Recherche appliquée

9 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun peut recevoir un cathéter jugulaire ou fémoral sous anesthésie, subir jusqu'à huit prélèvements sanguins en 24 heures, des gavages ou injections jusqu'à trois fois par jour, un hébergement individuel jusqu'à dix jours et jusqu'à 48 heures en cage à métabolisme sans enrichissement. La finalité est de mesurer la pharmacocinétique de candidats médicaments, l'effectif étant estimé d'après l'expérience du laboratoire et "le nombre de demandes de nos partenaires". Le porteur reconnaît que les tests in silico et in vitro suffisent à présélectionner les composés, puis conclut que seul un modèle animal permet de déterminer l'ensemble des propriétés pharmacocinétiques.

Objectifs

L’objectif du projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques et/ou les concentrations tissulaires d’entités thérapeutiques chimiques ou biologiques après administration chez le rat. Dans la recherche préclinique et la recherche de candidats, ces paramètres sont essentiels pour la sélection et l’évaluation des candidats médicaments. Les entités testées sont préalablement analysées lors de tests in-vitro. Une première sélection est ainsi réalisée pour n’administrer aux animaux que des entités avec des caractéristiques favorables en terme pharmacocinétique. Ces études préliminaires permettent d’objectiver les processus d’absorption, de dégradation, de distribution et d’élimination de chaque entité afin de prédire le comportement de ces entités chez l’homme. Ce projet s’inscrit dans une stratégie globale de caractérisation de nouveaux composés en vue de la première administration chez l’homme, c’est donc une étape clé dans le cycle de vie de tout médicament en développement.

Bénéfices attendus

A court terme, les expérimentations de ce projet permettront de déterminer les paramètres essentiels pour l’avancée du développement préclinique pour les entités testées. Ces résultats permettront de sélectionner les candidats potentiels ainsi que les doses et les voies d’administration les plus adaptées. A long terme, les entités sélectionnées constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques o Par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique), intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée : Durée 30 secondes sur animaux vigiles. Unique ou répétée max 2 ou 3 fois par jour selon la voie o Par voie intraveineuse à la veine caudale ou via le cathéter sur animal vigile: Durée 30 secondes. Unique ou répétée max 2 fois par jour • Prélèvements de sang : o Via le cathéter : Durée 30 secondes sur animal vigile. Maximum 8 fois sur 24h. o Via la veine saphène ou caudale en microsampling : Durée 30 secondes sur animal vigile. Maximum 8 fois sur 24h. o Via ponction cardiaque en phase terminale : Durée 1 minute sous anesthésie générale gazeuse ou chimique. o Les volumes et la fréquence des prélèvements seront selon les critères de la consigne en vigueur. Les volumes seront généralement de 50 à 150 µL. Le volume total prélevé n'excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l'animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place entre les prélèvements. • Procédure chirurgicale de pose de cathéter jugulaire et/ou fémoral : o 1 anesthésie gazeuse de 30 minutes maximum par animal sur la durée de la chirurgie. o Administration par voie sous-cutanée d’analgésique. Durée 30 secondes sur animaux vigiles ou anesthésié. Unique ou répétée max 2 fois. o Administration unique par voie sous-cutanée de NaCl pour l’hydratation des animaux. Durée 30 secondes sur animaux anesthésié. • Hébergement individuel post-chirurgie ou post traitement : o Cage individuelle avec enrichissement complet (litière et matériaux de nidification) avec maintien du contact olfactif et visuel. Habituation pendant au moins 3 jours. Durée de l’hébergement individuel maximal de 10 jours. o Cage individuelle à métabolisme sans enrichissement avec maintien du contact olfactif et visuel. Habituation pendant au moins 3 jours. Durée de l’hébergement individuel maximal de 48h.

Impact sur les animaux

Au cours des études, - la chirurgie de pose de cathéter sous anesthésie/analgésie peut entrainer une nuisance, douleur et durée modérée - Les administrations et prélèvements sanguins vigiles peuvent entrainer une douleur légère de courte durée par acte, mais la nuisance peut être légère à modérée par la répétition des actes sur une étude, - L’hébergement individuel post-opératoire peut entrainer une nuisance légère de durée modérée ; - Sur certaines études, l’hébergement en cage à métabolisme peut entrainer une nuisance légère à modérée selon la durée. Aucune dégradation de l'état de santé de l'animal n’est attendue par l’application des procédures de ce projet. Toutefois dans ces phases précoces de développement, des effets secondaires non prédictibles peuvent survenir : perte de poids, hypo- ou hyperthermie, comportement anormal (animaux hypo- ou hyperactifs), vocalisations. Tout effet observé sera noté selon une grille spécifique et donnera lieu à une action adaptée à la gravité des signes ; les points limites anticipés permettent de limiter la nuisance à un niveau de gravité modéré au maximum.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. Les cathéters implantés ne sont pas perméables au-delà de 10 jours pour une implantation à la veine jugulaire et 14 jours pour la veine fémorale. De plus, les composés sont testés pour déterminer les profils d’élimination mais ces données ne sont disponibles que bien après la fin des phases in-vivo. De ce fait, il n’est pas possible de réutiliser les animaux pour de nouvelles études.

Remplacement

De nombreux tests in silico et in vitro existent et permettent de sélectionner les entités d'intérêt uniquement sur la base de leurs caractéristiques pharmacocinétiques, notamment l'absorption et le métabolisme. Ces tests préliminaires ex vivo évitent le recours à l’animal. Pour la suite du développement des nouvelles entités thérapeutiques, il n'existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de déterminer l'ensemble des propriétés pharmacocinétiques d'un composé d'intérêt. Seul un modèle animal peut permettre de caractériser ces entités et discriminer celles qui pourront être envisagées pour un traitement chez l’homme.

Réduction

Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d'interaction du composé avec la cible d'intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). Cette approche préalable permet de réduire fortement le nombre d’entités à tester. Lors de l’administration de doses croissantes, les animaux seront traités de manière séquentielle afin de s’assurer de l’innocuité d’une dose avant de passer à une dose plus élevée; Cette organisation permet d’éviter l’administration à des doses où les nuisances seraient trop fortes, et ainsi de réduire le nombre d‘animaux. La forte sensibilité des méthodes analytiques permet la mise en œuvre de techniques de prélèvements sanguins de volumes réduits autorisant la réalisation de prélèvements répétés sur un même animal. Il est ainsi possible d’obtenir une cinétique complète à partir d’un seul animal. Cela augmente aussi la robustesse des données obtenues pouvant mettre en évidence une éventuelle variabilité inter-individuelle. Le nombre minimal d’animaux par cohorte de traitement est réduit au minimum scientifique, c’est-à-dire 3 animaux pour les études de pharmacocinétique. Ce nombre suffit pour avoir des données assez robustes pour présélectionner des candidats pour la phase pré-clinique. L’estimation du nombre de rats utilisés est basée sur l’expérience acquise sur ce modèle et sur le nombre de demandes de nos partenaires. 9000 rats seront prévus sur une période de 5 ans.

Raffinement

Les animaux seront hébergés conformément aux standards réglementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront groupés dans des cages contenant de l'enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Après réalisation des chirurgies, les animaux seront hébergés individuellement dans des cages conformes à la réglementation pour permettre une bonne récupération post-chirurgicale et éviter qu’ils ne s’abiment les sorties de cathéters ou les plaies en cicatrisation. Ces cages seront équipées d’enrichissement et matériaux adaptés. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Les locaux d'hébergement font l'objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d'hébergement et d'animaux sentinelles. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous l'autorité du vétérinaire désigné ou mis à mort selon les recommandations définies dans la consigne en vigueur. Un plan d'action sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire. Lors de l’administration de doses croissantes, les animaux seront traités de manière séquentielle afin de s’assurer de l’innocuité d’une dose avant de passer à une dose plus élevée; Cette organisation permet d’éviter l’administration à des doses où les nuisances seraient trop fortes pour les animaux. Le projet sera mis en œuvre par du personnel qualifié et habilité conformément à la réglementation en vigueur. De plus, les procédures sont fortement améliorées grâce à l’organisation de formations complémentaires pour le personnel en relation directe avec les animaux sur les techniques d’administrations et de prélèvements de liquides biologiques.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée dans les stratégies de sélection de candidat, en réalisant des essais de pharmacocinétique préclinique. De nombreuses publications le démontrent. Le choix de l’espèce est dicté par différents impératifs : - Techniques : compatibilité de volume de prélèvement sanguin total chez un même sujet expérimental; - Scientifiques : comparaison de résultats pharmacodynamiques et pharmacocinétiques chez la même espèce animale, homologie de récepteur de l’espèce choisie avec le récepteur humain. Le stade adulte sera utilisé par défaut (à partir de 7 semaines) car c’est celui qui permet de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de l’espèce pour une entité donnée.

24 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun opéré des deux yeux au cours de la même intervention, puis gardé vivant trois mois avant d'être tué pour l'analyse des greffons. Un chirurgien ophtalmologiste greffe dans chaque cornée un lenticule de stroma décellularisé et lyophilisé, dix minutes par œil. Le porteur affirme que l'intervention est "totalement indolore en post opératoire", tout en annonçant une vision floue pendant 72 heures, une douleur possible les 24 premières heures et un suivi des points limites fondé sur la Rabbit Grimace Scale et le resserrement des paupières. L'application chez l'être humain reste renvoyée à un objectif "à terme", quand la double greffe et la mise à mort à trois mois relèvent, elles, du protocole arrêté.

Objectifs

La cornée est la membrane transparente située en avant de l’oeil. Elle est constitué de plusieurs couches : - L’épithélium, qui constitue la couche la plus externe - La membrane de Bowman - Le stroma - La membrane de Descemet - L’endothélium, la couche la plus interne Les atteintes de la cornée peuvent toucher son épaisseur sur la totalité ou en partie (épithéliale, stromale ou endothéliale). Ces atteintes génèrent une opacité ou une déformation, dans ce cas l’individu devient non voyant et il est nécessaire de réaliser une greffe de cornée, soit sur toute l’épaisseur, soit sur une partie de son épaisseur. Cependant, le nombre de cornées disponibles pour les greffes, le mode de conservation et sa durée reste limités. Dans le but de surmonter les pénuries et les contraintes, d’autres alternatives sont mises en places. Dans le cas où il est nécessaire de réaliser une greffe lamellaire antérieure (stromale) de la cornée, la mise au point de stroma cornéen décellularisé et lyophilisé serait extrêmement intéressante. Cela permettrait de répondre plus aisément aux différents problèmes de conservation, transport, urgence de greffes et disponibilité. En France, le mode de conservation de la cornée d’origine humaine est l’organoculture à +31°C. Cette méthode nécessite des conditions de stockage volumineux et contraignant. Une alternative à l’organoculture est la lyophilisation de la cornée qui permettra une facilité de stockage ( à température ambiante). Ce projet s’inscrit également dans un but humanitaire pour faciliter l’accès à la greffe lors de perforation dans les pays n’ayant pas les capacités d’approvisionnement en cornées. Les méthodes d’analyses permettent d’évaluer la conservation de l’intégrité structurale avant et après réhydratation ainsi que sa transparence. Cependant, il reste nécessaire de confirmer la bonne intégration de ces greffes in vivo (chez le lapin) avant une application chez l’homme.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’évaluer la compatibilité, l’intégration ainsi que la transparence au sein de la cornée du lapin du lenticule de stroma décellularisé lyophilisé. L’objectif est à terme une application pour la greffe chez l’humain. Ce projet s’inscrit également dans un but humanitaire pour faciliter l’accès à la greffe lors de perforation dans les pays n’ayant pas les capacités d’approvisionnement en cornées.

Procédures

Chaque lapin suivra une procédure chirurgicale sur chaque œil d'une durée de 10 minutes soit un temps opératoire de 20 minutes maximum. Cette intervention consiste à greffer des lenticules lyophilisés au niveau de la cornée. Ce geste est réalisé par un chirurgien ophtalmologiste hautement qualifié.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables de la greffe de corné chez le lapin sont les même que chez l'humain. Une vision légèrement floue durant les premiers 72h. Une légère douleur pourrait apparaitre durant les 24 premières heures due à l'inflammation engendrée par le geste opératoire.

Devenir

Tous les animaux sont gardés vivant pour une période de 3 mois à la fin de la procédure de greffe des lenticules, puis ils seront mise à mort pour l'evaluation des greffes.

Remplacement

Remplacement : la technique de lyophilisation de des cornées a été mise au point dans notre laboratoire et testée dans de nombreuse conditions in vitro. Aujourd’hui, nous devons confirmer la bonne intégration et la transparence des greffons stromaux lyophilisés sur la cornée animale avant de pouvoir l’utiliser chez l’homme. La dimension et la composition de la cornée du lapin est proche de celle de l'homme, cela permet une insertion plus facile par le chirurgien. De plus, le stroma cornéen sera préalablement décellularisé pour faciliter l’intégration dans la cornée du lapin.

Réduction

Dans le cadre de la règle des 3Rs : Réduction : Chaque lapin sera opéré des deux yeux. Cette intervention n’est pas cécitante, elle est régulièrement pratiquée en médecine humaine et totalement indolore en post opératoire ce qui nous permet de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés : - L’oeil droit recevra un lenticule dans l'épaisseur du stroma cornéen (INLAY) - L’oeil gauche recevra un lenticule à la surface du stroma cornéen (OVERLAY) Le nombre de lapins utilisé fait référence aux études antérieures et est nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement fiables et interprétables. Nous utiliserons un test de Wilcoxon ou un test Q de Cochran pour l'interprétation de statistique de nos résultats.

Raffinement

L’ensemble des procédures seront effectuées sous sédation profonde monitorée, couplée à une anesthésie locale médiée par un collyre ophtalmique. Les temps opératoires seront très courts maximum 10 minutes par oeil et pratiqué par un chirurgien qualifié. Afin de garantir une parfaite transposition chez l’humain les soins post opératoire seront les mêmes qu’en médecine traditionnelle : -Injection sous conjonctivale d’anti-inflammatoire en fin d’intervention. -Pommade ophtalmique deux fois par jour jusqu’à cicatrisation totale soit 5 à 7 jours. Chaque semaine, des photos seront réalisées sur les yeux afin de suivre la bonne intégration du greffon cornéen. A 3 mois post-greffe les cornées seront prélevées pour analyses histologiques. La manipulation des lapins sera facilitée par des séances d’entrainement récompensée (Fruity bites) durant les deux semaines d’acclimatation pré-opératoire. Des Bunny Block, des briquettes de bois et de luzerne seront disposés dans la cage de façon alterné afin d'assurer l'enrichissement du milieu et de la musique douce sera diffusée quotidiennement. Les points limites seront déterminés en se basant sur le Rabbit Grimace Scale et essentiellement sur l’Orbital tightening.

Choix des espèces

L’espèce choisie est le lapin new zealand. L’expérimentation proposée est relativement facile chez le lapin car la dimension de la cornée est proche de celle de l’homme et permet à un chirurgien d’insérer les lenticules de 7-8mm de diamètre avec facilité. Les lapins peuvent sous sédation être facilement examinés au biomicroscope pour la réalisation de photos post-opératoires et sont de très bons candidats pour cette mise au point. L’intervention réalisée chez l’homme sous forme de greffe de cornée n’est pas douloureuse et ne nécessite habituellement aucun antalgique. Stade adulte afin que l'oeil de l'animale ait atteint sa taille maximale. Soit 2kg à 2.5 kg 24 lapins seront utilisés 12 pour une correction à 2 lenticules et 12 pour une correcrtion à 3 lenticules.

90 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales de prostate humaine, passent au scanner puis sous radiothérapie FLASH sous anesthésie gazeuse, et sont suivies deux semaines pendant la croissance de la tumeur, avec des injections intrapéritonéales et rétro-orbitaires avant la mise à mort. Le but est de mesurer la réponse des vaisseaux tumoraux et l'oxygénation du tissu, données recueillies post mortem. Le porteur justifie l'espèce en indiquant que la souris est "le plus petit animal répertorié" sur lequel la radiothérapie FLASH fonctionne tout en autorisant une greffe tumorale suivie deux semaines.

Objectifs

La radiothérapie est un traitement contre le cancer utilisé chez plus de la moitié des patients. Une méthode récente ultra-rapide, dite "FLASH", a montré une toxicité inférieure sur les tissus sains tout en maintenant la même efficacité anti-tumorale dans différents modèles animaux. Le niveau d'oxygénation tissulaire semble être un paramètre qui influe sur le ratio bénéfice/risque de cette radiothérapie. De nombreuses études attestent du rôle de l'O2 dans les tissus sains mais aucune ne s'est intéressée aux tissus tumoraux dans ce contexte. Pourtant, le niveau d'O2 tumoral est un facteur qui est bien connu pour jouer sur l'efficacité anti-tumorale de la radiothérapie. En effet, lors de la radiothérapie conventionnelle, l'oxygénation tumorale augmente dans les premières semaines de traitement. L'oxygène présent facilite des réactions physicochimiques qui augmentent la destruction des cellules tumorales. Le projet a donc pour but d'étudier la réponse des vaisseaux sanguins tumoraux à la radiothérapie FLASH, et la conséquence en termes d'oxygénation du tissu tumoral. Le nombre de vaisseaux, la fraction d'aire hypoxique (sans oxygène) et le pourcentage de vaisseaux perfusés seront déterminés post-mortem. La taille des tumeurs sera également suivie. Cette connaissance est essentielle pour appréhender la réponse clinique globale et envisager les étapes ultérieures d'application de la méthode FLASH chez l'homme. Pour des raisons techniques, le projet se déroulera dans deux établissements.

Bénéfices attendus

La réoxygénation du tissu tumoral entre plusieurs séances de radiothérapie constitue l'un des piliers théoriques des procotoles cliniques actuels de radiothérapie. Il est en effet très important d'augmenter l'oxygénation de la tumeur, habituellement défectueuse, car la quantité d'oxygène dicte une grande partie des effets physico-chimiques de la radiothérapie et donc son efficacité. Il est donc crucial d'établir si les vaisseaux sanguins tumoraux répondent à la radiothérapie FLASH de la même manière qu'à la radiothérapie conventionnelle. Les données sur la réponse des vaisseaux ainsi que l'oxygénation tumorale permettront d'établir la pertinence des protocoles cliniques fractionnés actuels, ou dans le cas inverse de proposer de nouveaux protocoles de traitement. Les données permettront d'évaluer la performance globale de la radiothérapie FLASH sur la tumeur. Elles pourront permettre également d'envisager des combinaisons thérapeutiques avec des chimiothérapies anti-angiogéniques ou immuno-modulatrices. Enfin, elles apporteront des connaissances fondamentales sur les cellules du microenvironnement vasculaire, utiles à la communauté scientifique de la radiothérapie FLASH.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 procédures: 1- injection (seringue insuline) sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (2 min) 2- imagerie scanner CT-scan sous anesthésie gazeuse (15 min max) 3- radiothérapie sous anesthésie gazeuse (15 min) 4- suivi tumoral pendant 2 semaines puis injections ip et rétroorbitale (2 min) sous anesthésie gazeuse avant sacrifice endormi. Les actes 1-2-4 se déroulent dans l'Etablisssement 1. L'acte 3 dans l'établissement 2.

Impact sur les animaux

Lors des phases de transport et d'acclimatation, de préhension, contention ou anesthésie, il est attendu d'observer des périodes de stress léger chez les animaux. La greffe tumorale sous-cutanée produira une douleur légère et passagère (quelques minutes). La radiothérapie est imperceptible et ne peut en soi causer de souffrance. Seuls les actes associés (manipulations) sont décelables. La croissance tumorale, en particulier lors des deux dernières semaines, peut engendrer une détresse telle que: atteinte de la mobilité, fatigue. Ces signes sont cependant facilement détectables en amont et interviennent peu dans ce modèle. De plus, le modèle n'est pas métastatique et n'engendre pas d'autre risque.

Devenir

Les animaux suivent tous les même parcours: greffe tumorale, imagerie, radiothérapie, suivi. Tous les animaux seront euthanasiés en fin d'expérimentation, le but étant de prélever les tissus tumoraux pour analyse.

Remplacement

Les premières phases du projet scientifique global se sont déroulées sur des cellules, notamment endothéliales, constituants des vaisseaux sanguins. Tout ce qui a pu être étudié sans expérimentation animale a été fait. Néanmoins l'oxygénation tissulaire ne peut être étudié que dans un tissu perfusé et régulé physiologiquement.

Réduction

La stratégie en trois expériences indépendantes successives permettra de n'utiliser que la quantité d'animaux nécessaire à l'atteinte de la significativité statistique en fonction de la taille d'effet réellement observé: dès la significativité atteinte, les lots d'animaux suivants seront annulés.

Raffinement

Pour le bien-être des animaux, la socialisation et l'environnement seront optimisés: groupes de 5 invariables, maintient des cages et litières penant les transports, cycle jour-nuit adapté, eau-alimentation à volonté et sans changement de régime entre les établissements, frisottis en quantité pour nidification. Les dômes seront exclus car ils ont tendance à créer des comportements de domination chez la souris nude mâle. Une habituation à la manipulation et en creux de main sera réalisée progressivement. Pour éviter le stress, l'injection tumorale sous-cutanée, l'imagerie et l'irradiation seront réalisées sous anesthésie générale. Une stabulation sur tapis chauffant permettra à l'animal un réveil plus rapide et une meilleure stabilité physiologique pendant les procédures. Enfin, les animaux seront observés périodiquement selon un barème décisionnel qui évaluera le stress et la douleur, avec des critères d'arrêt d'expérimentation.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus décrit en tumorigenèse. Les phénotypes des lignées et leurs particularités génétiques sont répertoriés ("mouse phenome database"). Le génome de la souris (différentes souches), entièrement séquencé, et sa physiologie sont similaires à l'homme: 23 000 gènes codants contre 30 000 chez l'homme, avec une bonne conservation des gènes et des fonctions. La souris tolère l'homozygotie, ce qui permet de travailler sur des lignées et d'obtenir des résultats scientifiques très reproductibles. Le modèle immunodéprimé utilisé ici permet la greffe de cellules tumorales humaines. Plus précisément pour ce projet, la souris représente le plus petit animal répertorié sur lequel la radiothérapie FLASH fonctionne et permettant la greffe tumorale avec un suivi suffisamment long (2 semaines post-radiothérapie). L'efficacité du faisceau de particules particulier que nous utilisons a été montrée chez la souris préalablement, ce qui rend ce modèle fiable. Le cancer de prostate est un cancer de l'adulte et les animaux utilisés seront donc adultes (>8 semaines).

Poids, comportement et aspect du poil servent de points limites déclenchant la mise à mort anticipée. 12 812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réparties sur cinq établissements. Chaque animal peut recevoir un implant d'œstrogène posé sous anesthésie, une injection sous-cutanée de cellules tumorales humaines, huit prélèvements sanguins, cinq gavages au tamoxifène, des injections intrapéritonéales deux fois par semaine et des gavages quotidiens pendant jusqu'à trente semaines, plus une ligature vasculaire. Les souris des procédures expérimentales sont tuées pour exploration anatomique et histologique, celles de l'élevage restant en vie pour la reproduction, à l'exception des mâles immunodéficients.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)

Impact sur les animaux

Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.

Devenir

Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.

Raffinement

Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.

Séparées de leur mère pendant vingt-quatre heures au neuvième jour de vie, en hypoglycémie, en hypothermie et en état de stress, les souris de ce projet reçoivent ensuite, à partir du soixante-troisième jour, une injection quotidienne de psychotrope pendant deux semaines. 646 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Viennent les traitements, dans l'eau de boisson pendant trente jours ou par injection abdominale pendant quatorze, puis une roue d'activité pendant quatre semaines, puis les tests comportementaux, activité locomotrice, labyrinthe d'anxiété, mémoire de travail, réflexe de sursaut, reconnaissance d'objet, interactions sociales. 500 souris sont tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, les 146 autres partent vers d'autres projets, dont 86 femelles gestantes et 60 utilisées comme stimulus social.

Objectifs

Affectant près de 1% de la population, la schizophrénie est une maladie psychiatrique fréquente hautement handicapante du fait de la triade de symptômes qu’elle engendre : symptômes positifs (hallucinations, idées délirantes), négatifs (repli social, émoussement affectif) et cognitifs (déficits de mémoire, d’attention). La prise en charge thérapeutique des patients schizophrènes est incomplète car les déficits cognitifs et les symptômes négatifs sont encore mal pris en charge par les antipsychotiques actuels. Par ailleurs, ces traitements ont de nombreux effets secondaires et environ 30% des patients y sont résistants. La mise au point d’approches thérapeutiques innovantes est donc un enjeu majeur de santé publique. L’étiologie de la schizophrénie reste inconnue, cependant, l’hypothèse majoritaire est qu’elle serait d’origine multifactorielle, impliquant une interaction entre facteurs génétiques et environnementaux. Ce projet se positionne dans le développement d’un nouveau modèle murin associant trois facteurs (vulnérabilité génétique, stress précoce et consommation de psychotrope) qui sera tout d’abord caratérisé d’un point de vue comportemental. Dans la deuxième partie du projet, des traitements d’intérêt (molécules et activité physique et leur combinaison) seront évalués.

Bénéfices attendus

L’un des objectifs de cette étude est d'examiner, d’une part, la validité d’un nouveau modèle animal d’un point de vue comportemental (caractérisation de déficits dans des tests modélisant les différents symptômes de la pathologie) puis post-mortem (modifications cérébrales qui seront corrélées aux modifications comportementales) puis de tester les effets de différentes stratégies thérapeutiques médicamenteuses ou non et leur combinaison. Ce projet a pour ambition de proposer des améliorations dans la prise en charge des patients souffrant de schizophrénie : non seulement des traitements pharmacologiques adjuvants aux traitement actuels et qui ne recouvrent pas l’ensemble des symptômes, mais aussi des traitements non-pharmacologiques basés sur l’activité physique spontanée. En effet, l’activité physique pourrait constituer un moyen efficace pour lutter contre la sédentarité de ces patients et les problèmes de santé associés, mais aussi pour lutter contre les effets secondaires des traitements chroniques et améliorer le fonctionnement cérébral en stimulant les phénomènes de plasticité. Il trouve donc une application certaine santé humaine.

Procédures

Dans un premier temps, les souris seront séparées de leur mère durant 24h à l’âge de 9 jours. Puis, à l’âge de 63 jours, les mêmes animaux recevront une administration quotidienne durant 14 jours d’un psychotrope par voie sous-cutanée. Chaque injection nécessite une contention de l’animal et prendra environ 1 minute par souris. Une partie des animaux sera ensuite soumise à des traitements pharmacologiques dans l’eau de boisson pendant 30 jours et/ou administration par injection intrapéritonéale pendant 14 jours, ou non-pharmacologiques (mise à disposition d’une roue d’activité accessible par un petit tunnel à partir de la cage d’hébergement pendant 4 semaines). Les animaux vont ensuite réaliser plusieurs tests comportementaux afin, tout d’abord, de mesurer leur activité locomotrice/exploratrice (1fois, 30 minutes), leur niveau d’anxiété (1 fois 5 minutes dans un labyrinthe), les performances de mémoire de travail (1 session de 5 minutes). D’autres tests seront également réalisés afin d’évaluer le réflexe de sursaut (1 session de 25 min), les performances de mémoire de reconnaissance d’objet et enfin de mesurer les interactions sociales (1 session de 5 minutes suivie de 2 sessions de 10 minutes. A l’issue de l’expérimentation comportementale, la moitié des animaux seront exposés à une procédure de mise à mort menée sous analgésie et anesthésie profondes d’une durée de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Lors de la séparation maternelle de 24h, les animaux sont en état d’hypoglycémie, d’hypothermie et de stress psychologique (nuisance modérée). Une légère perte de poids transitoire peut être observée suite à la séparation et une augmentation de l’anxiété à l’âge adulte peut être observée, il s’agit d’un état prévu à la suite de cette manipulation qui fait partie de la modélisation. Les animaux recevront des injections quotidiennes (durée d’injection : environ 1 minute, durant 14 jours d'une molécule qui induit des modifications comportementales qui miment certains symptômes rencontrés dans la schizophrénie (hyperlocomotion, troubles sociaux, troubles de mémoire, etc.) et qui sont la base du modèle de cette pathologie (nuisance modérée). Il ne s’agit pas à proprement parler de douleur mais d’une certaine déstabilisation du fonctionnement du cerveau qui peut induire une certaine angoisse. Une partie des animaux sera ensuite soumise à des traitements pharmacologiques dans l’eau de boisson pendant 30 jours (nuisance légère) et/ou administration par injection intrapéritonéale pendant 14 jours (nuisance modérée). Enfin, un certain niveau de stress sera possiblement ressenti aux tests comportementaux qui seront réalisés (nuisance légère).

Devenir

Une partie des animaux des procédures (500 souris) seront mis à mort après les études comportementales. Le cerveau de ces animaux sera prélevé pour des exploitations scientifiques (analyses électrophysiologiques ex vivo, quantification de différents marqueurs associés à la schizophrénie) Les souris restantes seront réutilisées dans d’autres projets (86 souris gestantes + 60 souris stimulus).

Remplacement

Ce projet se positionne sur le développement d’un nouveau modèle de schizophrénie pour tester par la suite une approche thérapeutique innovante pour traiter les symptômes non pris en charge par les traitements actuels. S’agissant d’études comportementales faisant appel à des fonctions cérébrales très intégrées, aucun modèle in vitro ne peut remplacer, à l’heure actuelle, l’utilisation des animaux vivants dans notre projet. De plus, il n’existe aujourd’hui qu’une seule espèce où le génome a été modifié pour porter la délétion du gène de la sérine racémase, la souris.

Réduction

Toutes les procédures incluront des mâles et des femelles. En effet, les recommandations récentes concernant la recherche sur la schizophrénie ont souligné l’importance d’évaluer les deux sexes dans la mise au point de modèles précliniques. En effet, la schizophrénie touche aussi bien les hommes que les femmes avec des différences en termes d’intensité des symptômes et d’âge d’apparition. De plus, nous souhaitons tester un potentiel nouveau traitement, qui a pour but final d’être efficace aussi bien chez les femmes que chez les hommes, donc nous souhaitons d’emblée tester des femelles et des mâles. Nous nous attendons à observer des différences entre les deux sous-populations. Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste en fonction du niveau d’effet attendu a priori pour les études comportementales, pour obtenir une puissance statistique suffisante. Une analyse statistique sera réalisée a posteriori via l’utilisation de tests statistiques adaptés afin de comparer les données obtenues.

Raffinement

Diverses mesures seront prises pour raffiner les expérimentations qui ne seront réalisées que par du personnel formé. Après leur arrivée au laboratoire, les animaux seront stabulés dans des cages contenant un igloo en papier mâché et des lamelles de papier kraft afin d’assurer un enrichissement, permettant aux animaux de trouver un abri en cas de conflit et d’avoir une activité minimale (construction de nid). Ils seront laissés au repos sans intervention (hormis la surveillance quotidienne et le change de cage bi-hebdomadaire) durant 1 semaine (habituation au cycle inversé jour / nuit), puis seront manipulés et pesés durant 1 semaine avant de débuter les expérimentations et régulièrement durant la durée totale de chaque expérimentation afin de les habituer au contact humain. De plus, au moins 30 min avant le début de chaque test, les animaux seront placés dans la pièce d’expérimentation pour leur permettre de s’habituer à l’environnement. L’accès à une roue constitue aussi un enrichissement par rapport aux cages standards, en augmentant l’espace disponible pour les animaux et en leur permettant de faire de l’activité physique volontairement. Un traitement pharmacologique sera administré dans l’eau de boisson, ce qui réduit le stress des animaux par rapport à un traitement par gavage ou par injection. Enfin, l’utilisation d’anesthésique volatil et d’analgésique sera effectuée pour l’implantation des puces et la mise à mort. Par ailleurs des points limites précis seront mis en place afin de déceler le plus précocement possible un état de souffrance ou de détresse des animaux.

Choix des espèces

L’espèce choisie est la souris (Mus musculus). Il s’agit comme le rat, d’un animal sur lequel ont été mis au point des modèles de schizophrénie très utiles à la recherche des dysfonctionnements cérébraux liés à cette pathologie. Son comportement est bien connu et décrit dans la littérature et sa proximité génétique avec l’espèce humaine permet d’accéder à des mécanismes cérébraux communs et à des fonctions cognitives et des comportements en beaucoup de points similaires et mesurables (mémoire à court et à long terme, sociabilité, exercice physique, réflexe de sursaut, activité spontanée). Par ailleurs, notre modèle comprend une composante génétique (mimant la prédisposition génétique, bien démontrée chez l’homme), or, il n’existe à l’heure actuelle aucune autre espèce animale disponible qui porte la délétion du gène codant pour la sérine racémase. Les animaux seront testés une fois devenus adultes entre 84ème et le 114ème jour post-natal, correspondant chez l’Homme à la période symptomatiques. Avant ces tests, des étapes sont nécessaires : - Séparation maternelle au 9ème jour de vie post-natale, mimant un stress environnemental précoce, facteur de risque de la pathologie - Exposition subchronique à une drogue durant l’âge jeune adulte (du 63ème au 76ème jour), période caractérisée par une exposition accrue aux substances psychotropes chez les patients Les études en électrophysiologie et immunohistochimie seront réalisées post-mortem.

Une injection sous la peau de la patte ou de la face suffit à provoquer chez eux une inflammation, puis une hypersensibilité douloureuse au toucher. 200 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués sous anesthésie profonde pour prélever les tissus nerveux. L'objectif est de comprendre comment cette inflammation dérègle un canal des astrocytes, un travail qui prolonge des résultats déjà obtenus au niveau trigéminal. Le porteur programme sept séances de tests comportementaux de trente-cinq minutes chacune, sans dire lesquels, et qualifie ces mesures de peu douloureuses puisque l'animal peut retirer sa patte.

Objectifs

Lorsque la douleur est chronique ou persistante, elle devient alors pathologique car elle n’offre plus aucun avantage mais provoque au contraire une extrême souffrance. C’est notamment le cas de douleurs inflammatoires qui apparaissent suite à une inflammation du système nerveux périphérique ou central. Parmi les symptômes douloureux, nous nous intéressons à l’allodynie qui correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse, qui peut être déclenchée suite à l’inflammation. Ce phénomène provoque l’activation de plusieurs populations neuronales, mais fait également intervenir les astrocytes, un sous-type de cellules gliales. Cependant, les mécanismes astrocytaires impliqués dans la genèse de l’allodynie en condition inflammatoire au niveau trigéminal sont peu connus. Les résultats obtenus jusqu’à présent ont permis notamment de mettre en évidence que l’inflammation induisait une réactivité astrocytaire ainsi qu’une diminution des canaux astrocytaires. Cependant, la question de comment l’inflammation est capable d’entrainer cette dérégulation du canal astrocytaire, ainsi que la réactivité astrocytaire reste toujours en suspend. Les objectifs de ce projet est d'étudier si il y aussi une dérégulation en condition inflammatoire au niveau de la patte et de la face.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes centraux induisant la dérégulation du canal astrocytaire, impliquée dans les phénomènes d’hypersensibilité douloureuse. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux douleurs chroniques, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 1 : Injection sous-cutanée (

Impact sur les animaux

Utilisant un modèle de douleur infammatoire, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse lors d'une stimulation tactile. Les résultats obtenus ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mise à part le développement d'une allodynie suite à une stimulation tactile. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » (retrait de la face ou de la patte selon le modèle). Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement et n'entrainent pas de réactions visibles autres que le retrait moteur de la zone stimulée.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse protéique.

Remplacement

L’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique. D’après nos connaissances il n’existe à ce jour aucune méthode de remplacement capable d’intégrer tous ces éléments. C’est pourquoi, il est nécessaire de réaliser notre étude sur animal entier.

Réduction

Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après les données antérieures le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc par il est préférable de prévoir un maximum de 10 animaux par groupe: habituation, injections,comportement, prélèvements. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et moléculaires seront réalisées avec les mêmes groupes.

Raffinement

Les animaux sont stabulés de façon à avoir un enrichissement social. Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée à partir de 7 jours après réception (période d’adaptation) et après 5 jours d’habituation pour les expériences encomportement. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Les animaux seront notamment surveillés quoditiennement lors des différentes procédures. Le poids est mesuré quotidiennement. Si la perte de poids excède 15% du poids initial, les animaux seront mis à mort par injection intrapéritonéale létale d'anestésique sous sédation profonde. Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.

Choix des espèces

La souche de rat Sprague-Dawley est un des modèles les plus couramment utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Enfin, comme énoncé précédemment, ce projet fait suite à d'autres études et doit donc être réalisé sur la même souche de rat. Pour les expériences comportementales et l'étude protéique, nous utiliserons des animaux âgés de 5 à 8 semaine, comme dans les projets précédents (125g à 250g).

Infectées par le SARS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie, après implantation d'une puce de télémétrie dans le dos et trois prises de sang à la joue, 70 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend des symptômes généralisés et une perte de poids, sans mortalité, avec une guérison en quatre jours. Toutes sont tuées à la fin du protocole pour prélever les poumons, la rate et le sang, l'essai visant à confirmer in vivo trois anticorps neutralisants identifiés par séquençage de répertoires immunitaires et intelligence artificielle. Leur pouvoir neutralisant équivaut, écrit-il, à celui du seul anticorps encore efficace sur les variants circulants, dont la vente est restreinte aux États-Unis.

Objectifs

L’utilisation d’anticorps monoclonaux issus de patients ciblant les protéines de surface d’un virus a déjà fait ses preuves dans la lutte contre le SARS-CoV-2. Cependant, l’émergence de nouveaux variants viraux d’intérêt dont le variant Omicron, compromet la bonne efficacité des anticorps monoclonaux utilisés en thérapeutique. Ainsi, il est nécessaire d’apporter régulièrement des évolutions thérapeutiques avec le développement d’anticorps à activités neutralisantes plus larges. Nous avons identifié des anticorps dirigés contre le SARS-CoV-2 à partir de séquençages de répertoires immunitaires de patients infectés et guéris de la COVID-19 combinés aux technologies d’Intelligence Artificielle développées par une entreprise. Nos travaux se focalisent particulièrement sur l’obtention d’anticorps neutralisants de large spécificité qui conservent leur efficacité sur les nouveaux variants d’intérêt du SARS-CoV-2 en circulation ou à venir. Dans ce cadre, trois anticorps à très forte affinité et à haut pouvoir neutralisant ont été identifiés, avec la capacité de neutraliser différents variants du SARS-CoV-2, et ciblant chacun des épitopes différents de la protéine virale S. Leur capacité neutralisante est équivalente à celle d'un autre anticorps commercialisé (unique) encore efficace sur les variants circulants actuels et dont la vente est restreinte aux USA. Ainsi, le fort pouvoir neutralisant de ces 3 anticorps en fait de bons candidats à visée thérapeutique. Il nous semble nécessaire de renforcer ces résultats obtenus in vitro par des essais in vivo. Ainsi, nous nous attendons à ce que ces 3 anticorps injectés à des souris préalablement infectées par le SARS-CoV-2 initient une protection chez l’animal face à l’infection, diminuant voire empêchant l’apparition de symptômes, comme attendu avec un anticorps thérapeutique à visée clinique.

Bénéfices attendus

La validation des anticorps thérapeutiques testés dans le cadre de cette étude servira de base pour amorcer leur développement clinique dont l’utilisation finale sera d’ameliorer la prise en charge des patients atteints de formes sévères de la COVID-19. Cela permettra également de confirmer le processus d’identification rapide in silico d’anticorps thérapeutiques développé par notre groupe d’étude lors d’une nouvelle émergence virale de coronavirus ou d’une virose inconnue (virus X) comme soutenu par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS).

Procédures

Tous les animaux, soit 70 souris. Une puce dorsale d’identification et de télémétrie sera injectée en sous-cutané pour une souris (12 minutes par animal, une fois). Des prises de sang à la veine submandibulaire seront effectuées sur chaque animal tout au long de l’expérience à l’aide d’une aiguille (5 minutes par animal, 3 fois soit une fois par semaine). Inoculation des anticoprs thérapeutiques ou placebo par voie intra-péritonéale sur animaux en contention. L’objectif est de mesurer l’efficacité thérapeutique neutralisatante des anticorps. (5 minutes par animal, 1 fois). Challenge infectieux par voie nasale sous anesthésie générale en voie intra-péritonéale. L’objectif est d’induire une infection pulmonaire. (10 min par animal, 1 fois). Prélèvements nasaux sous anesthésie gazeuse. L'objectif est d'analyser la réponse immmunitaire mucosale (5 min, 2 à 3 fois par animal).

Impact sur les animaux

Le protocole développé dans cette étude consiste à infecter des lots de souris avec du virus SARS-CoV-2. Les souris utilisées sont sensibles à ce virus et vont développer des symptomes généralisés mais sans mortalité au vu des doses inoculées. Une perte de poids temporaire est attendue suivi d’une guérison totale au bout de 4 jours. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon nos observations bi/quotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. Les administrations en voie intra-péritonéale pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantations du sensor télémétrique. Les prises de sang peuvent également entrainer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (poumons, rate, swab, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pur le recrutement cellulaire et sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution pour remplacer ce modèle murin qui permettra de restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie thérapeutique et pour mimer une clinique proche de l’humain. Ce modèle de souris transgéniques a été mis au point spéicifiquement afin de pallier les difficultés rencontrées avec les précédents modèles animaux et en absence de méthode alternatives . Le modèle de souris transgénique est bien décris dans la littérature développant la pathologie attendue et induisant une réponse immunitaire, afin répondre aux attentes du projet sur la protection antivirale.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques minimum en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base de l’étude de la réponse immunitaire et virale.

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Les souris sont hébergées, aus sein d'une animalerie confinée, en isolateur durant l'infection infection expérimentale. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Tout type de médication pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire. Les souris sont anesthésiées par injection par voie intra-péritonéale avant chaque instillation intranasale. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type graines de Tournesol sera réalisée.

Choix des espèces

Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par l’inoculation d’anticorps post-infection dans l’étude du COVID. Le modèle de souris est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux COVID. Adulte et immunocompétent (6 semaines). Le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents en vue de passer à une étude clinique.

Quinze minutes le nez maintenu au contact d'un aérosol de bacilles de la tuberculose, puis un gavage d'antibiotique cinq jours par semaine pendant quatre semaines : 5940 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour compter les bactéries dans leurs organes. L'objet réel du projet est bactérien, il s'agit de savoir quelles fonctions permettent au bacille de survivre à la fois au traitement et à la réponse immunitaire, la souris fournissant le lieu de l'infection. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit les granulomes des phases tardives et que le modèle animal reste "incontournable". Les bénéfices annoncés, des traitements plus courts et plus efficaces, restent au conditionnel, l'infection de près de six mille souris étant, elle, planifiée sur cinq ans.

Objectifs

La tuberculose reste un problème majeur de santé publique dans le monde entier. Cette maladie se caractérise par la persistance des bacilles de la tuberculose chez l’hôte et la longueur des traitements antibiotiques. Plusieurs résultats suggèrent un lien entre la tolérance bactérienne aux médicaments, c'est-à-dire la capacité à supporter certains niveaux d'antibiotiques pendant un certain temps, et la capacité bactérienne à résister à la réponse immunitaire de l'hôte. Cependant, les études qui font le lien entre ces deux domaines manquent cruellement. Nous proposons ici d'explorer les fonctions et les adaptations importantes pour survivre au traitement médicamenteux et à la réponse immunitaire de l'hôte chez les bacilles de la tuberculose. Notre objectif est d’évaluer si cibler des fonctions importantes pour la persistance chez l’hôte et la tolérance aux antibiotiques permet une meilleure efficacité des traitements et une élimination plus rapide des bacilles. Dans des travaux antérieurs, nous avons sélectionné des mutants de bacilles de la tuberculose présentant une persistance accrue chez la souris. Nous avons constaté que la tolérance à l’isoniazide et la rifampicine, deux antituberculeux utilisés en clinique, était également accrue chez ces mutants. Dans un premier temps, nous avons entrepris de caractériser les mutations responsables et les mécanismes moléculaires sous-jacents. Nous construirons ensuite des souches recombinantes de bacille de la tuberculose dans lesquels les gènes identifiés seront soit inactivés soit placés sous contrôle d’un promoteur inductible à la doxycycline. Enfin nous évaluerons dans le modèle souris l'effet synergique des médicaments et de l’inactivation de ces gènes. Les résultats attendus devraient mettre en lumière les caractéristiques mycobactériennes expliquant la pandémie actuelle de tuberculose et fournir des perspectives intéressantes pour le contrôle de cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'acquérir de nouvelles connaissances scientifiques sur la tolérance aux médicaments chez les bacilles de la tuberculose et le lien entre la tolérance et la persistance chez l’hôte traité ou non-traité. Les résultats attendus devraient également fournir des informations sur l'effet synergique de la réponse immunitaire et des antibiotiques sur des souches recombinantes altérées pour la tolérance aux médicaments. Ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques intéressantes contre la tuberculose dans le but de réduire la durée des traitements et d’augmenter leur efficacité.

Procédures

Les animaux seront infectés avec des bacilles de la tuberculose. Pour cela, les souris seront maintenues dans des chambres individuelles de contention permettant de maintenir le nez de la souris en contact avec l’aérosol. Cette opération dure 15 minutes. Certains groupes d'animaux recevront 5 jours par semaine pendant 4 semaines maximum une dose d’antibiotique donnée par gavage.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus à deux niveaux dans nos expériences: 1) lors de l’infection des animaux, et 2) lors des traitements antibiotiques . Pour le 1er niveau, il s’agit de nuisances modérées (contention) d’une durée d’environ 15 min. Enfin, concernant les antibiotiques, les animaux subiront une contention de quelques minutes 5 jours sur 7 pendant 2 ou 4 semaines. L’impact de cette manipulation sur le bien-être des animaux sera évalué lors d’expériences préliminaires.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour évaluer la charge bactérienne dans différents organes.

Remplacement

Les modèles cellulaires ne permettent pas à l’heure actuelle de rendre compte de la totalité des étapes de l’infection d’un hôte par les mycobactéries pathogènes, tel que les bacilles de la tuberculose. Ainsi il n’existe aucun modèle cellulaire pertinent pour l’étude des phases tardives de l’infection telles que la persistance ou la transmission. Les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire les granulomes rencontrés dans ces phases tardives et d’étudier la réponse bactérienne aux stress rencontrés dans ceux-ci. Le modèle animal est donc incontournable à l’heure actuelle pour ces études. Dans ce contexte, le modèle animal le plus couramment utilisé est le modèle souris. Ce modèle reproduit notamment au niveau immunologique bon nombre des observations faites chez l’humain. Dans ce projet, les souches mutantes de Mycobacterium tuberculosis seront testées au préalable in vitro et dans des modèles cellulaires mimant les étapes précoces de l'infection. Le modèle souris sera utilisé en cas de résultats positifs pour mimer les étapes tardives.

Réduction

Les différentes phases du projet seront suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des résultats. Nos expériences antérieures nous ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Nous utilisons des lots d’animaux homogènes pour réduire la variabilité.

Raffinement

Des mesures seront prises pour réduire au minimum les nuisances: limitation au minimum des temps de contention lors de l'infection et administration des antibiotiques, surveillance accrue après chaque geste, mise en place d'une grille de scoring et de points limites précoces. L’expérience implique un traitement antibiotique quotidien (5 jours sur 7). Nous réaliserons deux expériences préliminaires pour évaluer le stress et la contrainte sur les animaux et choisir la voie d’administration la moins contraignante pour les animaux tout en permettant d’observer l’effet des antibiotiques. Au cours de ces expériences préliminaires, nous déterminerons aussi le temps le plus précoce auquel un effet des antibiotiques est détecté

Choix des espèces

Pour notre projet visant à explorer le lien entre tolérance aux antibiotiques et persistance chez l’hôte par le biais de l'étude de souches bactériennes mutantes, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'existence et de l'excellente caractérisation des fonds génétiques de résistance variable à la pathologie , ii) du fort degré de convergence avec les paramètres de l'immunité chez l'homme, iii) de la prédominance des outils d'analyse (réactifs immunologiques disponibles) par rapport aux autres espèces envisageables. Pour ces raisons, le modèle souris est généralement le modèle utilisé en première intention dans les études précliniques. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes et, si possible, âgées entre 6 et 10 semaines. L’objectif est que les souris aient un système immunitaire mature et que les groupes soient homogènes en âge.