Recherche appliquée

370 souris vont être utilisées, toutes tuées au plus tard sept jours après le début de la procédure, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une seule administration du composé, une injection dans l'abdomen ou un gavage de trente secondes, et son sang comme ses organes sont prélevés après la mise à mort. Le projet ne mesure pas l'efficacité de la molécule mais son trajet dans le corps, absorption, diffusion, élimination, afin de choisir la dose et la voie des futures études sur des souris atteintes de cancers du sang. Le porteur indique avoir calculé l'effectif par groupe avec des logiciels statistiques reconnus, sans dire combien de groupes il prévoit ni ce qui conduit à 370 animaux.

Objectifs

Les cancers hématologiques comme les leucémies, les myélomes et les lymphomes, sont des cancers qui se développent à partir de cellules du sang. En France chaque année, 33 000 personnes sont touchées par ces pathologies, en particulier les enfants, jeunes adultes et personnes âgées. Ils représentent 7% des cancers. Les traitements des cancers hématologiques peuvent entrainer un certain nombre d’effets indésirables et leur efficacité diffère selon les patients. Malgré ces traitements, l’espérance de vie des personnes touchées par ces types de cancer varie de 2 à 5 ans après le diagnostic. Nous nous intéressons dans ce projet à un potentiel nouvel agent anticancéreux : une petite molécule qui a montré lors de précédentes études, un effet prometteur sur des cellules de cancers hématologiques. Cette molécule ou composé est capable d’être internalisé par les cellules, et d’empêcher l’interaction de différentes molécules, ce qui permet de perturber la survie et la prolifération des cellules tumorales puis de jouer sur leur résistance à différents stress cellulaires. Une étude de ce composé a déjà été réalisé au préalable chez la souris, celle-ci avait pour but de définir sa tolérance par l’animal selon les modes d’administration. Ayant connaissance de ces informations, le présent projet vise à étudier le devenir de ce composé dans l’organisme une fois administré. Différentes voies d’administrations, différentes doses seront testées chez l’animal et une analyse du composé dans le plasma au cours du temps, nous permettra alors d'étudier au bout de combien de temps celui-ci est-il est détectable dans le sang, la quantité maximale que l'on va pouvoir atteindre et au bout de combien de temps il va être éliminé. L’objectif principal étant alors grâce à ces informations, de conclure quant à la voie et la fréquence d’administration, ainsi que la dose, qui seront préférées pour de futures études d’efficacité de ce traitement sur des souris atteintes de cancers hématologiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine à moyen terme. En effet, il y a encore aujourd’hui des patients atteints de cancer hématologiques réfractaires aux traitements sur le marché. L’étude va permettre de développer de manière préliminaire une nouvelle molécule qui permettra au mieux de guérir les patients atteints de ce type de cancers, ou au moins de ralentir la progression tumorale.

Procédures

Administration des traitements : contention et injection des composés en intrapéritonéal (une fois unique, geste d'une durée de 30 secondes) ou en gavage (une fois unique, geste d'une durée de 30 secondes). Les prélèvements de sang et d'organes sont réalisés en post-mortem.

Impact sur les animaux

Lors du traitement, les animaux vont subir un stress à la contention et une douleur de quelques secondes dûe à l'aiguille lors de l'injection intrapéritonéale. Les administrations par voie orale avec sonde de gavage génèrent un stress de quelques secondes lors de la contention. Aucun signe de toxicité particulière lors de l'administration du composé aux doses testées dans ce projet n'ont été observé chez la souris lors de l'étude préalable de tolérance.

Devenir

Tous les animaux auront été mis à mort au plus tard 7 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai afin de pouvoir réaliser les prélèvements prévus dans la procédure.

Remplacement

Avant le passage chez l’animal, de nombreuses manipulations de caractérisation de notre composé d’intérêt ont été réalisées (études de cytotoxicité) ayant permis de sélectionner les types de cancer sur lequel il serait le plus efficace. Ensuite, le passage chez la souris a permis l’évaluation de sa tolérance sur un organisme entier. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans l’organisme nécessitent d’être étudiés et définis sur l’organisme vivant sain avant de tester dans de projets futurs son efficacité sur organisme malade. Pour cette raison nous devons effectuer cette étude sur la souris.

Réduction

Les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de manière fiable sur cette étude préliminaire qui permettra de définir le cheminement du composé dans l'organisme. Pour la comparaison des quantitiés maximales du composé dans le plasma entre chaque groupe traité, nous utiliserons un test statistique fiable à multiple comparaisons. Pour le choix du nombre de souris par groupe qui nous permettra de pouvoir observer des différences entre les groupes et de choisir la dose ainsi que le mode d'administration les plus adéquats chez la souris, nous avons utilisé des logiciels statistiques reconnus. Les résultats de ce projet seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Les souris seront observées tous les jours par le personnel de l'animalerie qui remplit une fiche de suivi de l’état général des souris afin de détecter rapidement une souffrance, et 7 jours sur 7 dans le cadre de ce protocole par les expérimentateurs qui remplissent un scoring plus détaillé si nécessaire afin d’identifier l’atteinte d’un point limite. L’état général des souris sera ainsi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation grâce à une grille de scoring détaillée. Les expérimentateurs sont expérimentés et sont à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux). Pour les groupes dont le composé ou le véhicule sera administré par voie orale en gavage, des sondes de gavages en plastique flexibles évitant l'irritation et à usage unique seront utilisées.

Choix des espèces

Afin de plus tard développer cette molécule thérapeutique chez l'Homme, nous devons au préalable observer son devenir dans l'organisme chez l’animal, la première étape sur organisme entier étant classiquement réalisée chez la souris avant d’envisager éventuellement d’autres études plus avancées chez le chien ou le primate. Pour ce faire, nous souhaitons étudier les paramètres pharmacocinétiques qui correspondent à : son absorption, sa distribution, sa métabolisation et son élimination en analysant les quantités de celui-ci dans le sang à différents temps après injection, dans les deux sexes chez la souris non consanguine. Les souris non consanguines sont utilisées pour l’évaluation toxicologique et pharmacologique des candidats-médicaments. Ainsi, les souris non consanguines présentent une plus grande diversité génétique, et sont donc plus intéressantes pour les études de tolérance. Les animaux seront utilisés à l’âge de 6 à 8 semaines afin que les animaux soient jeunes et en bonne santé.

2 880 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à trois administrations par jour pendant trois semaines et subir six prélèvements sanguins en vingt-quatre heures. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, 2 700 souris sont tuées et 180 réutilisées ailleurs, ces dernières étant celles sur lesquelles un geste invasif a été pratiqué sans qu'un candidat médicament leur soit administré. Gavage à la sonde, injections intraveineuses après passage en enceinte thermorégulée, injections intrapéritonéales, intramusculaires, intranasales et sous-cutanées, instillations oculaires, recueil d'urine de quatre heures, examen ophtalmologique, prélèvement en veine jugulaire sous anesthésie juste avant la mise à mort : le porteur ajoute que la molécule testée peut par elle-même provoquer des effets cliniques. Il s'agit de trouver la dose maximale tolérée avant les études d'efficacité, et le porteur présente ce projet comme une réduction des contraintes futures, puisque les études suivantes utiliseront davantage de souris.

Objectifs

L’objectif principal de la recherche et développement (R&D) est de développer de nouveaux candidats médicaments chimiques ou biologiques qui seront évaluées durant des essais cliniques en vue de satisfaire les besoins médicaux. des études préliminaires in vivo de sécurité non clinique sont mises en place sur des espèces rongeurs afin de déterminer un profil de sécurité robuste des nouvelles molécules avant administration chez l’Homme,. le développement d’un médicament nécessite d’évaluer à la fois : - la sécurité : par des études de toxicologie sur la souris (procédures encadrées par la présente DAP). - l’efficacité : à l’aide d’études de pharmacologie sur la souris (modèle mimant la pathologie) (procédures encadrées par d’autres DAP). Ces études in vivo de sécurité non clinique interviennent précocement dans le processus de développement pharmaceutique (en amont des études vivo d’efficacité) et ne sont réalisées que sur des molécules sélectionnées après des étapes de caractérisation/sélection in vitro (modèles cellulaires de toxicité) et in silico (ex. analyse informatique de la génotoxicité). A ce stade ni la dose efficace ni la première dose toxique in vivo ne sont connues. La réalisation de ces études chez la souris permet de déterminer un intervalle de doses tolérées par l'animal ainsi que la dose maximale à ne pas dépasser. Ces données sont essentielles pour que les études de pharmacologie, utilisant un effectif plus important de souris, puissent être réalisées dans des conditions optimales. Dans ce projet, des études de sécurité non clinique chez la souris seront réalisées afin de prédire la toxicité chez l’animal dans les études d’efficacité qui nécessiteraient d’utiliser de fortes doses et/ou des doses potentiellement toxiques (souvent le cas en oncologie). Elles permettent d’évaluer sur une courte durée et avec moins d’animaux si la dose et le schéma d’administration seront bien tolérés dans les études d’efficacité. L’utilisation de doses croissantes dans ces études peut permettre d’identifier la Dose Maximale Tolérée (DMT) pour un produit (ou un nouveau véhicule) et de l’utiliser en toute sécurité dans les études ultérieures. Ces études utilisent des souris ayant le même fond génétique (modèle non pathologique avec phénotype dommageable non exprimé) que les études d’efficacité afin qu’elles soient les plus prédictives possibles.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche et développement de nouvelles entités à visée thérapeutique. Le bénéfice apporté par ce projet est l’optimisation du développement de candidats médicaments en évaluant très précocement leur toxicité éventuelle, en déterminant un profil de sécurité complet aux doses envisagées en efficacité et en ajustant au mieux les doses et le schéma expérimental. Cette approche permet ainsi de réduire les contraintes auxquelles les animaux seraient soumis dans les études d’efficacité par la suite et qui, elles, utiliseront un nombre plus important d’animaux.

Procédures

- A l’administration (unique à réitérée 1 à 3 fois par jour pendant 1 jour à 3 semaines) de composés par voie orale ou parentérale - A l’administration sous-cutanée d’analgésique avant l’euthanasie - A des prélèvements de sang grâce à la technique du microsampling (faible volume de sang prélevé à la veine marginale de la patte ou veine mandibulaire) : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 2 fois maximum dans l’étude - A des recueils urinaires d’une durée maximale de 4h heures sur sable hydrophobe (1 fois par étude au maximum) - A un prélèvement unique de sang en veine jugulaire réalisé sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie - A des examens paracliniques (ophtalmologie, nécessitant une contention légère au maximum 2 fois par étude

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet et pour une durée de procédure pouvant aller de 1 jour à 3 semaines, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : - Conséquences directes des actes expérimentaux : •Administration orale de la molécule : la contention d’une durée de moins de 15sec et le passage de la sonde de gavage dans l’œsophage (moins de 10sec) peuvent générer du stress chez l’animal (maximum 3 fois par jour). (Degré de sévérité léger) •Administration intraveineuse : le passage dans une enceinte thermorégulée (nécessaire pour dilater les veines et réaliser le geste dans de bonnes conditions) d’une durée maximale de 5min, la contention dans une boite adaptée à l’espèce utilisée (2min maximum) peuvent générer du stress et l’injection de la douleur (maximum 2 fois par jour) (Degré de sévérité modéré). •Administrations intrapéritonéales, intramusculaires, intranasales ou sous-cutanées : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10 sec) de la douleur (maximum 3 fois par jour). Degré de sévérité léger pour une ip unique ou modéré si l’administration ip est réitérée. Pour les autres types d’administrations degré léger. •Instillation oculaire (topique externe) : la contention d’une durée de moins de 15sec peut générer du stress et la molécule administrée de la douleur pour l’animal. (maximum 1 fois par jour) (Degré de sévérité léger) •Prélèvements de sang à la veine marginale de la patte, veine mandibulaire ou à la veine caudale : la contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (maximum 6 points de prélèvement sur 24h) (Degré de sévérité modéré) •Recueil urinaire (sable hydrophobe) : le changement d’environnement et l’isolement de courte durée (4 heures maximum) peuvent générer une nuisance et un stress pour l’animal (Degré de sévérité léger). - Conséquence indirecte des actes expérimentaux : La molécule administrée peut en elle-même induire des effets cliniques et provoquer une nuisance pour l’animal.

Devenir

L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un candidat médicament dans ce projet sera euthanasié à l’issue de chaque procédure pour la collecte de sang/ liquide céphalo-rachidien pour analyse et d’organes pour lecture anatomopathologique. . Tous les animaux pour lesquels au moins un premier geste invasif a été réalisé dans le cadre de la procédure (entrant dans la définition de la procédure expérimentale réglementaire ex : micro-sampling) et qui n’ont pas reçu de candidat traitement /véhicule pourront être réutilisés dans un autre projet

Remplacement

Ce projet couvre les études de sécurité très précoces réalisées sur les candidats médicaments de notre recherche, études pour lesquelles il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux. De méthodes alternatives in vitro et in silico sont utilisées au préalable dans la caractérisation et la sélection des molécules à tester dans ces études ce qui permet de réduire fortement le nombre de molécules testées in vivo. Cependant, la mise en place précoce d’un profil de sécurité d’un candidat médicament nécessite l’utilisation d’organismes complexes après ces premières étapes de sélection par des méthodes alternatives. Les études incluses dans ce projet ont un design optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données essentielles pour les études ultérieures.

Réduction

Les molécules les plus prometteuses sont sélectionnées à l’aide de tests vitro et ou silico avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre d’animaux est adapté à la variabilité des paramètres étudiés et prend en compte l’homogénéité des souches, la disponibilité de données historiques pour les paramètres étudiés et de leur variabilité. Pour ces études, le nombre habituel d’animaux est déterminé pour être le compromis le plus efficace afin d’atteindre les objectifs des différentes procédures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint. Il permet d’intégrer de la mixité male/femelle dans les groupes sans avoir à doubler le nombre d’animaux. Exceptionnellement ce nombre peut être ponctuellement augmenté dans le cas où la variabilité d’un paramètre serait élevée (ex : haute variabilité individuelle dans la distribution du produit). Ces études permettent de confirmer les premières données in vitro, avant de réaliser les études vivo nécessaires à la poursuite du développement de la molécule. Elles participent à la réduction du nombre total d’animaux utilisés par projet thérapeutique car les résultats obtenus sécurisent les études de pharmacologie utilisant un nombre d’animaux plus important en prédisant la toxicité éventuelle aux doses testées. Selon la procédure, un ensemble d’examens cliniques et paracliniques peuvent être réalisés par animal (observations cliniques, poids et température corporelle, examen ophtalmologique, prélèvement de sang pour pharmacocinétique ou biologie clinique, collecte d’urine, prélèvements d’organes…) réduisant aussi le nombre d’animaux nécessaire. Dans le cas d'un véhicule bien connu, les données historiques internes vont permettre de réduire le nombre d'animaux dans l'étude en supprimant le groupe témoin véhicule). En cas de protocole particulier (ex : nouveau schéma d’administration ou besoin de suivre plus précisément un paramètre/biomarqueur particulier), le service de biostatistiques pourra aider à définir le design expérimental adapté. Enfin, l’utilisation de la technique du microsampling pour prélèvement de sang (prélèvement d’un faible volume à la veine marginale de la patte ou veine mandibulaire) peu invasive, rapide, permet de permet de réduire le nombre d’animaux en réalisant une cinétique complète sur un même individu (sans animaux dédiés à la pharmacocinétique dans l’étude), tout en respectant les limites de volémie physiologiques et le bien-être animal.

Raffinement

Ces études permettent de mieux cibler les doses et le schéma d’administration pour les études suivantes, diminuant ainsi le risque pour les animaux. Des observations cliniques approfondies sont réalisées chaque jour. Les administrations pourront être réalisées de manière décalée : si un premier animal traité présentait des signes cliniques précoces (30 minutes après traitement par ex.), les autres animaux du groupe pourraient ne pas être traités ou leur dose administrée pourrait être diminuée. Dans tous les cas, si apparition de signes cliniques, une décision rapide est prise entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la SBEA et les équipes en charge des animaux. Cette décision peut mener à une prescription de soins, un arrêt de traitement, une diminution de dose ou une euthanasie, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude (si besoin utilisation du score d’une grille de points limites spécifique à la souris). L’ensemble des animaux est hébergé et manipulé dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement strictes empêchant ainsi l’expression du phénotype dommageable lorsque les animaux utilisés sont immunodéprimés. Les animaux sont manipulés par un personnel technique formé au bien-être animal afin de limiter le stress et peuvent être entrainés si l’étude nécessite un geste technique particulier (ex : contention pour administration intraveineuse. Tous les animaux sont stabulés en groupes, sauf cas exceptionnel (signes cliniques nécessitant l’isolement, recueil urinaire), avec de l’enrichissement adapté à la souris (matériel de nidification). Pour les prélèvements de sang, la technique du microsampling est mise en place dès que possible. Cette technique, rapide, peu invasive et peu stressante, permet de limiter l’impact d’une cinétique et de respecter les limites de volémie physiologiques. Elle permet d’éviter le placement de l’animal dans une enceinte thermorégulée pour la dilatation des vaisseaux. La durée du recueil urinaire sera limitée à son minimum (max 4h) et réalisé en cage conventionnelle en remplaçant la litière par du sable hydrophobe. Cela permet d’éviter l’usage de cage à métabolisme (environnement plus stressant). Dès qu’un acte expérimental nécessite une incision (ex: prélèvement de sang en veine jugulaire), une analgésie adaptée est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

L‘unique procédure de ce projet sera réalisée sur l’espèce souris car elle intervient en amont des études d’efficacité réalisées sur ce modèle. De plus cette espèce présente une forte homologie génétique et physiologique avec l’homme et ainsi une forte valeur translationnelle. La sélection se fait aussi sur des critères réglementaires, éthiques, scientifiques afin d’obtenir la meilleure prédiction possible de la réponse chez l’Homme. S’ajoutent à cela les données historiques (internes et issues de la littérature, par souche, âge, sexe) et nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets ainsi que les données des études pharmacologiques réalisées en amont chez le rongeur. Pour se placer dans les mêmes conditions que les études d’efficacité puis les études requises ultérieurement, les souris utilisées seront des jeunes adultes et adultes, correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet.

90 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales prostatiques humaines, passent un scanner puis une séance de radiothérapie FLASH sous anesthésie gazeuse, et sont suivies deux semaines pendant que la tumeur grossit, ce qui peut selon le porteur atteindre leur mobilité et les fatiguer. Les bénéfices annoncés restent en amont de la clinique : établir si les vaisseaux tumoraux répondent à cette radiothérapie ultra-rapide comme à la radiothérapie conventionnelle, et apporter des connaissances utiles à la communauté scientifique. Sur le remplacement, le porteur affirme que "tout ce qui a pu être étudié sans expérimentation animale a été fait" et que l'oxygénation d'un tissu ne s'étudie que dans un organisme perfusé.

Objectifs

La radiothérapie est un traitement contre le cancer utilisé chez plus de la moitié des patients. Une méthode récente ultra-rapide, dite "FLASH", a montré une toxicité inférieure sur les tissus sains tout en maintenant la même efficacité anti-tumorale dans difféerents modèles animaux. Le niveau d'oxygénation tissulaire semble être un paramètre qui influe sur le ratio bénéfice/risque de cette radiothérapie. De nombreuses études attestent du rôle de l'O2 dans les tissus sains mais aucune ne s'est intéressée aux tissus tumoraux dans ce contexte. Pourtant, le niveau d'O2 tumoral est un facteur qui est bien connu pour jouer sur l'efficacité anti-tumorale de la radiothérapie. Le projet a donc pour but d'étudier la réponse des vaisseaux sanguins tumoraux à la radiothérapie FLASH, et la conséquence en terme d'oxygénation du tissu tumoral. Cette connaissance est essentielle pour appréhender la réponse clinique globale et envisager les étapes ultérieures d'application de la méthode FLASH chez l'homme. Pour des raisons techniques, le projet se déroulera dans deux établissements.

Bénéfices attendus

La réoxygénation du tissu tumoral entre plusieurs séances de radiothérapie constitue l'un des piliers théoriques des procotoles cliniques actuels de radiothérapie. Il est en effet très important d'augmenter l'oxygénation de la tumeur, habituellement défectueuse, car la quantité d'oxygène dicte une grande partie des effets physico-chimiques de la radiothérapie et donc son efficacité. Il est donc crucial d'établir si les vaisseaux sanguins tumoraux répondent à la radiothérapie FLASH de la même manière qu'à la radiothérapie conventionnelle. Les données sur la réponse des vaisseaux ainsi que l'oxygénation tumorale permettront d'établir la pertinence des protocoles cliniques fractionnés actuels, ou dans le cas inverse de proposer de nouveaux protocoles de traitement. Les données permettront d'évaluer la performance globale de la radiothérapie FLASH sur la tumeur. Elles pourront permettre également d'envisager des combinaisons thérapeutiques avec des chimiothérapies anti-angiogéniques ou immuno-modulatrices. Enfin, elles apporteront des connaissances fondamentales sur les cellules du microenvironnement vasculaire, utiles à la communauté scientifique de la radiothérapie FLASH.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 procédures: 1- injection (seringue insuline) sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (2 min) 2- imagerie scanner CT-scan sous anesthésie gazeuse (15 min max) 3- radiothérapie sous anesthésie gazeuse (15 min) 4- suivi tumoral pendant 2 semaines puis injections ip et rétroorbitale (2 min) sous anesthésie gazeuse avant sacrifice endormi. Les actes 1-2-4 se déroulent dans l'Etablisssement 1. L'acte 3 dans l'établissement 2.

Impact sur les animaux

Lors des phases de transport et d'acclimatation, de préhension, contention ou anesthésie, il est attendu d'observer des périodes de stress léger chez les animaux. La greffe tumorale sous-cutanée produira une douleur légère et passagère (quelques minutes). La radiothérapie est imperceptible et ne peut en soi causer de souffrance. Seuls les actes associés (manipulations) sont décelables. La croissance tumorale, en particulier lors des deux dernières semaines, peut engendrer une détresse telle que: atteinte de la mobilité, fatigue. Ces signes sont cependant facilement détectables en amont et interviennent peu dans ce modèle. De plus, le modèle n'est pas métastatique et n'engendre pas d'autre risque.

Devenir

Les animaux suivent tous les même parcours: greffe tumorale, imagerie, radiothérapie, suivi. Tous les animaux seront euthanasiés en fin d'expérimentation, le but étant de prélever les tissus tumoraux pour analyse.

Remplacement

Les premières phases du projet scientifique global se sont déroulées sur des cellules, notamment endothéliales, constituants des vaisseaux sanguins. Tout ce qui a pu être étudié sans expérimentation animale a été fait. Néanmoins l'oxygénation tissulaire ne peut être étudié que dans un tissu perfusé et régulé physiologiquement.

Réduction

La stratégie en trois expériences indépendantes successives permettra de n'utiliser que la quantité d'animaux nécessaire à l'atteinte de la significativité statistique en fonction de la taille d'effet réellement observé: dès la significativité atteinte, les lots d'animaux suivants seront annulés.

Raffinement

Pour le bien-être des animaux, la socialisation et l'environnement seront optimisés: groupes de 5 invariables, maintient des cages et litières penant les transports, cycle jour-nuit adapté, eau-alimentation à volonté et sans changement de régime entre les établissements, frisottis en quantité pour nidification. Les dômes seront exclus car ils ont tendance à créer des comportements de domination chez la souris nude mâle. Une habituation à la manipulation et en creux de main sera réalisée progressivement. Pour éviter le stress, l'injection tumorale sous-cutanée, l'imagerie et l'irradiation seront réalisées sous anesthésie générale. Une stabulation sur tapis chauffant permettra à l'animal un réveil plus rapide et une meilleure stabilité physiologique pendant les procédures. Enfin, les animaux seront observés périodiquement selon un barème décisionnel qui évaluera le stress et la douleur, avec des critères d'arrêt d'expérimentation.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus décrit en tumorigenèse. Les phénotypes des lignées et leurs particularités génétiques sont répertoriés ("mouse phenome database"). Le génome de la souris (différentes souches), entièrement séquencé, et sa physiologie sont similaires à l'homme: 23 000 gènes codants contre 30 000 chez l'homme, avec une bonne conservation des gènes et des fonctions. La souris tolère l'homozygotie, ce qui permet de travailler sur des lignées et d'obtenir des résultats scientifiques très reproductibles. Le modèle immunodéprimé utilisé ici permet la greffe de cellules tumorales humaines. Plus précisément pour ce projet, la souris représente le plus petit animal répertorié sur lequel la radiothérapie FLASH fonctionne et permettant la greffe tumorale avec un suivi suffisamment long (2 semaines post-radiothérapie). L'efficacité du faisceau de particules particulier que nous utilisons a été montrée chez la souris préalablement, ce qui rend ce modèle fiable. Le cancer de prostate est un cancer de l'adulte et les animaux utilisés seront donc adultes (>8 semaines).

Vingt et un gavages pour 360 souris, sept injections pour 240 autres, 1 200 prélèvements de selles, un rasage du dos et une ponction de la veine submandibulaire : 600 souris sont soumises à ces actes, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur signale un risque de traumatisme de l'œsophage lié au gavage à la canule et un risque d'infection cutanée lié au rasage. Il s'agit d'explorer le rôle de bactéries intestinales et de produits bactériens sur le comportement, chez des souris dont la réponse immunitaire a été altérée par délétion génique. Chaque souris passe une fois chaque test comportemental, pour 145 minutes cumulées d'épreuves sur trois semaines, sans que ces tests soient nommés.

Objectifs

Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte, une grande diversité de microorganismes (constituant le microbiote) et des molécules provenant de l’alimentation. Les bactéries et les produits qu’elles sécrètent y jouent un rôle crucial pour la bonne santé de l’hôte. Ainsi un déséquilibre de la diversité de microorganismes a été montré chez les patients atteints de maladies manifestées par des symptômes neuro-psychiatriques (Parkinson, dépression, sclérose en plaque). Notre travail de recherche vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales dans les manifestations comportementales de l’hôte. Des travaux suggèrent que certaines bactéries et des produits bactériens sont responsables de l’apparition de troubles du fonctionnement du système nerveux central . L’objectif de ce projet est d’explorer les mécanismes et d’identifier le rôle des bactéries et des produits bactériens dans la régulation du comportement dans un modèle de souris présentant une réponse immunitaire altérée.

Bénéfices attendus

Validation d’un modèle de souris présentant des modifications spécifiques des cellules neuronales sur des récepteurs de l’immunité innée pour l’étude de manifestations neuro-comportementales. Amélioration de la compréhension de l’influence du microbiote sur le comportement de l’hôte sur le comportement. Amélioration de la compréhension de l’impact des voies immunologiques dans les manifestations comportementales.

Procédures

Gavages : 360 souris seront soumises à 21 gavages (quelques secondes) et 240 à 7 injections (quelques secondes) ou au total, correspondant à une intervention par jour selon le protocole. La contention et le gavage sont réalisés en moins de 10 secondes par un expérimentateur qualifié. Prélèvement de selles : 2 prélèvements de selles correspondant à un placement dans un pot de récolte pendant 5 minutes maximum pour les 600 animaux, soit 1200 prélèvements. Rasage : les animaux subiront 1 rasage d’identification d’une durée de 10 secondes soit 360 actes de rasages de 10 secondes. Tests de comportement : tous les animaux subiront 1 fois chaque test comportemental dont la durée maximum est de 30 minutes. La durée cumulée d’épreuves comportementale sera de 145 min sur 3 semaines par animal. Prise de sang, durée inférieure à 15 secondes, 1 fois pour chaque animal.

Impact sur les animaux

stress léger induit par le placement dans un pot de récolte pour les prélèvements fécaux (émission naturelle de fèces par la souris en début et en fin de protocole) et la pesées des animaux (une fois par semaine). Douleur liée à la piqure et l’injection d’anesthésique et antalgique et des métabolites de l’étude.. Risque de traumatisme de l’œsophage induit par la manipulation de gavage oral à la canule souple pour administration des bactéries de l’étude. stress induit par la mise en conditions expérimentales des tests comportementaux douleurs et stress induit par la contention manuelle et la piqure effectuée par la lancette lors des prélèvements sanguins par ponction de la veine sub mandibulaire : risque de complication cutanée par infection induit par rasage à la tondeuse d’une zone du dos pour l’identification temporaire nécesaire à l’identification pendant l’enregistrement des vidéos.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre de récupérer le sang et les organes à des fins d'analyse scientifique

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico permettant d'évaluer le lien entre l'étât physiologique du microbiote et les processsus cérébraux complexes comme les comportements Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données sur les bactéries intestinales, la composition et l’abondance du microbiote intestinal, et des données phénotypiques (poids, prise alimentaire) et comportementales.

Réduction

Nous avons choisi d’utiliser des groupes de 12 animaux en se basant sur les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres comportementaux.

Raffinement

Les souris bénéficieront d’un enrichissement avec du papier pour réaliser des nids et une maison en propylène rouge pour permettre aux souris de faire ce nid et se cacher. Elles auront également un bâton à ronger. Les animaux sont hébergés dans des cages transparentes permettant des interactions visuelles. Afin de limiter le stress lié aux tests comportementaux, les animaux seront habitués aux procédures et au matériel de manière progressive. Les animaux seront observés chaque jour (surveillance visuelle) et plus précisément une fois par semaine au moment de la pesée des animaux. Enfin des points limites adaptés sont définis pour limiter d’éventuelles souffrances.

Choix des espèces

Les animaux auront 6 à 8 semaines au début de la procédure, âge auquel le système immunitaire est mature et le microbiote intestinal stabilisé. Le modèle souris est largement étudié dans les recherches sur le comportement et l’immunologie, ce qui permet l’accès à de nombreuses données physiologiques de comparaison. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal. De plus, les délétions de gènes spécifiques dans un type de cellules donné n’existent que dans ce modèle murin.

L'objet réel de ce projet est de nourrir avec du sang de lapines vivantes un élevage de tiques que l'unité entretient depuis quinze ans. 10 lapines vont être utilisées sur cinq ans, cinq tuées et cinq adoptées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les tiques restent fixées sur leurs oreilles quatre à sept jours, sans anesthésie ni pendant la pose ni les jours suivants, et chaque lapine sert trois fois en quatre mois pour couvrir un cycle complet du parasite. Le devenir dépend du caractère de l'animal, celles que le porteur juge trop agressives seront tuées après avis du vétérinaire, les plus dociles proposées à des particuliers.

Objectifs

L’élevage des tiques est bien établi dans l’unité depuis 15 ans. L’objectif principal de ce projet est d’établir et de maintenir des élevages de tiques qui sont les vecteurs de certaines maladies humaines et animales et d’étudier le rôle des tiques dans l’acquisition et la transmission de certains microorganismes aux humains et aux animaux.

Bénéfices attendus

Cet élevage permettra de maintenir des espèces de tiques nécessaires pour différents projets de recherche évaluant les interactions entre les pathogènes et les vecteurs (tiques) pour la compréhension de la transmission des maladies humaines et animales (zoonose).

Procédures

Une lapine sera utilisée pour un cycle complet de développement de la tique (adulte (oeufs)/larve/nymphe/) soit 3 fois sur une durée d’environ 4 mois. Sachant que les adultes peuvent rester sans manger entre 10 à 12 mois. Les lapines ne sont pas anesthésiées ni durant la pose des tiques, ni les jours suivants. Les tiques restent fixées sur les oreilles des lapines pendant quatre à sept jours selon le stade de devéloppement.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont dues à la piqure des tiques qui restent fixées sur les oreilles des lapines pendant quatre à sept jours selon le stade de devéloppement de la tique. Cette fixation provoque des lésions peu importantes et parfois des démangeaisons.

Devenir

Les animaux qui sont trop agressifs pour être adoptés et ceux qui auront d’autres anomalies seront euthanasié après avis du vétérinaire de notre laboratoire. Par contre, les animaux en bonne santé et les moins agressifs seront adoptés pas des particuliers.

Remplacement

Les tiques sont des acariens strictement hématophages à tous les stades de développement. Actuellement, aucune alternative de remplacement des lapins pour l’engorgement des tiques n’est disponible, malgré les différents essais que nous avons réalisé dans notre laboratoire pour gorger les tiques sur des membranes artificielles comme c’est le cas des moustiques, puces, punaises de lit et triatomes que nous élevons également au sein de notre laboratoire.

Réduction

Un lapin sera utilisé pour un cycle complet de développement de la tique (adulte (œufs)/larve/nymphe/) soit 3 fois sur une durée d’environ 3 à 4 mois. Sachant que les adultes peuvent rester sans manger entre 10 à 12 mois. Un lapin sera donc utilisé 3 fois/an/espèce de tiques. Donc, seulement 2 lapins seront utilisés par an (un pour chaque espèce de tiques de notre élevage) soit 10 lapins pendant la durée totale de ce projet (60 mois).

Raffinement

Pendant la période d’engorgement nous allons proposer le gel Diet Energy de Safe dites qui est un aliment hydraté contenant 63% d’eau. Après engorgement des tiques les oreilles des lapins seront nettoyées avec de la bétadine et les jours suivants jusqu’à guérison des lésions causées par les tiques. Les lapins sont visités chaque jour y compris les week-end et jours fériés pour s’assurer que les animaux ont de la nourriture et de l’eau. Ils seront manipulés en dehors des procédures expérimentales, dans un espace calme, par du personnel formé et habitué. Les cages de chaque lapin seront enrichies avec des foins, des jouets en bois.

Choix des espèces

Le lapin (New Zealand) est l’espèce animale la plus appropriée pour nourrir les trois stades de développement des tiques, compte tenu du fait que c’était l’espèce qui a été utilisée pour adapter et établir un élevage des tiques au laboratoire. Ces lapins sont de grande taille à l'âge adulte, ils sont dociles et donc faciles à manipuler, ce qui est un avantage. Ce projet n'inclura que des lapins adultes en raison de leur taille. La taille des adultes permettra de les manipuler facilement et de nourrir plus de tiques sans utiliser d'animaux supplémentaires. La grande taille des oreilles permet un nourrissage d'un grand nombre d'individus. De plus, cette taille d'oreille nous permet une fixation facile des chaussettes et carcans.