réalisées avec des aiguilles fines afin de réduire les traumatismes. Les animaux anesthésiés seront installés sur des tapis chauffants pour prévenir l’hypothermie, et leurs yeux seront protégés par l’application de gel ophtalmique. Les conditions d’hébergement, les soins et les protocoles pourront être ajustés en temps réel en fonction de l’état des animaux, dans une démarche continue de raffinement.

Choix des espèces

Le choix des souris comme modèle animal repose sur des raisons scientifiques solides. Les souris sont les plus utilisées en recherche grâce à une expertise confirmée en élevage, manipulation et suivi vétérinaire. Elles garantissent des résultats fiables et reproductibles, essentiels au développement de nouveaux traitements. Les lignées sélectionnées pour ce projet ont été choisies pour leurs caractéristiques adaptées à l’étude de l’arthrite rhumatoïde : Les souris seront utilisées dès 7 à 8 semaines, âge correspondant à un développement physiologique complet, garantissant des résultats fiables. L’utilisation de ces modèles est indispensable pour comprendre l’arthrite et tester des traitements innovants. Aucun modèle in vitro ou informatique ne permet aujourd’hui de reproduire cette complexité.

Trois macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun subissant deux PET-scans de deux heures, une IRM d'une heure trente, quatre ponctions lombaires et trois transports entre deux établissements. Tous les gestes se font sous anesthésie générale, avec le risque d'hypothermie et de dépression cardiorespiratoire que le porteur signale. Les ponctions de liquide céphalorachidien peuvent provoquer des fuites, des maux de tête, des vomissements et des signes neurologiques. La thérapie génique testée a déjà été validée chez quatre modèles de souris et le passage par le primate est décrit comme une étape réglementaire exigée par l'ANSM, les trois macaques étant tués à la fin pour prélever leurs organes, l'essai chez des patients restant à ce stade une perspective.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative conduisant à une atteinte majeure de la qualité de vie chez les patients, consécutive à une perte des neurones. De nos jours, il n’existe aucun traitement efficace. L’enjeu majeur est donc de trouver un traitement pour ces patients permettant de ralentir voire de corriger les symptômes de la maladie. Notre approche thérapeutique se base sur la thérapie génique. Nous avons d’ores et déjà démontré l’efficacité de notre approche thérapeutique dans 4 modèles de souris de la pathologie par administration dans une zone précise de cerveau de ces animaux. L’objectif ici consistera d’une part à évaluer la faisabilité, l’efficacité et la tolérance d’une administration intraveineuse de notre thérapie génique chez le primate non humain (PNH). D’autre part, ce projet a également pour objectif de valider un marqueur d’imagerie comme biomarqueur pour le suivi de l’efficacité thérapeutique. Le suivi de l’effet de notre thérapie génique nécessitera de travailler dans 2 établissements ( établissement 1 et établissement 2) pour l’utilisation d’un appareil d’imagerie spécifique.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet est d’établir la preuve de concept de la faisabilité et de l’efficacité d’une nouvelle approche de thérapie génique pour le traitement de la maladie d’Alzheimer ainsi que de valider un marqueur d’imagerie afin de proposer de nouvelles pistes de traitements chez l’Homme et ainsi d’amener à une étude clinique chez des patients souffrants de cette pathologie (165000 cas par an en France) mais aussi de valider un biomarqueur de suivi de la pathologie.

Procédures

Tous les gestes techniques sont réalisés sous anesthésie générale, et une même anesthésie générale permet la réalisation de plusieurs gestes. Dans l’ établissement 2, les animaux, sous anesthésie générale, réaliseront deux imageries PET-scan à environ 2 mois d’intervalle, qui nécessiteront à chaque fois 1 injection intraveineuse d’une substance faiblement radioactive et un prélèvement de sang (durée par imagerie environ 2h). Dans l’établissement 1, les animaux, au cours de la même anesthésie générale, auront une imagerie par résonance magnétique (environ 1h30), recevront une administration intraveineuse de thérapie génique (environ 10min) et auront une prise de sang et une ponction lombaire de liquide cérébrospinal (45 minutes maximum pour les deux prélèvements). Pour le suivi ( établissement 1), les animaux, sous anesthésie générale, auront 3 autres prises de sang et ponction lombaire de liquide cérébrospinal (45 minutes maximum pour les deux prélèvements) avec un minimum d’une semaine de repos entre chaque prélèvement. Les animaux réaliseront 3 transports assurés par un transporteur agréé entre les établissements 1 et 2 (durée inférieure à 1h par trajet). Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure par une méthode réglementaire afin de réaliser le prélèvement des organes d’intérêts pour l’évaluation de notre thérapie génique.

Impact sur les animaux

Les animaux seront sous anesthésie générale pour l’injection intraveineuse de thérapie génique, pour les prélèvements (sang et liquide céphalorachidien) et pour les examens d’imagerie. Ces anesthésies seront associées à une hypothermie et un risque de dépression cardiorespiratoire. Les animaux ressentiront un stress lié à leur capture en cage à l'induction de l'anesthésie. Les 3 transports de l’animal entre les deux établissements pourront engendrer un stress. De plus en raison de la conformation des cages de l’ établissement 2, une anesthésie brève sera réalisée pour les 2 transports au départ de cet établissement, mais du fait de leur courte durée elles ne présenteront qu’un risque très rare de dépression cardiorespiratoire pour l’animal. Les prélèvements de sang seront associés à un risque d’hématomes et d’induration au niveau de la zone de prélèvement. Les prélèvements de liquide céphalorachidien (LCR) seront associés à un risque de fuite de LCR (maux de tête, vomissements, signes neurologiques) et la formation possible d’hématomes. Les administrations pour les anesthésies et la prise en charge péri-opératoire (immunosuppresseurs, analgésie...) engendreront un stress, un inconfort et une légère et brève douleur au point d’injection.

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux sera euthanasié pour prélever les organes d’intérêt pour les études histologiques et de biodistribution qui permettront d’évaluer l’efficacité thérapeutique et la tolérance de l’approche.

Remplacement

Toutes les études in vitro (en dehors de l’animal) possibles pour valider la cible thérapeutique ont été effectuées avant ce projet afin de valider l’utilisation de cette thérapie génique comme nouvelle piste thérapeutique dans la maladie d’Alzheimer. Ensuite la stratégie thérapeutique et la fonctionnalité de notre thérapie ont été évaluées chez la souris en amont de ce projet. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude de son efficacité et de sa toxicité, sur un modèle animal de plus grosse taille facilitant ensuite la translation vers un essai clinique chez l’humain. Ces étapes sont réglementaires et requises par l’Agence nationale de la sécurité des médicaments (ANSM) pour toute demande d’autorisation d’étude clinique (chez l’Homme).

Réduction

Il y a 3 animaux au total sur ce projet, ce qui correspondant au minimum requis pour la validation de l’efficacité de l’approche thérapeutique. L'étude statistique concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans une animalerie agréée, avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Un programme d’enrichissement est mis en place pour complexifier l’environnement et permettre l’expression de comportement propres à l’espèces (ex : fourragement). Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthésie. L’observation journalière permettra tout au long du projet de suivre l’atteinte de points limites mis en place dans le projet. A la moindre anomalie détectée, un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si nécessaire. L’ensemble des gestes techniques seront faits sous anesthésie et analgésie adaptées. Lors de ces anesthésies nous contrôlerons et maintiendrons les paramètres physiologiques de l’animal. Nous nous assurons ensuite du réveil et de la bonne récupération des animaux. Le nombre d'anesthésies est minimisé en regroupant les procédures, par exemple prise de sang et ponction lombaire sont faites au sein de la même anesthésie générale. Les animaux auront un temps de récupération de minimum 1 semaine entre chaque session de prélèvement, et nous respecterons les volumes de prélèvement maximaux recommandés pour l’espèce (volume adapté à la taille des animaux et conforme aux recommandations en termes de Bien-être animal). Ce projet se déroulera dans deux établissements, afin de minimiser le stress induit par les changements d’établissement utilisateur les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation à leur arrivée pour chacun des sites. Le transport entre les 2 Etablissements utilisateurs sera assuré par un transporteur agréé et avec un animal vigile. L’euthanasie des animaux sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie.

Choix des espèces

Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée et ayant permis de confirmer la preuve de concept de la thérapie. Cependant pour une étude de toxicologie règlementaire, une deuxième espèce animale de grande taille est requise. Les organes du primate non humain, en particulier le cerveau, se rapprochent le plus du cerveau Humain en termes de structure anatomique et connectivité fonctionnelle. L’administration de notre thérapie par voie intraveineuse et l’étude de son effet sur un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres du protocole clinique (chez l’homme). Une fois validée chez un modèle de rongeurs, l'injection de notre thérapie génique chez le primate est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance d'une telle approche thérapeutique avant de passer à l’Homme. Les animaux utilisés sont des macaques adultes (2-15 ans) (3 à 10 Kg) ayant un cerveau complètement développé compte tenu des patients ciblés par notre approche.