Recherche appliquée

Des souriceaux nouveau-nés séparés de leur mère jusqu'à quatre heures, stimulés au pinceau puis au laser infrarouge au niveau du tronc cérébral: 708 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, tuées pour des analyses post-mortem. Les mères reçoivent des injections intrapéritonéales d'anesthésique et se voient retirer une partie de leur portée. Le projet cherche à comprendre pourquoi les souriceaux modèles du syndrome de Prader-Willi tètent mal et comment l'ocytocine rétablit la tétée, un essai clinique de phase 3 étant déjà en cours chez des bébés. Trente femelles sont réutilisées pour quatre à cinq portées avant d'être tuées, et 312 autres souris sont utilisées pour la reproduction de huit lignées puis tuées vers l'âge de six mois.

Objectifs

Ce projet porte sur la compréhension de mécanismes physiopathologiques impliqués dans la tétée chez des souris modèles d’une maladie rare (le syndrome de Prader-Willi) et le rôle d’une hormone qui restaure une activité de tétée normale. En effet, il a été montré qu’il y a un dysfonctionnement de l’activité de tétée chez les souris modèles d’une maladie rare, tout comme cela a été observé chez les bébés Prader-Willi et que l’administration de l’hormone étudiée rétablie une tétée normale chez ces souriceaux. Ces études précliniques ont engendré des essais cliniques (PhaseI/II) chez des enfants atteints du syndrome de Prader-Willi, il résulte une amélioration (voire normalisation) de l’activité de succion. Toutefois le mécanisme d’action de cette hormone dans l’activité de tétée n’a jamais été investigué Les études associées à ce projet permettront d’identifier les altérations sensorielles ou motrices lors de la tétée chez les souriceaux modèles du syndrome de Prader-Willi, d’étudier comment l’hormone étudiée restaure une tétée normale chez ces souriceaux et quelles régions du cerveau sont activées, et donc d’argumenter l’intérêt d’utiliser cette hormone et définir les conditions optimales pour traiter les bébés Prader-Willi. Ce projet comprend 6 procédures. Au total, 708 souris, dont 678 issues de 164 croisements que nous effectuerons et 30 femelles provenant d'un fournisseur agréé, seront expérimentées.

Bénéfices attendus

Les bébés Prader-Willi présentent dans plus de 95% de cas un déficit de l’activité de tétée qui nécessite une intubation de quelques semaines. Cette intubation peut avoir des conséquences sur le développement et le comportement de ces enfants. Nos études précliniques ont montré que l’administration sous-cutanée d’une hormone (une seule administration à la naissance), permet de restaurer une activité normale de tétée chez les souriceaux modèles du syndrome de Prader-Willi et une amélioration dans le comportement cognitif et social de ces souris plus tardivement. A partir de ces études précliniques, une étude clinique de phase I/II a été mené chez des bébés Prader-Willi montrant une normalisation de la tétée chez ces bébés; une étude clinique en phase 3 est en cours. Il s’agit ici d’un projet qui est focalisé sur la tétée pour comprendre quelles sont les altérations mécaniques ou sensorielles qui empêchent les souriceaux modèles du Syndrome de Prader-Willi de téter normalement et comment une administration de l’hormone étudiée agit sur le plan fonctionnel (sensoriel ou moteur) et sur l’activité neuronale du cerveau pour rétablir une tétée normale chez ces souriceaux. Ce projet amènera : 1) une compréhension des mécanismes fonctionnels et cellulaires du déficit de la tétée dans un modèle du syndrome de Prader-Willi et par extension chez les bébés Prader-Willi ; 2) de mieux comprendre, en général, les mécanismes sous-jacents à l’activité de tétée qui est très peu étudiée ; 3) d’élucider comment l’administration de l’hormone étudiée corrige ce déficit; 4) plus généralement elle nous révèlera le rôle du de tout un système hormonal dans la tétée et cela nous permettra d’envisager d’élargir le traitement à des bébés qui présentent un déficit de tétée à la naissance (soit 10% des nouveau-nés). Les résultats attendus permettront donc de comprendre et de proposer un traitement approprié (en connaissance de cause) du déficit de tétée chez les bébés Prader-Willi mais aussi dans d’autres pathologies qui présentent un déficit de tétée. Cet aspect translationnel est vraiment très important.

Procédures

Sur les mères, les interventions sont : Les injections intra-péritonéales d’anesthésique sur femelles allaitantes. La séparation avec une partie de leurs nouveau-nés pour quelques heures (même si une partie des nouveau-nés restent avec elles). Sur les nouveau-nés, les interventions sont : Les injections sous cutanée sur les nouveau-nés. L’isolement de la portée de souriceaux de leur mère pendant 4 heures maximum. La manipulation des souriceaux pendant le test de saisie de tétine, La stimulation tactile des nouveau-nés à l’aide d’un pinceau. La stimulation externe (au niveau du tronc cérébral) de nouveau-nés à l’aide d’un laser Infra-rouge (peu énergétique) faite sur animaux non contraints Sur les souris génétiquement modifiées lors du maintien de lignée : caudectomie ; tatouage Il n'y a aucune procédure chirurgicale dans cette DAP. Un prélèvement de queue sera effectué sur animaux vigiles dans le cadre du génotypage si le génotypage ne fonctionne pas à partir d’une touffe de poils prélevée sur l’individu (des mises au point sont en cours) mais concernera au grand maximum 312 souris.

Impact sur les animaux

Les injections intra-péritonéales d’anesthésique sur femelles allaitantes peuvent représenter, comme toute injection, une nuisance par leur caractère douloureux. Malgré le temps très court de cette nuisance (

Devenir

Pour l’ensemble des animaux expérimentés en Procédures 1, 2, 4, 5 la mise à mort est justifiée par des analyses post-mortem sur des tissus prélevés. Procédure 3: 30 femelles réutilisées qui, après une première portée, seront utilisées deux fois dans notre étude et pourront aussi être utilisées comme génitrices 2 fois supplémentaires. Après 4 à 5 portées, les femelles seront euthanasiées. Procédure 6: 312 souris seront utilisées comme géniteurs (rices). Il s’agit du maintien de 8 lignées sur 4 ans et d’animaux qui seront géniteurs pour produire les animaux qui seront expérimentés. Ces animaux seront euthanasiés à l’âge adulte vers 6 mois.

Remplacement

Ce projet porte sur la physiologie et physiopathologie de la tétée qui est altérée dans la majorité des maladies neurodéveloppementales et en particulier dans le syndrome de Prader-Willi, qui est notre sujet d’étude. Il n’y a, à ce jour, aucune alternative à l’utilisation de mammifères pour conduire ce type d’étude. La stratégie de l’équipe a consisté en particulier à travailler sur le modèle de souris génétiquement modifié (qui mime ce déficit de tétée) et nous prenons en compte les analyses faites en parallèle sur les bébés Prader-Willi afin d’apporter le maximum de réponses pour comprendre les mécanismes mis en jeu en situation normale et pathologique et, ainsi, mieux traiter les patients.

Réduction

L'utilisation de souris qui sont identiques sur le plan génétique (ici une souche particulière de souris de laboratoire) permet de réduire la variabilité et donc le nombre d'animaux utilisés. Les tests comportementaux présentent par nature une variabilité interindividuelle importante, encore plus avec les souriceaux à la naissance. Nous utiliserons des femelles qui ont déjà donné naissance à au moins une portée, pour favoriser le comportement maternel et ainsi optimiser le taux de survie des souriceaux. Notre importante expérience pour les tests de comportement depuis plus de 10 ans montre qu’il est généralement nécessaire d’utiliser des effectifs de 15-20 animaux par groupe, dans le test de saisie de tétine, pour valider la démarche statistique. En ce qui concerne les expériences pour étudier l’anatomie du cerveau ou l’activité électrique de neurones, nous utiliserons 6 animaux par condition. Le fait de ne pas distinguer les souriceaux mâles et femelles dans nos analyses (les travaux antérieurs ne montrent pas d’effet sexe sur le comportement de tétée) nous permet de diminuer de moitié le nombre de portées étudiées.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, dépourvu de pathogènes spécifiques. La température et l’hygrométrie sont contrôlées, avec un cycle de lumière de 12h. Les cages enrichies avec du matériel de nidification (dôme et coton) et la présence d'objets (cylindre carton). Les souris sont entre 2 et 4 par cage, mais pas isolées ou exceptionnellement mais moins de 48 heures. La douleur/souffrance des animaux adultes et souriceaux est évalué quotidiennement via l'observation de leur aspect (poil hirsute, position voutée, yeux fermés) et de leur comportement (apathie, agressivité, absence de nidation, ou déplacement la pointe des pattes) en suivant la Grille de Score. Les souriceaux qui réaliseront le test de saisie pourront être isolés de leur mère pendant 20min à 1h. Pendant le temps de séparation de leur mère, les 4 souriceaux seront déposés dans un bac approprié, avec une partie de la litière et du nid de la cage maternelle (pour maintenir les odeurs maternelles) et en posant ce bac sur une plaque chauffante à 38°C pour maintenir le nid à 36°C malgré l’absence de la femelle et ainsi éviter un stress thermique des souriceaux. Sachant que seul 4 petits par portée seront testés, la mère reste dans la cage avec n-4 souriceaux (n étant le nombre de nouveau-nés), ce qui permet de diminuer le stress éventuel de la mère. Lors des injections sur les souriceaux au jour de la naissance et lors du tatouage des animaux de la procédure 6, un analgésique sera appliqué sur la peau pour diminuer la sensation de douleur.

Choix des espèces

L’étude que nous menons, dans le contexte pathologique, sur les déficits de tétée et l’effet de l’ocytocine dans des conditions physiologiques et pathologiques ne peut pas être menée sur des modèles in vitro ou via des modélisations. Cette étude évalue des paramètres de comportement de tétée ainsi que l’anatomie du cerveau. Il est donc nécessaire d’étudier des mammifères, en particulier des modèles de souris de la maladies rare qui nous intéresse mais aussi d’avoir la possibilité de travailler sur des modèles de souris génétiquement modifiés. A ce jour, la souris est donc le modèle le plus adapté à ce type d’étude. Les stades choisis sont le jour de la naissance car le déficit de tétée observé chez les bébés Prader-Willi démarre à la naissance (tout comme dans le modèle souris étudié) et des souris femelles adultes, mères des nouveau-nés étudiés, sont aussi expérimentées.

Toutes tuées à l'issue, une partie sans même être analysée puisqu'elle ne sert qu'à l'entretien de la lignée, 384 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris transgéniques développent spontanément des lymphomes et des adénocarcinomes intestinaux dans leur première année de vie, avec grossissement de la rate, du thymus et du foie, occlusions intestinales et amaigrissement. Elles reçoivent jusqu'à quarante injections intrapéritonéales sur huit mois, vigiles, et alternent chaque mois deux semaines de régime gras et deux semaines de régime standard, cette alternance servant à faire apparaître plus souvent le type de tumeur étudié. Le porteur affirme qu'on ne peut pas recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier" et conclut qu'il est "nécessaire" de travailler in vivo.

Objectifs

Les cancers MSI (pour microsatellites instables), sont des tumeurs fréquentes, présentant des niveaux élevés de mutations notamment dans des séquences répétées microsatellites. Ces tumeurs sont caractérisées par la perte de l’activité du système de réparation de l’ADN appelée MMR (pour MisMatch Repair). Dans ce type de tumeurs, nous avons rapporté l’effet d’une mutation dans un gène codant pour une protéine dont le rôle est de protéger la cellule d’agressions et stress. La mutation de ce gène présente dans 25 pourcents des tumeurs des patients atteint de cancer MSI, affaiblis la cellule tumorale, tandis que son absence est associée à une résistance des tumeurs aux traitements de chimiothérapie. Avec ce projet nous voulons trouver une nouvelle piste thérapeutique pour les patients atteints de cancer MSI qui présente une mutation dans ce gène et qui donc est résistante à la chimiothérapie. Nous espérons expliquer comment les cellules tumorales utilisent cette protéine pour se défendre des dommages induits par les agents de chimiothérapie. Dans ce projet, nous testerons l'hypothèse selon laquelle la perte de fonction de la protéine influence la sensibilité des cellules tumorales aux chimiothérapies via la modulation de l'activité métabolique de la cellule. D’un point de vue fondamentale ce projet vise à améliorer nos connaissances des mécanismes de résistance à la chimiothérapie de certaines cellules tumorales. D’un point de vue clinique ce projet ouvre à terme des nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de patients atteints de cancers coliques de type MSI.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’élucider dans un point de vue fondamentale et clinique, le rôle du métabolisme dans la réponse à la chimiothérapie des patients atteints de cancers coliques de type MSI (pour Microsatellites instables). Les cancers MSI (pour microsatellites instables), sont des tumeurs fréquentes, présentant des niveaux élevés de mutations notamment dans des séquences répétées microsatellites. Ces tumeurs sont caractérisées par la perte de l’activité du système de réparation de l’ADN appelée MMR (pour MisMatch Repair). Des préliminaires montrent que dans environs 75 pourcents de ces types de tumeurs, le métabolisme et la protéostasie c’est-à-dire la biogenèse, le repliement, le trafic et la dégradation des protéines, seraient associé à une mauvaise réponse au traitement de chimiothérapie et ceci via une protéine spécifique que nous étudions ici. Les résultats que nous obtiendrons ouvriront à terme des nouvelles pistes thérapeutiques pour ce type de cancer

Procédures

Les modèles murins transgéniques utilisés développent spontanément des cancers dit MSI pour microsatellites instables (lymphome et adénocarcinome) dans la première année de vie. Les animaux recevront un régime riche en gras à raison de 2 semaines par mois et retrouveront un régime classique les 2 semaines suivantes tout au long du projet. Les animaux recevront différents traitements par injections intrapéritonéales sur animal vigile à raison de 5 injections par mois pendant maximum 8 mois (soit 40 injections maximum). Dès l’apparition de signes évocateurs du développement d’une tumeur, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements pour répondre à la question scientifique.

Impact sur les animaux

Les modèles murins transgéniques utilisés développent spontanément des cancers dit MSI pour microsatellites instables (lymphome et adénocarcinome) dans la première année de vie. Les effets indésirables sont donc principalement liés à ce développement tumoral. Les principaux symptômes du lymphome sont une augmentation de la taille des organes comme la rate, le thymus et le foie ainsi que dans certains cas des ganglions qui se manifeste généralement par une prise de volume au niveau abdominale/cou. Pour l’adénocarcinome intestinal, il s’agit d’une tumeur qui reste localisé et n’envahi pas les tissus/organes à distance (pas de métastase). Les souris dans ce contexte peuvent faire des occlusions intestinales qui se manifeste généralement par un amaigrissement. L’alternance entre régime standard et régime riche en gras pourra induire un léger stress en raison du changement d’alimentation (néophobie de la souris). L’administration des différents traitements par injection intrapéritonéale pourront induire un stress et une douleur de courte durée lié à la piqure de l’aiguille. Les traitements devraient réduire les effets liés au développement tumorale (lymphome et adénocarcinome) avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités.

Devenir

À la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés selon des méthodes réglementaires adaptée afin de prélever des tissus pour analyse. Une partie des animaux ne seront pas analysés puisqu’ils seront euthanasiés dans le cadre de l’entretien de la lignée.

Remplacement

La mise en œuvre de ce projet n’est aujourd’hui possible que grâce à l’obtention préalable de données in vitro. A ce stade de nos recherches, il est important tester notre hypothèse sur un modèle in vivo afin d’ouvrir à terme une nouvelle piste thérapeutique. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Dans le cas d’un projet qui vise à étudier l’effet d’une nouvelle molécule et l’implication du métabolisme dans la réponse à la chimiothérapie, il est nécessaire de travailler sur un modèle in vivo car mieux adaptés à l'observation des effets globaux sur un sujet vivant et en particulier pour ce qui concerne l’initiation et la progression tumoral ainsi que les effets autres qui pourraient se manifester sur l’organisme.

Réduction

Le projet impliquera un total de 384 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. En effet, en se basant sur les données de la littérature nous avons choisi de mettre en une étude séquentielle afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Dans un premier temps, un premier lot d’animaux sera inclus pour définir la concentration optimale des traitements. Dans un second temps, nous évaluerons l’impact de ces traitements à leur concentration optimale sur nos modèles transgéniques. Cette stratégie permettant de réduire significativement le nombre d’animaux impliqués. De plus, l’utilisation de la stratégie du riche en gras de manière alterné permet d’accroitre la fréquence du développement de l’un des types de tumeur qui nous intéresse, ce qui permet de réduire la taille des groupes à 20 souris. Il apparait nécessaire de mettre en observation 20 souris par groupe pour espérer mettre en évidence un impact significatif du traitement dans le cadre de notre expérience en restant respectueux de la règle des 3R. Nous utiliserons différents tests statistiques pour l’interprétation fiable de nos résultats.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite). Les contraintes induites par le manipulateur dans ce protocole sont faibles (uniquement l’injection des traitements). Elles sont réalisées par du personnel formé et compétent et avec du matériel adapté en condition stérile. Durant les phases de traitement la surveillance sera augmentée afin de mettre en évidence toute intolérance liée au traitement. Un suivi pondéral des animaux sera réalisé afin de mettre en évidence une éventuelle perte/prise de poids. La principale douleur pouvant être subit par les animaux concerne surtout le développement naturel des tumeurs. Ainsi, grâce au suivi et à la très bonne connaissance des modèles murins utilisés, nous pouvons détecter les premiers signes d’un développement tumoral. Dans ce cas, les souris seront immédiatement euthanasiées.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Les souris sont des animaux modifiables génétiquement et qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Pour notre projet, l'utilisation des modèles murins est la seule approche permettant d'intégrer le développement tumoral MSI et la complexité de la réponse aux traitements de chimiothérapie. Justification des stades : Les études se feront avec des animaux adultes. Les animaux impliqués dans la mise au point des traitements seront des animaux commerciaux utilisées à partir de 8 semaines de vie. Nous avons choisi cet âge pour tester la toxicité du traitement sur des animaux relativement jeunes afin d’envisager pour la dose un traitement préventif si besoin. Les modèles animaux qui développent des tumeurs spontanément rentreront dans le protocole de traitements à partir d’environs 8-10 semaines. Les souris auront alors atteint un poids et une taille favorable pour pouvoir bien supporter le traitement de chimiothérapie. De plus, grâce à notre expérience de ces modèles, nous savons que l’âge moyenne d’apparition des signes cliniques liés au développement de la pathologie est de 180 jours, ainsi la mise en œuvre d’un traitement à partir de 8-10 semaines nous permettra d’évaluer l’efficacité d’un traitement curatif ainsi que préventif.

Pour tester la tolérance et l'efficacité de cinq molécules destinées à des maladies rares de la cornée, 2 400 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à différents délais pour prélever leurs tissus oculaires. Les lésions de la cornée sont provoquées sous anesthésie générale et locale, ou par exposition aux rayons ultraviolets B, puis suivies d'examens répétés de l'œil jusqu'au seizième jour et d'injections sous la conjonctive. Les collyres sont instillés dans les deux yeux sur animal vigile, maintenu de force. La douleur est mesurée par un test de retrait de la patte sous pression, et le porteur reconnaît qu'après l'induction des modèles les rats sont susceptibles de souffrir et de développer une infection de la surface oculaire avec rougeurs et sécrétions.

Objectifs

Le défaut de cicatrisation de la cornée est le dénominateur commun de nombreuses maladies oculaires rares, ce qui représente un problème médical critique et un domaine où les besoins médicaux sont largement insatisfaits. Dans des maladies rares de la cornée, une inflammation, la croissance de nouveaux vaisseaux, une innervation défectueuse et un œdème conduisent à une perte de la transparence entraînant une baisse de la vision et la cécité. A ce jour, les traitements disponibles sont peu efficaces et provoquent des effets indésirables. Les objectifs dans ce projet de recherche sont d’investiguer et de proposer de nouvelles alternatives pour le traitement de maladies affectant la surface oculaire. Ainsi, la tolérance et l’efficacité de composés nouveaux et déjà existants seront évaluées dans des modèles expérimentaux animaux afin de comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces maladies ainsi que les mécanismes d'action des traitements proposés.

Bénéfices attendus

Ce projet consiste en des tests précliniques de toxicité et d’efficacité en utilisant des modèles expérimentaux animaux pertinents qui doivent être réalisés au préalable pour évaluer la sécurité et l'efficacité de ces médicaments avant d’aller chez l’homme. Les maladies oculaires, de manière générale, ont tendance à provoquer de nombreux effets délétères chez les patients touchés, en plus du risque de cécité permanente. Cependant, parmi le vaste groupe de maladies pouvant affecter l'œil, il en existe certaines qui sont considérées comme rares et qui, malgré leur gravité, ne sont généralement pas une priorité en termes de recherche et de développement, précisément en raison de leur faible incidence et prévalence dans la population en général. En Europe, environ 30 millions de personnes souffrent de cécité et de déficience visuelle. Il est estimé qu’il y a environ 500 000 patients qui souffrent de maladies rares de la surface oculaire, ce qui représente environ 1.7 pour cent de la population totale atteinte de déficiences visuelles et de cécité eu Europe. Parmi ces maladies rares, la néovascularisation cornéenne conduisant au rejet de greffe et à la cécité représente une prévalence de 1 à 10 cas pour 50 000 personnes. Le déficit en cellules souches limbiques, une autre maladie rare de la surface oculaire dans laquelle les patients présentent une altération de la cicatrisation épithéliale cornéenne et des ulcères cornéens chroniques pouvant mener à des perforations cornéennes, représente une prévalence de 1 cas pour 8 000 personnes en Europe. Dans ce contexte, les études précliniques revêtent d’une importance primordiale pour filtrer et proposer des schémas thérapeutiques qui pourront être transposés aux patients, tout en garantissant la sécurité des doses proposées avec le moins d'effets indésirables possible. Tous les médicaments suggérés présentent des données préliminaires montrant des effets remarquables dans la restauration de la physiologie cellulaire, immunitaire, avasculaire, neuronale et environnementale de signalisation dans la cornée dans le contexte de maladies rares, depuis les modèles animaux jusqu'aux essais cliniques. Les résultats attendus dans ce projet sont susceptibles de constituer une avancée majeure pour les patients qui souffrent depuis trop longtemps de maladies débilitantes et progressives sans avoir accès à un traitement adéquat et abordable.

Procédures

L’induction des modèles pathologiques dure entre 10 à 15 minutes. Les lésions cornéennes sont réalisées après anesthésie générale et locale. Un analgésique est également administré 30 minutes avant la réalisation de l’acte. Suivant le modèle utilisé, l’analgésique est administré pendant 3 à 5 jours après l’induction de la lésion cornéenne. L’évaluation de la douleur est réalisée par un test comportemental en appliquant une pression sur la patte et en mesurant la réponse de retrait ainsi qu’en observant les signes comportementaux. Les collyres sont administrés à l’aide d’un flacon contenant un compte-gouttes dans les deux yeux. L’administration des gouttes est réalisée sur animal vigile par contention physique. Les injections sous-conjonctivales se réalisent sous microscope opératoire après anesthésie générale. L’acte ne dure que quelques secondes. Les examens in vivo afin d’évaluer la morphologie et la transparence cornéennes sont réalisés après anesthésie générale et durent entre 5 à 10 minutes chacun. Pour l’évaluation de la toxicité des gouttes, des examens in vivo sont réalisés le premier jour puis 7 jours après sur l’ensemble des animaux. Pour l’évaluation de la toxicité du traitement administré en sous-conjonctival, les examens in vivo sont réalisés le premier jour puis 4 jours après sur l’ensemble des animaux. Dans le modèle expérimental de cicatrisation cornéenne, les examens in vivo sont réalisés à avant l’induction du modèle puis après 6h, 24h, 48h et 72h sur l’ensemble des groupes expérimentaux. Dans le modèle expérimental de dommages cornéennes induites par l’exposition au rayonnement ultraviolet B (UVB), les examens in vivo sont réalisés avant l’induction du modèle puis 3, 5, 7, 10, 14 et 16 jours après sur l’ensemble des animaux. Un examen d’angiographie in vivo pour la visualisation des néovaisseaux cornéens est réalisé une seule fois au 14ème jour. Dans le modèle expérimental d’insuffisance limbique, les examens in vivo sont réalisés le premier jour puis 3, 7 et 14 jours après sur l’ensemble des animaux.

Impact sur les animaux

Les traitements évalués dans ce projet ne contiennent que des excipients connus et approuvés pour un usage oculaire et des études antérieures ont montré que ces excipients n’entraînent pas ou très peu d’effets indésirables. Les doses sont faibles étant donné que les formulations sont administrées localement. La quantité de produit qui traverse les barrières oculaires et se retrouve dans le sang est négligeable. La préhension des animaux vigiles et l’administration topique des formulations en contention physique peuvent entraîner un stress. Avant l’induction des modèles expérimentaux, les animaux sont anesthésiés par voie générale en intrapéritonéal. L’injection peut entraîner une douleur lors de la piqure et l’anesthésie peut mener à des problèmes respiratoires, dépression ou encore d’hypothermie. Après l’induction des modèles expérimentaux, les animaux sont susceptibles de ressentir une douleur. Une infection de la surface oculaire comprenant des rougeurs et des sécrétions peut également survenir après l’induction des modèles.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés à différents délais pour le prélèvement de tissus oculaires afin de mieux analyser les effets des traitements à l’issue de toutes les procédures.

Remplacement

Avant de passer chez l’homme, il est impératif d’évaluer la toxicité des molécules dans des modèles pertinents qui se rapprochent le plus possible des mécanismes complexes chez l’homme. Les rongeurs restent l’une des espèces la plus utilisée pour l’évaluation de la tolérance des médicaments dans le domaine de l’ophtalmologie. Des modèles expérimentaux animaux seront également utilisés afin d’étudier les mécanismes physiopathologiques visibles uniquement à l’échelle de l’animal. Travailler sur l’animal entier est devenu une nécessité pour étudier les mécanismes physiopathologiques intégrés, les lignées cellulaires ne pouvant pas reproduire les mécanismes complexes d’adaptation d’un organisme. Toutes les études plus spécifiques sur les mécanismes plus délimités seront effectuées avec des cultures cellulaires. Dans cette étude, il est impératif de passer par l’animal avant de procéder à des tests cliniques chez l’homme.

Réduction

Au total, 2400 rats seront utilisés dans ce projet qui englobe l’évaluation de la toxicité et de l’efficacité de 5 molécules à potentiel thérapeutique pour des maladies rares de la surface oculaire. Une étude de la littérature ainsi qu’une estimation grâce à un test de puissance ont été réalisées pour s’assurer de la faisabilité du projet ainsi que pour estimer le nombre d’animaux nécessaires. Cela permettra également de mettre en évidence des différences statistiques entre les résultats de nos différents groupes. Les analyses in vivo dans le temps chez le même animal permettront de diminuer le nombre d’animaux euthanasiés.

Raffinement

Une semaine d’acclimatation est mise en place avant toute manipulation des animaux. Ceci leur permet de récupérer de leur transport et de s’habituer aux nouvelles conditions de vie. Les rats seront hébergés en portoirs ventilés en pression positive avec enrichissement du milieu tunnels en carton ou en plastique et ou maison en plastique au sol ou accrochée à la grille afin que ces derniers soient dans un environnement qui leur soit le plus adapté possible. La stabulation sera conventionnelle et les animaux recevront un régime alimentaire normal. Ils seront suivis quotidiennement pendant les périodes d’évaluation, ainsi que pendant les phases de repos afin de s’assurer de leur bien-être et de pouvoir apporter rapidement des soins le cas échéant. Les animaux sont anesthésiés par voie générale et locale lors de l’induction des modèles expérimentaux. Afin d’éviter l’hypothermie pendant l’anesthésie, les animaux sont placés sur tapis chauffant. Les procédures utilisées dans le projet pouvant entraîner une souffrance modérée pour les animaux, des mesures de prévention et des points limites précoces ont été mis en place afin de réduire ou éviter la douleur. Les animaux seront pesés avant l’induction des modèles expérimentaux puis pendant toute la durée des procédures.

Choix des espèces

Les rongeurs dont les rats sont l’une des espèces les plus choisies car il s’agit d’un modèle établi pour le développement de différentes pathologies dont des maladies oculaires humaines de la surface oculaire. Par ailleurs, il existe de nombreux outils d’analyse en ophtalmologie qui ont été développés notamment pour la réalisation d’examens fonctionnels in vivo. Par rapport à la souris, le rat est plus facile à manipuler pour l’induction des modèles expérimentaux. La taille de l’œil du rat est plus importante que celle de la souris, ce qui permet une meilleure manipulation, un meilleur contrôle et reproductibilité lors de l’induction des modèles et facilite la réalisation des imageries in vivo. Des rats jeunes adultes entre 6 à 8 semaines et entre 10 à 12 semaines seront utilisés dans ce projet. L’âge choisi est en accord avec ce qui est fait dans la littérature pour ces types d’expériences et de modèles expérimentaux. Il s’agit de modèles de pathologies survenant à l’âge adulte.