Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Production et caractérisation de souris transgéniques FMC1 KO (1/3)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
Une perte de 25 % du poids, ou un score de douleur de huit à neuf sur la grille du laboratoire, déclenche la mise à mort. 313 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements terminaux de sang et d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation qui reproduit un syndrome mitochondrial rare, elles sont suivies de la naissance jusqu'à deux ans, avec prélèvements sanguins et urinaires à un, deux, quatre et six mois, tests de force et d'endurance et séances d'IRM et d'échocardiographie sous anesthésie aux mêmes âges. Le porteur attend un déficit de poids d'environ 20 %, un défaut cardiaque et un défaut musculaire, et présente ce travail comme l'étape préalable au test de candidats médicaments déjà repérés sur des cellules de patients.
Objectifs
Le syndrome NARP (Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire) est une pathologie rare qui affecte majoritairement les fonctions cardiaques, musculaires, et neurologiques et pour laquelle il n'y a toujours pas de traitement. Au laboratoire nous avons identifié des candidats médicaments efficaces sur les cellules de patients atteints du syndrome NARP. Afin de pouvoir proposer le traitement à des patients il nous faut prouver leur efficité dans un animal entier (ici le modèle murin). Avant, il est nécessaire d'identifier des déficits clairs dans le modèle souris du syndrome de Barth. Ce projet vise donc à caractériser finement le modèle souris du Syndrome NARP d'un point de vue cardiaque, musculaire, comportementale etc.... Ceci permettra ensuite de tester si les candidats médicaments efficaces en cellules de patients sont capables de diminuer les défauts mis en évidence dans l'étape de caractérisation du modèle murin. Si tel est le cas, on aura la preuve de leur efficacité dans un animal entier. L'objectif ultime étant de proposer les candidats médicaments efficaces dans les cellules de patients et le modèle murin du syndrome NARP à des patients atteints du syndrome NARP.
Bénéfices attendus
Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome NARP, dans nos animaleries afin d'identifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. Seront analysés, le comportement, le poids, la fertilité, les portées, les avortements spontanés, la mortalité périnatale, l'acidose, la force musculaire, l'endurance, la coordination, les fonctions cardiaques, les fonctions mitochondriales sur tissus et des dosages sanguins et urinaires.
Procédures
Prélèvements sanguins et urinaires aux âges de 1 mois, 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excédera pas 10 minutes. Tests comportementaux (force musculaire, motricité, équilibre et endurance) aux âges de 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes. IRMs et echocardiographies aux âges de 2, 4 et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 30 minutes et les souris subiront des anesthésies.
Impact sur les animaux
Des nuisances liées aux souris présentant un phénotype dommageable peuvent être attendues. Comme d'autres modèles murins similaires (avec des déficits mitochondriaux) nous pouvons attendre, à l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents, un défaut cardiaque et un défaut musculaire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse par IRM et échocardographie nécesite une anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données IRM ou échocardiographiques. Le suivi des performances sur tapis de course, rotarod ou grip test teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de caractériser à différents niveaux le modèle murin.
Remplacement
Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome NARP, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également avant de procéder aux essais cliniques chez l'homme.
Réduction
Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 20-25 pourcents d’animaux en plus, soit 10 souris par groupe.
Raffinement
Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 1 fois par semaine. Si l'animal perd entre 10 et 15 pourcents par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 25 pourcents l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Nous raffinons nos expérimentations en utilisant les animaux de chaque groupe pour recueillir plusieurs types de données. Sur chaque animal, l’ensemble des organes et tissus pouvant être recueillis sont prélevés afin d’anticiper les expérimentations futures. Pour toutes les procédures, les animaux seront observés quotidiennement, et les points limites seront évalués en détail: Plaie/Traumatisme, Comportement/Mouvement, Aspect général, Evolution pondérale. Un score sera attribué, qui déterminera les traitements/observations à suivre: Score 0-2 = aucune douleur => pas de traitement. Score 3-5 = Observation plus importante et gel diet et croquettes humides au fond de la cage. Score 6-7=douleur légère à modérée=>Nettoyer d'éventuelles plaies et injection en sous cutanée d'un anti douleur et euthanasie si pas d'amélioration sous 24H. Score 8-9 = euthanasie de l'animal pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. Les animaux seront transférés dans différentes animaleries selon les analyses. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquate et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des cages de transport adaptées contenant copeaux, cotons et nourritures. Les souris contrôles seront toujours séparées des souris modèle de la maladie. Les transferts seront effectués une semaine avant les analyses pour laisser un temps d'acclimatation dans la nouvelle animalerie.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - les symptômes de la maladie retrouvés dans le modèle murin sont équivalents à ceux retrouvés chez l'homme suggérant qu'un candidat médicament efficace dans le modèle murin le sera également chez l'homme Les animaux seront suivis de leur naissance (mortalités, suivi des portées, génotypage, avortements spontanés) à l'âge de 2 ans. Les animaux seront caractérisés dès l'âge de 10 jours pour un suivi de poids hebdomadaire, aux âges de 2, 4 et 6 mois pour des tests d'endurance, de force musculaire, de coordination et de fonction cardiaque et aux âges de 1, 2 ,4 et 6 mois pour des dosages sanguins et urinaires, et des prélèvements d'organes.
Evaluer le rôle d’un récepteur de la sérotonine et l’intérêt de ses ligands pour traiter les troubles cognitifs et sensoriels
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Quarante-deux gavages, un par jour pendant quarante-deux jours, voilà ce que subissent 480 des souris de ce projet, 800 d'entre elles passant par ailleurs des tests comportementaux répétés jusqu'à cinq jours d'affilée. 872 souris vont être utilisées en tout, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 72 d'entre elles et modéré pour 800. La démyélinisation est provoquée par un produit ajouté à la nourriture, afin de tester si des molécules ciblant un récepteur de la sérotonine corrigent les troubles cognitifs et sensoriels associés à la sclérose en plaques. Le porteur retient la souris pour son homologie génétique de 90 % avec l'être humain et parce qu'il dispose déjà de lignées transgéniques dépourvues de ce récepteur, hébergées chez un prestataire d'élevage.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire chronique du système nerveux central (SNC) qui touche environ 2,5 millions de personnes dans le monde. La maladie se manifeste par une grande variété de symptômes qui se caractérisent par une atteinte des voies motrices, une baisse de la sensibilité et l'apparition de troubles cognitifs et émotionnels. Ces symptômes sont liés à la perte de la gaine de myéline (processus de démyélinisation) qui entoure les neurones et qui permet à l'information de voyager rapidement et efficacement le long des nerfs. De plus, plusieurs résultats de la littérature soulignent l'intérêt de cibler un récepteur de la sérotonine pour le traitement de maladies neurodégénératives. Sachant qu'il est connu que des molécules qui se lient à ce récepteur ont des effets bénéfiques pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques, l'idée principale de ce projet est de vérifier si ces molécules peuvent aider à traiter différentes facettes de la maladie, comme les problèmes de perte de myéline ainsi que des troubles cognitifs et sensoriels dans un modèle animal de maladie qui reproduit ses symptômes. Nous réaliserons des études comportementales et des analyses biochimiques et histologiques pour évaluer le rôle du récepteur dans cette maladie. Dans cette étude nous utiliserons 872 animaux.
Bénéfices attendus
Parmi les bénéfices attendus du projet, nous espérons l'identification d'une molécule qui permettra de réduire d'au moins 50% la demyélinisation et capable de restaurer les déficits sensoriels et cognitifs. Nous espérons faire progresser l'état des connaissances quant au rôle du récepteur de la sérotonine dans les effets cognitifs de la démyélinisation dans le modèle de sclérose en plaques .
Procédures
Afin de réaliser le génotypage, un poinçonnage de l'oreille sera effectué après l'âge de 14 jours. Cette intervention n'est réalisée qu'une fois par animal et dure moins de 30 secondes. Le génotypage ne sera pas systématique puisque l'élevage sera maintenu avec des croisements homozygote x homozygote. Ainsi, seulement une partie des animaux sera prélevée pour le génotypage. Au total, 42 administrations (1 administration par jour pendant 42 jours) par voie orale (1 min/gavage/jour) seront réalisées sur 480 animaux vigiles. 800 animaux effectueront des tests de comportement n'excédant pas 10 minutes par test et deux tests maximum par jour. Une période d'habituation de 20 minutes pourra parfois être nécessaire soit de 5 à 30 min/jour/animal. Certains tests pourront être répétés tous les jours pendant maximum 5 jours pour mesurer les comportements sociaux. L'ensemble des animaux recevra une dose sublétale d'anesthésique/antalgique (1 min/injection intrapéritonéale) avant leur mise à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés dans ce projet sont identifiés par les bagues à l'oreille et une partie est prélevée de l'autre oreille pour le génotypage (DAP générique pour les prélèvements pour le génotypage). Les souris pourraient ressentir une légère nuisance due à ces prélèvements (douleur légère de courte durée). Contrairement au modèle EAE (Encéphalomyélite Autoimmune Expérimentale), le modèle de démyélinisation par la cuprizone n’induit pas de paralysie des animaux et n’engendre pas de perte de poids. Cependant, ce modèle est connu pour entrainer des déficits cognitifs et sensoriels. Nous ne nous attendons pas à l'apparition de douleur suite au traitement cuprizone qui est ajouté dans la nourriture. L'objectif de ce projet est essentiellement thérapeutique et a pour but de tester les propriétés des ligands du récepteur 5-HT7 synthétisés par nos collègues chimistes dans un modèle de sclérose en plaques. Nous avons déjà montré qu'une des molécules testées (Serodolin) possède des propriétés anti-inflammatoires et antalgiques. Cependant l'injection quotidienne de ligands du récepteur 5-HT7 peut induire un stress des animaux. Si nous n'avons pas observé d'effet indésirable après administration unique, l'administration répétée peut induire différents effets indésirables tels qu'un inconfort dû à l’injection ou des effets secondaires liés au composé (comme la sédation par exemple). De même, la manipulation des animaux dans plusieurs tests comportementaux peut induire un stress. Les procédures mises en œuvre seront de classes légères ou modérées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des trois procédures pour réaliser des dosages et analyses immunohichimiques.
Remplacement
Des études in vitro seront réalisées en parallèle des études in vivo afin d’obtenir plus d’informations sur les mécanismes d’action et les voies de signalisation impliquées. Les études in vitro nous permettent aussi de vérifier l’affinité des molécules pour le récepteur et ainsi de définir la dose utilisée in vivo. Cependant, l’évaluation de l’effet anti-inflammatoire et neuroprotecteur des ligands du récepteur de la sérotonine nécessite l’utilisation de l’animal afin de considérer un organisme entier et de confronter l'effet de nos ligands à la complexité des mécanismes neurologiques mis en jeux dans la démyélinisation/remyélinisation induite par la cuprizone. L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement de médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet d’une molécule résulte de son action au niveau de l’ensemble de l’organisme. A ce jour aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de prédire et rendre compte de l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’action d’un médicament et en particulier ceux qui conditionnent le comportement.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé sera réduit au minimum pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides. Les approches décrites nécessitent des cohortes de 6 animaux minimum par groupe et 10 animaux maximum par groupe pour les études de comportement. Chaque expérience sera réalisée deux fois indépendamment afin d’assurer la validité statistique des résultats. En ce qui concerne l’analyse des données comportementales, des procédures statistiques adaptées à l’analyse des variables dépendantes relevées seront utilisées.
Raffinement
Nous réaliserons une période d'acclimatation d'une semaine des animaux avant le début des expériences. Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le milieu est enrichi avec entre autres, des bâtons de bois à ronger de deux tailles différentes et/ou du celluron et/ou des disques de papier kraft compactés et/ou tunnels en carton ou dômes en cellulose et/ou une pyramide polycarbonate où sont placées les capsules de nourriture. Les animaux seront suivis tout au long des procédures quotidiennement (observation de l’aspect général extérieur de l’animal : posture, qualité du pelage, faciès, yeux). Un suivi deux fois par semaine avec la grille de scoring au moment de leur pesée permettra d’appliquer un point limite prédictif et aboutira à la décision de mise à mort par les responsables de bien-être animal si les points limites sont atteints. En fonction du score total, la grille de scoring pourra être appliquée quotidiennement. Dans le cas où un animal présente un ou des signe(s) clinique(s) lors des visites quotidiennes, nous effectuerons une surveillance renforcée. Le suivi des animaux est conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Des données de la littérature indiquent que des préparations de croquettes commercialisées n'induisent pas toutes une démyélinisation, aussi nous avons choisi de préparer notre nourriture. Une étude antérieure nous a permis de montrer que la nourriture faite maison induisait bien une démyélinisation. Cependant, sachant que la nourriture préparée ne permet pas aux animaux de ronger, dans ce projet et pour le confort des animaux, nous souhaitons évaluer si les croquettes commerciales induiront bien une démyélinisation. Si tel est le cas, les croquettes commerciales contenant l'agent de démyélinisant seront utilisées dans les procédures suivantes. Dans le cas où nous utilisons la nourriture faite maison, elle sera préparée tous les 3/4 jours et renouvelée 2 fois/sem et nous ajouterons des bâtons de bois à ronger dans la cage pour limiter la pousse continuelle des dents.
Choix des espèces
La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études précliniques. Nous utiliserons des souris C57BL/6 car nous disposons actuellement de souris transgéniques qui n'expriment pas le récepteur 5-HT7 sur ce même fond génétique. Ces souris sont actuellement hébergées dans un établissement prestataire d'élevage, ce qui donne de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. La souris est : - un mammifère proche de l'Homme (homologie de 90%) - l’animal de laboratoire le plus utilisé par la communauté scientifique et pour les études précliniques Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (7 à 12 semaines) afin de garantir un système nerveux central mature. Cet écart d'âge se justifie pour pouvoir constituer nos cohortes et réduire le nombre de portées nécessaires. Nous veillerons à ce que l'âge moyen des animaux par groupe soit homogène.
EVALUATION DE L’ACTIVITE ANTI-TUMORALE D’UN COMPOSE CHEZ LA SOURIS IMMUNCOMPETENTE OU IMMUNODEPRIMEE PORTEUSE DE CELLULES CANCEREUSES IMPLANTEES PAR VOIE INTRAVEINEUSE
- Recherche appliquée
- Cancers
Greffées par voie intraveineuse de cellules cancéreuses puis traitées une à deux fois par jour pendant jusqu'à cent vingt jours, 3 330 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 95 d'entre elles et modéré pour 3 235. Certaines portent en plus une pompe implantée chirurgicalement, subissent jusqu'à six prélèvements sanguins en vingt-quatre heures et des injections d'imagerie deux à trois fois par semaine. L'objectif est de sélectionner un candidat médicament et de déterminer les cancers non solides qu'il pourrait traiter, le porteur présentant la sélection in vitro préalable comme un filtre qui limite le nombre d'animaux. Les 95 souris témoins, ni greffées ni traitées, ne seront pas tuées avec les autres, elles passeront dans un projet consacré à l'entraînement des expérimentateurs.
Objectifs
Le cancer est une maladie complexe qui peut prendre des formes extrêmement variées en fonction des organes et des tissus affectés. Les cellules cancéreuses sont initialement des cellules normales ayant acquis, au cours du temps, un certain nombre de caractéristiques faisant qu’elles ne répondent plus au système de régulation de l’organisme. Celles-ci prolifèrent indéfiniment soit en formant une tumeur maligne et/ou des métastases dans un organe, on parle de tumeurs solides, soit en circulant dans le sang ou la lymphe, on parle de tumeurs liquides tels que les cancers hématologiques (lymphome hodgkinien ou non hodgkinien, leucémie lymphoblastiques ou myéloblastiques…). Il est donc primordial de développer de nouvelles thérapies innovantes ciblant ces cellules cancéreuses et ces métastases tout en limitant les effets secondaires sur l’organisme. Les phases d'étude et de développement des nouveaux composés sont validées dans un premier temps par des tests in vitro sur des cellules en culture, mimant artificiellement la pathologie de l’homme. Grâce à ces tests in vitro, des molécules actives sont sélectionnées avant d’être testées, en seconde intention, dans des modèles in vivo de souris porteuses de tumeurs afin de démontrer leur activité et leur efficacité anti-tumorale. C’est en effet dans un organisme vivant complet que l’on peut mesurer les effets pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris. En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique et ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat. L’objectif de ce projet est de sélectionner le meilleur candidat médicament et de déterminer la ou les pathologies qu’il peut traiter (indication thérapeutique), dans différents types de cancers « non solides » ou dans des métastases, en monothérapie ou en combinaison avec d’autres molécules pour son développement clinique.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche en oncologie. Les bénéfices attendus du projet sont de sélectionner le meilleur candidat médicament et de déterminer son indication thérapeutique, dans différents types de cancers « non solides » ou dans des métastases, en monothérapie ou en combinaison avec d’autres molécules pour son développement clinique.
Procédures
Injection en intraveineuse de cellules tumorales une seule fois sur animal vigile (contention d’une durée maximale de 30s) suivie d'une progression tumorale (selon les procédures maximum 120 jours sauf en cas de point limite) Administration intra-péritonéale ou per-os ou intraveineuse ou sous cutanée de candidats médicaments (entité biologique ou chimique) (contention d’une durée maximale de 15s quotidienne ou biquotidienne) sur 120 jours maximum Ou selon les procédures, possibilité d’implantation de pompe (osmotique durée de l’intervention 15 minutes, électronique 1 heure) permettant l’administration de candidats médicament. Pour les groupes suivis par imagerie, injection en intra-péritonéal de l'agent substrat nécessaire aux mesures par bioluminescence, 2 à 3 fois par semaine (la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress ainsi que l’injection (moins de 10s) maximum 2 fois par semaine sur 120 jours maximum En cours d'étude, des prélèvements sanguins (moins de 30 secondes) avec un maximum de 6 prélèvements de sang sur 24 h peuvent être réalisés sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Une potentielle source de stress/douleur peut provenir : - De la greffe de cellules tumorales par voie intraveineuse : la contention (d’une durée maximale de 30s) peut générer du stress ainsi qu’une douleur légère à l’injection (moins d’une minute). - De la progression tumorale liée au modèle pathologique recherché (douleur modérée) • De l’injection de l’agent substrat nécessaire aux mesures d’imagerie par bioluminescence : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress ainsi qu’une douleur légère à l’injection (moins de 10s) - De l’administration des traitements candidats (entité biologique ou chimique) en intra-péritonéal ou per-os, sous cutanée ou en intraveineuse : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress ainsi qu’une douleur légère à l’administration (max de 10 s) - Ou de l’implantation chirurgicale d’une pompe osmotique (15 min) ou électronique (1h) et du poids de la pompe (douleur légère à modérée) et de la potentielle gêne occasionnée pour la souris (durée de l’étude) - Pour les prélèvements de sang, il est nécessaire de tondre les pattes arrière de l’animal : la contention ainsi que le rasage de la patte d’une durée maximale de 30s peuvent générer du stress. - Du prélèvement de sang au niveau de la patte : la contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress. - De l’induction de l’anesthésie (gazeuse) pour la mesure d’imagerie : l’induction qui est rapide peut générer du stress
Devenir
Les 5 souris contrôle négatif de chaque étude mettant en œuvre de l'imagerie (correspondant à des souris non greffées non traitées par l’agent biologique ou chimique) pourront être réutilisées à l'issue de ce projet dans le cadre d'un autre projet autorisé dédié à l'entrainement des expérimentateurs. Les autres souris incluses dans les études sont euthanasiées si des points limites sont atteints ou en fin d’étude et les organes et le sang pourront être prélevés afin de vérifier l’envahissement tumoral et/ou métastatique via des analyses qualitatives
Remplacement
Aujourd’hui, de plus en plus de tests in silico et in vitro sont mis en place pour caractériser autant que possible les candidats médicaments, de façon à n’investiguer in vivo que les meilleurs candidats issus de ces sélections. Ce projet est mis en œuvre après la validation in vitro des différentes nouvelles entités biologiques et chimiques. L’absence d’efficacité in vitro ne permet pas de justifier l’utilisation d’un modèle animal par conséquent ce projet s’inscrit en dernier lieu dans le processus de recherche d’un candidat médicament. C’est seulement sur la base de ces données que les études d’efficacité antitumorale sont ensuite réalisées : uniquement les candidats les plus prometteurs vont être testés, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Cependant, cette étape chez l’animal reste aujourd’hui encore indispensable : en effet, même avec les limitations inévitablement liées à n’importe quel modèle, c’est dans un organisme vivant complet que l’on peut vraiment étudier les effets pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse. Son comportement dans un système complexe est plus relevant d’un point de vue physiologique.
Réduction
Les conditions et taux de croissance tumorale pour chaque lignée tumorale à tester ont été déterminés au préalable dans un projet dédié. Une collaboration avec le service bio-statistiques permet de consolider le design expérimental et l’effectif nécessaire par groupe, en intégrant de nombreux éléments comme l’influence environnementale, la répartition des points de cinétique, l’historique des données du modèle notamment sur les groupes véhicules des anciennes études, … Les doses de composé à administrer, définies au préalable dans un autre projet, sont non toxiques. La méthode de prélèvement sanguin par microsampling est privilégiée chaque fois que possible (puisqu’elle est extrêmement rapide, et réalisable plusieurs fois sur un même individu dans la limite des recommandations de la Structure du Bien Être Animal) L’imagerie optique est une technique non invasive de plus en plus utilisée en recherche qui permet d’évaluer la dissémination cancéreuse en temps réel sans nécessiter l’euthanasie de souris à chaque mesure, réduisant considérablement le nombre d’animaux inclus par étude. Chaque souris est son propre témoin. A noter que si les méthodes de détection des cellules tumorales dans le sang prélevé par microsampling dans le cadre du projet préalable de mise au point des conditions de greffe tumorale sont validées et corrélées avec l’envahissement tumoral réel, alors cette méthode pourra permettre d’effectuer cette cinétique sur un même animal et réduira donc également considérablement le nombre d’animaux utilisés par rapport à celui théorique dans ce projet
Raffinement
Les doses de produits à administrer à l’animal sont sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) afin de limiter les risques d’une potentielle toxicité des composés testés. Les études de pharmacocinétique (PK) réalisées en amont de l’étude pharmacologique permettent d’optimiser la dose à utiliser permettant d’avoir la meilleure exposition dans le modèle pharmacologique vivo. Des prélèvements de sang répétés par microsampling peuvent être mis en œuvre pour exploiter au mieux les données d’activité antitumorale et obtenir des informations sur des biomarqueurs ou sur le profil d’exposition du composé (évitant dans ce cas les études de pharmacocinétique dédiées). Cette technique, peu invasive et rapide, permet de réduire le nombre d’animaux en prélevant plusieurs fois de faibles volumes sur un même individu, tout en respectant le bien-être animal et les limites de volémie physiologiques. L’imagerie optique est une technique non invasive qui permet d’évaluer la dissémination cancéreuse en temps réel. La mesure du poids corporel et le suivi du développement tumoral en imagerie seront effectués 2 à 3 fois/semaine, sous anesthésie gazeuse. Une surveillance accrue sera réalisée si les souris présentent un fort signal de bioluminescence couplé à une perte de poids ou tout autre signe d’altération de l’état général. Les souris immunodéprimées seront hébergées et manipulées dans un secteur à confinement spécifique avec des conditions d’hébergement et de manipulations strictes afin de prévenir tout risque d’infection ou contamination. L’utilisation de pompes permet de ne pas intervenir sur l’animal plusieurs fois par jour ou semaine pour les administrations de candidats traitements, contrairement aux approches thérapeutiques par bolus répétés, en limitant ainsi le stress. Après la pose des pompes, des massages sont régulièrement effectués pour éviter tout phénomène d’adhérence. Les souris sont hébergées en groupes sociaux (sauf dans le cadre d’une administration par pompe électronique). Cependant, des études en amont seront effectuées afin d’évaluer la possibilité de laisser les souris en groupes sociaux tout au long des études. Un enrichissement de milieu par des éléments de nidification adaptés va également permettre de surveiller leur état général par l’observation de leur comportement vis-à-vis de ces éléments.
Choix des espèces
En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique : ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat et le modèle murin est à l’heure actuelle le modèle le plus couramment utilisé pour ce type de recherche en immuno-oncologie. Le choix du modèle est dicté par le type d’anti-cancéreux étudiés (souris immunocompétentes et/ou immunodéprimées) et le choix de la souche par les études de dissémination tumorale qui permettent de définir les conditions optimales de greffe. Dans la mesure du possible, la même souche est conservée pour l’ensemble des études in vivo pour un modèle tumoral donné (DMA/DMT, pharmacocinétique, pharmacodynamie, efficacité). En effet, il peut exister des différences importantes en termes de tolérance et d’exposition plasmatique d’un produit fonction de la souche murine considérée, pouvant impacter les résultats. Les souris sont utilisées à partir de 6 semaines en début d’expérimentation. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés au cours de la sélection des candidats médicaments. Afin de ne pas avoir d’interférence avec les signes de vieillissement, nous essayerons dans la mesure du possible de ne pas excéder 6 mois d’âge à la fin des études.
Mieux comprendre la physiopathologie de la dénutrition sévère et son dimorphisme sexuel lors d’interventions probiotiques et vaccinales
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Sevrées à 21 jours puis nourries quatre à huit semaines avec un régime carencé en macronutriments et en micronutriments, des souris juvéniles reçoivent ensuite par gavage des probiotiques, une souche vaccinale, puis une souche bactérienne virulente qui provoque une infection intestinale. 1 140 souris vont être utilisées, 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 660 dans des procédures d'un niveau sévère, avec six prélèvements sanguins caudaux par animal. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Le porteur écrit pourtant que son modèle "ne présente pas de signe manifeste de souffrance hors un retard de croissance", tout en reconnaissant que la combinaison de la dénutrition et de l'infection peut faire souffrir les souris non vaccinées.
Objectifs
Près d'une personne sur trois dans le monde souffre de malnutrition. L'apparition précoce de la malnutrition a des conséquences désastreuses plus tard dans la vie. Au moment du sevrage, un changement du microbiote intestinal (flore intestinale) se produit et induit une réaction immunitaire qui protège des pathologies futures liées au système immunitaire. La malnutrition entrave ce processus, entraînant une plus grande sensibilité aux maladies non transmissibles, aux infections et une diminution de l'efficacité vaccinale. Développer de manière durable des thérapies nutritionnelles pour contrer la dénutrition est une priorité sanitaire mondiale notamment chez les enfants souffrant de dénutrition sévère aigüe (Severe Acute Malnutrition, SAM). La guérison de la SAM nécessite la prise en compte simultanée des paramètres de croissance, immunitaires et du microbiote intestinal. De par sa complexité, le modèle animal reste incontournable. Récemment, nous avons développé un modèle de SAM chez la souris mâle juvénile qui récapitule fidèlement les principales caractéristiques de la SAM observés chez les enfants. La prépondérance des différences entre les hommes et les femmes dans la malnutrition plaide en faveur de l'inclusion des deux sexes dans la recherche, et lors de la conception de thérapies. Dans notre modèle murin de la SAM, nous avons démontré que le microbiote intestinal et l'immunité intestinale ne sont pas restaurés lors d’une intervention nutritionnelle et ce malgré un retour de croissance. Il faut donc étudier comment restaurer l’ensemble de ces paramètres simultanément. Les probiotiques sont des microorganismes vivants et non pathogènes qui, lorsqu'ils sont administrés en quantités suffisantes, confèrent un bénéfice pour la santé de l'hôte. Certaines souches ont démontré leur capacité à limiter les retards de croissance et les infections intestinales. Dans ce projet nous étudierons donc 1/ le dimorphisme sexuel de la SAM, 2/ l’impact de la SAM sur l’efficacité vaccinale vis-à-vis d’une infection à Salmonella enterica Typhimurium, 3/ la capacité de probiotiques à améliorer la SAM et 4/ la capacité de probiotiques à améliorer l’efficacité vaccinale vis-à-vis d’une infection intestinale.
Bénéfices attendus
Bénéfices à court terme : ce projet permettra l'identification des mécanismes à l'origine des différences entre les mâles et les femelles dans la dénutrition ainsi que la caractérisation de ses effets lors d’interventions vaccinales et probiotiques. Ce projet permettra non seulement de disséquer la pathogénie de la dénutrition mais aussi de fournir les connaissances manquantes pour améliorer les interventions thérapeutiques. Ce projet permettra notamment l’identification de nouvelles thérapies pour restaurer le microbiote intestinal et l'immunité, pour in fine renforcer l’écosystème intestinal général face aux infections et optimiser la formulation des régimes thérapeutiques et des vaccins. Ce projet fera avancer les connaissances dans les domaines de la nutrition, l'immunité, l'infection, la vaccinologie et le microbiote intestinal. Bénéfices à long terme : ce projet fournira des informations importantes pour concevoir des thérapies nutritionnelles adaptées aux garçons et aux filles souffrant de malnutrition. Des stratégies multifactorielles comprenant des probiotiques devraient fournir des approches thérapeutiques durables en favorisant aussi bien la reprise de poids et la croissance, que la maturation du système immunitaire et du microbiote intestinal.
Procédures
Consommation d’un régime alimentaire carencé en macro- et micronutriments durant 4 semaines ou 8 semaines. Prise de poids sur animaux vigiles quotidienne ou hebdomadaire, durée estimée à 2 minutes/souris. Contention des souris associée à l’administration par gavage de probiotiques, de molécules servant à étudier la perméabilité intestinale ou la capacité d’absorption des graisses, d’une solution de glucose (2g/Kg pour suivi glycémique), de souche vaccinale et souche virulente de bactéries causant des infections intestinales sur animaux vigiles : durée estimée à environ 30 secondes/souris (gestes de contention 10 secondes + de gavage 10 secondes). Mise à jeun 4h00 ou sur la nuit : 1 fois durant la procédure. Prélèvements sanguins sous-mandibulaire sur animaux endormis : 1 à 2 fois/souris sous mélange à 4% d'isoflurane et 96% d'oxygène. Prélèvements sanguins caudaux sur animaux vigiles : 6 fois/souris.
Impact sur les animaux
Le but de ce projet est de suivre l’impact d’une alimentation entrainant une dénutrition sévère sur la physiologie, l’immunité et le microbiote intestinal des individus. Grâce à notre expérience dans ce domaine, nous savons aujourd’hui que notre modèle murin de malnutrition ne présente pas de signe manifeste de souffrance hors un retard de croissance chez les mâles juvéniles. Nous nous attendons à ce que les femelles juvéniles soient moins sévèrement impactées du fait de leur capacité à mieux résister à certaines carences en vitamines. Dans ce projet, nous nous intéressons donc à caractériser les différences entre mâles et femelles lors d’une dénutrition apportée par un régime fortement carencé en macro- et micronutriments. Ces différences seront également étudiées lors d’essais vaccinaux réalisés avant l’infection. L’administration du vaccin ne devrait pas induire de souffrance particulière chez les animaux. Par contre la combinaison d’une malnutrition et d’une infection intestinale peut engendrer une souffrance liée à une réponse immunitaire faible chez les groupes d’animaux qui n’auront pas été vaccinés. Afin de renforcer le système immunitaire et contrer les effets de la dénutrition, des probiotiques seront également testés chez les souris dénutries et vaccinées. L’administration des probiotiques ne devraient pas induire de souffrance particulière chez les animaux. Des gavages seront également réalisés sur animaux vigiles. Les gestes de contention (10 secondes), de gavage (10 secondes) génère du stress chez l’animal que nous évaluons à environ 30 secondes/intervention de ce type. En fonction de la procédure cette intervention est occasionnelle, hebdomadaire ou quotidienne. De même, nous allons mettre à jeun les souris 4h00 ou sur la nuit ainsi que réaliser des prélèvements sanguins qui généreront également du stress.
Devenir
De par la nécessité de prélever des organes vitaux pour analyses, tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures.
Remplacement
De nos jours la complexité de l’écosystème intestinal et notamment l’interaction entre système immunitaire et microbiote intestinal ne peut être reproduite in vitro, les organoïdes ne peuvent pas remplacer l’animal dans ce projet. L’étude de la physiologie, de l’immunité et du microbiote intestinal des individus, implique de facto l’utilisation d’animaux.
Réduction
Grâce à un test effectué au préalable sur 6 souris femelles (3 souris sur régime contrôle (Ctrl) + 3 souris sous régime SAM), nous avons pu réaliser un test statistique basé sur la prise de poids hebdomadaire des souris, et calculer l’effectif nécessaire par expérience pour obtenir une puissance du test 80% minimum, avec un risque de se tromper de 5%. Ceci nous amène à un nombre sujets de 5/groupe pour une puissance du test de 81%. Le projet est organisé de façon à réduire au strict nécessaire le nombre de souris utilisées. En parallèle des souris femelles, nous allons utiliser certaines souris mâles que nous allons décomptés d’une autre DAP et non de cette DAP. Nous allons également étudier certains paramètres avant la mise à mort des souris, qui seront par la suite mises à mort pour l’analyses d’autres paramètres. Nous aurons donc besoin de 5 souris/groupe. Nous réaliserons 3 expériences indépendantes pour chaque lot de souris enrôlé dans chaque procédure. Le nombre de souris utilisé est justifié au sein de chaque procédure expérimentale, soit 1140 souris. Nous aurons également 60 souris mâles qui seront décomptés dans une autre DAP.
Raffinement
Les souris seront hébergées à raison de 5 souris/cage maximum avec la nourriture et l’eau fournies à volonté. Des dômes et du papier seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Nos visites quotidiennes pour la surveillance des souris seront réalisées plutôt en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. La souffrance potentielle induite par ce régime et son impact sur l’efficacité vaccinale sera prise en compte dans le respect du bien-être animal, et les souris seront observées quotidiennement ou 2 fois par jour afin de prévenir l’apparition de points limites : prise alimentaire et poids corporel, signes cliniques (fièvre, respiration), comportement, apparence générale (poils et sécrétions). Des mesures adéquates seront prises pour soulager la douleur comme l’administration éventuelle d’un analgésique.
Choix des espèces
Le but de ce projet est de caractériser l'impact d'une dénutrition sévère sur la physiologie, le système immunitaire et le microbiote intestinal afin de proposer un régime thérapeutique durable aux enfants souffrant de SAM. Il est maintenant bien reconnu que le système immunitaire et le microbiote intestinal de la souris sont suffisamment proches de celui de l’Homme pour pouvoir utiliser la souris comme modèle avant qu’une transposition ne soit faite chez l’Homme. De plus, l’épithélium intestinal murin est anatomiquement et physiologiquement proche de celui de l’Homme. Aucun autre organisme modèle de petite taille (danio zébré, drosophile) ne possède une telle structure aussi similaire. Par ailleurs, le modèle murin est celui pour lequel les effets de la dénutrition ont été validés chez les souris mâles. Enfin, le modèle infectieux que nous souhaitons utiliser est très bien décrit et étudié chez la souris. L’ensemble de ces critères fait de la souris l’espèce animale la plus appropriée pour effectuer notre étude. Nous utiliserons des souris mâles et femelles sevrées à 21 jours afin d’être au plus proche des conditions de développement de la SAM observée chez l’Homme entre trois et 24 mois lors du sevrage. En effet, l’épithélium intestinal des rongeurs est immature à la naissance. L’intestin grêle de la souris continue à se développer après la naissance et sa maturation est fortement associée à la période de sevrage. Le sevrage est donc une étape clef dans la structuration de l’épithélium intestinal, le développement immunitaire et la maturation du microbiote intestinal des rongeurs. Par ailleurs notre étude chez les mâles a montré que la dénutrition induite à 21 jours reproduit les principaux critères de dénutrition décrits chez l’Homme. A cet âge la maturité du système immunitaire, la physiologie et la maturation du microbiote intestinal sont en cours de développement chez la souris, tout comme ça l’est chez l’enfant à bas âge.
Évaluation du potentiel thérapeutique d’un composé d’intérêt dans un modèle murin d’épilepsie du lobe temporal
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des points limites sont censés interrompre l'expérience avant la mort, mais environ 20 % des souris peuvent mourir directement des crises provoquées. 42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Jusqu'à neuf injections en quatre jours déclenchent chez elles un état de mal épileptique, puis une partie subit l'implantation de sondes cérébrales et vit isolée jusqu'à cinq semaines, avec vingt-quatre à trente-deux injections supplémentaires et des enregistrements allant jusqu'à dix heures par jour pendant douze jours. Le bénéfice annoncé pour les patients pharmacorésistants, éviter une résection chirurgicale du foyer épileptique, reste au conditionnel, quand l'état de mal épileptique, lui, est infligé d'emblée.
Objectifs
L’épilepsie est l’une des affections neurologiques les plus fréquentes avec une prévalence de près de 1 pour cent au niveau mondial. En particulier, l’épilepsie du lobe temporal mésial (mTLE) avec sclérose hippocampique est la forme la plus fréquente d’épilepsie focale chez l’adulte. Près de 30 pour cent des patients souffrant de cette forme d’épilepsie ne répondent pas aux traitements antiépileptiques conventionnels et sont dits pharmacorésistants. Une résection chirurgicale du foyer épileptique est alors parfois la seule option thérapeutique disponible pour ces patients. L’objectif du projet sera de tester spécifiquement l’effet et le potentiel thérapeutique d’une administration répétée d’une molécule dans un modèle murin d’épilepsie expérimentale. Spécifiquement, nous testerons l’effet de ce composé sur la fréquence des crises et des activités de type épileptique dans ce modèle.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de valider le potentiel thérapeutique d’une nouvelle classe de molécules dans les épilepsies du lobe temporal, offrant une nouvelle piste thérapeutique pour les patients pharmacorésistants et leur évitant ainsi le recours à une procédure chirurgicale.
Procédures
Les animaux recevront des injections intrapéritonéales et sous-cutanées, sur animal vigile (durée inférieure à 1 minutes par injection, 9 injections maximum réparties sur 4 jours) afin d’induire un état de mal épileptique jusqu’à la fin de la procédure (durée 9 semaines maximum). Une partie des animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie adaptées pour l’implantation de sondes au niveau du cerveau (1 fois, durée 1h). Ils seront ensuite hébergés individuellement jusqu’à la fin de la procédure, soit 5 semaines maximum. Après minimum une semaine de récupération post-chirurgie, afin d’évaluer l’effet d’un composé sur notre modèle pathologique, les animaux opérés recevront des injections d’une molécule d’intérêt ou de son contrôle pendant 2 périodes de 6-8 jours, 2 fois par jour (matin et soir), soit 24-32 injections intrapéritonéales maximum (durée inférieure à 1 minute). Après minimum une semaine de récupération post-chirurgie, l’activité électrique du cerveau des animaux opérés sera mesurée, pour cela ils seront connectés à un système d’enregistrement, vigiles et libres de se déplacer durant les mesures (maximum 10 heures par jour, pendant 12 jours consécutifs). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
L'injection de la molécule permettant de mettre en place notre modèle chez la souris peut entraîner une perte de poids, une fatigue et une réduction de la mobilité pendant quelques jours. Environ 20 pour cent des souris peuvent mourir à cause de crises épileptiques sévères. Les injections peuvent causer une légère douleur au point d'injection. Les manipulations nécessaires pendant les procédures peuvent être stressantes pour les souris. L'implantation d'électrodes dans le cerveau peut causer une douleur temporaire et une légère perte de poids. Les souris implantées seront isolées pendant trois à cinq semaines, ce qui peut également être une source de stress pour elles.
Devenir
Une partie des animaux sont susceptibles de décéder spontanément des suites de l’état de mal épileptique. Le reste des animaux seront euthanasiés en fin de période de maintien prévue ou plus tôt en cas d’atteinte d’un point limite. En effet, ces animaux ayant subi un état de mal épileptique, il n’est pas possible de les réutiliser pour un autre projet.
Remplacement
Les composés utilisés dans cette étude ont déjà été testés sur des modèles cellulaires et des modèles humains (tissus postopératoires) afin d’en prédire le potentiel thérapeutique. Toutefois, ces modèles ne permettent pas d’en tester directement l’effet sur des crises d’épilepsie. Pour cela, le recours à un modèle animal est indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux (42 souris) mis en œuvre dans ce projet est basé sur les travaux précédents du laboratoire et de la littérature. Ainsi un nombre de 10 animaux par groupe a été défini, en prenant en compte : - la mortalité liée à l’induction d’un état de mal épileptique (environ 20 pour cent) - le taux d’échec d’induction d’un état de mal épileptique (environ 25 pour cent) - l’absence de développement d’une épilepsie chronique (environ 15-20 pour cent) afin d’atteindre un nombre d’animaux expérimentaux minimal de 10 par groupe avec 2 groupes expérimentaux (test et contrôle). Nous analyserons nos résultats avec les tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des locaux agréés, en groupes sociaux de 5 individus maximum (sauf en post-chirurgie où ils seront en hébergement individuel, identifié et avec enrichissement complémentaire) et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification et d’un bâtonnet à ronger au minimum. Ils auront accès à l’eau et à une nourriture adaptée à leur stade physiologique ad libitum. Une observation quotidienne des animaux sera assurée par l’équipe de zootechnie. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront pris en charge avec les soins nécessaires ou exclus du protocole. Depuis plusieurs années, nous avons raffiné notre protocole d’induction d’état de mal épileptique chez la souris, nous avons testé et comparé plusieurs protocoles d’induction et retenu celui offrant le plus haut taux de succès (survie de l’animal et développement d’une épilepsie chronique). Un soutien nutritionnel et une surveillance de la récupération des animaux sont assurés lors de l’induction du modèle pathologique. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et avec une prise en charge analgésique adaptée. Nous nous assurerons du maintien de la température de l’animal durant toute la durée de l’anesthésie. Après la chirurgie la surveillance des animaux sera renforcée pendant au minimum une semaine. A partir de la chirurgie les animaux seront hébergés seuls afin d’éviter tout endommagement du matériel mis en place, ils bénéficieront alors d’un d’enrichissement complémentaire (lanière de kraft et maison en cellulose). Des points limites sont définis et seront respectés afin d’éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Le modèle rongeur est standard dans notre domaine de recherche. D’autre part, les paradigmes d’induction de crises que nous souhaitons tester ont été très bien caractérisés chez la souris. Enfin, nous avons conduit sur cette espèce des essais préalables dans ce modèle visant à l'optimiser, en réduisant notamment les doses de molécules injectées pour la mise en place du modèle, la mortalité et la fréquence des échecs d'induction, limitant ainsi le nombre d'animaux mis en œuvre. En outre, les procédures d’anesthésie et d’analgésie sont également très bien standardisées dans cette espèce. Les animaux seront étudiés à 8 semaines (stade jeune adulte) qui est le stade le plus proche des conditions de la pathologie humaine.
Maintien et production pour l’expérimentation de la lignée de souris ASV-B à phénotype dommageable
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Produire des souris atteintes d'un cancer du foie et les expédier vers un autre établissement, c'est tout l'objet de ce projet, qui n'y ajoute aucune expérience. 1 680 souris mâles porteuses de la modification ASV-B vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles développent une dysplasie du foie à huit semaines, des nodules et un abdomen gonflé à douze, puis un carcinome diffus à partir de seize semaines. 600 d'entre elles sont expédiées vivantes avant sept semaines, avant l'apparition du phénotype, les 1 080 gardées pour la reproduction étant tuées avant quatre mois.
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire (CHC= cancer du foie) est la troisième cause de mortalité par cancer dans le monde. La mortalité élevée du cancer du foie est principalement liée au manque de traitements curatifs pour les formes avancées. En effet¸ malgré les avancées technologiques dans le dépistage du cancer du foie, seuls 30-40% des patients sont éligibles à un traitement curatif (résection chirurgicale, destruction percutanée, transplantation hépatique). Afin de proposer des traitements curatifs à une plus large proportion des patients, il est important d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques et de pouvoir les tester dans un modèle pertinent d’un point de vue de la pathologie humaine. L’objectif de ce projet est de produire, dans notre établissement, un modèle de souris transgéniques (ASV-B) développant un cancer du foie sur foie sain, mimant parfaitement la maladie qui se développe chez le patient. Ces animaux seront ensuite expédiés dans un autre établissement utilisateur afin d’y tester de nouvelles molécules thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L’élevage de ces animaux permettra d'obtenir des animaux reproduisant de manière très fidèle la pathologie humaine. Ces animaux seront intégrés dans un projet scientifique qui vise à permettre l’évaluation de nouvelles thérapies anti-angiogéniques mais également l’intérêt de l’immunomodulation dans le carcinome hépatocellulaire.
Procédures
Les mâles ASV-B utilisés pour l’élevage dans notre EU peuvent manifester un phénotype dommageable léger au-delà de 12 semaines (abdomen légèrement tendu à la palpation sans gêne particulière) et seront mis à mort avant un stade avancé de la pathologie (avant 4 mois). Les mâles ASV-B utilisés pour l'expérimentation seront expédiés avant 7 semaines, soit avant le début de l’expression du phénotype dommageable dans notre EU. Au total, 1680 mâles ASV-B seront générés en 5 ans : 1080 pour l’élevage et 600 pour l’expérimentation. Pour cette DAP, aucune autre intervention ne sera réalisée dans notre établissement.
Impact sur les animaux
Les souris ASV-B mâles développent la pathologie en 3 phases : à 8 semaines le foie grossit (dysplasie, sans douleur), à 12 semaines, peuvent apparaître un léger gonflement de l’abdomen et de petites taches blanches sur le foie (nodules) mais les animaux restent actifs, se nourrissent et se déplacent. À partir de la 16ème semaine, la totalité du foie commence à être atteinte (carcinome diffus). Des études ont déjà été menées par les porteurs de projet avec ce modèle et ont démontré que le foie tumoral ne devrait augmenter ni au point d’interférer significativement avec les fonctions normales du corps, ni au point d’induire, du fait de son emplacement, souffrance et/ou détresse, entre la 6ème à la 22ème semaine de vie de l’animal concernant les mâles. Selon nos observations, les mâles gardés au-delà de 12 semaines pour la reproduction peuvent manifester un phénotype léger (abdomen légèrement tendu à la palpation sans gêne particulière) et sont mis à mort avant un stade avancé de la pathologie (avant 4 mois).
Devenir
Une partie des mâles portant le génotype d’intérêt ASV-B sera expédiée avant l’expression du phénotype dommageable et utilisée pour expérimentation dans un autre établissement utilisateur. Une autre partie des mâles ASV-B sera utilisée pour l’élevage dans notre établissement. Les mâles utilisés pour l’élevage seront mis à mort avant 4 mois, soit avant le stade avancé de pathologie, ou plus tôt si non nécessaires pour maintenir l’élevage (e.g.si surplus). Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d’évaluation du bien-être animal seront mis à mort.
Remplacement
Dans le développement des médicaments anti-cancéreux, l’utilisation d’animaux est aujourd’hui indispensable. En effet, les résultats in vitro sont une étape primordiale, puisqu’ils permettent d’évaluer les effets directement sur les cellules tumorales. Toutefois, les immunothérapies et les anti-angiogéniques nécessitent également de pouvoir évaluer les effets dans un système « intégré ». Nous entendons par là, dans un système où les cellules tumorales, les cellules immunitaires, les cellules endothéliales et tout le microenvironnement si typique d’une tumeur puissent interagir. À ce jour, aucun modèle ne permet de mimer ce type d’interaction, d’où un passage obligatoire par le modèle animal.
Réduction
Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés est appliquée pour répondre aux différentes questions du projet scientifique. Un nombre total de 1680 animaux au phénotype dommageable est nécessaire et comprend les animaux pour accouplements et les animaux issus des accouplements et nécessaires pour l’expérimentation pour le projet scientifique associé. La production des animaux sera planifiée et suivie par l’expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Le nombre de reproducteurs, le schéma de croisement et la durée d’accouplements seront définies en amont de la mise en place des croisements. Ces paramètres seront définis en fonction des objectifs et des différentes caractéristiques connues des lignées (taille de portées, viabilité, phénotype, etc.). L'élevage sera suivi via le fichier de l'élevage. En fin de projet expérimental, l’élevage sera arrêté et le modèle restera accessible sous forme cryoarchivé pour utilisation ultérieure.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages de taille réglementaire (6 maximum par cage) comportant des enrichissements permettant la nidification. Les mâles ASV-B sont susceptibles de développer le phénotype dommageable à partir de 12 semaines et seront ainsi expédiés avant 7 semaines pour l’expérimentation dans un autre établissement, avant le début de l’expression du phénotype dommageable. Dans le cas où les mâles ASV-B ne sont pas transférés vers l’autre établissement pour l’expérimentation, ces derniers seront utilisés pour l’élevage et mis à mort avant 4 mois, avant le stade avancé de la pathologie (abdomen légèrement gonflé sans gêne particulière peut être observé après 12 semaines). Ils seront suivis tous les jours à partir de 8 semaines et ce jusqu'à leur mise à mort avec la grille d’évaluation du bien-être animal contenant des mesures de raffinement (croquettes humides et/ou aliment gélifié déposés dans la cage) et des points limites précoces.
Choix des espèces
La souris est un modèle pertinent car la plupart des immunomodulateurs reconnaissent les cibles murines. De plus, les grosses molécules comme les anticorps, sont réputés pour être difficiles à tester dans des conditions in vitro, et de ce fait, les tests in vivo peuvent être privilégiés. Nous utilisons un modèle de souris transgénique qui développe un carcinome hépatocellulaire (CHC), le modèle ASV-B. C’est un modèle syngénique avec un système immunitaire fonctionnel, idéal pour tester les immunomodulateurs, présentant les mêmes anomalies vasculaires que la pathologie humaine. Dans ce modèle, la carcinogenèse et l’angiogenèse miment à la perfection celles observées chez l’homme (CHC sur foie sain). La pathologie évolue en 3 phases : à 8 semaines le foie grossit (dysplasie, sans douleur), à 12 semaines peuvent apparaître un léger gonflement de l’abdomen et de petites taches blanches sur le foie (nodules) mais les animaux restent actifs, se nourrissent et se déplacent. À partir de la 16ème semaine, la totalité du foie commence à être atteinte (carcinome diffus). Les mâles ASV-B seront ainsi envoyés pour expérimentation avant 7 semaines, avant le début de l’expression du phénotype dommageable. Les mâles ASV-B seront utilisés pour les croisements dès l’âge de 6 semaines et ce jusqu’à 4 mois, soit avant le stade avancé du phénotype dommageable (abdomen légèrement gonflé sans gêne particulière peut être observé après 12 semaines). Les femelles non porteuses de la modification ASV-B étant saines, aucune restriction d’âge n’est attendue. Elles seront utilisées pour les croisements dès l’âge de deux mois et ce jusqu’à un âge où le taux de fécondité est maintenu stable.
Étude et caractérisation du lien causal entre la dysbiose induite par une pneumonie et la progression de maladies cardiovasculaires dans des modèles précliniques de souris.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles respiratoires
Les souris utilisées sont génétiquement hypercholestérolémiques et développent rapidement des plaques d'athérosclérose dès qu'elles reçoivent un régime gras. Elles sont 2 148, toutes tuées pour prélever des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une pneumonie leur est provoquée par instillation dans la trachée sous anesthésie générale, et le sang est prélevé plusieurs fois par incision de l'extrémité de la queue sur animal éveillé, entre dix semaines et huit mois d'âge. Le porteur annonce une première étape vers la prévention de l'athérosclérose après une pneumonie, et justifie l'effectif en une phrase, un nombre "réduit au minimum" pour permettre une analyse statistique fiable.
Objectifs
Les pneumonies font partie des maladies infectieuses principales, qu’elles soient acquises dans la communauté (comme la grippe ou la COVID-19) ou au cours d’une hospitalisation. Les maladies cardiovasculaires sont quant à elles l’une des causes les plus fréquentes de mortalité dans le monde. Il a été observé que l’incidence des maladies cardiovasculaires augmente après une infection, mais les mécanismes reliant l’un et l’autre n’ont pas encore été mis en évidence. L’idée principale du projet est d’étudier la relation causale entre la progression des maladies cardiovasculaires et les altérations observées suite à une pneumonie au niveau de la réponse immunitaire et de l’ensemble des microorganismes vivant en communauté complexe au sein du poumon. Ceci permettrait d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes impliqués et nous permettrait de contribuer, sur une plus grande échelle, à de nouvelles pistes pour mieux identifier les patients à risque, à trouver de nouvelles cibles thérapeutiques, et globalement à améliorer le rétablissement des patients et diminuer l’impact des infections. Notre objectif pour cette partie est de mettre en place et caractériser un modèle murin de pneumopathie dans un contexte de prédisposition aux maladies cardiovasculaires, ici l’athérosclérose, une maladie fréquente et caractérisée par le dépôt d’une plaque essentiellement composée de lipides (aussi appelée athérome) sur la paroi des artères. À terme, ces plaques peuvent entrainer une lésion de la paroi artérielle (sclérose) et conduire à l’obstruction des vaisseaux ou à leur rupture avec des conséquences souvent graves. Pour cela, nous allons : 1) Étudier la réponse de l’hôte à une pneumonie après le développement de plaques d’athérosclérose et d’une hypercholestérolémie, et caractériser le paysage immunitaire pendant et après la guérison de la pneumonie. 2) Étudier la progression des maladies cardiovasculaires après résolution d’une pneumonie et étudier la composition des cellules immunitaires dans les lésions d'athérome Pour ces deux parties, nous chercherons également à identifier les médiateurs immunitaires affectant la susceptibilité à la progression des maladies cardiovasculaires.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de comprendre comment l'athérosclérose influence la réponse immunitaire des poumons pendant la pneumonie, ce qui contribuera à améliorer les soins aux patients souffrant de maladies cardiovasculaires et d'infections respiratoires. En caractérisant les réponses immunitaires, le projet mettra en lumière les interactions complexes entre l'athérosclérose et les infections pulmonaires, ce qui pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Ce projet constitue la première étape pour prévenir la progression de l'athérosclérose et améliorer les résultats du traitement après la pneumonie.
Procédures
Une partie des animaux de ce projet sont soumis à une administration intra-trachéale (IT) sous anesthésie générale. Pour toutes les souris, plusieurs prélèvements de sang par une coupure minime à l’extrémité de la queue sera réalisé à différents temps, sur animaux vigiles. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanées (SC) de morphinique pourraient être réalisées sur animaux vigiles. Tous les gestes d’IT, SC et prélèvements sont très rapides et ne durent au maximum que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les modèles d’inflammation respiratoire aigüe sont des modèles entraînant quelques nuisances attendues et contrôlées (type perte de poids et poils hérissés) avec une récupération de l’état général des souris à partir de 2 jours après l’infection. Une petite douleur consécutive à l’instillation intratrachéale peut survenir, due à l’insertion de la sonde de gavage. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3 jours) et modérée (environ 10%) est observée, sans perte de motricité. Les souris présentent une hypercholestérolémie et développent une athérosclérose lorsqu’elles sont nourries avec un régime hyperlipidique, sans impact négatif sur la vie de l’animal. Plusieurs prélèvements de sang seront réalisés par incision minime à l’extrémité de la queue sur animaux vigiles après application d’une crème anesthésiante.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications cardiovasculaire et immunologiques.
Remplacement
Dans ce projet, l'utilisation de modèles animaux est essentielle car les paramètres étudiés ne peuvent pas être remplacés efficacement par des procédures in vitro. Les interactions complexes entre la réponse immunitaire pulmonaire pendant et après la pneumonie et l'athérosclérose nécessitent une approche globale que seul un modèle animal peut fournir. Les modèles animaux sont donc indispensables à une compréhension approfondie de ces phénomènes.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement, et un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place. Celui-ci permet notamment d’évaluer l’aspect physique global (perte poids et état de la peau, présence de plaie), le comportement des animaux (prise d’eau et de nourriture ; absence d’activité et perte de mobilité) et la modification des selles et des urines. Un système de score a été établi en fonction des signes cliniques observés, et selon les résultats obtenus, une ou plusieurs injections de morphinique seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage est préalablement enduite d’analgésique pour anesthésier localement la trachée. Une crème anesthésiante est utilisée comme anesthésiant local lors des prélèvements sanguins. Les volumes de sang et les temps de récupération ont été définis selon les recommandations (prélèvement inférieur à 7.5% du volume sanguin total et temps de récupération minimal d’une semaine). Dans ces conditions, les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle.
Choix des espèces
Les modèles murins d’infections sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les données déjà générées dans ce projet de recherche. De plus, le modèle murin est le modèle de choix et utilisé de longue date pour caractériser les mécanismes impliqués dans la régulation du métabolisme du cholestérol et des maladies cardiovasculaires. Nous disposons d’un modèle de souris hypercholestérolémiques et prédisposées au développement rapide de la plaque d’athérosclérose lorsqu'elles sont nourries avec un régime hyperlipidique. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte : ils auront 10 semaines au début des procédures et environ 8 mois à la fin. À ce stade, les paramètres cardiovasculaires sont stables et le système immunitaire est mâture. Ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale.
Les volailles peuvent-elles équilibrer leur statut redox par automédication ?
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Deux prises de sang au sinus occipital sont pratiquées sur des poulets éveillés, à deux semaines d'intervalle, pendant leur exposition à une élévation de température en fin d'élevage. 200 poulets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués à six semaines pour prélever leur foie et leur muscle. Le porteur décrit chez eux un halètement, un déploiement des ailes pour dissiper la chaleur et une baisse de la prise alimentaire. Ce projet, déclaré au titre du bien-être animal et de la nutrition animale, cherche à savoir si les poulets consomment d'eux-mêmes un aliment antioxydant quand ils en ont "besoin".
Objectifs
Les poulets sont fortement vulnérables à l’élévation de température ambiante en raison de leur capacité limitée à réguler leur température interne et à dissiper la chaleur au regard de leur croissance. Nous proposons dans ce projet exploratoire de tester la capacité des poulets à mettre en œuvre un comportement d’automédication en régulant leur statut redox (indicateur de stress cellulaire pouvant affecter de nombreuses fonctions physiologiques) lors d’une exposition à un stress thermique de chaleur en fin d’élevage, une période pendant laquelle les poulets sont plus vulnérables à l’élévation de la température ambiante. Des aliments supplémentés ou non avec des molécules antioxydantes seront mis à disposition des animaux pendant toute la période d’élevage. Le comportement alimentaire individuel de poulets vis-à-vis d’aliments supplémentés ou non avec des molécules antioxydantes sera analysé pendant toute la période d’élevage. Les données permettront de savoir si les poulets consomment les différents aliments de manière aléatoire ou préférentielle au cours de leur vie et notamment au cours du stress thermique. L’hypothèse est que les poulets ne consomment un aliment supplémenté en antioxydant que s’ils en ont besoin pour équilibrer leur statut redox (notamment pendant la période de stress thermique), et que sinon, ils éviteraient de le consommer. Un panel de marqueurs du métabolisme, du statut redox et d’inflammation sera dosé dans le sang des animaux avant la mise en place du stress thermique et deux semaines plus tard correspondant à la fin de l’élevage, ainsi que dans le foie, organe cible du stress oxydant et de sa régulation, et le muscle dont dépend directement la qualité de la viande.
Bénéfices attendus
Grâce à ce projet, nous comprendrons mieux les comportements et mécanismes d’adaptation à la chaleur des poulets de chair, particulièrement importante dans le cadre du changement climatique auquel sont exposés les animaux. Le projet permettra de déterminer s’il est possible d’atténuer les effets néfastes de la chaleur sur les poulets en leur proposant des aliments contenant des extraits végétaux permettant de revenir à un état physiologique non altéré.
Procédures
Deux prises de sang au sinus occipital seront effectuées sur les mêmes animaux à deux semaines d’intervalle en situation de stress thermique. Elles seront réalisées sur des animaux vigiles et ne dureront que quelques secondes.
Impact sur les animaux
La contention lors des prises de sang engendre du stress pour l’animal, une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. L’exposition des animaux à un stress thermique d’élévation de température peut entrainer chez les poulets une réduction de la prise alimentaire et des manifestations de halètement et de déploiement des ailes pour réguler la température corporelle.
Devenir
Suite à la procédure de prise de sang pendant le stress thermique, les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissus et organes à l’âge de six semaines.
Remplacement
L’étude du comportement d’automédication chez le poulet qui fait l’objet du projet ne peut se réaliser que chez l’animal et directement sur l’espèce cible (Gallus gallus domesticus, poule domestique).
Réduction
L’effectif de 200 animaux (50 animaux par groupe, 4 groupes) a été défini pour permettre de détecter statistiquement un effet de la chaleur et de l’aliment sur la stabilité du statut antioxydant des animaux dans 3 tissus (sang, foie, muscle), sur la base de données d’études précédentes réalisées dans des conditions comparables.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un bâtiment d’élevage standard, au sol sur litière avec copeaux de bois dans des parquets où ils resteront en groupe. La taille du parquet est suffisante pour permettre aux poussins de se déplacer avec une zone de repos significative en plus de l’espace mangeoire et abreuvement. Les animaux auront à disposition plusieurs enrichissements leur permettant de grimper et de se cacher (Perch'up) ainsi que le dispositif de mangeoires électroniques lui-même avec 8 accès d’aliments possibles. Le suivi des performances est continu pendant toute la durée de l’élevage et permet de disposer de suivi individuel. Toute manifestation de symptômes persistants définis par un point limite entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation. Les prises de sang seront effectuées dans un lieu différent des espaces d’hébergement.
Choix des espèces
Le poulet de chair a été choisi comme modèle car c’est l’espèce agronomique cible du projet. Les poussins éclos au couvoir commercial seront mis en place dans le bâtiment d’élevage et élevés jusqu’à l’âge de six semaines.
Etude de l’effet thérapeutique des MSC métaboliquement standardisées et de leur suivi post-injection intra articulaire dans un modèle murin de l’arthrose.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Tester si des cellules souches au métabolisme standardisé freinent la dégradation du cartilage suppose d'abord de détruire ce cartilage. 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses radiologiques et histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux injections de collagénase sont pratiquées dans le genou droit à deux jours d'intervalle sous anesthésie gazeuse, puis une injection de cellules une semaine plus tard. L'arthrose ainsi provoquée peut plonger les souris dans la prostration, les isoler de leurs congénères et leur faire cesser le toilettage social, un signe clinique déclenchant des croquettes humidifiées, deux un analgésique, trois la mise à mort.
Objectifs
L’arthrose (OA) est une pathologie dégénérative et inflammatoire affectant 50 % de la population mondiale de 65 ans et plus. Cette pathologie atteint l’ensemble des tissus de l’articulation et est caractérisée par des douleurs et une raideur articulaire importante. Alors que l’OA est la plus commune des maladies rhumatismales, seuls des traitements palliatifs non spécifiques existent et ne permettent pas d’enrayer la dégradation articulaire. Il apparaît donc primordial de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques spécifiques de l’OA. Dans ce contexte, les cellules souches adultes et leur potentiel thérapeutique ont été largement étudiés. Des études pré-cliniques et cliniques ont montré des résultats prometteurs. Cependant, des inconvénients majeurs ont été mis en évidence, la fuite des cellules du site d’injection, leur faible viabilité après l’injection et la variabilité de l’efficacité des cellules en fonction des donneurs. Les travaux de nos collaborateurs ont montré que le métabolisme des cellules joue un rôle primordial pour leurs propriétés thérapeutiques. L’un des objectifs du projet est de standardiser le métabolisme des cellules afin de maximiser leurs propriétés thérapeutiques et rendre plus reproductible les résultats obtenus avec différents donneurs de cellules. L’objectif de ce projet vise à montrer l’effet immunosuppresseur des cellules traitées quel que soit le donneur de cellules dans un contexte arthrosique et de suivre le devenir des cellules injectées. Les données recueillies permettront d’envisager une étude chez un plus gros animal que la souris. Selon les résultats obtenus, nous envisagerons ensuite d'encapsuler les cellules traitées dans un hydrogel afin de les protéger d’une fuite du site d’injection et de la mort cellulaire afin de prolonger leur effet thérapeutique.
Bénéfices attendus
La prise en charge des patients atteints d’arthrose (OA) est à ce jour peu efficace et, compte-tenu de l’absence de traitement curatif permettant de réduire ou de stopper la dégradation articulaire, le traitement de l’OA représente un enjeu économique et social majeur. Ce projet permettra de mettre en évidence l’importance du statut métabolique des cellules souches mésenchymateuses (MSC) in vivo pour le traitement de l’OA et de suivre le devenir des MSC injectées dans l’articulation. Ces travaux pourront, à long terme, permettre de proposer des stratégies thérapeutiques pour des essais cliniques chez le chien (animal présentant naturellement de l’OA comparable à l’Homme) puis chez l’Homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux injections intra-articulaires de 5 µL de la molécule permettant d’induire une dégradation précoce du cartilage ou d'une solution saline pour les groupes « contrôle » dans le genou droit à deux jours d’intervalle. Puis, une semaine après, une partie des animaux recevront une injection de 8 µL de cellules dans ce même genou pour étudier leur effet thérapeutique. Ces injections dureront quelques secondes par animal et seront effectuées dans des conditions d’asepsie strictes, sous anesthésie gazeuse et associées à un traitement anti-douleur pré- et post-opératoire. Les souris sont anesthésiées par inhalation d’anesthésique durant toute la procédure.
Impact sur les animaux
Lors du développement de l’arthrose (OA), de la douleur peut être ressentie par l’animal. Celui-ci peut alors entrer dans un état de prostration (état dans lequel l’animal est inactif, immobile et en repli sur lui-même), s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Une infection pourrait intervenir au niveau du point d’injection de la collagénase puis des cellules. De façon générale, différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué tel qu’un changement mineur, une boiterie, une mobilité réduite, …) seront attentivement observés afin d’apporter les soins nécessaires et le plus rapidement possible aux animaux.
Devenir
A l’issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus et procéder à des analyses radiologiques, histologiques et cellulaires.
Remplacement
L’articulation se compose de différents tissus et types cellulaires ainsi que d’un liquide synovial. L’ensemble de ces composants agissent ensemble pour maintenir un état sain stable. Cependant dans certains cas pathologiques, ces différents composants peuvent interagir et participer au maintien d’une pathologie comme dans le cas de l’arthrose. Cette dernière a des causes et des conséquences multiples pour lesquelles il n’existe pas, à ce jour, de modèle in vitro (expérience en laboratoire, réalisée hors d’un organisme vivant) permettant de reproduire simultanément tous ces paramètres associés. C’est pourquoi, ce type d’étude nécessite une preuve d’efficacité in vivo dans des modèles utilisant des animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au strict minimum mais suffisant pour démontrer des différences statistiquement significatives et reproductibles entre les groupes. De précédentes études ont été réalisées pour le suivi de cellules marquées notamment après injection sous la peau. Ainsi nous n’utiliserons pas d’animaux pour la mise au point technique de la détection des cellules marquées. De plus, des études in vitro ont permis d’optimiser le protocole de standardisation des cellules souches adultes afin de limiter le nombre de groupes de souris lors de la procédure d’expérimentation animale.
Raffinement
De façon générale, un suivi quotidien par un personnel impliqué dans la procédure pendant la première semaine post-injection puis hebdomadaire des animaux permettra d’évaluer leur état de santé. Dans les cas particuliers du suivi post-injection, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant les 3 premiers jours. Si des signes cliniques sont observés, la gestion de la douleur se fera comme suit : 1 signe notable = visite 3 fois / semaine, mise à disposition de croquettes humidifiées dans la cage ; 2 signes notables = administration de analgésique ; 3 signes notables ou un signe sévère (point limite) = euthanasie. S’ajoute à cette observation une surveillance réalisée par les animaliers lors de l’entretien des cages des animaux (une fois tous les 10 jours). Le reste du temps, les souris sont hébergées en groupes sociaux de 5 souris par cage avec de l’enrichissement du type frisottis et d’un dôme. Les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Pour le cas particulier des injections, les souris sont anesthésiées par inhalation d’anesthésique durant toute la procédure et sont suivies quotidiennement pendant les 3 premiers jours post-injection.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris est justifiée car il s’agit d’un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens pré-cliniques. De plus, de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Dans le cas de l’arthrose (OA), plusieurs modèles murins ont été développés, faisant de cette espèce la plus décrite dans la littérature internationale pour l’étude de cette pathologie. D’autre part, elle permet la constitution de groupes d’animaux suffisamment larges pour pouvoir effectuer des calculs statistiques pertinents et reproductibles. Enfin, des études précédentes dans notre laboratoire ont montré la faisabilité du modèle et qu’il était possible d’injecter des volumes suffisants et de manière précise dans l’articulation permettant d’obtenir des résultants pertinents et reproductibles. Notre protocole démarrera chez des souris arrivées à maturité squelettique et âgées de 9 semaines minimum. Cet âge correspond à l’âge à partir duquel une induction de l’arthrose (OA) est possible et documentée dans la littérature.
Evaluation de l’efficacité de plusieurs vecteurs AAV dans le cadre de la mise en place d’une approche de thérapie génique dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
1 888 souris porteuses d'une modification génétique reproduisant la maladie d'Alzheimer vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 580 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection unique de virus modifié, soit dans la veine, soit directement dans le cerveau après ouverture du crâne sous anesthésie de quatre-vingt-dix à cent vingt minutes, avec barres d'oreille et risque de saignement. Deux tests de mémoire à court terme et d'apprentissage sont menés sur une journée ou après quatre à huit jours d'entraînement, avant un prélèvement de liquide céphalo-rachidien suivi de la mise à mort. Le porteur affirme qu'aucune culture cellulaire ni système synthétique ne reproduit la complexité architecturale des cellules du cerveau, et tient le recours aux modèles animaux pour "essentiel".
Objectifs
A l’heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper ou ralentir les maladies neurodégénératives. Notre objectif est de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre de la thérapie génique, consistant à introduire du matériel génétique (ADN) dans des cellules du cerveau afin de limiter la progression de la maladie. Cette approche s’est révélée efficace dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer (MA). Des preuves de concepts ont été établies par des injections intracérébrales (directement dans le cerveau) d’un virus modifié permettant de délivrer l’ADN au coeur même des cellules. Notre but étant de développer ces applications en clinique, l’administration intracérébrale peut induire des risques additionnels dans un cerveau déjà en dégénérescence et atrophié par la maladie chez les patients. Dans ce projet nous avons développé des nouveaux virus modifiés de façon à les rendre plus efficaces à passer la barrière protégeant le cerveau (la barrière hématoencéphalique) après une injection intraveineuse et ainsi permettre d’atteindre les cellules du cerveau. Le but est de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale en la remplaçant par une injection intraveineuse chez un modèle murin de la maladie MA. Notre objectif est donc de comparer l’efficacité thérapeutique de virus administrés soit par une injection intraveineuse, soit par une injection intracérébrale. L’objectif final est de poursuivre toutes les étapes précliniques permettant de proposer cette approche thérapeutique chez les patients atteints de la MA.
Bénéfices attendus
Le bénéfice recherché est de remplacer la voie intracérébrale (connue pour être efficace chez la souris) par l’administration intraveineuse de vecteurs AAV (Adeno-Associated Virus ou virus adéno-associés) codant pour la protéine X, afin de pouvoir l’appliquer à l’Homme, et plus précisément chez les patients atteints de maladies neurodégénératives. La maladie d’Alzheimer est une pathologie neurodégénérative affectant les fonctions cognitives, notamment la mémoire, l’apprentissage ou encore le langage, et responsable d’une perte d’autonomie des patients. La maladie d’Alzheimer est la plus fréquente des maladies neurodégénératives et représente plus de 70 pourcents de l’ensemble des démences de la personne âgée. Environ 1 million de personnes sont touchées en France, avec 225 000 nouveaux cas chaque année. Plus de 35 millions de personnes sont touchées dans le monde.
Procédures
Les animaux modèles de la maladie d’Alzheimer avec signes cliniques dommageables seront utilisés. Les animaux seront génotypés par un prélèvement de l'extrémité distale de la queue. Les animaux seront injectés une seule fois : soit par voie intraveineuse (5 minutes d’anesthésie gazeuse), ou par voie intracérébrale (90-120 minutes sous anesthésie gazeuse après injection d’un anti-douleur et injection d'analgésique en post-opératoire). Deux tests comportementaux permettent de mesurer la mémoire à court terme, l’apprentissage et la mémoire des souris (selon le test, 1 session d’une journée ou des sessions d’entraînement de 4 à 8 jours avec un test effectué en une journée juste après la session d’entraînement ou jusqu’à 72h après) seront effectués afin d’évaluer les déficits cognitifs. Puis le jour d'euthanasie, les animaux seront anesthésiés et analgésiés, puis nous réaliserons un prélèvement du liquide céphalo-rachidien (20 minutes) et sanguin (1 minute) préalablement à l'euthanasie (pas de réveil entre les actes).
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables attendus sur les animaux nous pouvons noter les éléments suivants : 1) Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, 2) Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. 3) Un risque de traumatisme mécanique locale relativement faible peut être également être observé suite l’injection de l’aiguille dans le cerveau des souris. 4) Un risque anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal. 5) Un risque d’infection oculaire peut-être observé après les injections intra-veineuses en retro orbitale. 6) Une perte de poids dûe à l’injection d'AAV (Adeno-Associated Virus ou virus adéno-associés) pourrait être observée (5 à 7 pourcents du poids de référence total de l’animal, selon nos précédentes études),7) le stress engendré par les test comportementaux. 8) douleur de courte durée engendrée par le génotypage invasif par prélèvement de l’extrémité distale de la queue. 9) le phénotype dommageable de la lignée (modèle de maladie neurodégénérative (Maladie d’Alzheimer), déficits cognitifs).
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem, impliquant donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux. Ceux-ci seront euthanasiés à la fin des actes prévus que ce soit à l’issu des procédures (avec prélèvement pour analyse) ou pour l’élevage (à la fin de la période reproductive, sans prélèvement).
Remplacement
Remplacement: Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement pertinents. Leur nombre (1888) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives.
Raffinement
Le geste de génotypage invasif est parfaitement maitrisé par les zootechniciens : prélèvement de la queue réalisé sur un animal très jeune où l’extrémité de la queue est peu sensible et cicatrise vite, au même moment que le tatouage pour limiter les manipulations, dans une pièce dédiée au calme, rapidement avec des ciseaux adaptés et désinfectés après chaque portée. Le souriceau est surveillé immédiatement après (absence de saignement et bonne reprise en charge par sa mère), puis 20-30 minutes après avant de replacer la cage sur le portoir d’hébergement. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. La douleur/souffrance des rongeurs utilisés dans cette étude sera diminuée par l’application locale d’anesthésique et par protocole analgésique pour les procédures chirurgicales. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. Un gel ophtalmique sera appliqué immédiatement après l’injection sur les yeux de l’animal. Une surveillance particulière de l’oeil sera faite en post-opératoire pour vérifier l’absence d’infection oculaire. L’applicateur est formé au geste d’injection intraveineuse. L’anesthésie générale sera assurée par une anesthésie gazeuse. Le respect des points limites en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe contribuent au bien-être des animaux. Le suivi est renforcé la semaine suivant la chirurgie puis celui-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf à l’approche de points limites qui auront été définis préalablement. A partir de 9 mois, les animaux seront pesés deux fois par semaine avec ajout de croquette/poudre sur le fond de la cage et observation attentive à chaque pesée. De plus, certains tests comportementaux étant réalisés sur plusieurs jours, favorisent un suivi renforcé et une habituation des souris à la salle et à l’utilisateur. Un environnement enrichi constitué d’un nestlet pour la fabrication du nid et d'un igloo sera ajouté dans chaque cage. Les animaux seront hébergés en groupe.
Choix des espèces
Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèle. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la maladie d'Alzheimer permettent de mimer fidèlement la pathologie. C’est pourquoi nous les utilisons dans des études d’efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques, comme l'évaluation de la surexpression de la protéine X. Dans ce projet des animaux adultes (jusqu’à 14 mois d’âge) seront utilisés. Chez ce modèle murin, les défauts neuropathologiques apparaissent dès 6 semaines puis ces défauts progressent ensuite de manière exponentielle. Nous réaliserons les injections intracérébrales ou intraveineuses chez les souris adultes (entre 5 et 7 mois d'âge) et évaluerons les effets du traitement (entre 6 mois et 14 mois d'âge) à différents âges et stades de la neuropathologie afin de comparer les effets du traitement sur la neuropathologie et le comportement en fonction des deux voies d’administration.
Etudes de thérapie génique pour la surdité chez le primate non humain
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Le dossier réglementaire exigé avant une première administration chez l'être humain repose sur 182 macaques à longue queue, tous tués pour évaluer la toxicité et la biodistribution du produit, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de l'oreille interne d'une à deux heures, jusqu'à quatre heures pour un traitement bilatéral, et parfois deux chirurgies espacées d'un mois. Les prises de sang se font sur animal éveillé sous contention manuelle, le liquide cérébrospinal est ponctionné sous anesthésie, et le recueil des urines et des fèces impose un hébergement individuel pouvant aller jusqu'à vingt-quatre heures. Le porteur annonce comme effets indésirables possibles une perte d'équilibre, un défaut de clignement des paupières et une paralysie faciale transitoire, et présente la réalisation de ce projet chez le primate comme "indispensable".
Objectifs
Le projet est réalisé pour vérifier et optimiser la transduction du vecteur viral (soit le composé d’intérêt de la thérapie génique développée), d’en évaluer l’impact sur la fonction auditive ainsi que sa sécurité chez le primate afin de préparer, chez l’Homme, la restauration de la fonction auditive, en cas de surdité profonde héréditaire, à l’aide du vecteur précédemment sélectionné. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme et fait partie des dossiers présentés aux autorités.
Bénéfices attendus
Suite à ce projet, le traitement pourra être testé en clinique, avec l’objectif ultime de palier les surdités génétiques/héréditaires tout en préservant la structure de l’oreille interne, laissant ainsi la possibilité pour le patient d’avoir ultérieurement un autre traitement tel que la pose d’un implant cochléaire par exemple.
Procédures
Chirurgie : sur animaux sous anesthésie générale, tous les animaux de l’étude, selon les protocoles d’usage vétérinaire. Considérant que la procédure chirurgicale commence avec l’anesthésie de l’animal et se termine au réveil de l’animal, la durée de chirurgie est estimée entre 1 et 2 heures (traitement unilatéral) et jusqu’à 4 heures (traitement bilatéral). Chaque animal est soumis à une chirurgie généralement. Potentiellement, un animal peut être soumis à deux chirurgies espacées d’au moins 1 mois pour réaliser des injections bilatérales non simultanées. Examens cliniques : les animaux sont suivis quotidiennement mais des examens spécifiques peuvent être conduits pour suivre les paramètres cardiovasculaires, la pression artérielle par exemple. Tous les animaux de l’étude sont concernés. Ces examens sont réalisés entre 2 et 4 fois selon la durée de l’étude. Prises de sang : sur animal vigile, tous les animaux de l’étude, contention manuelle, nombre de prélèvements selon les études mais toujours 1) dans le respect du volume maximal prélevable et 2) avec un temps de récupération des animaux entre 2 prises de sang. Les prises de sang, incluant la durée de contention de l’animal, sont de courte durée (environ 1 à 2 minutes). Liquide de l’oreille, liquide cérébrospinal : sur animal sous anesthésie générale ou à la nécropsie, tous les animaux de l’étude, 1 prélèvement par occasion, au maximum 2 occasions par animal (à la chirurgie sous anesthésie générale et à la nécropsie après euthanasie). Larmes, salive, température corporelle : ces prélèvements non invasifs sont réalisés chez les animaux avec une contrainte manuelle légère pour que l’animal ne bouge pas le temps du prélèvement (durée : quelques secondes et moins d’1 minute). Tous les animaux de l’étude sont concernés. Ces prélèvements sont généralement réalisés une fois dans les semaines précédant le traitement, deux fois par semaine pendant 2 à 3 semaines après traitement, puis en milieu et en fin d’étude. Les urines et les fèces sont collectés quand l’animal est hébergé dans une cage dédiée pour le recueil de ces fluides. L’hébergement individuel ne peut dépasser 24 heures. Tous les animaux de l’étude sont concernés. Chaque animal est soumis à 4 collectes généralement, réalisées une fois dans les semaines précédant le traitement, une fois dans les 2 premières semaines après traitement en milieu d’étude et en fin d’étude.
Impact sur les animaux
Les nuisances correspondent essentiellement à la chirurgie et aux conséquences de la chirurgie. Suite à la chirurgie, et selon sa durée (si traitement uni- ou bi-latéral, durée entre 1h et 2h), les animaux peuvent présenter une phase de réveil plus ou moins longue (variabilité inter individuelle), toujours sous surveillance étroite des techniciens et l’appui des vétérinaires. Il est possible qu’après la chirurgie, les animaux présentent une baisse légère, ponctuelle et transitoire de leur prise alimentaire et de leur poids. Les effets indésirables potentiels sont une perte d’équilibre, un défaut de clignement des paupières et/ou une paralysie faciale transitoire(s). Des effets indésirables liés aux prélèvements et/ou aux examens cliniques sont liés à la contention légère des animaux qui peut induire un léger inconfort ou stress aux animaux, qui restent transitoire. Dans tous les cas, une analgésie et une surveillance péri-opératoire sont mis en place (ex : les animaux sont suivis quotidiennement avec plusieurs examens quotidiens sur au moins 10 jours post-chirurgie avec contrôle vétérinaire).
Devenir
Procédure 1 : Tous les animaux sont euthanasiés pour permettre la collecte de tissus, fluides pour évaluer la toxicité du test item, la biodistribution du test item.
Remplacement
Il n'existe pas de système in vitro à l'heure actuelle pour la validation de l’efficacité et de la sécurité de la transduction des différents sérotypes de vecteurs viraux présélectionnés dans le modèle murin. Nécessité d’optimiser la chirurgie, la dose et le sérotype viral chez le primate afin de pouvoir ensuite transférer cette stratégie à l’humain.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est le minimum requis pour permettre une analyse statistique, conformément aux recommandations des lignes directrices. L’estimation du nombre d’animaux a été déterminée pour permettre la détection d'une différence de transduction virale entre les cellules ciliées des cochlées et d’une éventuelle variation de l'audition. Les tests statistiques seront choisis en fonction des paramètres comparés. Cette procédure permet d'optimiser le nombre d'animaux utilisés dans chaque série, soit en utilisant les deux oreilles avec une condition différente pour chacune, soit en utilisant à chaque fois l'oreille controlatérale comme témoin expérimental.
Raffinement
Pendant la phase pré-opératoire, de réveil et les jours après la chirurgie, sont surveillés étroitement notamment l’activité et la mobilité des animaux, les interactions sociales, l’apparence physique, la réponse aux stimuli, la consommation alimentaire, le clignement des yeux/mobilité des paupières (signes cliniques de paralysie faciale, par les techniciens avec l’appui des vétérinaires. Toute anomalie est signalée au vétérinaire pour mise en place des soins pour soulager l’animal (ex. traitement anti-inflammatoire). Afin de limiter la douleur et la souffrance des animaux, toutes les interventions chirurgicales sur les animaux se font sous anesthésie générale, renforcée par des compléments analgésiques et antiinflammatoires appropriés, selon les procédures vétérinaires approuvées. L’état de santé des animaux est surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites, qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a des signes d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés au minimum par deux et un programme d'enrichissement adapté est mis en place tout au long de l'étude.
Choix des espèces
Les études préalables menées chez la souris ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’Homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une organisation de l’oreille comparable à celle de l’Homme. Le choix de Macaca fascicularis est justifié par le fait que l’on trouve dans cette espèce une organisation du système auditif, une dimension et une structure de l’oreille moyenne et interne comparable à celles de l’Homme. Des études préalables ont également mis en évidence une différence morphologique critique entre l’oreille moyenne de souris et celle de macaque. Seuls ces derniers présentent une structure de la fenêtre ovale similaire à ce que l’on retrouve chez l’Homme (absence d’artère stapédienne qui existe chez la souris) et permet de rendre possible la translation de la technique d’injection locale dans l’oreille interne à l'Homme. Animaux (2 à 6 ans). La nécessité de travailler avec des animaux de cet âge est de pouvoir avoir un système auditif bien développé au moment de l’étude.
Elevage d’une lignée de souris modèle de la lipofuscinose neuronale céroïde de type 7, une maladie neurodégénérative héréditaire
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Sur 2 340 souris élevées, 600 seront transférées vers d'autres projets utilisant la même lignée et les autres tuées, aussi bien les surnuméraires d'élevage que celles dont on prélève les organes. Toutes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Un morceau de queue est coupé sur chaque animal pour le génotypage, et des mâles reproducteurs sont isolés une semaine afin d'obtenir des embryons d'âge daté. La lignée porte une maladie neurodégénérative héréditaire qui paralyse progressivement les souris homozygotes à partir de huit mois, aussi le porteur prévoit de toutes les mettre à mort avant sept mois pour éviter que ce phénotype ne s'exprime.
Objectifs
L’objectif du projet est d'élever une lignée de souris modèle de la lipofuscinose neuronale céroïde de type 7 afin de mieux comprendre la maladie et de tester des approches thérapeutiques. La lipofuscinose neuronale céroïde de type 7 est une maladie neurodégénérative rare qui est diagnostiquée vers l’âge de deux ans. Les enfants présentent rapidement des déficits moteurs puis cognitifs et meurent avant l’âge de dix ans car il n’existe aucun traitement curatif. Le modèle de la maladie que nous allons utiliser récapitule plusieurs aspects de la pathologie humaine dont l’altération progressive des fonctions motrices et la mort prématurée. Nous allons isoler des cellules à partir de différents organes des souris (peau, cerveau) afin de tester une nouvelle approche thérapeutique in vitro. Si nos résultats sont concluants, nous pourrons évaluer l'efficacité de notre approche in vivo dans ce même modèle de souris.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’évaluer in vitro la possibilité de traiter la céroide lipofuscinose neuronale de type 7 par une nouvelle approche de thérapie cellulaire. Si elle est concluante, nous pourrons poursuivre le projet in vivo chez la souris et ensuite chez l’Homme et ainsi nous pourrons proposer un traitement aux enfants atteints par cette maladie. De manière plus générale, cette étude pourrait ouvrir la voie au traitement de plusieurs maladies neurologiques héréditaires pour lesquelles il est nécessaire de délivrer ue protéine thérapeutique dans le système nerveux central.
Procédures
Un petit morceau de queue sera prélevé sur tous les animaux pour pouvoir réaliser une analyse génétique.
Impact sur les animaux
Certains animaux (homozygotes pour la mutation) présentent un phénotype dommageable qui apparait vers l'âge de huit mois sous la forme d'une paralysie progressive corrélée à une perte de poids qui évolue jusqu'à l'âge de 11 mois. La procédure de génotypage des animaux implique de réaliser une biopsie de queue qui peut povoquer un stress (contention) et une douleur de très courte durée et d'intensité faible. L’incision de l’extrémité de la queue (moins de 5mm) peut conduire à une légère perte de sang. Pour obtenir des embryons d’âge défini, certains mâles reproducteurs devront être isolés dans des cages pendant une semaine avant la mise en accouplement.
Devenir
Les animaux de génotype d'intérêt seront mis à mort (prélèvement d'organes) ou transférés dans de nouveaux projets utilisant cette lignée. Les animaux surnuméraires d'élevage seront mis à mort.
Remplacement
La lipofuscinose neuronale céroïde de type 7 est une maladie génétique qui atteint plusieurs organes dont le système nerveux central. Il n'existe aujourd'hui pas de lignée cellulaire "naturelle" (fibroblastes de peau de souris ou d'Homme immortalisés) ou obtenue par génie génétique dans laquelle on observe les défauts cellulaires caractéristiques de la maladie. Nous devrons travailler sur des cellules mises en culture à partir de tissus (peau, cerveau, foie...) prélevés chez des souris sauvages et mutantes adultes ou au stade embryonnaire tardif dans lesquelles les défauts cellulaires sont visibles. Ces cellules doivent être renouvelées régulièrement car elles ne peuvent pas être gardées longtemps en culture. Il n'existe pas pour le moment de modèle informatique de la maladie. Il s'agit d'une maladie rare assez peu étudiée et pour laquelle nous disposons donc de peu de données.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous prélèverons plusieurs organes simultanément sur les mêmes animaux (neurones et fibroblastes de peau sur embryons ; cerveau et foie sur adultes). La lignée sera maintenue avec un nombre minimal d'accouplements.
Raffinement
Les animaux seront élevés en groupe sauf dans le cas des accouplements contrôlés nécessaires pour la mise en culture des cellules pour lesquels des mâles seront isolés. Pour que les cellules survivent en culture, les tissus doivent être prélevés sur des embryons d'âge défini. Pour cela il est indispensable de dater les accouplements. L'isolement préalable des mâles permet d'en augmenter la probabilité de réussite au cours de la nuit pendant laquelle les animaux sont mis ensemble et donc d'éviter de mettre à mort des femelles qui n'auraient pas été fécondées. L’isolement des mâles sera limité strictement dans le temps afin de minimiser le stress induit par l’absence de congénères et l’enrichissement sera augmenté dans les cages. Les animaux qui portent la copie délétère du gène sur les deux allèles (homozygotes) présentent un phénotype dommageable qui commence à se manifester vers l’âge de huit mois. Il n’est pas nécessaire dans ce projet d’utiliser des animaux homozygotes âgés de plus de sept mois. Ils seront donc tous mis à mort au plus tard à sept mois pour éviter l’expression du phénotype dommageable et ainsi du stress et des souffrances inutiles.
Choix des espèces
Le modèle murin de lipofuscinose neuronale céroïde de type 7 avec lequel nous avons choisi de travailler récapitule assez bien les phénotypes observés dans la pathologie humaine. Les cellules dérivées de ces souris devraient également présenter les phénotypes associés à la maladie et ainsi permettre de tester notre approche thérapeutique in vitro puis in vivo si notre preuve de concept est validée.