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Développement chez la souris d’une nouvelle méthode contraceptive non hormonale
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
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- Biologie du développement
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Un ovule de la taille d'un grain de blé est introduit au pouce dans le vagin de souris maintenues par la base de la queue, pendant deux minutes trente, jusqu'à trois fois pour la même femelle. 640 souris vont être utilisées dans ces procédures, classées au niveau de souffrance léger, pour tester si une molécule odorante, le lyral, empêche la fécondation et pourrait fournir une contraception sans hormone. Le porteur écrit que l'expérimentateur exerce un massage doux pour "apporter du bien être à l'animal pendant ce geste" et que la souris ne montre aucun signe de douleur, tout en prévoyant de surveiller pendant deux à trois semaines l'apparition de dermatites et de conjonctivites dues au caractère allergisant du lyral. Les femelles retournent au pool des accouplements après chaque essai, et les souriceaux qui naissent sont mis à mort immédiatement, sans que leur nombre apparaisse.
Objectifs
La contraception bénéficie de nombreuses méthodes. La pilule à base d'hormones qui est l'une des méthodes les plus utilisées dans notre société souffre à tort ou à raison d'une suspicion quant aux effets négatifs que l'usage répété d'hormone pourrait engendrer. Les travaux de recherche sur les récepteurs olfactifs (OR) capables de reconnaître des molécules odorantes, ont montré qu'un certain nombre d'entre eux étaient présents à la surface des spermatozoïdes de plusieurs mammifères dont l'homme et la souris. Il a été montré qu’un odorant, le bourgeonal, modifiait in vitro le chimiotactisme des spermatozoïdes humains et que le lyral, un autre odorant, modifiait lui aussi in vitro le chimiotactisme des spermatozoïdes de souris. Suite à ces travaux, nous avons cherché à savoir si in vivo l'addition de lyral dans le vagin des souris modifierait leur chimiotactisme. Pour cela, nous avons émis l’hypothèse qu’une surcharge de lyral dans le vagin de souris serait de nature à perturber la reconnaissance d’un ligand naturel à découvrir et limiterait la fécondation de l'œuf. Dans une série d’expériences préliminaires nous avons de fait observé que l’introduction de lyral liquide dans le vagin de souris perturbait la procréation : Ainsi, la copulation de 31 couples de souris, n’a donné naissance qu’à 176 souriceaux (13 femelles n’ayant eu aucune progéniture) alors que tous les couples témoins (n=31) ont été productifs et amené à la naissance de 372 souriceaux (résultats non publiés). A partir de ces résultats, statistiquement significatif, nous avons émis l'hypothèse qu'une molécule odorante introduite dans le vagin par un ovule pourrait être la source du développement d'une nouvelle méthode contraceptive non hormonale. Le présent projet a pour but de tester cette possibilité, ainsi le mode de l'utilisation via un ovule.
Bénéfices attendus
Les conséquences et bénéfices attendus sont à deux niveaux le premier dans le cadre de la pratique médicale, le second sur le plan de la recherche fondamentale. 1) Si le lyral introduit dans le vagin à l’aide d’un ovule diminue nettement la procréation, comme observé précédemment chez les souris ayant reçu du lyral liquide il est prévu de faire des essais cliniques d'utilisation d'ovules chargés d'un odorant reconnu par les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes humains, dans le but de développer une nouvelle méthode contraceptive sans hormone. 2) Sur le plan de la recherche fondamentale, une forte limitation de la taille des progénies confirmerait les résultats de nos expériences précédentes selon lesquels les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes ont un rôle biologique dans la fécondation de l'oeuf, ce qui n’a jamais été démontré. Cela ouvrirait la voie à la recherche de ligand(s) particuliers impliqués dans le chimiotactisme naturel des spermatozoïdes et dans la reproduction. Cela conduirait aussi à la recherche des cellules émettrices de ce ligand et plus encore permettrait d’envisager de nouvelles explications et hypothèses de travail relatifs à la stérilité de certains couples.
Procédures
L'expérimentation se limite à l'introduction d'un ovule de la taille d'un petit grain de blé dans le vagin de souris avant leur mise en accouplement. L'introduction sera réalisée manuellement et délicatement la souris est maintenue, sans contrainte par la base de la queue afin de permettre à l'expérimentateur d'accéder à la région vulvaire. L'ovule est introduit délicatement avec le pouce. L'expérimentateur maintient une légère pression avec son pouce sur la région génitale afin d'éviter une sortie de l'ovule et exerce un massage doux de la zone pour faciliter l'introduction complète de l'ovule et apporter du bien être à l'animal pendant ce geste. Le temps d'introduction complète est d'environ 2m30s et l'animal ne montre aucun signe de douleur ou de stress (pas de morsure, de réaction de fuite...) Le geste sera répété à une semaine d'intervalle ou plus, en cas de non copulation. La même souris femelle pouvant être utilisée jusqu’à 3 fois, si nécessaire.
Impact sur les animaux
Les expériences préliminaires que nous avons faites et qui consistaient en l'introduction directe de lyral dans l'espace vaginal de souris n'ont pas mis en évidence d'effets indésirables à court ou moyen terme chez les souris. La même dose sera utilisée dans cette expérience. L’introduction de la molécule via un ovule sera également sans effet. Aussi toutes les souris recevant un ovule (placebo ou test) seront quotidiennement observées pour noter tout changement dans leur comportement ou l'apparition de quelques symptômes qu'ils soient. Etant donné le caractère allergisant du lyral, une attention particulière sera donnée à l’apparition de démangeaisons et de conjonctivites pendant 2 à 3 semaines après introduction des ovules. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne de leur comportement afin de détecter toute gêne éventuelle, ou phénomène de nature allergisant (dermatites, conjonctivites). Si de tels problèmes étaient observés, risquant d’entrainer une douleur chez l’animal, l’expérience sera stoppée et celui-ci sera euthanasié.
Devenir
Après chaque accouplement, les souris seront remises dans le pool et utilisées pour d'autres accouplements. Les souriceaux seront immédiatement mise à mort.
Remplacement
Il est impossible de remplacer ces expérimentations chez la souris, préliminaires à des essais cliniques chez l'homme, par des tests in vitro dans la mesure où la question posée est celle de savoir si un ovule libérant dans le vagin une molécule odorante se fixant à la surface des spermatozoïdes pourrait empêcher la procréation en perturbant leur chimiotactisme en direction de l'œuf. A l’évidence, des expériences reposant sur fécondation in vitro ne permettrait pas de tester cette hypothèse.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques pertinentes et scientifiquement irréprochables afin de valider les données obtenues.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une structure agréée qui tient compte de l'éthique animale. Les accouplements seront hébergés dans une armoire ventilée afin d'éviter les conséquences olfactives de l'utilisation de la molécule odorante sur les autres animaux présents dans la pièce d'hébergement. Le reste du temps l'hébergement se fera en groupes sociaux et les animaux bénéficieront d’un environnement calme et d'une alimentation abondante. Une surveillance journalière des animaux sera réalisée pour s'assurer que les conditions de bien-être sont respectées. Si des souris présentaient une réaction de nature allergisante, elles seraient immédiatement retirées de l'expérience. Par ailleurs, rappelons que les ovules sont de qualité pharmaceutique, fabriqués par une société pharmaceutique avec des produits autorisés par la pharmacopée et ainsi sans danger par elles-mêmes.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce animale pour laquelle on a clairement identifié les récepteurs olfactifs exprimés à la surface des spermatozoïdes. Par ailleurs nous avons choisi la souris Swiss CD1 car elle est très prolifique. Les portées sont régulièrement supérieures à 10 souriceaux, ce qui facilite la recherche d'un effet négatif sur la procréation. Les souris mâles et femelles utilisées auront entre 8 à 48 semaines.
Evaluation de l’efficacité de lots de produit pharmaceutique d’une molécule thérapeutique dirigée contre une toxine végétale en vue de sa mise sur le marché
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- Autres troubles humains
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- Système immunitaire
- Système respiratoire
Toutes tuées à l'issue, sans réutilisation possible parce que leur corps contient la toxine, 2 500 souris vont être intoxiquées par une toxine végétale classée parmi les agents de bioterrorisme aux États-Unis. 2 100 sont soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 400 à un niveau sévère. Chaque animal reçoit sous anesthésie une injection de toxine puis d'anticorps, avec deux prélèvements de sang, les effets attendus allant de la perte de poids et de la mobilité réduite aux difficultés respiratoires et aux douleurs liées à la destruction des tissus, jusqu'à la mort. Aucun anti-inflammatoire n'est administré, le porteur indiquant qu'il perturberait la survie et l'effet des molécules testées, et le même projet revendique comme second objectif de démontrer la corrélation avec une technique in vitro afin de remplacer "dès que possible" ce test sur les souris.
Objectifs
La toxine d’origine végétale, cible de ce projet, est classée dans la liste des agents bioterroristes des CDC (Centers for Diseases Control and Prevention) aux Etats-Unis. Sa disponibilité dans la nature et sa facilité d’extraction font de cette toxine une arme de bioterrorisme, et de nombreuses tentatives ayant pour objectifs son utilisation à des fins malveillantes ont été répertoriées notamment en France à Paris en 2018 ainsi qu’en Allemagne à Cologne en 2023. A ce jour, aucun traitement n’est disponible commercialement. Une contre-mesure médicale a été développée et il est maintenant nécessaire d’utiliser un test de contrôle de qualité pour garantir que chaque lot de produit pharmaceutique fini possède les caractéristiques d’efficacité revendiquées. Le projet présente deux objectifs majeurs : 1) Contrôler l’efficacité de lots de produits pharmaceutiques administrés à la dose cible dans un modèle in vivo, à la suite d’une intoxication avec la toxine végétale. Ce premier objectif va permettre le contrôle qualité de l’efficacité et donc la libération de lots de produits pharmaceutiques selon les exigences réglementaires. 2) Le deuxième objectif est de répondre à la demande globale de remplacement des techniques de contrôle de qualité de l’efficacité in vivo (seule technique pertinente aujourd’hui pour la toxine) par une technique in vitro. Il est indispensable, pour sa recevabilité réglementaire, de démontrer que la technique in vitro est fortement corrélée avec la technique in vivo pour le contrôle de l’efficacité thérapeutique des lots de produit pharmaceutique. Le prérequis de cette démarche de remplacement est donc de disposer d’un nombre de données vivo/vitro suffisantes pour démontrer la corrélation des techniques nécessaire au dépôt du dossier d’enregistrement.
Bénéfices attendus
L’objectif premier du projet est de contrôler l’efficacité de différents lots de produit pharmaceutique d’une molécule thérapeutique en utilisant un modèle murin d’intoxication par une toxine végétale. Dans le contexte de la classification de cette toxine végétale comme agent de bioterrorisme et l’absence de traitement, le bénéfice attendu est la mise sur le marché d’un traitement contre les intoxications à cette toxine. Cette technique in vivo d’intoxication dans le modèle murin, seule technique fiable pour contrôler l’efficacité d’une molécule thérapeutique contre cette toxine, va permettre de répondre aux requis réglementaires de contrôle de l’efficacité du produit pharmaceutique dans le cadre de l’enregistrement de cette molécule thérapeutique et sa mise sur le marché. De plus, elle permettra la libération des lots de produits pharmaceutiques de cette molécule thérapeutique au cours des années. Le second objectif du projet est de démontrer la corrélation des techniques vivo/vitro pour la mesure de l’efficacité de lots de produits pharmaceutiques. Le bénéfice attendu de cet objectif est de pouvoir remplacer, dès que possible, la technique in vivo par une technique in vitro. Plusieurs techniques sont en cours d’évaluation et les mesures obtenues in vitro seront comparées, pour les mêmes échantillons, aux données obtenues par le modèle de référence in vivo. Si l’une des techniques in vitro démontre une corrélation suffisamment robuste avec les données de la technique in vivo, et si ce niveau de corrélation est accepté par les autorités réglementaires, elle sera alors utilisée en remplacement de la technique in vivo.
Procédures
Des prélèvements de sang et des injections (intoxication à la toxine et administration des anticorps) seront réalisés sur les animaux. Ces manipulations pouvant entrainer des perturbations du bien-être animal, elles seront réalisées sur des animaux anesthésiées. Les prélèvements sanguins seront au nombre de deux et seront réalisés rapidement (30 à 60 secondes). Le volume prélevé sera adapté au poids de l’animal et toujours réalisé sur animaux anesthésiés. L’intoxication et l’administration des anticorps ne sera réalisé qu’une seule fois et ce fera de manière rapide (30 à 60 secondes).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables (douleur et stress) liés aux gestes associés à la procédure (injections et/ou prélèvements) seront limités car réalisés sous anesthésie générale. Les effets indésirables associés à l’intoxication sont une perte de poids, une mobilité réduite, des difficultés respiratoires ainsi que des douleurs associées aux destructions tissulaires en lien avec les effets de la toxine pouvant entraîner la mort de l’animal. Ces effets indésirables sont pris en compte dans la définition des points limites. L’objectif premier de ce projet étant le contrôle qualité d’une contre-mesure médicale, à priori efficace. La majorité des souris seront traitées avec cette contre-mesure, limitant les effets de l’administration de la toxine.
Devenir
A la fin de cette procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés. Les animaux ne peuvent être réutilisés dans une autre procédure étant donné la présence de la toxine.
Remplacement
A ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico n’est capable de prédire à 100% l’efficacité des molécules thérapeutiques lors de l’intoxication par cette toxine végétale. En effet, il existe des disparités entre les résultats obtenus par les méthodes actuelles in vitro et ceux obtenus in vivo. Nous avons ainsi pu observer qu’une molécule apportant une très bonne neutralisation à l’échelle d’une lignée cellulaire dans le modèle in vitro avait une efficacité très modérée in vivo. Ainsi, les mécanismes d’action des molécules thérapeutiques contre cette toxine peuvent être multiples et un effet à l’échelle cellulaire ne reflète pas toujours un effet sur un organisme entier. A ce jour, il est donc nécessaire de passer par des modèles plus complexes pour contrôler l’efficacité de lots de produit pharmaceutique, prenant en compte la distribution de la toxine comme celle de la molécule thérapeutique, la réponse inflammatoire et immunitaire, comme c’est le cas avec des modèles murins. Le deuxième objectif de ce projet est de démontrer la corrélation entre la technique de contrôle de l’efficacité in vivo et de nouvelles techniques in vitro. Si la corrélation est suffisante aux requis réglementaires, la technique in vivo sera remplacée par une technique in vitro pour le contrôle de l’efficacité des lots de produit pharmaceutique.
Réduction
Objectif 1 : Le nombre d’animaux utilisés pour contrôler chaque lot de produit pharmaceutique doit correspondre au nombre permettant de conclure que l’échantillon contrôlé a bien une efficacité supérieure à la spécification et différente du groupe placébo. La détermination de ce nombre minimum d’animaux a fait l’objet d’une analyse biostatistique qui tient compte les différentes variables du modèle. Cette analyse a permis de déterminer le nombre minimal d’animaux par groupe nécessaire pour comparer les taux de survie obtenus lors d’un test in vivo à la spécification d’efficacité du produit avec un niveau de confiance minimal requis réglementairement. Objectif 2 : Le nombre d’animaux utilisés pour démontrer la corrélation entre les techniques vivo/vitro doit correspondre au nombre permettant de s’assurer que la technique in vitro est fiable et robuste pour contrôler l’efficacité des lots de produit pharmaceutique. La détermination de ce nombre minimum d’animaux a fait l’objet d’une analyse biostatistique qui tient compte les différentes variables du modèle. Cette analyse a permis de déterminer le nombre minimal d’animaux par groupe nécessaire pour réaliser les analyses de corrélations entre les techniques vivo/vitro avec un niveau de confiance minimal requis réglementairement. Objectif 1 & 2 : Les groupes placébo seront mutualisés. Un seul groupe placébo sera utilisé pour chaque phase expérimentale incluant des groupes répondant à l’objectif 1 (avec plusieurs lots de produit pharmaceutique) et des groupes répondant à l’objectif 2 (avec plusieurs lots de corrélation).
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage collective afin de favoriser les relations sociales. Une hutte en carton ainsi qu’une feuille de cellulose seront également ajoutées pour maximiser le bien-être des animaux et leur permettre de faire leur nid. Les animaux seront également observés quotidiennement durant toute la durée des essais, et lors de l’ensemble des procédures par du personnel qualifié. L’ensemble des procédures sera réalisé sur animaux anesthésiés. Les points limites déterminés pour ces essais (notamment les signes cliniques) nous serviront à nous assurer du bien-être des animaux, et nous permettront d’éviter une souffrance trop importante. Lors des essais avec la toxine, des aliments hydratés seront ajoutés dans la cage pour éviter la déshydratation des animaux. L’utilisation d’anti-inflammatoires est impossible, du fait de leurs effets potentiels sur la survie et sur l’effet thérapeutique des molécules testées.
Choix des espèces
Le modèle murin est majoritairement utilisé et a été amplement validé pour l’évaluation d’activité de différentes contre-mesures médicales contre ricinecette toxine. Les souris utilisées sont adultes car elles possèdent à cet âge-là un système immunitaire mature. La facilité d’élevage et de manipulation des souris font de ces animaux un modèle adéquat pour faire ces essais. Par ailleurs, la petite taille des souris fait utiliser une dose de toxine qui est très inférieure à la dose toxique chez l’homme, ce qui constitue un facteur de sécurité pour les opérateurs qui manipulent la toxine.
Inoculation de biopsies à l’animal pour identification et production d’un pathogène (renouvellement de projet)
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Maladies infectieuses
Cochons d'Inde : 50
450 souris et 50 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent dans le péritoine une préparation issue de prélèvements humains ou animaux, sang, biopsies, liquide céphalo-rachidien, insectes, pour que les micro-organismes qu'elle contient s'y multiplient, avant une anesthésie terminale et le prélèvement du sang et des organes. Le laboratoire indique n'utiliser que deux animaux par échantillon, le second au cas où le premier ne répondrait pas à l'inoculation. Leur corps tient lieu de milieu de culture, et le porteur affirme que produire ces germes hors d'un organisme vivant reste hors d'atteinte, les organoïdes n'étant "pas encore au point".
Objectifs
Le but de ce travail est double : isoler des micro-organismes dont la culture est fastidieuse, voire impossible et les produire en grande quantité ce qui permettrait d’une part la confirmation de diagnostic, et d’autre part la mise au point d’un milieu de culture axénique (stérile et exempt d’autres microorganismes).
Bénéfices attendus
Le laboratoire reçoit plusieurs milliers de prélèvements (sang, biopsies, LCR- Liquide Céphalo-Rachidien, arthropodes, insectes…) effectués par des vétérinaires ou des médecins dans le cadre de consultations ou de projets de recherches. Certains de ces prélèvements contiennent des micro-organismes en petite quantité qui n’ont jamais été décrits ou dont la culture n’a jamais été mise au point, d’où l’intérêt d’amplifier les pathogènes en les inoculant à un animal de laboratoire sensible. A partir des prélèvements de l’animal infecté il sera possible d’ensemencer une gamme variée de milieu afin d’identifier et de mettre au point une culture axénique. Des souris ou des cobayes seront utilisés en fonction de la nature du germe à isoler.
Procédures
Les interventions sur les animaux seront les injections en intrapéritonéal (IP) de la préparation issue du prélèvement et in fine, l'injection en IP des solutions d'anesthésiant/ euthanasiant avant les prélèvements post-mortem.
Impact sur les animaux
La première nuisance sera celle de l'injection en intrapéritonéal (IP) de la préparation issue du prélèvement. Au niveau local, une rougeur et/ou gonflement peuvent apparaitre suite à l’injection. Si ces signes diminuent ou disparaissent dans les 48heures post-inoculation, la procédure sera poursuivie jusqu’à la fin du protocole. En revanche, si des complications et des signes extérieurs d’inconforts décrits dans la grille de scores des points limites sont observés, les mesures décrites dans la grille seront appliquées. Une deuxième nuisance peut être liée à l’injection en IP des solutions d'anesthésiant/ euthanasiant avant les prélèvements post-mortem. L’anesthésie ayant un effet rapide, aucun effet indésirable n’est attendu suite à l’injection.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux: Les animaux subissent une anesthésie profonde terminale pour permettre le prélèvement sanguin et/ ou d’organes avant l’euthanasie finale.
Remplacement
Il n’existe pas toujours de milieu de culture pour certains micro-organismes et un animal sensible à l’infection est utilisé d’une part pour l’isolement et d’autre part pour maintenir un stock de ces pathogènes afin de les étudier ultérieurement. En outre, la mise au point d’un milieu de culture axénique (stérile et exempt d’autres microorganismes) nécessite la disponibilité d’un nombre important du pathogène à étudier pour tester ses conditions de culture (test de composés de culture différents) d’où la nécessité d’utiliser un animal pour produire les pathogènes à tester. La mise au point d'organoïdes par exemple n'est pas encore au point afin d'amplifier des microorganismes ex-vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux est de 2 maximum par prélèvement potentiel. L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet reste faible. Lorsque nous recevons un échantillon « précieux », il est en général en faible quantité et la concentration en microorganisme est assez faible aussi. Nous utilisons 2 animaux par échantillons au cas ou une injection ou un animal ne répondrait pas favorablement à l’inoculation.
Raffinement
Les deux individus de la même espèce sont hébergés ensemble dans la même cage avec une surface suffisante ainsi que des éléments de raffinement appropriés (igloo, carrée de nidification, bois à ronger). Pour limiter toute souffrance et/ou angoisse des animaux, nous mettons en oeuvre des mesures d’acclimatation en zone d’hébergement d’une semaine avant de commencer les manipulations. Les animaux seront observés par un personnel compétent et expérimenté (pelage, respiration et mobilité) quotidiennement et pesées (2 fois par semaine) afin de relever tout signe d’anormalité. La température corporelle sera prise si des signes extérieurs correspondant à la grille de score sont observés. De la nourriture et de l'eau sont disponibles ad libitum. Un analgésique sera administré en cas de signes avérés de souffrance suivant la grille de score couplée à ce projet. L’analgésique que nous utiliserons sera de la buprénorphine en SC (sous-cutané) toutes les 12 heures pour la souris et toutes les 6 heures pour le cobaye. Un anesthésique sera administré avant l'euthanasie finale en injection IP pour les 2 espèces.
Choix des espèces
Certains pathogènes ne peuvent être produit qu'en utilisant un modèle animal. Selon le pathogène suspecté soit la souris soit le cobaye sera l'hôte approprié/ sensible pour sa multiplication. Par exemple: Le cobaye Dunkin Hartley pour cultiver Borrelia hispanica Les souris BALB/c: autres Borrelia, Coxiella, Bartonella et Rickettsia Le stade choisi sera le stade adulte : souris 6 à 8 semaines et cobaye 4 à 5 semaines. La volémie chez l’adulte est plus importante (un volume de sang plus important pourra être collecté).
Observation des conséquences de mutations de facteur de réparation de l’ADN chez la souris
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- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
206 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une biopsie de l'extrémité de la queue vers six à huit jours de vie pour le génotypage, puis un tatouage à l'encre. Le porteur crée deux lignées portant des mutations de facteurs de réparation de l'ADN, prévoit une létalité embryonnaire, et annonce des résultats susceptibles d'ouvrir des pistes thérapeutiques pour les patients dont le génome est instable. Si un phénotype dommageable apparaît avant le sevrage, les souris sont tuées immédiatement pour que leur système hématopoïétique soit analysé.
Objectifs
Des mutations dans des génes impliqués dans la stabilité du génome peuvent causer des défauts hématopoïétiques. Afin de déterminer quelles sont les conséquences de ces mutations in vivo, 2 modèles de souris portant ces mutations seront produits. Ces modèles permettront de déterminer les conséquences fonctionnelles de ces mutations en se focalisant sur le système hématopoïétique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'apporter de nombreuses informations originales et fondamentales sur les conséquences fonctionnelles de ces mutations et plus largement sur le rôle des facteurs analysés dans la stabilité du génome. Les résultats obtenus devraient permettre d'ouvrir des pistes à des approches thérapeutiques chez les patients présentant une instabilité du génome.
Procédures
Biopsie de la queue réalisée vers 6-8 jours de vie en vue du génotypage (une biopsie par animal). Une biopsie correspond à un prélèvement de l'extrémité de la queue par animal qui dure quelques secondes. Une létalité embryonnaire peut exister lors de la gestation.
Impact sur les animaux
Les animaux, du fait d'un défaut potentiel de la stabilité du génome peuvent présenter un défauthématopoïétique. Stress associé à la biopsie nécessaire pour le génotypage ainsi que le tatouage (marquage à l'encre). De plus, une létalité embryonnaire pourrait être observée.
Devenir
A la fin de chaque procédure les souris seront mis à mort selon la méthode règlementaire utilisée en fonction de l’âge des souris
Remplacement
Les questions scientifiques que nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo ou ex vivo, sur des organes prélevés sur des souris. Il s’agit ici d’études sur le développement des cellules du sang qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère. En effet, le développement des cellules sanguines des mammifères et leurs rôles sont de mieux en mieux caractérisés chez la souris et aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de ces processus dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part. En revanche l'analyse de la réparation de l'ADN sera en grande partie réalisée dans des lignées cellulaires des différentes lignées de souris ce qui permettra d'utiliser un nombre limité d'animaux.
Réduction
En se basant sur des tests statistiques, nous réduiront au maximum le nombre de souris utilisées pour obtenir les résultats escomptés. Par ailleurs, de nombreux tests seront réalisés sur des lignées cellulaires obtenues de souris, permettant une étude in vitro de nombreux paramètres et ainsi réduisant le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Les souris seront observées de façon hebdomadaire par le personnel compétent de l'animalerie. Les cages disposent par ailleurs de matériel d'enrichissement (bouts de coton, tunnels colorés, morceaux de bois). Le maintien des souris dans une zone sans pathogène devrait les préserver d'infections opportunistes et ainsi éviter un caractère dommageable. La mise à mort de la souris sera réalisée selon la méthode réglementaire en fonction de l'âge en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites observés lors du scoring hebdomadaire.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement des cellules sanguines, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement de ce système entre les souris et l’Homme. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation de ce projet tels que des anticorps pour les immuno-marquages. Le phénotype dommageable affectant la survie (au stade embryonnaire (E13) ainsi qu'après la naissance) sera déterminé au moment du sevrage (3 semaines), le phénotype du système hématopïétique sera réalisé à 8-10 semaines (période classique d’analyse pour laquelle le système immunitaire est pleinement fonctionnel). Si un phénotype dommageable est observé avant cette période, les souris seront immédiatement mise à mort et leur système hémaopoïétique sera analysé.
Impact d’une supplémentation en actifs végétaux sur le vieillissement chez le rongeur
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Rats : 192
63 souris seront immobilisées trois heures par jour pendant vingt et un jours, et 192 rats subiront huit prélèvements de sang en six heures : 322 souris et 192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris reçoivent aussi des gavages pendant deux à trois semaines et des injections dans l'abdomen sur deux à huit semaines, dont des injections de LPS qui provoquent fièvre, fatigue, repli sur soi et perte de poids. Le porteur décrit ces réactions comme "temporaires, adaptatives et contrôlées", et qualifie le stress de contention de psychologique. Le projet mesure ce que des phytonutriments du régime méditerranéen apportent au "bien vieillir", avec des retombées annoncées sous forme de recommandations nutritionnelles et de produits naturels.
Objectifs
Avec l'allongement de l'espérance de vie, le vieillissement démographique représente un défi majeur pour la société, étant associé à une augmentation des maladies chroniques et des coûts de santé. Pour faire face à ces enjeux, il est impératif d'identifier des moyens de prévention pour favoriser le "bien vieillir" et réduire l'incidence des maladies liées à l'âge telles que les maladies neurodégénératives et cardiovasculaires. Parmi les facteurs de risque, une alimentation inadéquate a été identifiée comme contribuant à ces maladies. L'alimentation étant un comportement modifiable, elle offre une voie prometteuse pour mettre en place des stratégies préventives basées sur la nutrition. Dans ce contexte, le régime méditerranéen (Medi) se distingue comme l'un des régimes les plus sains, grâce à ses bénéfices sur la santé et la longévité. Ce projet vise donc à explorer le rôle protecteur des phytonutriments du Medi dans la prévention du vieillissement et des maladies chroniques associées. Notre objectif principal est de comprendre les mécanismes d'action des phytonutriments du Medi et d'évaluer leur efficacité potentielle dans la promotion du "bien vieillir", en utilisant des modèles animaux pertinents pour simuler les processus inflammatoires, les effets du vieillissement accéléré, et le stress chronique. Nous cherchons également à développer des méthodes d'analyse fiables permettant de mesurer les phytonutriments et leurs métabolites dans les tissus biologiques des animaux, afin d'évaluer leur biodisponibilité et dans le but d’établir des corrélations entre les niveaux de métabolites des phytonutriments et les effets biologiques associés au vieillissement, tels que l'inflammation, le stress oxydant, et les altérations épigénétiques. Cette étape cruciale nous permettra d'évaluer comment ces composés sont absorbés et métabolisés dans l'organisme, ouvrant ainsi la voie à une meilleure compréhension de leur efficacité potentielle. En utilisant des modèles animaux pertinents, nous évaluerons ensuite les effets protecteurs des supplémentations en phytonutriments du Medi contre l'inflammation, les altérations cognitives liées au vieillissement accéléré, et les effets délétères du stress chronique.
Bénéfices attendus
Le projet vise à approfondir la connaissance scientifique en nutrition et vieillissement, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives pour améliorer la santé humaine. En caractérisant les effets des phytonutriments du régime Medi sur le vieillissement et les maladies chroniques à l'aide de modèles animaux spécifiques, cette recherche contribuera à mieux comprendre les mécanismes sous-jacents aux bénéfices de ces composés sur la santé. Les résultats permettront d'identifier les phytonutriments clés et leurs combinaisons ayant un potentiel effet protecteur contre le vieillissement et les maladies associées, notamment en modulant l'inflammation, le stress oxydatif et d'autres processus biologiques liés au déclin cognitif et aux pathologies liées à l'âge. Cette caractérisation approfondie des mécanismes d'action des phytonutriments éclairera sur les stratégies nutritionnelles pour favoriser un vieillissement en bonne santé, ouvrant des perspectives pour le développement de produits naturels visant à promouvoir le "bien vieillir" et à réduire l'incidence des maladies chroniques liées à l’âge. En approfondissant notre compréhension des interactions entre les phytonutriments et processus biologiques, cette recherche pourrait conduire à des interventions précoces ou à des recommandations nutritionnelles personnalisées pour améliorer la santé des individus vieillissants. Les bénéfices dépassent la recherche fondamentale, avec des implications potentielles dans la santé publique. Les connaissances générées pourraient conduire à des recommandations nutritionnelles spécifiques pour promouvoir le "bien vieillir", contribuant ainsi à réduire l'incidence des maladies chroniques associées à l'âge et à améliorer la qualité de vie des individus vieillissants. Avec l'allongement de l'espérance de vie, les systèmes de santé et les économies nationales sont confrontés à des défis importants, notamment des problèmes de santé chroniques entraînant des surcoûts en matière de soins, incapacité et dépendance. En identifiant les phytonutriments favorisant un vieillissement en bonne santé, cette recherche pourrait atténuer les impacts économiques du vieillissement de la population. Ce projet revêt ainsi une importance économique dans le contexte du vieillissement démographique. Ce projet vise donc à combler les lacunes actuelles dans notre compréhension des liens entre nutrition, vieillissement et santé, avec des implications potentielles significatives pour la santé publique.
Procédures
Les 322 souris seront soumises à deux prélèvements sanguins à la veine sous maxillaire (maximum 200µL et minimum deux semaines d'intervalle entre les prélèvements). Elles seront également sourmises à une administration orale par gavage pendant 2 à 3 semaines (232 souris), et à des injections intrapéritonéales allant de 2 à 8 semaines (250 souris). 63 souris seront également soumises à un stress de contention quotidien de 3h/jour pendant 21 jours. Les 192 rats quant à eux seront soumis à une cinétique de prélèvements sanguins effectués à la veine caudale ou saphène, et consistant en un prélèvement de 200µL maximum espacés de 30mn minimum ; 0, 30, 60, 90, 120, 180, 240, et 360mn.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les interventions prévues peuvent entraîner diverses réponses physiologiques et comportementales chez les animaux utilisés. Par exemple, l'administration de substances, bien que rapides et non douloureuses lorsqu’effectuées par une personne expérimentée, peut induire un stress temporaire lié à la manipulation directe des animaux. Pour atténuer ce stress, les animaux seront préalablement habitués à ces procédures. Les injections intrapéritonéales de LPS induiront des réactions physiologiques telles qu'une réaction inflammatoire, de la fièvre, de la fatigue et des comportements anormaux tels que le repli sur soi, l'hypophagie et la perte de poids chez les souris. Ces réactions, appelées comportement de maladie, sont temporaires, adaptatives et contrôlées, favorisant la récupération en mobilisant les ressources de l'organisme pour combattre l'agent pathogène. Les prélèvements sanguins répétés chez les rats peuvent causer une légère gêne et une perte de volume sanguin, tandis que les injections répétées chez les souris peuvent entraîner une réaction locale temporaire. Pour minimiser ces effets, nous alternerons le côté d'injection et limiterons le volume prélevé selon les recommandations spécifiques à chaque espèce. Les interventions expérimentales peuvent induire un stress léger entraînant une restriction alimentaire et une légère perte de poids chez les animaux. Tout changement de poids sera surveillé de près et un animal présentant une perte de poids significative sera retiré des expériences pour assurer son bien-être. Concernant le stress de contention chronique, bien que non invasif sur le plan physique, ce modèle entraine un stress psychologique et un inconfort dû à la restriction de mouvement, sans toutefois altérer la mobilité une fois le stress terminé. Ces interventions respecteront les lignes directrices éthiques et les expérimentateurs s'engageront à minimiser les perturbations et les impacts négatifs sur le bien-être des animaux en utilisant des techniques adaptées et en surveillant étroitement leur santé et leur comportement tout au long de l'étude et en prenant en charge la douleur si nécessaire. Des mesures telles que l'enrichissement de leur environnement seront mises en place pour garantir leur bien-être et leur confort. En cas de symptômes persistants ou sévères, les animaux seront euthanasiés selon des critères éthiques stricts pour éviter toute souffrance inutile.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés dans le but de mener des investifations aux niveaux biologiques et neurobiologiques.
Remplacement
Il existe actuellement peu d'alternatives non animales capables de reproduire adéquatement les interactions complexes entre nutriments et processus biologiques observés chez les animaux vivants. Les modèles animaux restent essentiels pour étudier les effets physiologiques et comportementaux des nutriments dans un contexte biologique pertinent, comme dans notre projet visant à caractériser les effets des phytonutriments sur le vieillissement et les maladies chroniques. L'utilisation d'animaux est nécessaire pour comprendre les réponses systémiques et les impacts à long terme sur la santé. Les modèles animaux permettent d'observer les effets intégrés des composés nutritifs sur différents organes et systèmes biologiques, ce qui est essentiel pour une compréhension holistique des mécanismes sous-jacents. Cependant, lorsque l’objectif le permettra, des études seront faites en culture cellulaire afin d’éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires, ces modèles in vitro offrant des informations utiles sur les réponses cellulaires aux composés nutritifs, mais ne pouvant pas reproduire les interactions complexes et intégrées observées dans un organisme vivant. Par exemple, les cultures de cellules Caco-2 peuvent être utilisées pour étudier l'absorption intestinale des phytonutriments in vitro, évaluant ainsi leur biodisponibilité et leur potentiel effet systémique. Ainsi, ce type d’étude in vitro peut être utilisé pour mener un screening initial des phytonutriments d’intérêts pour notre projet. De même, des cultures cellulaires spécifiques pourront être employées pour évaluer les effets des composés sur divers aspects de la santé cellulaire, comme la modulation de l'inflammation ou du stress oxydatif. Ces études peuvent fournir des informations précieuses sur les mécanismes d'action potentiels des phytonutriments sans nécessiter l'utilisation d'animaux. Cependant, malgré ces avantages, les modèles cellulaires présentent certaines limites. Ils ne peuvent pas reproduire de manière exhaustive les interactions complexes entre différents organes et systèmes biologiques observées dans un organisme vivant entier. Par conséquent, les études sur les modèles animaux restent nécessaires et justifiées pour atteindre nos objectifs scientifiques en l'absence d'alternatives satisfaisantes. Nous nous engageons cependant à minimiser le nombre d'animaux utilisés, à réduire au maximum leur souffrance et à suivre des protocoles rigoureux conformément aux normes éthiques en vigueur.
Réduction
Plusieurs mesures ont été mises en œuvre dans ce projet afin de minimiser le nombre d'animaux utilisés tout en atteignant nos objectifs scientifiques. Tout d'abord, le nombre d'animaux prévus pour ce projet a été déterminé en tenant compte des besoins expérimentaux et des objectifs de recherche afin de garantir la robustesse de nos résultats, tout en minimisant autant que possible la taille de nos effectifs. En effet, il existe une grande variabilité interindividuelle et nos précédentes études ont montré que la métabolisation des nutriments chez les animaux est sensible à cette variabilité, ce qui nous impose d’avoir un nombre d’animaux nécessaire et suffisant pour répondre à notre problématique, tout en nous restreignant à des effectifs les plus faibles possibles. Le calcul du nombre d’animaux a donc été fait sur la base de 8 à 10 animaux par groupe en fonction du modèle, nombre minimal requis afin d’atteindre une puissance statistique suffisante. De plus, nous adoptons une approche de partage et de réutilisation des tissus animaux pour maximiser leur utilisation. Les foies des rats seront utilisés pour établir des microsomes afin de développer des modèles cellulaires, notamment dans le cadre du protocole INFOGEST. Les tissus non utilisés des souris seront également employés pour le développement de méthodes analytiques sur tissus, minimisant ainsi le besoin de nouveaux prélèvements. Pour optimiser l'utilisation des animaux, nous avons choisi d'utiliser le rat dans la phase d'études de biodisponibilité. Cette décision est motivée par la plus grande taille des rats, qui offre une plus grande disponibilité d'échantillons et permet de nous restreindre à des effectifs les plus faibles possibles comparés à ceux qui auraient été nécessaires avec de plus petits animaux comme la souris. En outre, nous avons adopté une approche expérimentale ciblée pour étudier l'effet des phytonutriments. Dans le modèle de stress inflammatoire induit par le LPS, nous évaluerons l'effet des phytonutriments dans des conditions basales et stimulées. En revanche, dans d'autres modèles, nous nous concentrerons uniquement sur l'effet des phytonutriments en conditions stimulées, ce qui permet de minimiser le nombre de groupes expérimentaux tout en respectant nos objectifs scientifiques. Ces différentes pratiques nous permettent donc de maximiser l'utilisation des ressources disponibles tout en respectant les normes éthiques et les objectifs scientifiques du projet.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, nous mettrons en œuvre des mesures rigoureuses afin à minimiser les nuisances sur le bien-être des animaux pendant les procédures expérimentales. Tout d'abord, une surveillance quotidienne des animaux sera assurée tout au long de l'étude pour évaluer leur santé et leur comportement, avec un renforcement accru en cas de symptômes de détresse ou de douleur, et des mesures immédiates seront prises pour administrer un traitement de confort afin de soulager la souffrance des animaux le cas échéant. Nous avons défini avec attention des points limites pour chaque procédure expérimentale, permettant d'identifier rapidement les signes de détresse et de prendre des mesures appropriées, y compris l'euthanasie si nécessaire pour éviter toute souffrance inutile. Nous prendrons aussi en compte le bien-être des animaux via l'enrichissement environnemental dans les cages avec l'ajout de carrés de coton, d'igloos en carton et de bâtons de bois. Ces enrichissements offrent aux animaux des possibilités d'exploration et de comportement naturel, réduisant ainsi le stress lié à la captivité. De plus, nous favorisons la stabulation en cages collectives ce qui permet aux animaux de bénéficier de contacts sociaux et de réduire l'isolement. Cette approche contribuera à maintenir le bien-être psychologique des animaux tout au long de l'étude. Nous avons intégré dans nos protocoles des procédures d'entraînement et d'habituation préalable pour familiariser les animaux aux manipulations expérimentales, réduisant ainsi le stress associé aux procédures telles que l'administration orale ou les prélèvements sanguins. Enfin, nous resterons attentifs aux avancées scientifiques et aux nouvelles techniques de raffinement pendant la durée de vie du projet, ce qui nous permettra d’intégrer ces avancées dès qu'elles sont disponibles pour améliorer le bien-être des animaux et optimiser nos pratiques expérimentales.
Choix des espèces
Le rat sera utilisé pour les études de biodisponibilité et le développement des méthodes d’analyses en raison de sa taille anatomique, facilitant les prélèvements sanguins et d'organes en quantité suffisante tout en limitant le nombre d'animaux utilisés et en conservant une facilité d’hébergement et de manipulation. Le rat est également préféré à la souris pour la réalisation de cinétiques de prélèvements en raison de son plus gros volume sanguin. La souris, dont la petite taille et la facilité de manipulation permet un hébergement optimal conforme aux règles éthiques, sera choisie pour l’étude des phytonutriments sur le vieillissement. En effet, les souris sont adaptées aux manipulations nutritionnelles et aux expériences comportementales et les modèles sélectionnés sont largement validés et utilisés dans la communauté scientifique sur cette espèce. Enfin, l’utilisation de souris représente un avantage économique, coutant moins cher que les autres rongeurs en terme d’hebergement et de régimes alimentaires. S’agissant d’étude sur le vieillissement, les animaux seront utilisés à l’âge adulte.
Isolement et revivification des souches de Toxoplasma gondii en modèle murin
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Pour isoler et caractériser les souches de Toxoplasma gondii circulant chez l'humain et dans la faune, 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 540 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit dans l'abdomen une inoculation de l'échantillon à tester, puis un ou deux prélèvements de sang et de sécrétions sous anesthésie. Le porteur reconnaît que la culture cellulaire permet de cultiver le toxoplasme, tout en la jugeant moins sensible, et la réserve aux prélèvements qu'il ne considère pas comme précieux. Il écrit que dans la majorité des cas les souris ne présentent aucun effet indésirable, tout en décrivant une fièvre de quelques heures et "parfois mort rapide durant la nuit en cas d'infection sévère".
Objectifs
La détection et l'étude des souches de toxoplasme circulant chez l'humain et au sein de la faune sauvage et domestique se justifie par un intérêt épidémiologique (caractérisation génétique permettant de connaître la circulation des souches du parasite dans le contexte d'une seule santé : One Health). Dans ce cadre, l'isolement de ces souches ne peut se faire de manière satisfaisante que sur modèle murin en laboratoire, la culture cellulaire étant significativement moins sensible, et plus sujette aux contaminations.
Bénéfices attendus
Un des objectifs du projet est de mieux connaître l’épidémiologie des souches de toxoplasmes en France métropolitaine et DOM-TOM et d’étudier ainsi la biodiversité de T. gondii à des fins de santé publique. Pour cela, ce projet vise à collecter les souches issues des prélèvements cliniques, de les caractériser (d’un point de vue phénotypique et génotypique), les comparer aux souches circulant dans le monde et le cas échéant, alerter les autorités sanitaires de la survenue de cas groupés dus à des génotypes identiques ou voisins. Ces travaux incluent également une comparaison des souches humaines avec celles isolées dans l’environnement (notamment les souches isolées des animaux impliqués dans la transmission de la maladie).
Procédures
Les interventions qui peuvent causer des nuisances sont: (1) l'inoculation en intrapéritonéale de l'échantillon, qui peut causer une gêne sur un laps de temps très court; (2) et le prélèvement sanguin et autres sécretions en lien avec l'infection, réalisé sur l’animal sous anésthésie, qui peut causer un stress de quelques secondes lié à la contention. Ces interventions sont réalisées une seule fois, à l'exception des sécretions en lien avec l'infection, qui peuvent etre réalisées jusqu'à deux fois.
Impact sur les animaux
Dans la majorité des cas, les souris ne présentent aucun effet indésirable. Dans une minorité de cas où les souris présenteraient des symptomes, les seules nuisances sont liées à l'infection (animal fièvreux durant quelques heures maximum et parfois mort rapide durant la nuit en cas d'infection sévère).
Devenir
Les animaux ayant été infectés par un agent pathogène, les souris devront être systèmatiquement euthanasiées en fin de procédure.
Remplacement
La culture cellulaire est possible pour le toxoplasme, mais elle est de moindre sensibilité que l’isolement chez la souris. Elle sera réalisée lorsque les prélèvements auront été réalisées dans des conditions proches de l'asepsie et que les prélèvements n'auront pas été considérés comme précieux (prélèvements précieux : prélèvements humains et prélèvements d'animaux pour lesquelles peu de données existent).
Réduction
L'optimisation du protocole a permis de réduire le nombre de souris utilisées de 6 à 3 sans nuire à la réussite de l’isolement de souches.
Raffinement
Les 2 à 3 souris inoculées en fonction de la procédure sont hébergées dans des cages pouvant contenir 5 à 6 souris d’après les normes en vigueur. Les souris font l’objet d’un enrichissement dès leur mise en cage et jusqu’à la fin de l’expérimentation. Dans les cas où la souche infectante montre des signes de virulence, une grille de score de la douleur, établie dans le cadre du projet, est suivie pour définir les interventions ou point limites à appliquer. Ces interventions incluent, le cas échéant, l'administration d'un traitement antidouleur, l'augmentation de la fréquence d’observation (deux à trois fois par jour au lieu d’une seule) et l'euthanasie des animaux si le score de la douleur correspond au point limite atteint. Tous les prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Les souris (Mus musculus) sont l’animal de choix pour l’isolement du parasite. Mis à part le chat domestique, la souris représente l'espèce animale de laboratoire la plus adaptée pour l'isolement de souches de toxoplasmes (le modèle rat par exemple ne permet pas cet isolement). Elle est utilisée par l'ensemble des équipes de recherche internationale qui travaille sur l'isolement du toxoplasme. Des souris femelles à partir de 4 à 8 semaines sont utilisées afin de permettre l'inoculation des prélèvements. L’âge des animaux utilisés dans nos procédures correspond à une taille et un poids de l’animal minimums pour lequel l’injection du volume d’inoculum envisagé est bien toléré.
Etude de la biodistribution et pharmacologie de vecteur-médicaments après infusion sous-cutanée ou intraveineuse chez la souris.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Une pompe osmotique est implantée sous la peau ou dans une veine, en dix à vingt minutes d'opération : 768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infusion continue se poursuit ensuite sur animal éveillé, avec des prélèvements de sang répétés, puis une injection létale permet de prélever organes et tissus. Le projet est mené par une société privée qui teste ses propres vecteurs d'acheminement de médicaments vers le cerveau, à raison de six études par an et de groupes de quatre animaux. Le porteur retient la souris parce que sa physiologie est bien connue, et parce qu'à 27 ou 30 grammes elle est "particulièrement économique" en termes de posologies.
Objectifs
Ces dix dernières années, notre société et ses partenaires académiques ont réussi à identifier et développer une stratégie de vectorisation innovante, afin de proposer de l’adressage spécifique de médicaments au niveau du système nerveux central. Ce transport est réalisé à l’aide de protéines ou peptides cargos (vecteurs) qui ciblent spécifiquement les récepteurs membranaires situés aux niveaux des barrières cellulaires de l’organisme, entre sang et tissus, dans notre cas, la barrière Hématoencéphalique (BHE) du cerveau. Le succès de ces travaux et les dernières collaborations internationales ont démontré tout le potentiel de notre technologie sur le développement de nouveaux traitements contre certaines neuropathies. Cet engouement a permis de développer de nouveaux axes de recherches, notamment sur certaines maladies rares (Myopathies, lysosomales) ou chroniques liées à l’hygiène de vie (Cancers, Diabètes, obésités), devenues le fléau de ces 20 dernières années. C’est dans ce contexte que nous souhaitons relever de nouveaux défis et optimiser notre technologie pour améliorer ou prolonger l’adressage et l’effet de certains traitements. Par diverses optimisations, Il s’agira de contourner les problématiques de la pharmacologie (élimination, stabilité, immunité) et de démontrer l’apport de notre système de pompe autonome (délivrances prolongées et maîtrisées). Nous pourrons ainsi proposer de meilleures pharmacologies et optimisées pour le traitement de pathologies plus complexes ou sans traitements efficaces.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons tester le potentiel d’action de nos vecteurs sur des administrations prolongées. Nous pourrons ainsi rechercher leurs meilleurs effets pharmacologiques pour de meilleures perspectives thérapeutiques. La modulation dans le temps et la réduction des concentrations médicamenteuses sont également des paramètres non négligeables lorsqu’il s’agit de molécules présentant certains effets secondaires, notamment lors de traitements à fortes doses efficaces.
Procédures
Une première partie de mise en place de l’étude sur animaux éveillés, une seconde sous anesthésie et anti-douleurs (chirurgie) et enfin le suivi et manipulation jusqu’à la mise à mort de l’animal en fin de cinétique. -Constitution des groupes d'animaux (éveillés). -Analgésie (éveillé) : Administration simple et unique (5 secondes) sous la peau au niveau de la nuque. - Procédure chirurgicale et implantation des pompes osmotiques : implantation en sous-cutanée (10 min) ou intraveineux (20 min). -Prélèvements sanguins intermédiaires sur animal éveillé en cours de cinétique. -Mise à mort finale pour prélèvements de tissus et organes.
Impact sur les animaux
Les possibles sources de stress, angoisse et/ou douleurs sont ici listées : - Du stress et des douleurs légères de courte durée causées par les injections et les prélèvements sur animaux vigiles. - Du stress et de l’inconfort lors des anesthésies et de possible douleurs suites aux interventions chirurgicales Le composé injecté ne devrait pas avoir d'effets indésirables sur les animaux
Devenir
Afin de réaliser l'étude de l'efficacité pharmacologique, les organes et tissus d'intérêts doivent être prélevés. Pour cela, les animaux seront tous mis à mort.
Remplacement
Afin de mener à bien notre projet, nous n’utiliserons que nos vecteurs préalablement étudiés in vitro (cellules) ainsi qu’in vivo sur des suivis pharmacologiques et de biodistributions. Ces premières séries de tests amonts ont notamment permis de contrôler le maintien de leurs efficacités directement sur leurs cibles (Récepteurs cellulaires), mais restaient insuffisantes pour prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations). Afin de développer notre modèle pharmacologique pour l’infusion médicamenteuse, nous devrons réaliser nos études sur le petit animal de laboratoire, ici le rongeur (souris). Le choix du modèle rongeur se justifie comme étant pour l’heure le 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’Homme pour l’étude des mécanismes physiologiques, sans trop de contraintes d’hébergement, ni de manipulations. Son utilisation sous forme de petits groupes permet d’exploiter au maximum les résultats par l’obtention de données statistiques significatives. Malheureusement, il n’existe pour le moment aucun modèle prédictif de bio-informatique associant l’ensemble des mécanismes physiologiques, capable d'apporter toutes ces réponses ou suffisamment complexe et informel tel que les organoïdes ou sphéroïdes. Dans notre cas, le principal désavantage de cette demande reste donc le recours indispensable à l’utilisation d’animaux. Il s’agit maintenant de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus à utiliser.
Réduction
Le nombre total d’animaux sera réparti de manière équivalente pour les deux procédures d’implantations, en sous-cutanée puis en intra-veineux. Les animaux seront répartis en petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de 4 groupes tests par étude et 6 études par an, ce qui représente 96 individus/an et par procédure. C’est-à-dire pour les deux procédures, 192 animaux par an (mixité des groupes 96 mâles + 96 femelles). Il est important de noter que pour chaque espèce, ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles. En expérimentation animale nous travaillons avec des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles que nous prendrons en considération lors des tests statistiques. En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile d’animaux. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires en cours de cinétique permet d'obtenir des données précieuses sur le sang.
Raffinement
Nous porterons une attention particulière à la préparation amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux, laquelle sera au minimum de 7 jours dès réception. Les opérations chirurgicales et implantations se feront sur animaux anesthésiés + anti-douleur, tandis que l’administration (infusion), continue et autonome, se fera sur animal éveillé. Le contrôle des pesées et les prélèvements intermédiaires de sang seront précis et rapides (≤ 2min) sur animaux éveillés. Tout au long de la procédure, des points limites seront systématiquement établis afin de pouvoir répondre à une situation d’urgence. En point final, une injection létale d’anesthésiques permettra une mise à mort rapide des animaux sans stress ni douleur. .
Choix des espèces
Les rongeurs représentent cette famille (d'animaux) de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études de pharmacocinétiques (groupes de 4 individus). A l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur (souris et rat), reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’Homme. Par sa petite taille, Il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques) et une diminution des posologies. Les animaux seront utilisés pour réaliser des cinétiques pharmacologiques et des échantillonnages de sang et tissus. Pour notre procédure nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 10 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons les variations inter individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Chez la souris, cet âge présente un poids moyen de 27-30g environ, et qui s’avère particulièrement économique et mois risqué en termes de posologies par rapport à des animaux plus âgés (réduction des doses/risques immunogènes).
Etudes précliniques non-réglementaire d’une immunothérapie des muqueuses avec l’IgA pour le traitement du cancer colorectal
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
620 souris subissent une greffe de cellules tumorales dans le caecum puis l'ablation d'une partie de cet organe, sur les 1 240 utilisées pour tester l'efficacité du médicament. 1 330 souris vont être utilisées en tout, toutes tuées à l'issue, dont 1 240 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Trois d'entre elles sont utilisées pour former le personnel aux gestes de chirurgie, et une cohorte est tuée chaque semaine de la troisième à la huitième pour observer la prise tumorale et l'apparition de métastases. Le porteur écrit que les traitements "n'entraineront pas de douleur supérieure à celle d'une piqure d'aiguille", alors que 1 240 souris sont déclarées en souffrance sévère.
Objectifs
Le cancer colorectal est le second cancer, en terme de fréquence, chez la femme (après le cancer du sein) et le troisième chez l'homme (après le cancer du poumon et celui de la prostate). Les cancers coliques ont une fréquence élevée en France : chaque jour, 100 personnes apprennent qu'elles ont un cancer colorectal. Plus exactement, on découvre 33 000 nouveaux cas par an, et 16 000 personnes en meurent. Chez les non-fumeurs, il est la deuxième cause de mortalité par cancer. Les hommes sont un peu plus touchés que les femmes (taux d'incidence de 40 et 27 pour 100000, respectivement). Aux Etats-Unis, le cancer colorectal est la deuxième cause majeure de décès par cancer et le troisième par ordre de fréquence chez l’homme et chez la femme. L’arrivée des thérapies ciblées représente une nouvelle avancée, avec notamment les anticorps permettant de bloquer la formation de petits vaisseaux sanguins destinés à fournir à la tumeur l’énergie dont elle a besoin pour grossir. Celle-ci est alors privée des nutriments indispensables à sa croissance et régresse. Une autre approche ciblée concerne les tumeurs qui surexpriment un facteur de croissance cellulaire. Les premiers résultats montrent qu’associées à la chimiothérapie, ces molécules augmentent le taux de réponse des patients. Elles font actuellement l’objet de nombreuses études. Mais beaucoup d’études ciblent l’environnement de la tumeur afin de bloquer son développement mais pas la tumeur directement. Aujourd’hui, dans le cas du cancer colorectal, trop peu de molécules thérapeutiques ciblent directement des marqueurs exprimés sur les cellules cancéreuses car leur profil d’expression et leur fonctionnalité varient fortement en fonction des mutations accumulées dans les cellules cancéreuses.
Bénéfices attendus
Nous développons une nouvelle approche d'immunothérapie orale qui montre des résultats prometteurs dans la réduction des tumeurs locales. L'efficacité du médicament est l'élément critique pour l'adoption d'un nouveau médicament, mais la voie d'administration l'est tout autant : en prenant le produit par voie orale, le patient redevient acteur de son long parcours de soins et il n'a plus besoin de se déplacer à l'hôpital pour poursuivre son traitement. L'impact sur l'amélioration de la qualité de vie du patient sera considérable, lorsque le médicament sera approuvé et utilisé. Concernant le coût de traitement, il sera diminué de toute la partie de la prise en charge hospitalière et du transport du patient jusqu'au centre de soins. À mesure que le coût des soins dans les hôpitaux augmente, il est de plus en plus nécessaire de trouver des alternatives économiques pour toujours garantir la même qualité de soins au patient. Maintenir les patients à domicile en leur permettant de poursuivre leur traitement à distance améliore considérablement l'accès aux soins pour les patients vivant dans des zones rurales dépourvues d'infrastructures médicales importantes (Hôpitaux universitaires, centres de recherche contre le cancer de pointe, centres d'investigation clinique pour les essais cliniques). De plus, les traitements contre le cancer sont généralement extrêmement toxiques, constituant un challenge pour les médecins prescripteurs qui doivent trouver le meilleur équilibre entre bénéfice thérapeutique et tolérance pour le patient. Les effets secondaires nombreux et variés selon les conditions physiologiques du patient rendent le parcours de soins du patient extrêmement difficile à vivre. A cela s'ajoute la lourdeur d'un traitement qui nécessite une administration régulière à l'hôpital (parfois chaque semaine), souvent pendant de longues heures (4 à 6 heures) voire des jours, par perfusion sous contrôle médical. Pour le bien-être du patient, l'administration orale d'un traitement anticancéreux représentera une révolution et une amélioration sans précédent de sa qualité de vie. Enfin, notre démarche s’inscrit dans le contexte du traitement d’indications orphelines telles que les lésions précancéreuses de la muqueuse buccale, qui laissent, par définition, les patients sans aucune chance de traitement.
Procédures
4 animaux vont avoir une greffe sous-cutanée au niveau du flanc sous anesthésie. Chaque semaine durant 10 semaines, ils seront suivis par imagerie sous anesthésie, ils seront pesés et auront un prélèvement de sang toutes les 2 semaines. 32 animaux vont recevoir une greffe dans le caecum. Les souris seront anesthésiées et pesées. Chaque semaine, ils seront suivis en imagerie. Ils auront également un prélèvement de sang toutes les 2 semaines. Dès la 3ème semaine et jusqu’à la 8ème, 4 animaux seront euthanasiés par semaine pour observer la prise tumorale et l’apparition de métastases. 3 animaux seront utilisés pour la formation du personnel par une vétérinaire aux gestes techniques de chirurgie. Pour les tests d’efficacité du médicament, 1240 animaux recevront une greffe. Dans ce groupe, la moitié des animaux (soit 620) auront une résection caecale. Pour chaque groupe, différentes posologies de traitements par gavage et/ou injections seront administrées. Le suivi sera réalisé en imagerie et par observation quotidienne de l’état général des animaux en accord avec une grille de score et le bien-être animal.
Impact sur les animaux
L’injection en sous-cutanée des cellules cancéreuses, l’analyse par imagerie de l’animal vont entrainer au réveil de l’animal un léger stress. Les gestes de chirurgie entrainent au réveil des animaux de l'inconfort et du stress malgré la prise en charge de la douleur avec l'analgésie et des anti-inflammatoire. Cette douleur résultante peut être observée pendant 48h. Les traitements n’entraineront pas de douleur supérieure à celle d’une piqure d’aiguille. Elles entraineront un léger stress sur les animaux sur la durée de la contention comme lors des gavages.
Devenir
Après le traitement, chaque cohorte sera mise à mort à un temps donné afin de prélever les organes (caecum, foie, poumon…) pour observer la présence de tumeur au niveau du caecum et la présence de métastases dans les autres organes. En parallèle, des analyses permettront d’observer les populations immunitaires recrutées au niveau de la tumeur mais aussi des autres organes permettant de valider l’action des anticorps médicaments.
Remplacement
Des tests sur cellules ont été au préalable effectués afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de notre traitement cependant le recours unique à des techniques sur cellule ou sur organes isolés est impossible car le développement tumoral et le suivi du traitement nécessité la prise en compte de l'organisme entier. En effet, les différents traitements doivent être testés dans le contexte d'un organisme entier afin d'évaluer leur efficacité, notamment dans le cadre d'une admnistration orale. De plus, le candidat médicament nécessite pour son fonctionnement le recrutement de l'ensemble des cellules du système immunitaire (muqueux et sanguins). Enfin, ces techniques in vivo nous permettent de vérifier l’accessibilité de notre traitement à la tumeur tissulaire ou aux métastases à distance du site primaire tumoral et du site d’absorption de notre molécule.
Réduction
Afin de tester ces différentes conditions de manière fiable, il faut un nombre suffisant d’animaux afin d’obtenir des résultats robustes nous permettant de passer à des études pré-cliniques réglementaires puis cliniques chez l’Homme. La 1ère procédure permettra de valider la croissance de la lignée cellulaire tumorale humaine dans un modèle de souris immunodéprimée et de valider le suivi de la prise tumorale par imagerie préclinique. La 2ème procédure permettra de déterminer la vitesse de croissance et le temps d'apparition de métastases de la greffe tumorale par imagerie et de suivre la colonisation métastatique. L'utilisation de l'imagerie permet de suivre un même animal de manière non invasive et tout au long du développpement tumoral, et d'anticiper l'apparition de foyers tumoraux non détectables par d'autres techniques. Il sera ainsi possible de réaliser des groupes d'animaux ayant les mêmes caractéristiques pour tester nos traitement saugmentant la robustesse de nos résultats et ainsi réduire le nombre d'animaux utilisés. La 3ème procédure correspond à la formation de notre personnel auprès d'une vétérinaire référente. Pour limiter le nombre d’animaux utilisés lors de cette formation, le geste technique sera tout d’abord appris sur essais cadavériques avec des animaux surnuméraires provenant des élevages de l’animalerie et devant être euthanasiés. Lors de la 4ème étude, le nombre d’animaux est imposé par la société partenaire certifiant les études pécliniques réglementaires afin de consituter le dossier pour aboutir in fine à des essais cliniques.
Raffinement
Afin de limiter le stress des animaux, ils seront manipulés régulièrement lors du change et des surveillances afin de les habituer aux différentes manipulations. Les procédures de chirurgie seront réalisées selon les dernières recommandations nationales avec une anesthésie stable et contrôlée avec prise de la douleur avec analgésie et anesthésie locale. Tout est mis en place pour garantir l'absence de contamination des animaux lors des gestes de chirurgie. Une bonne prise en charge de la douleur post-chirurgie sera effectuée pour le bien-être des animaux. Lors des procédures de chirurgie et d’imagerie les animaux seront maintenus sur tapis chauffant à 37°C. Pour éviter toute sécheresse oculaire du gel ophtalmique sera appliqué.
Choix des espèces
L’espèce a été choisie pour son temps de gestation court et elle possède un système immunitaire proche de celui de l’Homme. Les lignées murines immunodéficientes permettent de greffer des cellules tumorales d'origine humaine pour étudier la prolifération et le traitement. Les greffes tumorales seront réalisées sur des animaux jeunes (entre 2 et 4 mois), âge auquel la prise de greffe est optimal chez ces animaux.
Détection précoce de la fibrose cardiaque dans un modèle de rat atteint de dystrophie musculaire de Duchenne par imagerie médicale non invasive
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
93 rats porteurs de la mutation responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne vont être utilisés, tous tués à l'issue, 36 d'entre eux étant anesthésiés puis tués sans reprendre conscience, les 57 autres subissant des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon leur groupe, ils reçoivent jusqu'à huit injections, subissent jusqu'à deux anesthésies générales d'une heure, une pose de cathéter, une scintigraphie et une IRM. Le but est de vérifier si la fibrose du cœur, première cause de décès chez les patients, se détecte par scintigraphie avant d'être visible autrement. Le porteur écarte le chien, modèle "gros animal" jugé lourd à manipuler, et la souris, qui ne reproduit la maladie que partiellement, et retient le rat comme intermédiaire.
Objectifs
La maladie de Duchenne est une maladie incurable causée par des mutations génétiques entraînant une maladie grave et progressive affectant les muscles. Les principaux symptômes de la maladie de Duchenne sont une fonte et une faiblesse musculaire associées à des anomalies cardiaques et respiratoires, conduisant finalement au décès des patients au cours de la troisième décennie de leur vie. L'insuffisance cardiaque est la principale cause de décès chez les patients. Bien que la cause cellulaire principale soit la mort des cellules cardiaques, il devient de plus en plus évident que d’autres cellules contribuent largement à la gravité et à la progression de la maladie, en particulier les cellules de fibrose. La fibrose cardiaque, entrainant une rigidité du cœur, apparaît en effet à un stade précoce de la maladie. Dans cette étude, nous visons à évaluer si les lésions précoces associées à la fibrose du cœur dans un modèle de rat de la maladie de Duchenne peuvent être détectées par scintigraphie non invasive. L'apparition de la fibrose dans le cœur sera également suivie non invasivement par imagerie de résonance magnétique. Si l'hypothèse testée dans cette étude est confirmée, la scintigraphie pourrait émerger comme marqueur précoce pour l'évaluation de nouveaux traitements dans la maladie de Duchenne, à la fois dans les modèles animaux et chez les patients.
Bénéfices attendus
Si l'hypothèse de ce projet est confirmée, le protocole de scintigraphie développé pourrait émerger comme indication précoce pour le suivi de la fibrose du cœur et l'évaluation de nouveaux traitements à la fois dans la maladie de Duchenne, mais aussi pour d'autres pathologies cardiaques, dans des modèles animaux et chez les patients.
Procédures
Un premier groupe de rats subira : Injection sous-cutanée vigile (
Impact sur les animaux
Les rats utilisés sont atteints de la maladie de Duchenne. Cependant, les animaux utilisés auront au maximum 5 mois, donc avant l'âge critique où leur état de santé se dégrade. Les seules interventions prévues qui ne se feront pas sous anesthésie générale sont les injections nécessaires à l'anesthésie des animaux. Cela peut générer un stress du à la manipulation des animaux et de la douleur au point d'injection. Les anesthésies générales peuvent causer de la fatigue.
Devenir
A l'issue de ce projet, tous les animaux seront mis à mort afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses ex vivo nécessaires au projet.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de modèle alternatif pour tester les méthodes non invasive de détection du développement de la fibrose du cœur dans la maladie de de Duchenne. Le développement de fibrose musculaire est un processus physiologique global faisant interagir différents types cellulaires, éventuellement issus de différents organes. De plus, les méthodes de détection testées dans ce projet sont des méthodes d'imagerie médicale que nous voulons appliquer ensuite chez l'être humain. Ce projet ne peut donc pas être réalisé in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été évalué à l'aide d'un logiciel d'aide à l'expérimentation animale, proposant un outil de calcul statistique. Les groupes ont été établis de façon à ce que les résultats obtenus soient suffisants statistiquement pour conclure sur la bonne détection de la fibrose par nos méthodes d'imagerie. Le nombre d'animaux obtenu est cohérent avec nos expériences précédentes de protocoles d'imagerie lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Les données générées seront ensuite analysées à l'aide de tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les méthodes d'imagerie que nous utiliserons dans ce projet sont non invasives et non douloureuses. Elles nécessitent l'anesthésie des animaux afin qu'ils restent immobiles pendant l'examen. Afin de prévenir au maximum la souffrance et le stress infligés aux animaux, les procédures se dérouleront avec une surveillance régulière par les expérimentateurs. Des points limites ont été établis dans les différentes procédures, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Le bien-être animal passera également par de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu.
Choix des espèces
Le rat modèle de la maladie de Duchenne possède comme les patients une mutation d'un gène essentiel au fonctionnement des muscles. Les autres espèces utilisées comme modèle de la maladie de Duchenne, la souris et le chien, présentent des limites. Le chien présente une évolution de la maladie proche de celle des patients, mais est un modèle "gros animal" lourd à manipuler. La souris ne reproduit que partiellement la maladie. Le rat est donc un modèle intermédiaire avec un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations. Dès l’âge de 1,5 mois, les rats modèle de la maladie de Duchenne présentent les premières anomalies dans leurs muscles. A 3 mois d’âge, ces anomalies sont bien développées mais pas encore détectables sans biopsie. A 5 mois d’âge, la fibrose du cœur est suffisamment développée pour être observable en imagerie par résonance magnétique. Les catégories d'âge choisies (1,5 mois, 3 et 5 mois) devraient nous permettre d'observer la fibrose à 5 mois et de tester sa détection à des stades de développement plus précoces. Ce planning nous garantira de pouvoir effectuer l’intégralité du protocole chez tous les animaux inclus, sans atteindre l'âge critique où la dégradation de l'état de santé due à la maladie pourrait devenir sévère (au-delà de 8-9 mois).
Etude des mécanismes comportementaux liés aux troubles de la prise alimentaire
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Deux ponctions à la queue à trois semaines d'intervalle, un rationnement maintenant les souris à 90 % de leur poids libre, des isolements de une à deux heures et un régime riche en gras et en sucre pendant quatre à six semaines : 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'objectif déclaré est de relier des traits comportementaux, anxiété, prise de risque, capacités cognitives, prise de décision, au risque de développer un trouble du comportement alimentaire, avec l'idée de transposer les résultats à l'humain. Aucun prélèvement d'organe n'est prévu, et les souris sont tuées à la fin de la procédure parce que leur âge, plus de neuf mois, et leur régime empêchent de les réutiliser ailleurs. Sur la réduction, le porteur écrit seulement que "tous les efforts seront faits" et que le minimum sera utilisé, sans indiquer comment il arrive à 400 animaux.
Objectifs
L’objectif du projet est de faire ressortir des liens entre traits comportementaux et comportement face à la prise alimentaire. Plus spécifiquement, il s'agit de faire ressortir certains profils (caractère anxieux, prise de risque, capacités cognitives, choix et prise de décision) comme pouvant être à l’origine, voir prédictifs de trouble du comportement alimentaire. Nous nous intéresserons tout particulièrement au lien entre les trois processus suivants : Le décisionnel, le motivationnel, et le mnésique. Ces différents processus seront étudiés par divers études comportementales telles que : la mesure de l'anxiété, de la cognition, de la prise de décision par l'association d'un son à une action pour obtenir une récompense. Il s’agira in fine d’offrir une analyse originale et détaillée qui pourrait s’appliquer à divers modèles animaux de désordres alimentaires. Par la suite, l'idée est de transposer ces résultats chez l’Homme afin de connaître le lien entre caractère comportementaux et risque de déclencher un trouble alimentaire. Ce savoir permettrait à l’avenir, d’anticiper au maximum le développement de troubles alimentaires touchant aujourd’hui près de 600 000 jeunes en France.
Bénéfices attendus
Les troubles du comportement alimentaire sont des pathologies mentales graves caractérisées par d’importantes perturbations du comportement alimentaire et de la corpulence. Elles peuvent causer des dommages physiques et émotionnels pouvant conduire malheureusement à la mort. Elles touchent une part importante de la population, avec une augmentation considérable depuis ces 15 dernières années, et constituent un réel problème de santé publique. Il est donc indispensable d’approfondir nos connaissances sur cette physiopathologie afin d’identifier des perspectives thérapeutiques mais aussi préventives. Dans ce projet, la confrontation de l’étude comportementale avec l’étude métabolique permet de déterminer une éventuelle corrélation entre certains traits comportementaux (anxiété, impulsivité, habitude) et paramètres consommatoires et/ou métaboliques spécifiques. Il s’agira donc d’offrir une analyse originale et détaillée qui pourrait s’appliquer à divers modèles animaux de désordres alimentaires. Transposé à l’humain, ce projet apportera des connaissances sur les mécanismes à la base du comportement alimentaire et de ses altérations, afin d’éviter, le plus tôt possible (aspect préventif), l’apparition de pathologies liées à la consommation alimentaire.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang par ponction à la queue (ne durant que quelques secondes, le temps de prélever une goutte de sang) afin d’analyser leur taux de glucose et le métabolisme de chaque individu. Deux prélèvements à 3 semaines d'intervalle seront effectués au total sur chaque souris pour toute la procédure. Aucune autre intervention de type chirurgicale ne sera effectuée sur ces animaux.
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable majeur n'est attendu dans cette procédure. Principalement car elle est constituée de tests classiquement reconnus pour leur innocuité. Il est à noter tout de même que de légères nuisances sont à prévoir : stress, rationnement alimentaire léger (maintien à 90% du poids ad libitum). Les animaux seront également amenés à subir une isolation ponctuelle et de courte durée (pas plus de 2h), nécessaire notamment à la mesure de leur consommation individuelle. Cela peut entrainer un stress léger, qui sera diminué par l'utilisation de séparateurs de cage, permettant la conservation d'un contact visuel, auditif et odorant avec leur congénères. Dans la deuxième partie, la prise de poids induite par l'exposition chronique au régime hyperlipidique et les désordres métaboliques associés pourront être cause de nuisances, qui restent moindres, pour les souris. Comme par exemple : une prise de poids de 15% maximum, une augmentation de la masse grasse, une augmentation modérée des niveaux circulants d’insuline et de glucose induisant un début d'intolérance au glucose mais pas de diabète avéré. De plus, cette nuisance, identique à celle rencontrée chez l’Homme, est l’object précis de cette étude. Enfin, le suivi des paramètres intéressants, comme le taux de glucose, pendant toute la phase du régime hyperlipidique inclu deux prélèvements de faible quantité de sang (100microL) en utilisant la méthode de prélèvement la moins invasive possible (légère ponction à la queue).
Devenir
A la fin de la procédure, les souris sont agées de plus de 9 mois, et auront déjà suivi une batterie de tests comportementaux. De plus, les animaux auront consommé un régime riche en sucre et gras pendant près de 4 à 6 semaines, empéchant toute réutilisation auprès d'un autre projet. Aucun prélèvement de tissu ou organe n'est prévu dans ce projet. Tous les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Ce projet ne peut être réalisé sans l’utilisation de modèles animaux puisqu’il s’intéresse à des dimensions comportementales, et s’adresse donc au vivant. Ceci est particulièrement vrai pour des tests d’anxiété, cognitifs, ou de prise de décision, visant à observer des différences inter-individus. Il n’est donc pas possible de remplacer ce modèle souris par des modèles in-vitro ou in silico.
Réduction
Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d’animaux et le minimum de souris nécessaires pour atteindre une signification statistique sera utilisé.
Raffinement
Les recherches seront réalisées en accord avec les recommandations institutionnelles pour le bon traitement des animaux de laboratoire. Les souris seront hébergées tout au long de leur vie en cage collective avec un environnement enrichi et dans une animalerie agréée comportant une régulation de la température, de l’hygrométrie et du cycle jour/nuit. Lors d’expériences spécifiques et nécessaires impliquant une courte individualisation, des solutions sont mises en place pour réduire au maximum le stress de l'animal : une poignée de sciure de leur cage d’hébergement contenant une odeur familière et celle des congénères versée dans leur cage individuelle, ou encore la mise en place de séparateurs de cage pour garder un contact visuel, auditif et odorant avec un autre congénère. L'isolement est ponctuel et ne dure pas plus de 1-2h. La mise sous restriction alimentaire, nécessaires au bon fonctionnement des expériences mesurant l’aspect motivationnel lors de tests en conditionnement opérant seront réduites au maximum, et un suivi tout particulier sera effectué sur l’évolution du poids des souris. Hormis ces deux cas de figure, tout au long de leur hébergement, les souris recevront de l’eau et de la nourriture ad libitum, et seront changées régulièrement (1 fois par semaine) afin de conserver un environnement de vie propre et confortable. Elles seront également observées minutieusement de manière quotidienne par un personnel qualifié. Au cours de ces observations, si un animal présente des blessures, il sera immédiatement soigné et recevra un suivi renforcé (surveillé deux fois par jour). Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être (perte de poids de plus de 15%, poils hérissés, prostration…), la mise en place de mesures appropriées sera effectuée en fonction des besoins de l’animal. Il sera si besoin isolé de sa cage et les soins nécessaires lui seront administrés. Si, suite aux soins effectués, l’animal ne montre aucune amélioration significative dans les 48h suivant sa prise en charge, il sera mis à mort. De plus, si des signes d’agressivités sont présents dans une cage collective, l’agresseur est identifié et isolé du reste du groupe.
Choix des espèces
Le modèle de rongeur permet l’étude intégrée de la nutrition sur des aspects comportementaux qu’il n’est pas possible de remplacer par des approches cellulaires. Le comportement du vivant en réaction à l’anxiété, aux fonctions cognitives, sociales ou décisionnelles sera particulièrement exploité dans notre étude, d’autant plus que les tests comportementaux utilisés font appel à des comportements innés chez les rongeurs. La souris a tout particulièrement été choisie car les effets du régime utilisé dans la seconde partie de notre étude sont bien caractérisés chez cette espèce. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (8 semaines). Ils seront livrés au sein de l’animalerie par un établissement agréé dès l’âge de 3 semaines (après le sevrage). Puis hébergés en collectivité (par 4 ou 6), le temps d’atteindre leur âge adulte. Ils débuteront ensuite les premiers tests comportementaux à l’âge de 8 semaines (adulte). Puis ils seront utilisés pour une durée totale de 6 mois.
Etude du potentiel anti-tumoral d’extraits de plantes et leur impact sur la réponse aux immunothérapies
- Recherche appliquée
- Cancers
Tester des extraits de plantes en complément d'immunothérapies anticancéreuses, dans un contexte où "les industriels cherchent sans cesse à approfondir leur expertise sur les propriétés des végétaux" : 3 744 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou directement dans le rein par chirurgie, des injections d'immunothérapie tous les trois jours pendant deux semaines, et des gavages d'extraits de plantes trois fois par semaine pendant trois à quatre semaines. Le porteur qualifie la croissance de la tumeur rénale de "bien tolérée" et le gavage de "contrainte légère". Les extraits testés se trouvent déjà en pharmacie de proximité, et le projet vise à documenter ce qu'ils ajoutent à des immunothérapies existantes.
Objectifs
Les végétaux offrent une action globale au sein de l’organisme en agissant à plusieurs niveaux et en régulant différentes fonctions. Ces dernières années, les progrès en chimie ont permis l’extraction et la mise en évidence de principes actifs de certaines plantes, permettant d’accompagner la santé des individus (sommeil, digestion, stress, etc…). L’impact du régime alimentaire sur la modulation de notre microbiome intestinal a déjà été établit chez la souris comme chez l’Homme. Au sein de notre laboratoire, nous avons démontré l'association entre le microbiote intestinal et l'efficacité des traitements immunothérapeutiques dans le traitement du mélanome, du fibrosarcome et du carcinome rénal à cellules claires. Cet environnement intestinal est un haut lieu d’échange où communiquent les cellules épithéliales et le système immunitaire de l’individu avec un milliard de micro-organismes. De nos jours, les individus souhaitent de plus en plus se tourner vers l’emploi de produits dits naturels afin de renforcer leur microbiote intestinal et leur système immunitaire tandis que les industriels cherchent sans cesse à approfondir leur expertise sur les propriétés des végétaux. C’est dans cette optique que nous nous intéresserons à l’impact de la prise d’extraits de plantes sur la réponse immunitaire dans un contexte oncologique, en association avec des traitements immunothérapeutiques. Le but de ce projet est d’étudier le potentiel thérapeutique des extraits de plante afin d’améliorer le parcours thérapeutique des patients avec ceux-ci tout en approfondissant nos connaissances sur les propriétés de certains végétaux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’étudier l’effet de la bioactivité de certains extraits de plantes et/ou composés actifs sur la croissance tumorale, la réponse immunitaire et l’efficacité anti-tumorale des traitements immunothérapeutiques. Ainsi, nous pourrions approfondir nos connaissances concernant certains végétaux et ainsi, utiliser leurs propriétés afin de répondre aux besoins médicaux des patients. Cela se traduirait par l’accompagnement de la prise de traitements immunothérapeutiques par des extraits de plantes ou composés actifs, que l’on retrouve déjà dans nos pharmacies de proximité, permettant l’amélioration de la réponse anti-tumorale dans des cancers reconnus comme agressifs (rein et mélanome). Aussi, nous pourrions moduler positivement la balance « bonnes » bactéries/ « mauvaises » bactéries au sein du microbiote intestinal, au bénéfice des patients atteints de ces cancers.
Procédures
Les animaux auront des injections de tumeurs, réalisés sous anesthésie (durée 2 minutes, une par souris), ou des injections orthotopiques (injection chirurgicale dans l'organe) sous anesthésie générale (durée 10 minutes, une par souris). Les injections des traitements immunothérapeutiques se feront tous les 3 jours pendant 2 semaines, durée 2 minutes. Nous réaliserons également des gavages d’extraits de plantes ou de composés actifs issus de ces plantes, 3 fois par semaine pendant 3 à 4 semaines, durée 2 minutes. Des prélèvements sanguins seront également effectués sur les animaux, sous anesthésie générale (n=5, durée 5 minutes au maximum).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir un stress léger lié aux manipulations (préhension). Ils auront des injections en sous-cutanées ou par voie chirurgicale au niveau rénal, et des gavages d’extraits de plantes ou de composés actifs issus de ces plantes. Les injections sous-cutanées et intrapéritonéales provoquent une douleur transitoire légère et seront donc faites sous anesthésie. Les gavages provoquent une contrainte légère. La croissance des tumeurs dans le rein est bien tolérée et provoque des conséquences au maximum modérées.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin d'effectuer des analyses sur divers organes et tissus.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le microbiote, l’immunité anti-tumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse anti-tumorale dans un contexte tumoral, avec toutes les intéractions nécessaires. Il est actuellement impossible de reproduire toutes ces interactions in vitro ou ex vivo.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, nous regrouperons les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Nous mènerons cette étude de façon séquetielle pour que chaque procédure fasse suite à la validation de l’hypothèse précédente. Chaque expérimentation concluante sera répétée une seconde fois, afin d’éliminer le biais d’expérimentation et de s’assurer de la validité de nos observations. Dans le cas où la procédure s’avère non concluante, l’expérimentation ne sera pas répétée et le protocole sera arrêté, ce qui diminuera le nombre de souris. Le calcul du nombre d'animaux par groupe a été réalisé grâce à un test statistique, ce qui nous a permis d'établir un nombre de 8 souris par groupe.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être : régime alimentaire adapté et une eau stérile correspondant à leurs besoins, ainsi qu’un enrichissement adapté à l'espèce utilisé. Les animaux seront mis en quarantaine pendant une semaine avant le début de l’expérimentation, afin de leur permettre de s'acclimater à leur nouvel environnement. Dès le début des procédures, les souris auront un examen clinique quotidien afin de s’assurer de leur bien-être tout au long des procédures, suivant des critères pré-définis (poids, aspect du pelage et de la dentition, comportement social, taille et aspect de la tumeur). Des points limites ont ainsi été définis et seront strictement appliqués. Les injections et prélèvements sanguins se feront sous anesthésie. Les souris faisant partie des groupes nécessitant une chirurgie bénéficieront d'un suivi post-opératoire spécifique durant lequel nous leur administrerons des analgésiques.
Choix des espèces
La génétique de la souris est proche de celle de l’Homme et bien décrite au niveau de la littérature scientifique, ce qui rend comparable les voies de signalisation immunologiques des tumeures entre l'Homme et la souris.Les modèles de tumeur que nous utiliseront sont issus de lignées cellulaires murines. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 8 semaines, ce qui nous permettra d'étudier le système immunitaire à un stade de développement optimal et fonctionnel.
Traitement pharmacologique pour la myopathie à agrégats tubulaires dans des modèles souris
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Injections dans l'abdomen tous les deux jours de un à quatre mois, test de force trois fois par jour chaque mois, vingt-quatre heures d'enregistrement de l'activité locomotrice répétées jusqu'à quatre fois, prélèvement de sang mensuel : 660 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent l'une des deux mutations les plus fréquentes chez les patients atteints de myopathie à agrégats tubulaires, et présentent une faiblesse musculaire dès l'âge de deux mois. Le porteur signale aussi une douleur et un stress liés au poinçonnage de l'oreille et au tatouage de la queue. La mesure finale de la force musculaire dure jusqu'à trente minutes sous anesthésie, sans réveil, et les souris sont tuées pour que leurs muscles soient prélevés.
Objectifs
La myopathie à agrégats tubulaires (TAM) est une maladie rare caractérisée par une faiblesse musculaire progressive, des crampes et des myalgies. La majorité des patients présentent également des anomalies de la peau, des os, des plaquettes, et de la rate. La présentation complète de ces signes multisystémiques est appelé syndrome de Stormorken (STRMK). TAM et STRMK forment un spectre de la même maladie. Nous avons précedemment généré et caractérisé deux modèles murins portant les deux mutations TAM/STRMK les plus communes chez les patients, localisées sur des gènes différents. Les souris présentent les principaux signes cliniques des patients. A ce jour, aucun traitement n’est disponible ni pour prévenir ni pour atténuer ces signes cliniques. A partir d'une librairie de médicaments approuvées pour le traitement médical chez l'homme, nous avons identifier deux médicaments capables d'inverser les défauts associés à la maladie in vitro. Une autre molécule est actuellement entrée en Phase II en essais cliniques pour la pancréatite aïgues mais cible la même voie dérégulée chez nos patients. Nous avons l'intention de traiter nos modèles souris TAM/STRMK avec les deux médicaments et la molécule en Phase II afin de tester la prévention mais également la réversion des symptômes observés chez les souris. Nous espérons ici trouver une nouvelle indication thérapeutique à des médicaments utilisés pour le traitement d'autres maladies. Cette méthode permet d'offrir une solution thérapeutique plus rapide aux patients et également peu toxique. Cette méthode est particulièrement intéressante pour les maladies rares comme TAM/STRMK où le nombre de patients diagnostiqués n'est pas suffisant pour réaliser des essais cliniques sur cette maladie.
Bénéfices attendus
Il est attendu que cette étude apportera une preuve de concept pharmacologique pour un traitement efficace de TAM/STRMK.
Procédures
Les animaux seront injectés par injection intrapéritonéale tous les deux jours entre 1 et 4 mois pour la stratégie de prévention, et entre 4 et 6 mois pour la stratégie de réversion. L'injection est réalisée en moins de 30 secondes. Le test de comportement permettant d’évaluer la force globale de l’animal sera réalisé 3 fois par jour toutes les mois entre 1 et 4 mois pour la stratégie de prévention et entre 4 et 6 mois pour la stratégie de réversion. Chaque test dure 60 secondes avec repos minimal de 5 minutes entre chaque test. Le test permettant de mesurer l’activité locomotrice spontanée dure 24h, et sera répété 4 fois dans la vie de la souris pour la stratégie de prévention et 2 fois pour la stratégie de réversion (1 fois par mois). Le prélèvement du sang sera répété 1 fois par mois, soit 4 fois dans la vie de la souris pour la stratégie de prévention et 3 fois pour la stratégie de réversion, et durera 1 minute. La mesure de la production de force du muscle est une procédure sans réveil, qui durera au maximum 30 minutes. A l’issue de cette procédure, l’animal anesthésié sera mis à mort. Des injections péritonéales seront réalisées pour administrer le traitement. La procédure prendra environ 1 minute par souris.
Impact sur les animaux
Les souris malades manifestent des problèmes dans le muscle, la rate, et les plaquettes, tout comme pour l'homme. Le modèle murin est un outil approprié pour étudier le développement de la maladie et l'effet thérapeutique attendu des traitements étudiés. Les tests de comportement peuvent induire du stress chez l'animal. Les injections du traitement peuvent causer douleur chez l'animal. Une douleur et un stress physique sont attendus suite au poiçonnage de l'oreille et au tatouage consécutif de la queue lors de l'identification de l'animal.
Devenir
Les animaux seront mis à morts à l’issu des tests pour prélever les muscles nécessaires aux analyses moléculaires.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme qui dans notre cas est crucial car nous étudions une maladie associée à un phénotype multisystémique.
Réduction
Pour la partie expérimentale, les tests phénotypiques réalisés de manière non invasive offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement à la fin du traitement, ce qui permet de s’affranchir de générer une nouvelle cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. L’organisation de nos procédures vise à utiliser le plus possible de tissus différents provenant de la même souris afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un maximum d’un test par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum en veillant à obtenir une puissance statistique suffisante. Ainsi, nos précédentes études montrent que 15 souris au maximum par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu'au sevrage. La couleur de leur peau et la présence d'une poche de lait seront évaluées tous les 2 à 3 jours. Après le sevrage, les animaux seront hébergés en groupe dans des cages placées dans un environnement où la température sera maintenue constante, la qualité de l'air sera assurée par une ventilation et un cycle de lumière de 12 heures jour/nuit sera respecté. Les animaux auront accès à volonté à de l'eau et de la nourriture. La litière sera changée aussi souvent que nécessaire pour maintenir les animaux propres et au sec. Le milieu sera enrichi avec des nids et un tube. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. En cas de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. La plupart des expérimentations seront réalisées à l'aide de tests permettant une exploration totalement non invasive de la fonction musculaire dans des conditions physiologiques in vivo, ce qui limite le développement de la douleur. Afin de réduire le stress lié aux différents tests, une phase de familiarisation sera effectuée pour chaque test avant le début du suivi longitudinal. Pour les mesures de force in situ, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques permettant d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante pendant toute la procédure afin de maintenir sa température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. Des points limites pour nos souris incluent des signes de difficultés motrices majeurs tels que la perte de poids et une immobilité prononcée des membres postérieurs avec l’apparition d’une cyphose (dos arrondi). Si l'un des points limites est atteint, les souris seront euthanasiées. Les sites d'injections seront surveillés quotidiennement pour prévenir une infection.
Choix des espèces
Le modèle souris nous permet d’étudier la possible amélioration du phénotype musculaire et notamment du phénotype observé sur d’autres organes dans ce modèle murin d’une maladie multisystémique. Nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo chez la souris. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d'autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure du muscle est plus différente. C'est pourquoi nous proposons de réaliser ces techniques sur des lignées de souris disponibles dans nos laboratoires. Les tissus de la souris peuvent alors être utilisés pour effectuer d'autres analyses, maximisant ainsi les résultats obtenus par souris et minimisant le nombre total d'animaux utilisés. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Stim1R304W/+, caractérisé par de la faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît au bout de 2 mois et s’accentue avec l’âge présentant un phénotype modéré à 9 mois. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Orai1V109M/+, caractérisé par de la faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît également au bout de 2 mois. Les souris seront utilisées à l’âge adulte après 4 semaines (pour la prévention de la maladie) jusqu’à 4 mois, et des souris après 4 mois jusqu’à 6 mois (pour la réversion de la maladie), pour observer le développement des souris après le traitement. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Stim1R304W/+, caractérisé par de la faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît au bout de 2 mois et s’accentue avec l’âge présentant un phénotype modéré à 9 mois. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Orai1V109M/+, caractérisé par de la faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît également au bout de 2 mois. Les souris seront utilisées à l’âge adulte après 4 semaines (pour la prévention de la maladie) jusqu’à 4 mois, et des souris après 4 mois jusqu’à 6 mois (pour la réversion de la maladie), pour observer le développement des souris après le traitement.