Recherche appliquée

Une partie des souris utilisées appartient à une lignée transgénique retenue pour son nombre plus élevé de cellules mémoires dites MAIT, censé rendre l'effet recherché plus facile à observer. 1 946 souris vont être utilisées, 1 574 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 372 un niveau modéré. Elles reçoivent une injection de cellules sous anesthésie, puis une administration de produits sous une anesthésie pouvant atteindre quarante minutes, puis six injections espacées de vingt minutes le jour de leur mise à mort. Le porteur affirme que les activations du système immunitaire ainsi provoquées ne sont pas douloureuses et que le passage par un organisme vivant intégré est "indispensable" pour tester les mécanismes de régulation. Toutes sont tuées pour le prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.

Objectifs

Le système immunitaire a pour rôle de détecter un potentiel danger et d’y répondre par le biais des globules blancs afin d’éliminer cette source de danger. On compte parmi ces globules blancs des cellules appelées « lymphocytes T », dont le sous-type dit « CD4 » est absolument essentiel pour l’organisation et l’action du système immunitaire. Par exemple, les patients qui ont un déficit en lymphocyte T CD4 développent de graves maladies infectieuses. Chaque lymphocyte T généré dans l’organisme est capable de reconnaître une cible qui lui est unique. Quand un lymphocyte T n’a pas encore rencontré sa cible au long de la vie de l’individu, on dit qu’il est « naïf » et lorsqu’il a rencontré sa cible, on dit que cette cellule est « mémoire ». Les cellules mémoires sont capables de répondre plus rapidement en cas de reconnaissance d’un danger et c’est sur ce principe qu’est basée la vaccination.

Bénéfices attendus

Ce projet tente de répondre à une question fondamentale en immunologie : comprendre les différents signaux qui sont intégrés par les cellules T CD4 naïves et qui peuvent influencer leur activité. Ce projet pourrait permettre à court terme d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes qui régulent l’activation des cellules T CD4 naïves qui, pour rappel, sont des cellules clés de la fonction du système immunitaire. A plus long terme, nos résultats pourraient avoir des applications très intéressantes notamment dans le domaine de la vaccination car nous pourrions développer de nouveaux adjuvants capables d’activer des cellules mémoires et ainsi orienter la réponse T CD4 naïve de la façon la plus optimale par rapport à l’effet recherché.

Procédures

Dans la procédure expérimentale, les souris anesthésiées recevront d’abord une injection de cellules mémoires et/ou naïves (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie < 5 min). Puis les animaux recevront 6h plus tard une administration de produits non douloureux. Ce geste sera réalisé sur animaux anesthésiés (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie < 40 min). Le jour de la mise à mort, les animaux recevront six injections, chacune séparée de 20 min, d’un produit non inflammatoire sous anesthésie (durée de chaque anesthésie < 5 min).

Impact sur les animaux

Suite à l'injection d’anesthésique dans l'abdomen une douleur légère immédiate de courte durée liée à la piqûre est attendue. Au réveil de l’anesthésie, une douleur légère de courte durée pourrait être ressentie par les animaux après l’administration des traitements ou l’injection de cellules. Il est important à souligner que les activations induites du système immunitaire ne sont pas douloureuses pour l’animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour collecte de différents organes puis des analyses post-mortem seront réalisées

Remplacement

Le type d’activité que peut adopter une cellule CD4 naïve a déjà été étudiée in vitro et nous sommes capables aujourd’hui de modifier le comportement d’un lymphocyte T CD4 in vitro. Cependant, le comportement que va adopter un lymphocyte T CD4 in vivo peut être très différent de celui obtenu in vitro. Malheureusement, nous n’avons pas aujourd’hui les technologies nous permettant de reproduire in vitro les différents signaux complexes que peuvent recevoir les cellules naïves au sein de leur environnement proche. En effet, les mécanismes qui peuvent moduler l’activité des cellules naïves CD4 sont très nombreux et font notamment intervenir les cellules présentatrices de l’antigène (c’est-à-dire la source de danger), les cellules naïves et les cellules mémoires. Ainsi, une étape passant par un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris est nécessaire. Cette étape est notamment indispensable pour tester les mécanismes de régulation. Stratégie de remplacement : Des expériences in vitro ont déjà été réalisées au laboratoire et ont démontré que l’environnement immédiat des lymphocytes est déterminant pour leurs fonctions. Il est maintenant nécessaire de valider ces résultats dans un environnement intégré qu’est la souris.

Réduction

Nous utiliserons de façon générale 12 souris par groupe expérimental. Il s’agit d’un nombre suffisant nous permettant de surmonter les effets liés à la variabilité biologique entre les souris ainsi qu’aux variations intrinsèques liées à notre modèle. Ce nombre se base sur des expériences préliminaires déjà réalisées au laboratoire en utilisant ce modèle.

Raffinement

Tous les gestes douloureux ou nécessitant une immobilisation parfaite de l’animal seront réalisés sous anesthésie avec recours aux analgésiques si nécessaire. Lors des anesthésies, la température corporelle des animaux sera maintenue grâce à l’utilisation de tapis chauffant. Par ailleurs, pour éviter l’assèchement des yeux pendant les anesthésies, les yeux des animaux seront recouverts de vaseline officinale. Une solution de Ringer lactate préchauffée à 37°C sera administrée en fin d’anesthésie pour améliorer le réveil de l’animal. Les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil. L’état des animaux sera évalué de manière objective grâce à une grille de score permettant de définir des points-limite. L’atteinte de ces points-limite conduira à la mise en place de soins de support/analgésiques voire à la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche en immunologie pour plusieurs raisons : a) nous avons une bonne connaissance de son génome, ce qui nous permet notamment d'utiliser des souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt. b) la souris est aussi un modèle de choix du fait de la disponibilité de souches congéniques (« génétiquement proches ») et transgéniques (« génétiquement modifiées »). c) enfin, nous avons une expérience au laboratoire de plusieurs dizaines d’années sur l’étude du système immunitaire chez les souris Nous utiliserons des souris de « phénotype sauvage » (non génétiquement modifiées) mais également une lignée transgénique car cette lignée possède un plus grand nombre de cellules mémoires particulières dites « MAIT » ce qui permettrait d’observer plus facilement l’effet biologique attendu (influence des cellules mémoires sur le devenir des cellules naïves). Les souris seront utilisées à l'âge adulte (8 à 12 semaines) afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.

820 poissons zèbres juvéniles vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, certains passant deux à trois heures dans un test de mémoire dont une heure entière de stimulations électriques. Ils subissent aussi la coupe d'un fragment de nageoire caudale sous anesthésie brève, des séances d'imagerie, et pour d'autres une exposition à des agents pharmacologiques par bain ou par injection. Le porteur qualifie ces chocs de faible intensité et affirme qu'ils n'induisent pas de douleur, tout en retenant le nombre de stimulations reçues par un même individu comme l'un des deux points limites de la procédure. Les poissons expérimentaux sont tués à l'issue, les reproducteurs porteurs de la mutation liée au syndrome Kabuki étant gardés en vie pour maintenir la lignée.

Objectifs

Le syndrome Kabuki, principalement causé par un exemplaire non fonctionnel d'un gène identifié chez l’homme, est caractérisé par une déficience intellectuelle et des troubles immunologiques pour lesquels il n'existe à l'heure actuelle aucun traitement. Les mécanismes à l'origine de ce syndrome ne sont pas élucidés. Les 3 principaux objectifs du projet sont : (1) de modéliser les anomalies au niveau du système immunologique et du système nerveux du syndrome Kabuki grâce à une lignée de poissons dont l'un des 2 exemplaires du gène correspondant n’est pas fonctionnel; (2) de caractériser chez ces poissons les problèmes induits par le défaut génétique au niveau des cellules nerveuses et immunitaires, et enfin (3) de tester l’effet thérapeutique de plusieurs agents pharmacologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait d’abord valider l'utilisation du modèle pour étudier les troubles immunologiques et du système nerveux du syndrome Kabuki. Une fois ce modèle validé, il nous aidera à déterminer quels sont les gènes et les types cellulaires plus spécifiquement impliqués dans la survenue des problèmes immunologiques et nerveux associés à ce syndrome. Enfin, les tests avec des agents à visée thérapeutique réalisés à la fin de ce projet pourraient aboutir à de nouvelles pistes pour le développement de traitements pour les patients.

Procédures

L’utilisation d’une lignée de poissons-zèbre déficiente pour un gène particulier portant une mutation nécessite de vérifier la présence de cette mutation. Pour cela, une unique procédure d'identification à partir du prélèvement d’un fragment de tissu de la nageoire caudale est réalisée sous anesthésie générale brève (

Impact sur les animaux

La nageoire régénérant rapidement et spontanément chez cette espèce, le prélèvement d'un fragment de tissu de la nageoire caudale ne crée pas de gêne ou d’incapacité durable chez les animaux maintenus en hébergement. Réalisée par un personnel qualifié, elle n’induit généralement aucune douleur. Au cours des tests comportementaux, la stimulation électrique sera calibrée de façon à ne pas interrompre l'exploration spontanée des animaux selon des protocoles bien documentés qui n’induisent pas de douleur. Une attention particulière sera toutefois portée : 1) aux signes de stress, notamment lors de l’introduction dans la zone de test, et 2) au nombre de stimulations subi par un même individu lors de la phase de conditionnement. Ces deux paramètres constituent les points limites majeurs pour cette procédure. Lors des tests pharmacologiques, qui peuvent générer du stress et/ou de l’inconfort sur les animaux, le comportement de nage et la prise alimentaire des animaux expérimentaux seront donc surveillés avec attention durant et après le traitement selon des grilles de scoring adaptées.

Devenir

Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à l’issue des procédures décrites dans cette demande d'autorisation de projet, exceptés les animaux portant un exemplaire non fonctionnel du gène d'intérêt, et identifiés après une procédure de vérification de la présence de cette mutation. Ces derniers seront gardés en vie afin de maintenir la lignée à l'état hétérozygote pour assurer la reproduction lors du projet.

Remplacement

Le comportement des poissons et le fonctionnement des cellules immunitaires ne peuvent être étudiés qu’in vivo au niveau d’un organisme entier, il n’est donc pas possible de remplacer l'utilisation d'animaux vivants pour ce projet de recherche. Le comportement examiné et les cellules immunitaires d'intérêt n’étant matures qu’aux stades juvéniles, il n’est pas possible de mener cette étude à des stades précoces du développement.

Réduction

Nous réaliserons une expérience pilote chez des larves de moins de 5 jours de développement afin de déterminer quel agent thérapeutique de notre panel compense le mieux les effets de la mutation de notre gène d'intérêt chez l’espèce étudiée et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Le nombre d’individus à utiliser a été calculé afin d’obtenir des résultats fiables et statistiquement significatifs. Enfin nous avons établi des procédures en étapes successives, ce qui permet de stopper l'expérimentation dès que les objectifs scientifiques sont atteints.

Raffinement

Les poissons utilisés sont maintenus avec un seul exemplaire du gène d'intérêt non fonctionnel, ce qui permet d'éviter l'apparition de défauts dommageables pour le bien être des animaux au cours de l'expérimentation. Des grilles d'évaluation seront utilisées pour effectuer un suivi complet du bien-être des animaux selon leur aspect, leur activité, leur prise alimentaire et leur comportementet afin de définir des points limite adaptés en fonction de leur âge. Cette surveillance fine permet, à chaque étape du projet, de prendre des mesures adaptées pour réduire les nuisances sur le bien-être des animaux voire d'interrompre l'expérimentation. Une grande attention sera portée aux conditions d’hébergement et le comportement de nage ainsi que la prise alimentaire des animaux reproducteurs seront l’objet d’une surveillance régulière, trois fois par jour.

Choix des espèces

Le poisson-zèbre a été choisi pour ce projet car les processus biologiques étudiés (mémoire, immunité) ont été bien décrits chez cette espèce. De plus, une lignée de poissons mutante pour le gène d’intérêt a déjà été générée et son étude à des stades précoces a montré l’existence d'atteintes chez ces poissons semblables à celles du syndrome Kabuki. Ces résultats indiquent donc que le poisson-zèbre est un modèle de choix pour permettre à la fois d’étudier les mécanismes de la maladie humaine et de procéder à des tests pour de nouveaux agents thérapeutiques. Les poissons seront utilisés à des stades juvéniles (1 à 2 mois de vie) pour toutes les procédures décrites et sont justifiés scientifiquement par des études préalables qui ont démontré que : 1) le comportement que nous allons tester chez les poissons mutants se développe seulement à partir de 3 semaines de vie, et que 2) concernant l’étude immunologique, les cellules d’intérêt sont impliquées dans la régénération de la nageoire entre 3 et 8 semaines de vie. Une étude pilote utilisant des jeunes larves sera également menée afin de sélectionner de façon rapide et fiable le(s) meilleur(s) candidat(s) parmi les agents pharmacologiques à tester ensuite à des stades plus tardifs.

Toutes tuées à l'issue pour des analyses histologiques, 900 souris porteuses d'une mutation qui reproduit la maladie d'Alzheimer vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines subissent une chirurgie cérébrale d'une heure pour marquer les nouveaux neurones, d'autres un gavage suivi de quatre prélèvements espacés d'une heure, dont le porteur reconnaît que la douleur dure quelques jours jusqu'à cicatrisation. L'objet est de comparer l'effet d'un accès volontaire à une roue d'exercice selon qu'il commence à l'adolescence ou à l'apparition des troubles de mémoire. Les roues sont retirées la journée, et les trois tests comportementaux censés mesurer la mémoire ne sont pas nommés.

Objectifs

Le projet vise à étudier si l'exercice physique volontaire, pratiqué avant ou après le développement post-natal du cerveau, c’est à dire pendant ou après l’adolescence, déclenche des mécanismes biologiques différents et responsables d’effets bénéfiques sur le cerveau. Des données cliniques et épidémiologiques montrent que l'activité physique est une stratégie efficace pour promouvoir le vieillissement en bonne santé et ralentir le déclin de mémoire lié à certaines maladies neurologiques, comme la maladie d'Alzheimer (MA). L'exercice, tant chez les animaux que chez les humains, est une composante accessible de l’hygiène de vie. Il favorise un état anti-inflammatoire, améliore la fonction antioxydante et stimule la plasticité du cerveau. De plus, des facteurs sanguins sécrétés après l'exercice contribuent à son action neuroprotectrice : une étude a montré que le transfert de sang d'une souris active à une souris sédentaire imite les effets de l'exercice au niveau du cerveau, soulignant son effet systémique. Le microbiote intestinal, modifié par l'exercice, pourrait également jouer un rôle crucial dans la promotion de la santé. Comprendre quand et comment l'exercice retarde l'apparition de la MA est crucial pour développer des stratégies thérapeutiques efficaces. Nous faisons l’hypothèse que la période de la vie durant laquelle l'activité physique est pratiquée a une influence sur les bénéfices engendrés pour prévenir ou ralentir le déclin de mémoire. Des données de la littérature suggèrent que comparé à l'exercice à l'âge adulte, l'exercice à l'adolescence affecte différemment les processus de mémoire et la plasticité du cerveau chez les rats adultes. Ainsi, nous examinerons d’abord si une activité physique volontaire à l'adolescence ou au début de l'âge adulte entraîne un effet optimal sur le ralentissement du déclin de mémoire dans le modèle murin de la MA, à l’aide de tests comportementaux. Ensuite, nous explorerons les changements biologiques (centraux et périphériques) induits par l'exercice, susceptibles d’engendrer des effets différents sur la mémoire, à l'âge adulte.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à fournir des perspectives complètes sur l’impact de l'exercice physique dans la maladie d'Alzheimer (MA) en utilisant un modèle murin. En comparant l’impact de l’activité physique initiée pendant l'adolescence ou au début des symptômes de la MA sur la mémoire, nous déterminerons la période de vie pendant laquelle l’activité sportive a un effet optimal. Les investigations moléculaires rechercheront des changements dans certains mécanismes cérébraux décisifs pour les processus de mémoire, qui sont affectés dans la MA et qui pourraient être rétablis par l’exercice physique. L’étude de marqueurs périphériques circulants permettra d’identifier des mécanismes spécifiques activés par l'exercice ayant pour effet de protéger le cerveau. L’analyse des changements du microbiote permettra d’établir des profils de présence et/ou absence de certains marqueurs (changement dans la proportion de bactéries, changement dans la perméabilité intestinale …) en fonction des différents groupes. Finalement, cette recherche vise à approfondir notre compréhension du décours et des mécanismes induits par l'exercice physique et permettant d’améliorer la résistance du cerveau malgré la MA, ce qui pourrait éclairer de futures stratégies thérapeutiques.

Procédures

Certains animaux auront un gavage oral qui dure 30 secondes. Ces mêmes animaux auront 4 prélèvements espacés de 1h chacun. Pour certains animaux, 3 tests comportementaux seront effectués au cours de 2 à 3 semaines. Ils peuvent induire du stress du fait du déplacement des souris vers de nouvelles pièces et de la mise en contact avec de nouveaux objets. Pour limiter ce stress, les souris disposeront de périodes d’habituation aux pièces et aux dispositifs expérimentaux. Pour chaque souris, le temps maximal de tests sera limité à 1h30 par jour. Deux jours de manipulation sont également prévus afin que les souris s’habituent à l’expérimentateur dans la salle des tests comportementaux. Pour certains animaux, une injection sera réalisée par jour, pendant 4 jours consécutifs. La prise en contention et l’injection sont susceptibles de causer un stress léger, ainsi qu’une douleur légère qui dure environ 2 minutes. Finalement, certains animaux seront soumis à une chirurgie permettant de marquer des nouveaux neurones. Chaque chirurgie durera 1h maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables peuvent être dus à l’activité physique qui peut induire une légère perte du poids. Aussi, la prise en contention des animaux est susceptible de causer un stress léger. Certains animaux recevront une substance par gavage oral. Cette procédure représente une nuisance légère pour l’animal en raison de l’insertion d'une sonde dans l'œsophage. Ces mêmes animaux, auront des prélèvements qui peuvent induire une douleur légère. Ces prélèvements sont répétés 4 fois, avec un intervalle de 1h entre chaque. La douleur due aux prélèvements dure quelques jours jusqu’à cicatrisation de la plaie. Ceci représente une nuisance modérée car les prélèvements sont réalisés juste après le gavage. Certains animaux seront évalués dans des tests comportementaux. Ceux-ci ne provoquent qu’un stress léger ou modéré pour les animaux. De plus, pour quelques animaux, des injections sont susceptibles de causer une légère douleur. Ceci représente une nuisance légère. D’autres souris seront soumises à une chirurgie. Des effets indésirables de cette procédure peuvent se traduire par une altération de l’état général de l’animal : isolement, indifférence par rapport au milieu extérieur, diminution du comportement exploratoire ou une perte de poids. De plus, les chirurgies peuvent induire une douleur modérée au stade post opératoire durant quelques jours. Ceci représente une nuisance modérée.

Devenir

A l’issue des procédures expérimentales, les animaux seront mis à mort en vue d’analyses histologiques quantitatives.

Remplacement

Le projet a pour but d’évaluer, in vivo, l’impact de la période de la vie de l’animal (à l’adolescence ou au début des symptômes mnésiques à l’âge adulte) où l’exercice physique ralenti de façon optimale le déclin de mémoire associé à la MA. Un aspect important de ce projet est donc de pouvoir mesurer les capacités mnésiques des souris après l’exercice physique. Pour cela, un modèle animal est indispensable. De plus, nous allons étudier l’impact de l’activité sportive sur la physiologie de l’animal au niveau central (cerveau) et périphérique (sang, intestin…) où un dialogue et des interactions complexes se produisent entre le cerveau et les organes, des processus qui ne sont pas modélisables à ce jour.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe (n= 15) a été déterminé sur la base de nos études antérieures chez ce modèle murin et à l’aide de la littérature correspondante. Ce nombre est réduit au minimum pour permettre d’obtenir une puissance statistique suffisante pour les analyses statistiques nécessaires aux comparaisons intergroupes (8 groupes) et intra-groupes (comparaison des prélèvements à différents moments de la vie de l’animal). Ce nombre prend également en compte l’éventualité certains animaux ne montreront pas d’exercice physique volontaire en présence de la roue et seront donc retirés de l’étude. Ce nombre prend aussi en compte l’existence d’une variabilité inter-individuelle dans les études comportementales. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les animaux seront testés dans plusieurs tests comportementaux et nous utiliserons les mêmes animaux pour les études comportementales et post-mortem.

Raffinement

Les souris sont hébergées par 4 ou par 2 dans des cages contenant du matériel de nidification ainsi qu’une buchette pour l’enrichissement. Les roues d’exercice seront retirées pendant la période d’inactivité (la journée) pour encourager le repos des animaux. Pour limiter le stress lié au déplacement des souris vers de nouvelles pièces et à la mise en contact avec de nouveaux objets lors des tests comportementaux, les souris disposeront de périodes d’habituation aux pièces et aux dispositifs. Pour chaque souris, le temps maximal de tests sera limité à 1h30 par jour. Deux jours de manipulation sont également prévus afin que les souris s’habituent à l’expérimentateur dans la salle des tests comportementaux. Une attention particulière sera portée aux souris pendant les périodes d’exercice physique où le poids sera surveillé 1 fois par semaine et comparé au poids de référence avant le début de l’activité sportive. De plus, les animaux seront suivis quotidiennement par des personnes formées au soin. Les critères évalués sont l’aspect général de l’animal (pelage, peau, yeux, bouche), les fonctions corporelles (respiration), le comportement (posture, locomotion, réaction à la manipulation, isolement) et le poids (pesée une fois par semaine). Pendant les chirurgies, les animaux seront placés sur une couverture chauffante permettant de contrôler leur température corporelle. Un gel oculaire sera appliqué afin d’éviter le dessèchement des yeux. Les animaux seront surveillés jusqu'à leur réveil complet (déplacements spontanés dans la cage, prise d'eau et de nourriture) et 6 heures plus tard. Après l’opération, l’animal sera isolé dans une cage propre contenant du papier ; il sera maintenu au chaud en prêtant une attention particulière à son hydratation et son état sera contrôlé. Les souris recevront une injection d'anti-inflammatoire après la chirurgie et le lendemain pour éviter les éventuelles douleurs post-opératoires. La cicatrisation de la plaie sera également contrôlée dans les jours suivant la chirurgie.

Choix des espèces

Dans cette étude, nous utiliserons une lignée de souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer (MA). Cette lignée est l'un des modèles précliniques de MA les plus étudiés, en raison de l’évolution progressive de la pathologie, qui ressemble à ce qui est observé chez les patients atteints de MA. Les souris de cette lignée développent avec l’âge des plaques amyloïdes, comme chez le patient. Cette lignée constitue donc un modèle idéal pour étudier l’impact de l’exercice physique à diverses périodes de la vie, sur le déclin de mémoire lié à l’âge dans la MA. Les animaux les plus jeunes inclus dans le projet auront 28 jours (P28) (soit plusieurs jours après le sevrage) et les animaux les plus vieux auront 10 mois (adulte). Nous allons évaluer l’impact de l’exercice physique sur le déclin de mémoire lié à la MA en fonction la période de vie à laquelle l’exercice est pratiqué : pendant le développement post-natal (P28) ou au début des symptômes cognitifs (à 6 mois). Ceci explique que des animaux jeunes mais sevrés (P28) soient nécessaires.

Gavées chaque jour pendant trois jours, ou nourries pendant quatre-vingt-dix jours avec des contaminants alimentaires, 1 048 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des prélèvements à la veine faciale sous anesthésie, sept prises de sang lors d'un test de tolérance au glucose et des pesées hebdomadaires, pour mesurer si perfluorés, phtalates, bisphénols et pesticides activent ensemble des récepteurs impliqués dans l'obésité. La plupart sont tuées par dislocation cervicale, une partie des femelles étant gardée pour l'entretien de la lignée et une partie des animaux surnuméraires utilisée pour l'entraînement aux gestes techniques. Le porteur écrit n'attendre "pas de nuisances particulières", sans expliquer ce qui vaut à 256 d'entre elles un niveau de souffrance modéré.

Objectifs

Les maladies métaboliques, telles que le diabète et l’obésité, sont en constante augmentation dans les pays industrialisés. L'origine de ces maladies est complexe et multifactorielle. Les causes premières d’apparition de ces troubles, lorsqu’ils ne sont pas d’origine génétique, sont liées à une alimentation riche en sucre et en gras et à un mode de vie sédentaire. L’exposition à certains produits chimiques, dits « obésogènes environnementaux » est également suspectée de jouer un rôle dans l’apparition et/ou l’évolution de ces maladies. Un certains nombre de senseurs appelés les récepteurs nucléaires jouent un rôle important dans la régulation de l'équilibre énergétique et pourraient être des médiateurs des effets de ces « obésogènes environnementaux » sur le développement de troubles métaboliques. Les contaminants étudiés sont les composés perfluorés, les phtalates, les bisphénols, les organoétains et les pesticides connus pour leur caractère obésogène et identifiés sur la base tests en laboratoire sans animaux, réalisé par un partenaire du projet. Ces composés seront administrés seuls puis en mélange par gavage oral à des souris exprimant ou non certains récepteurs nucléaires en aigu (3 jours) ou en chronique (90 jours). Des analyses sur les perturbations métaboliques induites par l’exposition à ces contaminants seront réalisées.

Bénéfices attendus

Ces données permettront d’évaluer l’impact d’expositions à des contaminants alimentaires sur l'activation des récepteurs nucléaires et sur les perturbations métaboliques qui en découlent. Les expositions aiguës permettront de mettre en évidence un éventuel effet combiné dans l'activation d'un récepteur nucléaire donné. Les expositions chroniques de 90 jours permettront de déterminer si les mêmes récepteurs sont activés de la même manière lors d'expositions à plus faibles doses sur des temps plus longs et de rechercher les différentes perturbations métaboliques qui peuvent en découler.

Procédures

Pour les 3 expositions aiguës, les souris seront exposées à des contaminants par gavage quotidien (30 secondes) pendant 3 jours. Un prélèvement à la veine faciale submandibulaire sera effectué sous anesthésie générale (30 secondes). Pour l'exposition chronique, les souris seront exposées à des contaminants par l'alimentation pendant 90 jours. Elles seront pesées chaque semaine pendant toute la durée de l'expérimentation (ce qui correspond à environ 13 pesées de 30 secondes). Sept prélèvements d'une goutte de sang seront réalisés pendant le test de tolérance au glucose, sous pommade anesthésique. Un prélèvement à la veine faciale submandibulaire sera effectué sous anesthésie générale. Ce prélèvement dure environ 30 secondes.

Impact sur les animaux

Nous n’attendons pas de nuisances particulières chez les animaux exposés. Les expositions seront à des doses ne présentant pas de toxicité pour les animaux. Un stress peut être généré par la manipulation et la contention des souris.

Devenir

Les animaux ayant servi à l'expérimentation sont euthanasiés par dislocation cervicale au terme de l'expérimentation. Nous conserverons une partie des femelles pour l’entretien de la lignée et une partie des animaux surnuméraires sera utilisée pour de la formation aux gestes techniques.

Remplacement

Les tests en laboratoire sans animaux, réalisés par une équipe partenaire permet une sélection de seulement 16 molécules ayant montré un potentiel synergique auxquelle s'ajouteront 4 molécules de référence. Cependant, seule une approche avec des organismes vivants entiers est capable d’évaluer les conséquences de l'activation synergique de récepteurs nucléaires et les dérégulations métaboliques qui en découlent.

Réduction

Chaque étape de protocole vise à sélectionner les molécules présentant un potentiel synergique élevé pour les étapes suivantes passant de 20 molécules avec 5 doses à 8 molécules avec une seule dose. Si aucune molécule ne synergise ou n'active un récepteur donné, aucune molécule ne sera sélectionnée pour ce récepteur, réduisant ainsi le nombre de lots prévu lors des procédures suivantes.

Raffinement

La mise en place de d'abris en inox permettra aux animaux de s'isoler au besoin. Les animaux seront observés quotidiennement par les zootechniciens et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront habitués à la préhension par les zootechniciens. Un analgésique local est prévu pour les prélèvements de sang pendant le test de tolérance au glucose. Une anesthésie générale est prévue pour les prélèvements de sang précédant la mise à mort. En cas d’atteinte d’un des points limites établis, l'animal sera retiré de l'étude, anesthésié et euthanasié si les lésions observées sont jugées irréversibles . Les animaux seront hébergés sans dépasser 6 adultes par cage conformément recommandations liées au bien-être animal.

Choix des espèces

Nous utiliserons pour ce projet des souris d'une lignée particulièrement adaptée aux les études de perturbations métaboliques. Ce fond génétique nous permet d’utiliser des souris invalidées pour les récepteurs nucléaires d'interet, de manière à mieux évaluer leurs rôles dans les perturbations métaboliques induites par l’exposition aux contaminants alimentaires. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte car nous nous intéressons à l'effet des contaminants sur le métabolisme de l'individu adulte.