Recherche appliquée

Capturés en rivière sous autorisation préfectorale, 480 chevesnes sauvages vont être maintenus jusqu'à six mois dans des bassins extérieurs, puis tués. Les procédures sont classées en niveau de souffrance léger. Deux fois par semaine pendant deux semaines, chaque poisson est anesthésié pour ingérer un mélange d'herbicide, d'antidépresseur, d'antipyrétique et d'anti-inflammatoire, avant des relevés comportementaux, une prise de sang et une mise à mort permettant de compter les parasites intestinaux et de doser les polluants dans le foie, les muscles, le rein et le tube digestif. Le porteur annonce des connaissances utiles pour orienter les politiques de protection de la biodiversité, et signale que les bassins ne sont pas régulés en température, exposant les poissons à un stress thermique qui s'ajoute à celui de la capture et de la captivité.

Objectifs

La pollution des cours d'eau affecte les organismes et peut se répercuter sur les interactions biotiques. Certains parasites intestinaux sont connus pour accumuler des polluants depuis leur hôte, ce qui pourrait aboutir à une atténuation de certains effets écotoxicologiques, comme cela a été montré chez un poisson d'eau douce, le chevesne Squalius cephalus infesté par des acanthocéphales. Des premières manipulations ont été d’ors et déjà réalisées. Ces manipulations ont permis de montrer que l’allocation énergétique et le comportement des poissons sont corrélés à de la charge en parasites. Ce projet vise à tester 1) les effets cocktails de l’exposition à plusieurs polluants (résidus de médicaments et pesticides), 2) les possibles effets d’acclimatation suite à une pré-exposition aux polluants et de résilience lorsque l’exposition cesse, et 3) des conséquences sur le paramètres neurotoxiques influençant potentiellement le comportement et notamment les comportements de groupe. Les composés testés sont des molécules très présentes dans l’environnement, à savoir un herbicide, un antidépresseur, un antipyrétique, et un anti-inflammatoire non-stéroïdien. Des manipulations expérimentales seront menées chez des chevesnes issus de populations sauvages, hébergés en conditions semi-naturelles, et exposés à des polluants dans la gamme de variation communément observée en milieu naturel, afin d'évaluer les réponses écophysiologiques.

Bénéfices attendus

Nos recherches explorent une question originale : les parasites intestinaux, en capturant certains polluants, peuvent-ils apporter un bénéfice aux poissons en milieux pollués, malgré les effets négatifs du parasitisme ? Ce point est souvent ignoré en écotoxicologie, une discipline qui étudie les effets des polluants sur les organismes vivants, mais qui se limite souvent à des expériences en laboratoire sans prendre en compte les interactions entre les espèces. Contrairement aux tests classiques, nos études reproduiront les conditions réelles d’exposition aux polluants, en tenant compte des mélanges de substances et de leur accumulation au fil du temps. Nous nous intéresserons aussi aux effets sur le cerveau et le comportement des poissons, qui restent peu étudiés. Pour cela, nous utiliserons des marqueurs innovants permettant de mesurer l’impact des polluants sur l’activité cérébrale et les dommages neuronaux. Ces outils pourront être utilisés en écotoxicologie et en écophysiologie, notamment pour évaluer le stress des poissons, y compris ceux retrouvés morts dans la nature. Nos résultats aideront à mieux comprendre les risques liés aux résidus de médicaments et aux pesticides dans les milieux aquatiques. Ces connaissances seront précieuses pour orienter les politiques de protection de la biodiversité. Enfin, notre projet est mené en collaboration avec des acteurs de terrain (syndicats de rivière, agences de l’eau, fédérations de pêche), favorisant des échanges sur l’état des cours d’eau et des populations de poissons.

Procédures

Les individus seront capturés en milieu naturel (autorisation préfectorale), hébergés pour une durée de 6 mois maximum, dans des très grands bassins extérieurs avec enrichissement du milieu. Chaque acte durera moins de deux minutes, sur des poissons anesthésiés (selon la méthode réglementaire). Les interventions consisteront à manipuler expérimentalement l'exposition à des polluants à des doses réalistes d’un point de vue environnemental afin de déterminer les conséquences sur les conditions hôtes-parasites. L'exposition aux polluants se fera par ingestion sur individus anesthésiés (durée pour obtenir l'anesthésie inférieure à 3 minutes), à raison de deux fois par semaine pendant 2 semaines (temps de manipulations inférieurs à 2 minutes). Des paramètres comportementaux seront mesurés (durée de relevé des paramètres comportementaux inférieure à 15 minutes), et une prise de sang sera réalisée (sous anesthésie) afin d’évaluer les conséquences physiologiques, puis les poissons seront immédiatement euthanasiés par une méthode réglementaire et différents prélèvements réalisés pour quantifier les niveaux de polluants dans les tissus, étudier les effets écophysiologiques et évaluer les conséquences de l’exposition pour les parasites.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont : le stress de la capture et de la captivité, le stress de l’administration aux agents polluants, le stress thermique (les mésocosmes extérieurs sont influencés par les températures atmosphériques). L'anesthésie et la manipulation hors de l’eau peut engendrer de l'hypoxie, déshydratation, hyperthermie. L'exposition expérimentale à l’herbicide, à l’antidépresseur, à l’antipyrétique et à l’anti-inflammatoire peut engendrer des altérations physiologiques et comportementales, telles que des réponses immunitaires altérées, ou des comportements répétitifs.

Devenir

L'euthanasie, réalisée par une méthode réglementaire, se justifie par la nécessité de relever le nombre de parasites chez les poissons, et par le fait que les analyses écotoxicologiques doivent être réalisées sur certains tissus (foie, muscles, rein, tractus digestif) et sur les parasites intestinaux qui ne peuvent être prélevés que post-mortem.

Remplacement

Le projet consiste à tester les effets de l'exposition aux polluants à des niveaux réalistes d'un point de vue environnemental, sur les interactions biotiques, plus particulièrement sur les relations entre les chevesnes et les parasites acanthocéphales. Les acanthocéphales sont des parasites intestinaux présentant la remarquable capacité d'accumuler des polluants depuis leur hôte définitif, les chevesnes, pouvant aboutir à une atténuation de certains effets écotoxicologiques. Pour comprendre les effets à cette échelle biologique (relation entre deux organismes vivants), il est nécessaire d’étudier les effets sur ces organismes. Il n’est donc pas possible de le remplacer par des modèles in silico, in vitro ou ex vivo.

Réduction

480 animaux seront utilisés en tout, soit 30 animaux par lot pour l’ensemble des études (30X16 lots soit 480 individus). Cet effectif a été retenu à partir de calcul de puissance en supposant une taille d’effet similaire à ce qui a été obtenu lors d’études précédentes, en augmentant le N pour les études comportementales où la variabilité interindividuelle est beaucoup plus élevée. L’analyse statistique des données sera réalisée afin de comparer les groupes et donc les effets de la charge en parasites et de la charge en polluants sur les poissons, avec un suivi temporel des individus.

Raffinement

Les conditions d’hébergement ont été raffinées avec les mésocosmes extérieurs, de 12m3, entièrement tapissés de filets, pour une protection vis-à-vis des prédateurs, et la récupération rapide des poissons, réduisant ainsi le stress et les risques de blessure. Les mésocosmes disposeront de radeaux végétalisés flottants de dimension 1x1 m permettant de diversifier l’habitat, d’offrir des caches, abris, ombrage et nourriture diversifiées et de contribuer à l’épuration de l’eau. Les mesocosmes ne sont pas régulés en température, et les poissons seront donc soumis aux variations de la température extérieure, qui sera toutefois atténuée par l’ombre assurée par les radeaux végétalisés. Lors de chaque acte, les poissons seront dans des bacs oxygénés, puis transférés dans un bac avec l'anesthésiant (durée pour obtenir l'anesthésie inférieure à 3 minutes). Chaque acte réalisé sous anesthésie durera moins de deux minutes. Après manipulation, ils seront placés dans un bac de réveil (eau fraiche, oxygénée, réveil rapide de moins de 5 minutes, avec surveillance des battements operculaires), puis rejoindront le reste du groupe dans le mésocosme, une fois un état de conscience, une réactivité au stress retrouvé, une récupération totale de l’équilibre et des activités de nage. Un suivi journalier des mésocosmes sera effectué. Lorsque les poissons seront manipulés, des points limites ont été établis afin de réagir rapidement à l’apparition de symptômes attestant d’une souffrance. Le franchissement d’un point limite (anomalie du comportement [nage erratique, position au sommet de la colonne d’eau, absence d’interaction sociale, isolement, hyper ou hypo-activité], hyper ventilation, hypersécrétion de mucus, présence de lésions) engendrera le retrait immédiat de l’individu du mésocosme et sa mise en surveillance en aquarium dédié. La fréquence d’observation sera augmentée, un avis auprès du vétérinaire référent sera sollicité, un traitement adéquat sera administré ainsi qu’un soulagement de la douleur si nécessaire. Une détérioration plus sévère ou durable de l’état sanitaire conduira à envisager l’euthanasie, qui sera réalisée à l’écart, après anesthésie. Une forte mortalité constatée sur l’ensemble du groupe présentera un point limite pour l’ensemble de l’expérience.

Choix des espèces

L'espèce a été choisie car 1. plusieurs études ont montré l'accumulation de divers polluants dans leurs parasites acanthocéphales, rendant le couple chevesnes-acanthocéphales idéal pour cette étude, 2. cette espèce ubiquiste et abondante dans les cours d'eau français, 3. des précédentes études (en parasitologie et en écotoxicologie) ont été menées avec succès sur des chevesnes en captivité. Les chevesnes seront adultes, d'une taille moyenne de 15 cm, taille nécessaire pour que les poissons présentent des parasites acanthocéphales.

Pour vérifier qu'un extrait de cellules souches injecté dans les articulations est bien toléré, 5 chevaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque cheval reçoit douze ponctions-injections dans les boulets antérieurs réparties sur deux mois, sous tranquillisation et analgésie, avec cinq prises de sang et treize examens cliniques et échographiques. Le porteur indique que des injections de cellules souches ont provoqué, lors d'études antérieures, un inconfort et un gonflement articulaire transitoires chez environ 10 % des chevaux, et estime que l'absence de cellules dans le produit testé devrait atténuer ces réactions. À l'issue, les 5 chevaux sont définitivement exclus de la filière bouchère et confiés à une association ou à des particuliers, le projet visant une autorisation de mise sur le marché européenne pour cette thérapie.

Objectifs

Les arthropathies sont des affections dominantes chez le cheval et représentent la principale cause de boiterie, baisse de performance ou arrêt de carrière des chevaux de course et de sport. Cette maladie à l'origine de douleurs articulaires chroniques a donc un impact majeur sur le bien-être des animaux. L’objectif de ce projet est de développer une thérapie régénératrice articulaire pour le cheval (modèle et espèce cible), en envisageant une approche en rupture technologique par rapport aux thérapies biologiques actuellement disponibles. En effet, cette thérapie ne contient pas de cellules, elle a une formulation standardisée aux normes pharmaceutiques permettant son industrialisation et facilitant sa disponibilité au plus grand nombre de chevaux. Il s'agit d'un secrétome de cellules souches, c'est à dire une extraction des petites molécules produites par des cellules souches à haut potentiel de régénération. Ces petites molécules sont responsables des propriétés anti-inflammatoires et pro-régénératrices des cellules souches. Il est à noter qu'en plus du bénéfice pour l’espèce cible (le cheval), les résultats de cette étude pourront servir de base aux développements de nouvelles solutions thérapeutiques en santé humaine, le cheval constituant l'un des meilleurs modèles animaux d’arthrose pour la médecine humaine. L'objectif du projet est de valider l'innocuité dans l'espèce cible (cheval) du candidat thérapeutique retenu (sécrétome de cellules souches multipotentes) et de déterminer la dose optimale pour un meilleur bénéfice en termes d'innocuité et d'efficacité potentielle. Si les tendances observées sont favorables, ce projet permettra de lancer un essai clinique sur des chevaux boiteux atteints d'une affection articulaire non infectieuse (indication cible), dans lequel une évaluation statistique des effets du sécrétome sera réalisée sur de plus larges effectifs afin d'obtenir une Autorisation de Mise sur le Marché de cette thérapie articulaire innovante par les autorités Européennes.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu à terme est le développement d’une nouvelle thérapie, sous la forme d’un produit de thérapie biologique acellulaire autorisé sur le marché par les autorités réglementaires du médicament européen (EMA). Ce nouveau médicament représentera une avancée importante, étant donné sa sécurité (absence de cellules vivantes), son innocuité (bonne tolérance supposée), sa facilité d’utilisation (logistique simplifiée d’un produit lyophilisé). Surtout, il représentera une nouvelle option thérapeutique pour lutter contre l'ensemble des affections articulaires n'ayant pas une origine infectieuse chez le cheval. Un tel produit n'a pas encore été développé à l'échelle internationale. De plus, les résultats de ce projet serviront de base pour le développement de solutions thérapeutiques innovantes pour l’Homme. Cette étude constitue une première étape de ce développement qui va permettre d'obtenir des données préliminaires sur la tolérance locale (au niveau de l'articulation injectée) et systémique (au niveau de l'état général des chevaux injectés). En cas de résultats favorables (absence de survenue de réaction inflammatoire marquée), ces données préliminaires permettront de mettre en oeuvre un essai clinique, dans lequel la tolérance et l'efficacité de la thérapie seront évaluées sur un plus large effectif de chevaux, permettant une évaluation statistique des effets sur une population de chevaux atteints d’affections articulaires non infectieuses. Actuellement les thérapies les plus communément utilisées par voie intra-articulaire sont soit à base de corticostéroïdes soit à base de thérapies biologiques. La limite des stéroïdes est qu’ils ne peuvent pas être utilisés de façon réitérée au risque d’avoir un effet délétère sur le cartilage articulaire. Quant aux thérapies biologiques (sérum autologue, acide hyaluronique, gel polyarcrylamide, cellules souches mésenchymateuses), aucune n'a démontré de capacité à arrêter, ralentir ou inverser la progression des lésions articulaires dégénératives. Par ailleurs, les thérapies à base de serum autologue ou de cellules souches manquent de standardisation dans leur formulation et les produits de thérapies cellulaires ont des effets indésirables locaux très fréquents. Dans ce contexte, la thérapie sans cellules de grade pharmaceutique développée dans le présent projet, représenterait une excellente alternative pour une prise en charge des affections articulaires non septiques chez le cheval.

Procédures

- Des piqures seront réalisées dans les articulations des boulets antérieurs des chevaux à douze reprises : le premier jour (sur les 2 boulets antérieurs), le lendemain (sur les 2 boulets antérieurs), à 1 semaine (sur les 2 boulets antérieurs), à 1 mois (sur les 2 boulets antérieurs), à 1 mois et 1 jour (sur un seul boulet antérieur), à 1 mois et 1 semaine (sur un seul boulet antérieur) et à deux mois (sur les 2 boulets antérieurs). Chaque piqure dure 1 seconde, suivie d'une aspiration de liquide synovial qui dure 5 secondes et d'une éventuelle injection de 1 mL de produit qui dure 4 secondes. Elles sont réalisées sur animal vigile, après tranquilisation et administration d'un analgésique par voie générale et stabilisation du membre sur lequel est réalisé l'injection (membre placé au soutien par un opérateur, sans autre contention). - Par ailleurs, 5 prises de 10 mL de sang seront réalisées sur chaque cheval (premier jour, le lendemain, à 1 mois, à 1 mois et 1 jour et à 2 mois) sur animal vigile, sans sédation, sans autre contention qu'un licol, ces actes étant très bien tolérés par les chevaux. Ces actes durent 1 seconde pour la pigure cutanée, puis 10 secondes pour le prélèvement de sang. - Des examens cliniques généraux (examen physique et dynamique, appétit, transit intestinal, auscultation cardiaque, respiratoire et prise de température) et des examens échographiques des boulets antérieurs seront réalisés à 13 reprises sur chaque cheval de l’étude durant sa durée (2 mois) aux jours J0, 1, 3, 7, 14, 21, 28, 29, 31, 35, 42, 49, 56. Chaque examen dure 10 minutes, il est réalisé sur animal vigile en binôme avec un congénère, non sédaté et sans contention autre qu’un licol.

Impact sur les animaux

Lors d'études antérieures sur des injections de cellules souches dans des articulations de chevaux, un inconfort transitoire et une enflure temporaire de l'articulation injectée (1 à 7 jours) ont été rapportées dans environ 10 % des cas. De telles réactions pourraient également se produire avec le présent traitement, néanmoins, l'absence de cellules dans le présent traitement devrait conduire à des réactions locales moins marquées et plus transitoires qu'avec des injections de cellules souches.

Devenir

Après avoir été exclus définitivement de la filière bouchère, les 5 chevaux du protocole seront placés dans une association ou chez des particuliers ayant une expérience de longue durée de propriétaires de chevaux. Ils vivront au pré avec leurs congénères. Le présent projet ne devrait engendrer aucune séquelle compromettant leur état de santé future. Ils seront donc à même de mener une vie de cheval domestique, avec une éventuelle activité de loisirs.

Remplacement

Le présent projet a pour objectif de développer une thérapie articulaire, qui à terme, pourrait prévenir et limiter la progression, voire guérir les affections articulaires non infectieuses du cheval. Le modèle animal choisi ici constitue donc l’espèce cible de la thérapie. La compatibilité biologique du traitement a déjà été évaluée in vitro sur des modèles d'organoïdes de tissu cartilagineux sains et sur des cellules équines en culture. La survenue d’éventuels effets secondaires a été évaluée dans une étude pilote in vivo dans un modèle murin, où aucune manifestation indésirable n’a été constatée. En raison de spécificités immunitaires propres à chaque espèce, il est cependant nécessaire d'évaluer la survenue d'effets secondaires dans l'espèce cible, d'autant plus que le cheval est connu pour être particulièrement réactif.

Réduction

Le nombre de 4 chevaux, a été jugé être le nombre minimal pour lequel cette étude permettra de conclure à l'absence de survenue d'effet indésirable majeur contre-indiquant la mise en oeuvre d'un essai clinique, de la présente thérapie, sans être due au hasard ou à l’individu, compte tenu des résultats déjà acquis chez le cheval avec des injections de cellules souches. Pour garantir ce nombre exact, en cas de problème de santé majeur entraînant l'exclusion d'un cheval de l'étude, il a été décidé d'inclure 5 chevaux. Compte tenu de ce faible effectif, aucune conclusion statistique ne sera réalisée dans cette étude pilote dont l’objectif est, en cas de résultats favorables pour chacun des chevaux (absence d’effets indésirables majeur aux injections) de poursuivre par le lancement d’un essai clinique.

Raffinement

Les chevaux seront hébergés dans leur environnement naturel (pature avec abris) et en groupe avec leurs congénères. Les actes pratiqués sont tous de classe légère, et pour limiter le stress lors des examens et prélèvements sanguins, ils seront toujours manipulés par 2. Les chevaux auront une période de 1 mois d'acclimatation avant le début du protocole au cours duquel, ils seront habitués au personnel soignant, à la manipulation et à la réalisation d’échographies. Ainsi, les chevaux ne seront hébergés en box (3x4m) que le jour des ponctions-injections articulaires, et les 3 jours suivants. Pour limiter la douleur et le stress liés à la répétition des ponctions-injections synoviales, une analgésie et une tranquilisation sera mise en place le temps de leur réalisation. Par ailleurs, en cas de réaction inflammatoire marquée suite aux injections, un traitement par voie générale à base d’anti-inflammatoires non-stéroïdiens sera mis en place ainsi qu’une cryothérapie locale.

Choix des espèces

La thérapie a été développée à des fins de traitement chez des chevaux présentant une douleur (boiterie) associée à la présence d'une affection articulaire non infectieuse. Après une phase d'évaluation de l'innocuité et de l'efficacité sur des modèles d'organoïdes de cartilage équin sain et arthrosique, nous souhaiterions tester la tolérance de la thérapie dans l'espèce cible : le cheval avec la voie d'administration thérapeutique prévue. Il est donc nécessaire pour ce projet d’avoir recours au cheval. En effet les résultats obtenus sur d’autres espèces ne pourraient être transposables directement à l’espèce cible, puisqu’il existe des spécificités d’espèce sur le système immunitaire. Il est donc nécessaire dans le cadre de cette étude de travailler avec l’espèce cible du produit à évaluer. Les chevaux utilisés seront des adultes (≥ 3 ans). Le traitement étudié étant destiné à être utilisé chez l’adulte il est préférable pour cette étude de choisir des animaux de l’âge cible.

Sur les 1 100 souris que cet élevage fera naître, 710 seront tuées parce qu'elles ne portent pas le génotype recherché, 150 gardées vivantes pour la reproduction et 240 intégrées à des projets de thérapie génique. Toutes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, au titre de la gestion de deux lignées modèles de l'hypophosphatémie liée à l'X. L'unique acte déclaré est une biopsie de moins de 2 mm à l'oreille, pratiquée aux ciseaux sur animal vigile pour le génotypage, décrite comme une douleur "légère et passagère". Seuls les mâles porteurs de la mutation serviront de modèle, les femelles hétérozygotes n'exprimant que peu ou pas d'anomalie, ce qui explique le nombre de souris tuées sans avoir été utilisées.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de produire des souris utilisées comme modèles de l'hypophospahtémie liée à l'X appartenant à deux lignées très proches l'une de l'autre qui différent par leur fond génétique : HypDuk-BALB/c et HypDuk-B6. On parle de lignées congéniques. Chez les patients, l' hypophosphatémie liée à l'X est une maladie génétique héréditaire qui se manifeste par du rachitisme pendant la croissance et des atteintes musculo-squlettiques chez l'adulte. Elle est due à une mutation sur un gène dit "phex" qui fait que lorsque cette anomalie génétique et présente, elle se traduit par un défaut de minéralisation elle-même liée à une perte de phosphate au niveau des reins et une baisse de phosphate dans le sang. Les hommes et les femmes sont tous deux affectés par cette maladie car l'anomalie génétique est dominante. Les souris prises comme modèles de cette maladie dans ce projet ont un taux de phosphate dans le sang faible mais qui ne se traduit pas par des atteintes osseuses comme chez les patients. Ainsi, bien que le gène altéré est dominant chez les patients et affecte les hommes et les femmes, les femelles souris dites hétérozygotes qui possèdent un exemplaire du gène muté et un exemplaire du gène sain expriment peu ou pas d'anomalie . De fait, seuls les mâles portant la mutation sur le chromosome sexuel seront utilisés comme modèle d'étude et de thérapie génique de la maladie.

Bénéfices attendus

Cette demande s'inscrit dans le projet de développement d'une thérapie génique pour l'hypophosphatémie liée à l'X. Ces procédures justifient la production des colonies HypDuk-Balb/c et HypDuk-B6 et leur gestion.

Procédures

Les animaux subiront une biopsie de moins de 2 mm de diamètre à l'oreille pour le génotypage. Une paire de ciseaux fins sera utilisée à cet effet qui sera désinfectée à l'alcool et rincée à l'eau stérile entre chaque prélèvement. Cet acte est exécuté par du personnel zootechnique entraîné et ne nécessite que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Le prélèvement à l'oreille réalisé à des fins de génotypage est le seul effet indésirable du projet. Il induit une douleur légère et passagère.

Devenir

- 240 animaux seront inclus dans des projets scientifiques de thérapie génique pour traiter l'hypophosphatémie - 150 animaux seront gardés en vie pour les besoins de la reproduction et la gestion des élevages - 710 animaux seront euthanasiés car ne présentant pas un génotype d'intérêt pour l'expérimentation ou la reproduction.

Remplacement

Dans le cadre du projet de développement d'une thérapie génique pour le traitement de l'hypophosphatémie liée au chromosome sexuel X, nous avons nécessairement besoin d'utiliser le modèle animal car: i) Nous mesurons des paramètres biochimiques dans les fluides biologiques tels que le taux de phosphate dans le sang ; ii) Nos vecteurs de thérapie génique agissent simultanément dans différents compartiments sur le foie, les reins, et les os ; iii) Nous avons besoin d'un organisme corps entier pour évaluer les réponses de l'organisme à notre traitement comme les réponses immunitaires dirigées contre nos vecteurs et qui peuvent en affecter l'efficacité. Il n'existe donc pas de remplacement possible aux prélèvements de tissus et de sang à partir desquels nous procéderons à des explorations fonctionnelles dans le cadre de projets de thérapie génique pour le traitement de l'hypophosphatémie liée à l'X.

Réduction

La production des 2 lignées de souris objet de ce projet repose sur des croisements spécifiques et des stratégies d'accouplement en sorte d'adapter au plus juste la production aux besoins expérimentaux des projets de thérapie génique. Notre équipe dispose d'un historique lui permettant d'ajuster le nombre d'accouplement en tant que de besoin. A l'origine de cet historique, le nombre de couples avait été mis en place à l'aide d'un outil qui relie le nombre de reproducteurs nécessaires aux objectifs de production.

Raffinement

Pour la biopsie de l'oreille à des fins de génotypage, les souris vigiles seront maintenues en contention (manuelle) par du personnel zootechnique entrainé qui possède une parfaite maitrise du geste de manière à prélever moins de 2 mm de tissu sans saignement. Lorsque l'animal est remis dans sa cage, il est surveillé pendant au moins 5 minutes pour détecter un éventuel comportement qui traduirait une gêne occasionnée par l'acte.

Choix des espèces

A notre connaissance, les seuls modèles animaux mimant l'hypophosphatémie liée à l'X sont les deux modèles murins objets de cette demande. Les animaux sont prélevés à 7 jours.

Tuées pour le prélèvement de leurs placentas et de leurs fœtus, 68 souris femelles gestantes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent un composé perfluoré par l'eau de boisson après un gavage initial, sont pesées deux fois par semaine, subissent jusqu'à deux lavages vaginaux, puis une injection d'hormone thyroïdienne et une prise de sang sous sédation. L'effectif se déduit d'un calcul : six temps de prélèvement, quatre souris par temps, deux groupes, soit 48 femelles gestantes, portées à 68 parce que la mise à la reproduction n'aboutit que dans 70 % des cas. Le porteur écarte l'usage de placentas humains recueillis après un accouchement, au motif qu'ils ne renseigneraient pas sur la formation du placenta.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de déterminer si une exposition gestationnelle à un contaminant environnemental à des niveaux représentatifs de l’exposition de la femme enceinte peut altérer la fonction placentaire régulant les apports en hormones thyroïdiennes de la mère au fœtus. Pour cela, nous caractériserons, conjointement dans les compartiments maternel et fœtaux, l'évolution des concentrations d'une hormone thyroïdienne au cours du temps suite à une administration de cette hormone chez la souris.

Bénéfices attendus

Les composés perfluorés sont très persistants conduisant à une exposition importante des populations humaines. Des études suggèrent un lien entre une exposition pendant la grossesse à ce type de composés et des perturbations des fonctions thyroïdienne et placentaire. Or, un apport adéquat d’hormones thyroïdiennes de la mère au fœtus régulé par le placenta est critique pour le développement du système nerveux central. Dans ce projet nous testerons l’hypothèse qu’une exposition à un composé perfluoré peut altérer les échanges fœtaux maternels en hormones thyroïdiennes. Le projet devrait fournir des bases scientifiques pour une meilleure en prise en compte de l’exposition des femmes enceinte à ce composé et ainsi contribuer de façon significative à l’analyse du risque pour la santé humaine de ce contaminant.

Procédures

Administration du contaminant : 1 fois, maximum 30 secondes. Pesées bi-hebdomadaires : maximum 1 min/pesée. Lavage vaginal : 2 fois maximum, maximum 2 min/lavage. Administration d'hormone thyroïdienne sous sédation : 1 fois, maximum 3 min. Prise de sang sous sédation : 1 fois, maximum 30 secondes.

Impact sur les animaux

La dose en contaminant administrée aux souris est faible et des données préliminaires indiquent que le traitement n'induit pas d'effet toxique détectable en termes de prise alimentaire, abreuvement, prise de poids, comportement, nombre de foetus. Dans de rares cas, un hématome peut se collecter lors de l'administration de l'hormone thyroïdienne. Le prélèvement de sang présente une nuisance limitée pour les animaux car il sera fait sous anesthésie. Les manipulations de routine (pesées bihebdomadaires) peuvent engendrer un état de stress. Toutefois, si les conditions sont bien contrôlées (phase du cycle lumineux, personnel expérimenté, calme) ; l'habituation des animaux se fait vite sans effet notable.

Devenir

Les femelles seront euthanasiées pour récolte des placentas et des fœtus post-mortem.

Remplacement

Le projet porte sur l’impact d’un contaminant sur la fonction placentaire. Des modèles in vitro existent mais aucun ne permet de rendre compte de la complexicité structurale et fonctionnelle d’un placenta in vivo qui détermine et régule les échanges fœtomaternels. Des placentas humains perfusés collectés lors d’accouchements pourraient être une alternative mais cela ne permettrait de déterminer que les interactions directes entre le contaminant et les facteurs placentaires impliqués dans le transfert des hormones thyroïdiennes. En aucun cas ce modèle ne permettrait d’évaluer des effets sur la formation du placenta. Seul un modèle in vivo permet donc de rendre compte de ce niveau de complexité impliquant deux organismes à part entière (la mère et le fœtus) et une barrière physiologique (le placenta).

Réduction

Afin de bien pouvoir caractériser les échanges fœto-maternels d'une hormone thyroïdienne, il faut pouvoir déterminer les concentrations en cette hormone dans le sang maternel, le placenta et les fœtus à différents temps après l’administration de cette même hormone. Des modèles mathématiques permettent de déterminer que 6 temps de prélèvement et 4 souris par temps sont nécessaires pour pouvoir déterminer si le contaminant étudié a un impact sur les échanges fœto-maternels de l'hormone ciblée, soit 2 groupes (animaux traités ou non avec le contaminant)*6 temps*4 souris = 48 femelles gestantes. De plus, le taux de réussite de mise à la reproduction de la souche de souris étant de l’ordre de 70%, 68 souris seront finalement incluses dans le projet.

Raffinement

L’hébergement des souris par paire devrait permettre de limiter le stress des animaux. Les animaux seront traités par l’eau de boisson de façon à éviter toute intervention de type gavage chronique. Le gavage initial permet quant à lui d’atteindre d’emblée l’état d’équilibre des concentrations et ainsi de réduire la durée de traitement. L'administration d'hormone thyroïdienne et le prélèvement de sang seront fait sous anesthésie. Des points limites ont été déterminés avec différents niveaux d'action (de la surveillance à la mise à mort des animaux). Un enrichissement du milieu est prévu sous forme d’abri inox et morceaux de bois à ronger et mise à disposition de matériel de nidification. Les animaux seront placés en cycle lumineux inversé de façon à ce que les interventions de routines (pesée, changes, vérification du bouchon vaginal) réalisées le matin puissent être faites juste au début de leur période d’activité (fin de phase éclairée). Des pesées bi-hebdomadaires seront réalisées de façon à détecter de façon précoce un trouble général. L'administration d'une hormone marquée différentiable lors des dosages de l'hormone endogène permet de s'affranchir d'une ablation de la thyroïde sur ces animaux.

Choix des espèces

Il existe de grandes différences interspécifiques dans la structure histologique du placenta et sa fonctionnalité. Chez la plupart des primates dont l’humain et les rongeurs, le placenta est « hémochorial » : les villosités placentaires fœtales pénètrent jusque dans les vaisseaux sanguins maternels et sont directement en contact avec le sang. La prolificité de l’espèce permet d’obtenir un grand nombre d’échantillons placentaires et fœtaux pour une seule femelle et ainsi de prendre en compte le sexe du fœtus dans l’analyse des données et de réaliser des tests statistiques paramétriques plus résolutifs. La procédure sera mise en œuvre sur de jeunes adultes au pic de fertilité et ayant achevé leur croissance (10 -12 semaines).