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Imagerie de l’encéphalopathie septique et investigation de la perméabilité de l’axe cerveau-poumon dans différents modèles murins de SDRA
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
Les souris qui perdent plus de 15 % de leur poids ou dont le score de douleur dépasse 1,5 sont mises à mort. 498 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour, indique le porteur, ne pas laisser une souffrance méconnue perdurer. Selon les groupes, elles subissent une injection intrapéritonéale de toxine bactérienne, une instillation pulmonaire, une injection intracérébrale ou une chirurgie d'infection digestive, puis des injections quotidiennes pendant sept à dix jours, la pose d'un cathéter et des séances d'imagerie de trente minutes sous anesthésie. Les groupes chirurgicaux peuvent perdre jusqu'à 15 % de leur poids et présenter des difficultés respiratoires. Le choix des lignées suit l'effet recherché, des souris SWISS pour l'inflammation généralisée et l'infection digestive, des C57BL6/J mâles pour l'inflammation pulmonaire, les femelles étant décrites comme protégées de cette inflammation.
Objectifs
Le choc septique représente le stade ultime d'une infection aiguë, et est responsable d'environ 11 millions de décès chaque année dans le monde. A ce jour, les infections respiratoires restent la première cause de choc septique. Parmi ces patients, la dysfonction cérébrale aiguë (encéphalopathie) apparaît dans environ 40% des cas et s'associe défavorablement au pronostic. Néanmoins, à ce jour, les facteurs tant prédictifs que pronostics sont encore largement méconnus, et le diagnostic de l'encéphalopathie repose sur des échelles cliniques pouvant être prises en défaut (utilisation de médicaments sédatifs...). Afin de visualiser la neuroinflammation, il est possible d'utiliser l'IRM ou l'imagerie à particules magnétiques (une modalité d'imagerie récemment introduite) après injection de particules dirigées contre des marqueurs d'inflammation. Lors d'une inflammation, la perméabilité des vaisseaux sanguins change par le niveau d'expression d'une molécule appelée PLVAP. Nous souhaitons donc utiliser une approche utilisant des particules ciblant PLVAP afin de mettre en évidence l'inflammation et la perméabilité de l'axe poumon-cerveau dans différents modèles d'infection chez la souris, afin d'offrir une caractérisation non invasive de l'encéphalopathie. Ceci permettrait de valider la possibilité de diagnostiquer et de suivre la survenue d'une encéphalopathie au cours du sepsis par une imagerie non invasive chez l'Homme.
Bénéfices attendus
La survenue d'une encéphalopathie au cours d'un séjour en réanimation est un évènement pronostic majeur, bien que les éléments diagnostiques soient peu spécifiques et sujets à des facteurs confondants, au premier rang desquels l'utilisation de médicaments sédatifs. L'utilisation d'une technique d'imagerie avec l'observation d'éléments objectifs permettrait de s'affranchir de ces limites, de diagnostiquer plus rapidement l'encéphalopathie et de proposer une prise en charge rapide, permettant probablement de limiter les séquelles ultérieures. Par ailleurs, l'utilisation d'une technique basée sur la reconnaissance de changements vasculaires permettra une meilleure compréhension des phénomènes à l'origine de l'encéphalopathie chez ces patients, et d'offrir ainsi de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : induction d'un modèle d'inflammation systémique aiguë par injection intrapéritonéale unique (30 secondes), induction d'un modèle d'inflammation pulmonaire par instillation (2 minutes) et modulation thérapeutique par injection quotidienne pendant 7 jours (30 secondes par injection), induction d'un modèle d'inflammation cérébrale par injection intracérébrale unique (30 minutes) et modulation thérapeutique par injection quotidienne pendant 10 jours (30 secondes par injection), induction d'un modèle d'inflammation pulmonaire non infectieuse par instillation unique (30 secondes) et modulation thérapeutique par injection intrapéritonéale quotidienne pendant 7 jours (30 secondes par injection), induction d'un modèle chirurgical d'infection digestive (10 minutes), pesées quotidiennes (inférieur à 5 minutes), pose d'un cathéter pour l'administration de produit de contraste sous anesthésie (environ 10 minutes), réalisation d'examens d'imagerie sous anesthésie (environ 30 minutes).
Impact sur les animaux
Le modèle de d'inflammation généralisée par injection de toxine bactérienne est susceptible d'occasionner une perte de poids chez les animaux. Compte-tenu de notre expérience, la perte de poids est attendue inférieure à 10% et de courte durée (3 jours environ). Les modèles par instillation intra-nasale ou injection intracérébrale occasionnent une perte de poids plus modérée. Les modèles chirurgicaux d'infection digestive et par instillation sont susceptibles d'entraîner une perte de poids importante jusqu'à 15%, un inconfort et une souffrance de durée possiblement prolongée (quelques jours), ainsi que des difficultés respiratoires.
Devenir
A l'issue des procédures, les animaux seront mis à mort pour ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer.
Remplacement
Des tests in vitro ont été réalisés pour évaluer la spécificité du produit de contraste sur des cultures de cellules de vaisseaux sanguins. Ils ont permis de confirmer la surexpression de PLVAP au cours de l'inflammation, et la possibilité pour notre produit de contraste de se lier à sa cible in vitro. Néanmoins, il reste nécessaire d'étudier le produit de contraste à l'échelle de l'organisme, d'étudier le rapport signal/bruit à l'échelle de l'organisme, de comparer les données obtenues avec celles d'une imagerie sans produit de contraste spécifique. Les procédures expérimentales décrites sont donc nécessaires afin de pouvoir valider la faisabilité de notre approche à l'échelle d'un organisme complexe, avant de pouvoir envisager une translation à l'homme. D'autres méthodologies expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux ne permettraient pas l'obtention du même niveau d'information.
Réduction
Le nombre d'animaux à utiliser dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures utilisant le même type d'animaux et les mêmes modèles, ainsi que des données de la littérature. En fonction de l'expérimentateur (expérience, habitilité) et du taux de mortalité obtenu, le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. Enfin, l'utilisation de techniques non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés en répétant les analyses d'image à différents temps.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d'un temps d'acclimation d'une semaine afin de permettre une réduction du stress. Les animaux seront hébergés par groupe de 5 afin de conserver les interactions sociales. Le milieu sera enrichi par l'utilisation de matériel type boîte à oeufs, tunnel PVC ou igloo PVC, et coton. Dès l'initiation de la procédure, le suivi des animaux sera assuré deux fois par jour afin de rechercher l'apparition de signes de souffrance et de les prendre en charge. La douleur sera évaluée par l'utilisation d'échelles adaptées. Les animaux seront pesés quotidiennement. Les animaux des groupes chirurgicaux bénéficieront de compléments alimentaires humidifiés pour permettre une hydratation et une alimentation facilitée. Tous les animaux bénéficieront d'eau et de nourriture à volonté. Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer. Les animaux seront mis à mort si : perte de poids > 15% ; le score moyen l'échelle est supérieur à 1.5 ; l'animal est horripilé et recroquevillé ; l'animal est agité et/ou non alerte ; l'animal présente une respiration abdominale ; la provocation de l'applicateur n'entraîne pas ou peu de changement comportemental ; pendant les imageries ou chirurgies, un problème d'anesthésie survient, l'animal présente des saignement abondant, ou un arrêt respiratoire. Les animaux présentant une souffrance ne correspondant pas à un point limite recevront une antalgie. Au cours des différentes procédures expérimentales, les animaux recevront une antalgie, une anesthésie générale et une anesthésie locale.
Choix des espèces
La souris est l'espèce animale qui a le plus été étudiée dans le domaine des pathologies septiques. L'anatomie et la physiologie sont, dans ces pathologies, globalement transposables à l'homme. L'ensemble des connaissances acquises au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour l'étude de de la réponse au sepsis dans des conditions mimant ce qui est retrouvé chez l'Homme en soins critiques. Dans le modèle d'inflammation systémique, d'inflammation par injection intracérébrale, et d'infection digestive chirurgicale, les animaux utilisés seront des souris SWISS âgées de 8 semaines. Dans le modèle d'infection pulmonaire par instillation intranasale et d'inflammation pulmonaire non infectieuse, les animaux seront des souris C57BL6/J de 8 semaines, mâles car les femelles sont protégées de l'inflammation pulmonaire. Le modèle d'inflammation cérébrale par vascularite fera appel à des souris C57BL6/J de 8 semaines.
Validation préclinique in vivo d’une nouvelle méthode de thérapie cellulaire destinée à réduire la réponse auto-immune dans un modèle murin de diabète de type 1.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Jusqu'à quinze ponctions de la veine de la queue, quinze injections d'anesthésiant, quinze injections de son antagoniste et treize prélèvements sanguins par souris : 2 688 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Deux injections de streptozotocine leur provoquent un diabète, avec perte de poids rapide, diarrhée et une hyperglycémie que le porteur qualifie de potentiellement létale, avant une chirurgie de trente minutes pour greffer des îlots pancréatiques et l'injection intraveineuse de lymphocytes dirigés contre ces cellules. Le porteur décrit une mise à mort indolore, réalisée selon des méthodes "garantissant que les animaux ne souffrent pas", dans des procédures qu'il déclare par ailleurs de gravité sévère. La justification de l'effectif tient en une phrase, un calcul par logiciel statistique, sans qu'aucun nombre par groupe ne soit donné pour ces 2 688 souris.
Objectifs
Dans la pratique clinique, la production et la transplantation de structures pancréatiques sécrétrices d’insuline (îlots pancréatiques) dérivées de cellules souches constituent une option thérapeutique prometteuse pour les patients atteints de diabète de type 1. Cette approche permet de restaurer la production physiologique d’insuline et d’améliorer le contrôle de la glycémie. Cependant, la récidive de la maladie après la greffe demeure un obstacle majeur et nécessite le recours à un traitement immunosuppresseur important, associé à de nombreux effets secondaires. En effet, certaines cellules du système immunitaire continuent, en l’absence de blocage pharmacologique efficace, à attaquer les cellules productrices d’insuline après la transplantation. Cette réaction entraîne progressivement la destruction des cellules transplantées, provoquant une perte de fonction du greffon et le retour de l’hyperglycémie. Ces limitations soulignent la nécessité de développer de nouvelles stratégies visant à protéger les cellules greffées contre l’attaque immunitaire. Dans ce contexte, notre laboratoire a mis au point une approche innovante consistant à modifier certaines protéines impliquées dans la reconnaissance cellulaire par le système immunitaire. L’objectif est de rendre les cellules greffées moins visibles aux lymphocytes responsables de leur destruction, sans recourir à un traitement immunosuppresseur pharmacologique. Nos résultats préliminaires obtenus in vitro montrent que ces cellules génétiquement modifiées échappent à la reconnaissance et à la destruction par les systeme immunitaire du receveur, sans traitement pharmacologique. Ces résultats prometteurs ont conduit au dépôt d’un brevet et nécessitent désormais une validation dans un modèle murin pertinent. Cette étude permettra d’évaluer la capacité de nos îlots dérivés de cellules pluripotentes génétiquement modifiées à résister à l’attaque immunitaire tout en conservant leur capacité à sécréter l’insuline.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude permettront de confirmer l’efficacité de notre technique de modification génétique dans la production d’ilots pancréatiques fonctionnels et protégés de l’agression auto-immune du diabète de type I, ouvrant ainsi la possibilité de greffer les patients sans besoin de thérapies immunodépressive qui sont souvent accompagnées d’effets secondaires lourds, mais aussi d’améliorer le rendement de la greffe elle-même en limitant le rejet.
Procédures
Pendant la procédure, les souris recevront au total : - deux injections de streptozotocine afin d’induire le diabète (1 minute chacune) ; - une procédure chirurgicale (30 minutes) ; - une injection intraveineuse de lymphocytes réactifs contre les cellules pancréatiques (2 minutes) ; - un maximum de 15 injections sous-cutanées d’anesthésiant avant les analyses intravitales (1 minute chacune) ; - un maximum de 15 ponctionnes de la veine caudale sur souris vigiles pour suivi de la glycémie lors de l’induction du diabètes (10 secondes chacune); - un maximum de 15 injections intrapéritonéales d’antagoniste de l’anesthésiant après les analyses (1 minute chacune) ; - un maximum 13 prélèvements sanguins de 100 µL au niveau de la veine submandibulaire sur souris vigiles (une fois par semaine, 10 secondes chacun).
Impact sur les animaux
Les nuisances et complications éventuelles de la procédure incluent : (1) Stress et angoisse, voire des douleurs, liées aux contentions multiples auxquelles s’additionnent les actions d’injections, les prélèvement de sang et la période de jeun avant injection de la Streptozotocine; (2) Les souris pourront développer des effets indésirables aigües lié au traitement STZ (perte de pois rapide, diarrhée) et des effets indésirables chroniques typique du diabète (hyperglycémie potentiellement létale, perte de poids progressive) , qui seront monitorés régulièrement; (3) Des complications peuvent survenir au cours et après la procédure chirurgicale, notamment une mauvaise cicatrisation, un saignement ou une infection du site de la greffe ou du site de l'injection des cellules et des médicaments. Ces complications sont rares (
Devenir
La mise à mort des animaux à la fin de l’expérience est nécessaire pour pouvoir analyser précisément les cellules injectées dans les tissus. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées sur des animaux vivants sans leur causer de souffrance importante ou sans compromettre la qualité des résultats scientifiques. Les animaux sont euthanasiés de manière indolore : ils reçoiveront d’abord un traitement pour limiter toute gêne, puis une anesthésie profonde avant le prélèvement des échantillons. Cette procédure sera réalisée selon des méthodesreconnues, garantissant que les animaux ne souffrent pas.
Remplacement
Les expériences réalisées en laboratoire ont permis de démontrer l’efficacité de notre approche, mais elles ne reproduisent qu’une partie du fonctionnement réel du système immunitaire, qui reste beaucoup plus complexe dans un organisme vivant. Seule l’utilisation d’un modèle in vivo permet de prendre en compte l’ensemble des phénomènes physiologiques liés à la greffe et au diabète, comme le manque temporaire d’oxygène des tissus, la reformation des vaisseaux sanguins autour du greffon ou encore les déséquilibres métaboliques. Tous ces éléments peuvent influencer l’efficacité réelle de notre stratégie de protection des cellules transplantées.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans l'étude est strictement calculé avec le logiciel statistique reconnu pour obtenir des résultats statistiquement concluants, tout en réduisant au maximum le nombre de souris nécessaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes de 5 à 6, dans des cages enrichies afin de favoriser leur bien-être. Ils feront l’objet d’une surveillance quotidienne par le personnel animalier et les expérimentateurs, avec une attention portée à leur comportement, leur apparence et à l’apparition d’éventuels signes cliniques. Les souris immunodéficientes seront maintenues dans des conditions sanitaires renforcées afin de les protéger des infections. Elles seront hébergées dans des cages ventilées et manipulées dans un environnement stérile, selon des procédures spécifiques distinctes de celles des autres animaux. Les interventions chirurgicales seront réalisées dans des conditions limitant au maximum les risques d’infection et d’inconfort, avec désinfection du site opératoire, matériel stérile et maintien des animaux sur tapis chauffant pendant l’anesthésie. Une attention particulière sera portée au suivi des souris diabétiques, notamment au contrôle du poids, de la glycémie et à la surveillance de la cicatrisation, grâce à une grille d’évaluation adaptée permettant une prise en charge rapide en cas de besoin.
Choix des espèces
À l’heure actuelle, aucune méthode alternative ni expérience réalisée uniquement en laboratoire ne permet de reproduire toute la complexité du système immunitaire et ses interactions dans un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle chez la souris est donc indispensable pour étudier la réaction du système immunitaire face aux cellules transplantés dans un contexte proche du diabète de type 1, notamment l’attaque des cellules produisant l’insuline par des cellules immunitaires issus de patients diabétiques. Cette étape est essentielle avant d’envisager une application chez l’être humain. Les souris seront utilisées à l’âge adulte. Le choix d’animaux adultes permet de travailler avec un organisme physiologiquement stable, ce qui améliore la fiabilité et la reproductibilité des résultats en limitant les variations liées à la croissance et au développement.
Evaluation de l’immunogénicité de candidats vaccins contre le virus Nipah dans le modèle de la souris 129/S2SvPas
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Sept groupes de douze souris, six mâles et six femelles, chacun recevant un vaccin candidat différent contre le virus Nipah : 84 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leur sang et leur rate. La moitié de chaque groupe est tuée quinze jours après une injection unique, l'autre moitié reçoit une seconde injection à trente jours et est tuée quinze jours plus tard. Les souris sont identifiées par des encoches pratiquées dans les oreilles, geste qui provoque selon le porteur une douleur et un stress légers, et les prélèvements sanguins se font sous la mâchoire. Le projet ne mesure que l'immunogénicité, l'ampleur et la nature des réponses en anticorps et en lymphocytes, la protection réelle contre ce virus restant à établir dans des travaux ultérieurs.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de déterminer parmi les six candidats vaccins développés quels sont les plus immunogènes contre les antigènes majeurs du virus Nipah.
Bénéfices attendus
L’efficacité de la plateforme vaccinale utilisée dans ce projet a déjà été démontrée contre un premier virus très pathogène chez l’Homme. Cette plateforme a été utilisée à nouveau pour mettre au point différents candidats vaccins contre le virus Nipah, un virus hautement pathogène chez l’Homme. Grâce à l’analyse des prélèvements réalisés sur les animaux après chacune des deux injections de vaccins, nous pourrons mesurer l’évolution des réponses immunes aux antigènes du virus Nipah pour chaque vaccin et également comparer qualitativement et quantitativement ces différentes réponses immunes entre les vaccins. L’ensemble des résultats obtenus permettra de déterminer quels sont les vaccins les plus immunogènes, donc les plus susceptibles de protéger contre ce virus.
Procédures
Les animaux subiront les interventions suivantes : - Une identification (quelques secondes ) au sein d’un même groupe par encoches au niveau des oreilles. - La moitié des animaux subira une injection intrapéritonéale de vaccin, l’autre moitié subira deux injections de vaccin (injections durent quelques secondes réalisées à un mois d’écart). - Un prélèvement sanguin submandibulaire (quelques secondes) sera pratiqué sur tous les animaux quinze jour après chaque injection de vaccin.
Impact sur les animaux
L’identification des souris sera réalisée par des encoches aux oreilles ce qui peut provoquer une douleur et un stress léger chez les animaux. Des vaccins utilisant la même plateforme vaccinale ont déjà été utilisés chez la souris et aucun effets secondaires liés aux injections n’a été constaté. Les injections des vaccins peuvent néanmoins provoquer un stress, une douleur et un inconfort de sévérité légère et de courte durée. La manipulation des animaux peut induire une peur ou un stress physique de même que le prélèvement sanguin submandibulaire peut entrainer une douleur locale légère de courte durée liée à l’introduction de l’aiguille.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort au cours de la procédure car leur sang et leur rate doivent être prélevés pour analyser les réponses immunitaires aux vaccins inoculés.
Remplacement
Les réponses immunes à des antigènes sont un ensemble de mécanismes cellulaires répartis dans de nombreux types de cellules immunitaires au sein de différents organes et qui évoluent au cours du temps. Il est impossible à l’heure actuelle de reproduire par des expérimentations in vitro ces réponses immunitaires. Le recours à des organismes entiers reste indispensable pour tester l’immunogénicité de candidats vaccins.
Réduction
Ce projet implique 7 groupes de 12 animaux chacun constitué de 6 mâles et 6 femelles. Chaque groupe sera inoculé avec un vaccin différent. La moitié des animaux de chaque groupe sera mise à mort 15 jours après la première inoculation pour effectuer des prélèvements qui permettront de mesurer les réponses immunitaires à la vaccination. L’autre moitié des animaux recevra une seconde injection 30 jours après la première injection et sera mise à mort 15 jours plus tard pour effectuer des prélèvements qui permettront de mesurer les réponses immunitaires après une seconde vaccination. La mise à mort de six animaux par groupe (3 femelles et 3 males) après chaque vaccination constitue un effectif minimum nécessaire pour évaluer la reproductibilité des observations d’un animal à l’autre et réaliser ainsi des tests statistiques robustes de comparaison de groupes (one way anova principalement) et pour s’assurer également que les résultats obtenus ne sont pas dépendants du sexe des animaux. Les résultats obtenus lors d’un précédent protocole basé sur des effectifs identiques ont montré que les résultats des mesures des paramètres immunitaires obtenus à partir des prélèvements sur les animaux pouvaient être assez dispersés mais que les effectifs étaient suffisants pour réaliser ces tests statistiques. La réduction du nombre d’individus dans chaque groupe pourrait altérer de façon significative la qualité de l’analyse des résultats, compromettant ainsi l’ensemble de la procédure et l’intérêt du recours à cet effectif animal pour comparer l’immunogénicité de ces vaccins.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé, conçu pour garantir leur bien-être et limiter tout risque de perturbation extérieure. Leur habitat sera régulièrement nettoyé et stérilisé, et leur alimentation ainsi que leur hydratation seront adaptées pour répondre à leurs besoins physiologiques. Des mesures spécifiques seront mises en place pour enrichir leur environnement (matériaux de nidification, cachettes, etc.) et favoriser leur confort, notamment en cas de besoin accru en eau ou en chaleur. Lors des manipulations (injections, prélèvements), des précautions rigoureuses seront prises pour minimiser les risques d’inconfort ou d’infection. Les zones concernées seront désinfectées avant et après chaque intervention, et les gestes techniques seront réalisés dans des conditions optimales de sécurité. En cas de réaction locale (rougeur, gonflement) au point d’injection, des soins adaptés (nettoyage antiseptique) seront appliqués sans délai. Un suivi quotidien sera assuré, avec une attention particulière dans les jours suivant chaque vaccination. Les animaux seront observés pour détecter tout signe de détresse, de douleur ou de modification de leur état général (perte d’appétit, changement de comportement, altération de l’apparence). En cas de perte de poids supérieure à 10 % par rapport au poids initial, ou d’apparition de signes cliniques persistants tels que la prostration, la fermeture partielle des yeux ou une inflammation locale au site d’injection, les animaux seront mis à mort. L’ensemble de ces mesures vise à garantir le respect des animaux tout au long du projet, en appliquant les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement) et en s’appuyant sur les bonnes pratiques reconnues en matière de bien-être animal.
Choix des espèces
La lignée de souris utilisée est un modèle largement employé pour analyser les réponses immunes induites par des vecteurs vaccinaux et que nous avons déjà utilisé. Les animaux utilisés seront des adultes (à partir de 2 mois). Il est nécessaire que le développement de leur système immunitaire soit mature pour évaluer au mieux la réponse immune mise en place suite à la vaccination.
Etude des variations de virulence de l’agent de la furonculose chez la truite Arc-en-ciel pour mieux comprendre la maladie en élevage
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
Une truite est mise à mort dès qu'un seul critère de la grille atteint son point limite individuel, qu'il s'agisse du comportement de nage, de la réaction à l'épuisette, des furoncles, de l'exophtalmie ou de la respiration. 264 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, ce poisson étant selon le porteur le plus élevé en France. Elles sont infectées par quatre souches d'Aeromonas salmonicida en conditions contrôlées, et le porteur indique que les manifestations cliniques peuvent entraîner de la souffrance, notamment par l'apparition de furoncles sur la partie externe du corps. Aucune ne pourra être relâchée ni réutilisée pour des raisons sanitaires, et la finalité déclarée est d'améliorer vaccins et diagnostic dans une filière où la furonculose provoque des pertes économiques importantes.
Objectifs
La furonculose est une maladie bactérienne des Salmonidés causée par la bactérie Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida. Elle entraîne des pertes économiques importantes en raison de sa forte mortalité lors des formes suraiguës et des lésions cutanées qu’elle provoque dans les cas aigues à chroniques. La maladie est saisonnière et se déclare pour toutes les classes d’âges des poissons particulièrement en période estivale. La virulence peut varier entre les souches, soulignant l’importance de mieux la comprendre pour aboutir à des vaccins protégeant contre les formes les plus mortelles. L’objectif est d’étudier ces différences de virulence in vivo entre souches bactériennes afin de proposer dde nouveaux outils de prévention et de diagnostic de la maladie.
Bénéfices attendus
La compréhension du pouvoir pathogène d’A. salmonicida salmonicida permettra de proposer de nouvelles approches diagnostic pour distinguer la virulence des souches isolées en élevages piscicoles et adapter le recours à un traitement mais aussi de contribuer à optimiser les vaccins sur le terrain en sélectionnant des souches possédant des antigènes pertinents pour améliorer la protection des truites.
Procédures
Les animaux seront soumis à une infection expérimentale en condition contrôlée. Les animaux seront suivis quotidiennement. Aucun prélèvement ni procédure chirurgicale ne seront effectués sur animaux vigiles. En fin d’expérimentation, les animaux seront mis à mort Le suivi des animaux sera réalisée par des personnes expérimentées, en possession du niveau "concepteur" ou de niveau "applicateur" de la formation expérimentation animale", et formées à l’observation clinique des animaux et aux points limites.
Impact sur les animaux
L’étude du pouvoir pathogène des différentes populations bactériennes nécessite d’infecter des poissons. Les manifestations cliniques liées à ce challenge infectieux peuvent entrainer de la souffrance chez les animaux notamment par l’apparition de furoncles sur la partie externe de l’animal
Devenir
L'euthanasie des poissons est prévue en fin de protocole, pour des raisons notamment sanitaires (impossibilité de relâcher ou de réutiliser des poissons potentiellement infectés par A. salmonicida)
Remplacement
L’objectif du projet étant de comparer le pouvoir pathogène de différentes souches d’A. salmonicida salmonicida, cela ne peut se faire uniquement sur animaux vivants. Bien que des modèles cellulaires de truites existent, ils ne permettent pas de valider l’apparition de signes cliniques tels que les furoncles ni d’évaluer le taux de mortalité.
Réduction
L’expérimentation contiendra 4 groupes test (1 groupe d'animaux par souche) et 1 groupe contrôle. Chacun contiendra 24 animaux en duplicat, soit 48 animaux par groupe au total. De plus, 24 poissons (10%) surnuméraires sont prévus pour obtenir 5 lots homogènes en poids.
Raffinement
Une observation quotidienne des poissons est assurée. Lors des procédures de challenge infectieux, les poissons font l’objet d’une observation au moins deux fois par jour, tous les jours. • Seuils d’alarme liés aux paramètres d’ambiance. Température de l’eau : si >20°C et non rectifiable, arrêt de l’expérimentation. Oxygène dissous : si
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est un hôte naturel d'Aeromonas salmonicida salmonicida. C'est de plus l'espèce de poisson la plus élevée en France et donc pour laquelle il est essentiel de mieux comprendre le processus infectieux pour améliorer le diagnostic, la thérapeutique et les approches vaccinales. Les truites utilisées seront de 120g ± 10g. La furonculose est une maladie que l'on observe à différents stades d'élevage (alevins, truites portions = 200-250g et grosse truite > 1kg)
Nouvelle thérapie anti-inflammatoire dans des modèles murins de bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Une ouverture de la peau du cou pour injecter un agent inflammatoire directement dans la trachée, jusqu'à cinq injections par semaine, et une nécrose possible de la queue après les injections répétées de bléomycine : 1 868 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Dans les protocoles longs, elles développent une fibrose pulmonaire, des difficultés respiratoires et une perte de poids importante, tout en recevant un traitement trois fois par semaine pendant trois semaines et un prélèvement sanguin hebdomadaire sur animal vigile. Le projet teste des molécules censées bloquer l'installation de l'inflammation, présentées comme une réponse à la résistance qui apparaît chez 30 % des patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique après six mois de traitement. Le calcul annoncé porte sur vingt-deux souris par groupe, sans que le total de 1 868 souris soit rapporté au nombre de groupes prévus.
Objectifs
Les bronchopneumopathies chroniques obstructives (BPCO) ont une incidence en constante augmentation ce qui en fait la 3eme cause de mortalité dans le monde. Les BPCO sont caractérisées par une diminution progressive et irréversible des capacités respiratoires associée à une réponse inflammatoire chronique. Elles sont à l’origine d’obstruction des voies respiratoires et d’emphysème. Les traitements actuels ne peuvent que ralentir l’évolution de la maladie à l’aide d’une prise en charge multidisciplinaire (arrêt tabac, réhabilitation respiratoire) associée à des molécules non-spécifiques. Ces dernières années, de gros progrès ont été faits dans la compréhension de la réponse immunitaire et il est évident aujourd’hui que le système immunitaire, qui est le principal acteur dans les maladies inflammatoires, est une cible prometteuse. Les nouvelles stratégies d’immunothérapies cherchent à améliorer l’effet anti-inflammatoire des traitements en limitant les effets secondaires. Ces approches vont cibler des populations cellulaires ou des mécanismes immunitaires spécifiques de l’organe pathologique. De nouvelles cibles ont été identifiés comme jouant un rôle dans la modulation de l'inflammation. Nous aimerions tester différentes molécules capables d’activer une de ces cibles et analyser les effets engendrés par cette activation dans différents modèles animaux de fibroses pulmonaires
Bénéfices attendus
Les traitements actuels utilisés contre les Fibroses Pulmonaires Idiopathiques font appel à des traitements de type anti-fibrotique limitant l’installation de la fibrose pulmonaire et ralentissant le déclin respiratoire. Une résistance à ces traitements apparait chez 30% des patients au bout de 6 mois de traitements. De plus le changement de traitement par un nouvel anti-fibrotique n’améliore pas la survie de ces patients, montrant une désensibilisation des patients à ce type de traitements. Il est donc primordial de mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces patients. Nous avons donc développé de nouvelles molécules ciblant les récepteurs de la résolution de l’inflammation. Ces molécules diminuent l’installation de l’inflammation et permettraient potentiellement de ralentir l’installation de la fibrose et d’améliorer les fonctions respiratoires. Chez l’animal nous espérons diminuer l’infiltration pulmonaire aux temps précoce et diminuer l’installation de fibrose au temps tardif du modèle. Si ces études in vivo sont bénéfiques pour l’animal nous envisageons de pouvoir débuter un essai clinique chez l’humain afin de traiter les patients n’ayant plus de possibilité thérapeutique et de leur proposer une nouvelle voie thérapeutique.
Procédures
Les agents inducteurs seront injectés sur animaux anesthésiés et analgésiés, allant d'une injection à 5 injections par semaine par différentes voies d'administrations . Les traitements seront administrés 3 fois par semaines sur une durée de 3 semaines. Des prélèvements sanguins au niveau de la veine mandibulaire pourront être effectués sur animaux vigile (1 fois par semaine maximum tout au long du protocole).
Impact sur les animaux
L’injection intratrachéale induira de la douleur chez l’animal dû à l’ouverture de la peau du cou puis à l’injection d’un agent inflammatoire dans la trachée. Dépendant du modèle, l’inflammation pulmonaire sera de courte durée (24h) où de longue durée (J28) avec pour les modèles longs des difficultés respiratoires dû à l’installation de la fibrose pulmonaire ainsi qu’une perte de poids significative mais contrôlé. L’injection en intraveineuse de bléomycine (Ajout) ou de cellules humaines sur animaux vigiles engendrera une douleur modérée lors de l’injection ainsi qu’une nécrose possible de la queue à la suite des injections répétées de bleomycine sur ce site. Ce modèle induira une perte de poids ainsi que des difficultés respiratoires dû à l’installation de la fibrose pulmonaire.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d'intérêts pourront être prélevés pour compléter les analyses
Remplacement
Le meilleur moyen pour étudier le rôle d'une molécule sur une réponse immune qui est complexe et qui fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires est in vivo et ce en utilisant des animaux. En effet, nos molécules d’intérêt pouvant être exprimées par de nombreux types cellulaires et jouant un rôle sur de nombreux acteurs de l'immunité, il n'est pas possible de reconstituer un modèle de dommage tissulaire et d'étudier l'homéostasie d'un tissu dans des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible. En effet les différents axes définis plus haut ainsi que les 2 études pilotes permettront de réduire l’utilisation de l’animal puisque l’étude principale ne sera exécutée que sur l’étude pilote ayant validé le plus de critères de la pathologie et le moins de nuisances sur l'animal. En amont nous avons étudié par un test statistique le nombre d'animaux nécessaire afin d'observer une différence significative dans nos expériences. Basé sur un test de distribution normale d'échantillons nous avons déterminé un nombre d'animaux de n=22 animaux/groupe nécessaire.
Raffinement
Les animaux auront une phase d’acclimatation de plusieurs jours et ne seront pas manipulés afin de limiter leur stress. En amont de l’expérience le protocole sera entièrement planifié afin d’éviter du stress à l’animal et les points limites seront définis afin d’anticiper toute souffrance. Les animaux montrant des signes de douleurs lors de l’expérience recevront de l'analgésique 3 fois par jour puis dans l’eau de biberon pour la nuit. Les animaux ne seront pas maintenus au-delà des délais décrits pour chaque modèle, limitant leur utilisation si cela n’est pas nécessaire. L’animal sera maintenu en groupe, avec des frisottis pour se camoufler ainsi que des dômes ou des tunnels. Si un animal montre de l’agressivité il sera isolé afin de préserver les autres animaux et mis dans une cage avec des enrichissements de type : dôme ou tunnel, frisottis, coton
Choix des espèces
Afin d'étudier le rôle des différentes cibles in vivo dans des modèles expérimentaux d'inflammations induit par des molécules chimiques, nous utiliserons différentes lignées chez la souris décrite pour déclencher ce type d'inflammation. Les souris utilisées auront entre 6 et 10 semaines car l’inflammation générée par les molécules chimiques utilisées dans les différents modèles est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse inflammatoire.
Effet de régimes alimentaires et d’émulsifiants sur la virulence de souches E. coli associées à la maladie de crohn
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
Pour établir si des additifs alimentaires et des régimes déséquilibrés en fibres et en graisses favorisent l'implantation de bactéries Escherichia coli associées à la maladie de Crohn, 260 souris mâles porteuses d'un gène humain vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune suit un régime particulier pendant huit semaines dès le sevrage, reçoit par gavage les bactéries puis un traceur fluorescent, et subit deux prélèvements sanguins sous anesthésie, le second sans réveil. Les collectes de fèces imposent un isolement de dix minutes chaque semaine pendant six semaines, puis trois fois par semaine pendant deux semaines, et soixante souris reçoivent en plus quatorze gavages quotidiens de composés bactériens. Toutes seront tuées pour mesurer l'inflammation intestinale, l'épaisseur du mucus et la composition du microbiote, au service de traitements que le porteur présente comme contribuant au "bien-être" des patients, mot qu'il met lui-même entre guillemets.
Objectifs
Le microbiote intestinal joue un rôle clé dans le développement et l’entretien des pathologies inflammatoires chroniques de l’intestin telle que la maladie de Crohn. Certaines populations de bactéries dites ‘bénéfiques’ pour l’hôte sont diminuées au détriment de bactéries ‘agressives’ aux propriétés pro-inflammatoires. Une catégorie particulière de bactéries Escherichia coli adhérentes et invasives aux propriétés pro-inflammatoires, colonise anormalement l’intestin grêle de patients atteints de maladie de Crohn. La surexpression d’une protéine au niveau de la muqueuse de l’intestin grêle des patients favorise l’implantation de ces bactéries. Précédemment, il a été montré que l’expression de la protéine humaine au niveau de l’intestin grêle de souris favorise l’implantation de ces bactéries Escherichia coli, offrant un modèle d’étude précieux pour pouvoir tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. L’objectif du projet est d’évaluer les effets de divers facteurs alimentaires sur le microbiote de l’intestin grêle et plus particulièrement sur ces bactéries adhérentes et invasives. Ce projet permettra de mettre en évidence la capacité de certains additifs alimentaires ou régimes alimentaires déséquilibrés en fibres et en graisses à favoriser l’implantation des bactéries Escherichia coli et à augmenter leurs propriétés agressives. La compréhension des mécanismes sous-jacents permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques visant ces bactéries. La finalité du projet est d’utiliser l’ensemble de ces connaissances pour proposer 2 candidats d’intérêt (microorganismes ou produits issus du microbiote) qui seront testés dans ce modèle murin pour leur capacité à lutter contre le développement des Escherichia coli adhérentes et invasives et ainsi aider à améliorer le bien-être intestinal en rétablissant l’équilibre du microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Les investigations chez l’animal permettront de mieux comprendre les mécanismes qui permettent l’implantation des souches Escherichia coli adhérentes et invasives au niveau de la partie terminale de l’intestin grêle (leur zone de prédilection chez l’Homme) et leur répercussion sur l’écosystème intestinal et sur l’hôte de manière globale. Ce projet prend en compte également un facteur essentiel : l’alimentation. Ce projet permettra de mieux comprendre l’impact de certains régimes alimentaires et des additifs alimentaires sur le microbiote intestinal et sur les bactéries adhérentes et invasives. La finalité du projet est de proposer aux patients atteints de maladie de Crohn des stratégies thérapeutiques personnalisées, visant ces Escherichia coli. Ces options thérapeutiques personnalisées seraient proposées aux patients hébergeant ces bactéries délétères dans le but de maintenir les phases de rémission et/ou d’améliorer l’effet des traitements, contribuant ainsi à leur « bien-être ».
Procédures
Les procédures incluses dans ce projet, comprenant 260 souris, suivent toutes le même schéma expérimental incluant : -une administration de régimes alimentaires spécifiques sous forme de croquettes pendant 8 semaines à partir du sevrage -un prélèvement de fèces par semaine sur animal vigile pendant 6 semaines, puis 3 fois par semaine pendant 2 semaines (isolement des souris le temps de la collecte, maximum 10 minutes). -un gavage sur animal vigile avec les bactéries (préhension + geste = 10 secondes maximum) -un gavage sur animal vigile avec un traceur fluorescent (préhension + geste = 10 secondes maximum) -un prélèvement de sang (100-150µL) sur animal anesthésié -un prélèvement de sang (200-300µL) 7 à 10 jours après le dernier prélèvement de sang sur animal anesthésié, sans réveil. Une des procédure concernant 60 animaux inclut 14 gavages supplémentaires pour administrer les candidats thérapeutiques.
Impact sur les animaux
-Suite à l’infection des souris par les bactéries adhérentes et invasives, nous attendons un faible impact sur le poids, pouvant être dû à un stress post-gavage, et une inflammation au niveau intestinal en raison de l’implantation des bactéries. -Chez les animaux infectés par les bactéries Escherichia coli, certains régimes alimentaires peuvent favoriser l'implantation intestinale de ces souches, induisant une inflammation intestinale supplémentaire. -Deux prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie sur l'ensemble des animaux, et peuvent induire un stress chez l'animal en périodes péri-anesthésiques et au moment de la contention de quelques secondes de l'animal sous anesthésie. -Lors des prélèvements de feces, les animaux sont isolés le temps de la collecte (10 minutes maximum) une fois par semaine pendant 6 semaines, puis 3 fois par semaine pendant 2 semaines, ayant pour conséquence d'induire un stress chez l'animal en raison de l'isolement. -Les animaux vont recevoir des bactéries ou composés par voie orale (gavage). Ce geste impose une contention de l'animal pendant 2-3 secondes ce qui induit un stress. L'administration quotidienne par gavage de composés bactériens thérapeutiques pendant 14 jours dans une des procédures de ce projet peut induire un stress supplémentaire chez l'animal.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés lors de ces procédures (260 mâles) sera mis à mort à la fin des expérimentations. Il sera prélevé un ensemble d’échantillons biologiques chez l’animal à l’issu de l’expérience pour compléter les données issues des observations cliniques ou encore les données inflammatoires suite à des dosages dans les fèces des animaux : niveaux d’inflammation au niveau des tissus intestinaux, analyses histologiques, mesures de l’épaisseur de la couche de mucus, analyse de microbiotes.
Remplacement
L’effet des régimes alimentaires sur le microbiote intestinal sera étudié en amont de ce projet en systèmes in vitro, telles que des micro-fermenteurs ensemencés avec des selles de patients atteints de maladie de Crohn. Cela permettra de tester un ensemble de régimes et d’additifs alimentaires pour leurs effets sur la stabilité d’un microbiote complet, sain ou pathologique, et sur la virulence de certaines bactéries. Cependant, le but ultime du projet est de se positionner au sein de l’écosystème complet de l’intestin grêle, site de prédilection de certaines bactéries impliquées dans l’inflammation chez les patients atteints de maladie de crohn. Les études en micro-fermenteurs ont une limite : ils ne prennent pas en considération l’hôte : la muqueuse de l’intestin grêle et le mucus qui la recouvre ainsi que le système immunitaire. Or, l’interaction entre l’hôte et le microbiote est cruciale : la réponse immunitaire de l’hôte façonne le microbiote intestinal, et les microorganismes et les produits de leurs métabolismes influent également sur l’hôte en modulant sa réponse immunitaire. L’alimentation est un autre facteur qui peut jouer un rôle fondamental dans cet équilibre, de manière bénéfique ou au détriment de l’hôte. Il est donc nécessaire de travailler à l’échelle de l’organisme entier pour pouvoir étudier les effets de régimes alimentaires spécifiques sur la virulence des de certaines souches de bactéries, dont les Escherichia coli adhérents et invasifs, et sur le microbiote de l'intestin grêle pour pouvoir ensuite proposer des stratégies thérapeutiques participant à rééquilibrer ce microbiote.
Réduction
-Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet (260 souris) a été réduit au minimum dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. Précédemment, une étude publiée dans le même modèle murin a montré qu’un nombre de 6 souris par lot était suffisant pour analyser le comportement des bactéries Escherichi coli adhérentes et invasives au niveau de l'intestin. Les coefficients de variation des données de colonisation obtenues lors de cette expérience étaient acceptables pour une étude exploratoire (10-40% en log10). Le projet concerné par cette DAP implique d’étudier l’impact de régimes et d’additifs alimentaires sur ces bactéries adhérentes et invasives. Or, les réponses vis-à-vis de régimes peuvent varier selon les individus, en particulier en raison de la composition de leur microbiote intestinal. En effet, une variabilité inter-individu a été observé dans un autre modèle murin placé sous un régime riche en sucre et en graisse. Pour pallier à cette hétérogénéité de la réponse biologique, nous avons décidé d'augmenter le nombre d’animaux à 10 individus par lot pour l’ensemble du projet, afin d'espérer conserver un coefficient de variation équivalent à l'expérience exploratoire (10-40%), voire de le diminuer. -De plus, dans le but de diminuer encore le nombre d’animaux au strict nécessaire dans le cadre de ce projet, une des procédures ne sera réalisée que si les effets biologiques recherchés dans la procédure précédente sont notables.
Raffinement
L’expérimentation débutant par la mise à disposition d’un régime alimentaire spécifique pendant 8 semaines dès le sevrage, la période d’acclimatation est de ce fait, intégrée. Pendant cette période, le poids des animaux est mesuré une fois par semaine. Lors de ce contrôle, un prélèvement de fèces est réalisé afin de détecter d’éventuels troubles digestifs en réponse aux traitements et de doser l’inflammation au niveau fécal. Ce contrôle entraine/habitue l’animal à la présence de l’expérimentateur et à la préhension. Lors des 2 à 3 dernières semaines des procédures, après infection des animaux, la surveillance est renforcée : les animaux sont contrôlés 3 fois par semaine. Une grille de score est utilisée pour le suivi des animaux. En fonction de ce score, il faut soit renforcer les surveillances, soit prévoir un mode de soulagement, soit modifier le protocole expérimental. Il sera administré aux souris montrant des signes de souffrance un traitement analgésique pour réduire leur douleur. En fonction de l’évolution de l’état général de l’animal dans les heures qui suivent, un deuxième avis peut être demandé, mais en l’absence d’amélioration, l’euthanasie est considérée. L’animal est immédiatement sorti du protocole, anesthésié et mis à mort selon la réglementation en cours.
Choix des espèces
Le modèle choisi est la souris, modèle fréquemment utilisé dans l’étude de ce type de pathologie et qui dispose d’un grand nombre d’outil de diagnostic et d’analyses. Nous disposons d’un modèle de souris transgénique exprimant une protéine humaine servant de récepteurs pour les bactéries Escherichia coli adhérentes et invasives qui sont étudiées dans le cadre de ce projet. L'expression de cette protéine humaine au niveau de l’intestin grêle chez l’animal est nécessaire pour favoriser l’implantation de ces bactéries. Concernant le stade de développement, les animaux doivent entrer dans le protocole dès le sevrage (environ la 4ème semaine de vie) afin d'être placés sous régime alimentaire spécifique dès qu'ils commencent à s'alimenter par eux-mêmes et ce, pendant 8 semaines. En effet, le microbiote intestinal va subir un changement radical dans sa composition au sevrage en raison du changement d'alimentation. De ce fait, pour ne pas risquer de masquer les effets des régimes alimentaires spécifiques à étudier, il est préférable d'administrer directement ces régimes post-sevrage, sans passer par un régime alimentaire transitoire.
Potentiel thérapeutique de tissus nerveux 3D issus de la bioingénierie pour le traitement des lésions traumatiques cérébrales 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Macaques rhésus : 2
Immunodéprimés par un traitement administré pendant toute la durée de l'étude, 4 macaques, deux à longue queue et deux rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun subit deux chirurgies de deux heures, dont une pour reproduire un traumatisme crânien, des séances d'IRM sous anesthésie avec injection d'un produit de contraste, des prélèvements sanguins et des tests comportementaux de trente minutes à une heure, maintenu en chaise de contention, sans que le porteur précise lesquels. Le transport entre les deux établissements se fait sous anesthésie, dans une cage recouverte d'une housse pour le soustraire aux regards. Cette étude pilote doit selon lui "définir les caractéristiques du modèle de traumatisme crânien" avant une évaluation thérapeutique plus large, et les quatre macaques seront tués pour l'examen post mortem de leur cerveau.
Objectifs
Cette étude se déroulera sur deux établissements utilisateurs. Cette étude pilote s’inscrit dans un projet plus vaste d’évaluation thérapeutique de greffe de neurones corticaux dans le but d’une réparation de lésion cérébrale. Pour cette étude, deux singes adultes seront utilisés afin de modéliser le traumatisme crânien, d’évaluer les conséquences post traumatiques sur le comportement, d’évaluer l’étendue des lésions en imagerie et de valider la technique de greffe de neurones. Nous évaluerons également quelle est la récupération fonctionnelle, par des tests de comportement et par imagerie afin de caractériser complètement le modèle avant de passer à l’étude thérapeutique plus complète.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de définir les caractéristiques du modèle de traumatisme crânien en termes de comportement et d’imagerie cérébrale des lésions mais aussi de la récupération post traumatique en vue d’une étude thérapeutique utilisant la greffe de neurones.
Procédures
Administration orale du traitement pour l’immunosuppression (Etablissement Utilisateur 1, toute la durée de l’étude), à l’anesthésie pour l’IRM par injection intramusculaire, injection intraveineuse pour le produit de contraste (Etablissement utilisateur 2, 2 heures). Prélèvements sanguins (Etablissement Utilisateur1, 15 minutes), traumatisme crânien (Etablissement Utilisateur 1, 2 heures). Comportement (30 minutes à 1 heure, Etablissement Utilisateur 1).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont liés 1) aux conséquences du traitement pour l’immunosuppression (toute la durée de l’étude, inconfort), à l’anesthésie pour l’IRM et aux douleurs liées aux 2 chirurgies (2 heures pour chaque, modérée). Les nuisances sont liées aux prélèvements sanguins (sous anesthésie, légère, 15 minutes, stress), à la chirurgie pour mimer le traumatisme crânien (stress, modérée, 2 heures), au comportement (durée du test de 30 minutes à 1 heure, en chaise).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure pour une étude post-mortem du cerveau
Remplacement
Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du Primate non-humain (PNH) car il n’existe pas de modèles mathématiques valide et réaliste permettant d’étudier les lésions dues à un traumatisme crânien. Nous recherchons à travers l’utilisation des modèles animaux complexes et intégrés à coller à la réalité de la pathologie humaine, impossible à trouver dans des modèles cellulaires. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme) pour étudier les mécanismes impliqués dans ces processus lésionnels et réparateurs, est une étape préliminaire nécessaire à la mise en place de nouvelles thérapies.
Réduction
Nos modèles sont générés sur un plateau de haute technicité, nous permettant la manipulation des animaux dans les meilleures conditions (chirurgie, déplacement…) et une grande reproductibilité dans les différents modèles ce qui limite le nombre d'animaux. Les prélèvements cérébraux réalisés à chaque fin d’étude sont destinés de prime abord aux études post-mortem visant à identifier des marqueurs pour déterminer de nouveaux traitements, et servent également à renforcer notre banque de tissus (cérébrothèque) afin de proposer à la communauté scientifique des tissus de (Primates non-humains) PNH et ainsi réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
A leur arrivée, les singes sont acclimatés pendant 2 à 3 semaines dans l’animalerie en volière. Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties, avec des points limites associés spécifiques de la chirurgie, des soins appropriés en cas d’atteinte de ces points limites, avec un scoring permettant de décider des actions conservatoires à apporter, et des dispositifs de raffinement (monitoring cardiaque et respiratoire, maintien de la température corporelle, asepsie). Le transport du singe pour réaliser l’IRM s’effectue sous anesthésie dans une cage dédiée, sur chariot et protégée des regards extérieurs par une housse. Il est maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillotte, ses paramètres vitaux sont surveillés.
Choix des espèces
La proximité d’espèce avec l’homme fera toujours du primate non-humain un modèle de choix dans la phase finale de détermination de nouveau traitements thérapeutiques, ceci est encore plus vrai dans ce cas précis avec ce modèle de lésions cérébrale et en tant qu’étude pilote en vue d’une greffe de neurones issue de cellules souches humains. Deux espèces de macaques, proches l’une de l’autre, seront utilisés, car ils sont effectivement très proches sur le plan évolutif et génétique, ils appartiennent au même genre (Macaca), ce qui explique leurs nombreuses similitudes morphologiques, comportementales et biologiques. L’une ou l’autre des espèces sera utilisée en fonction de leur disponibilité.
Étude préclinique de tolérance d’analogues d’une bithérapie ciblant le métabolisme de la méthionine chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
Sélectionner entre quatre et huit molécules candidates parmi des analogues d'une bithérapie ciblant le métabolisme de la méthionine : 686 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chaque souris reçoit soit une injection unique, soit des injections quotidiennes pendant six semaines, soit un dispositif implanté sous la peau lors d'une chirurgie de quinze minutes sous anesthésie, et suit un régime alimentaire particulier qui peut lui faire perdre du poids. Les prélèvements sanguins ont lieu deux à trois fois sous anesthésie, complétés par des tests d'activité de dix à quinze minutes une à deux fois par semaine, sans que le porteur précise lesquels. Il indique qu'aucune méthode ne permet d'évaluer la sécurité et la toxicité à long terme de ces molécules sans animal, "car seule l'étude sur un organisme entier permet d'observer leurs effets sur différents tissus et fonctions".
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans la suite de travaux ayant permis de découvrir une molécule, associée à un régime alimentaire spécifique, capable de ralentir la croissance de certaines tumeurs. L’objectif est de tester des versions améliorées de cette molécule, toujours associées à ce régime, afin d’identifier entre 4 et 8 candidats finaux présentant le meilleur compromis entre efficacité et tolérance. Pour cela, la dose optimale, la manière dont ces traitements agissent dans le temps, ainsi que leurs éventuels effets indésirables seront étudiés, afin de mieux comprendre leurs effets bénéfiques et secondaires. Les résultats aideront à sélectionner le candidat le plus prometteur pour le développement de futurs traitements chez l’Homme.
Bénéfices attendus
L’objectif est de déterminer une dose adaptée et sûre d’utilisation. Si les résultats sont satisfaisants, ils permettront de poursuivre le développement de ce traitement dans des études plus avancées. À terme, ce projet pourrait contribuer à la mise au point d’une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement du cancer du pancréas chez l’Homme.
Procédures
Les animaux recevront une injection unique ou des injections quotidiennes (hors week-end) pendant 6 semaines, réalisées sur animaux vigiles. Dans certains cas, un petit dispositif sera placé sous la peau lors d’une intervention chirurgicale mineure (environ 15 minutes) sous anesthésie, afin d’administrer le traitement de façon continue. Des tests simples d’activité (quelques minutes à 10–15 minutes, 1 à 2 fois par semaine) seront réalisés sur animaux vigiles. Les prélèvements sanguins (2 à 3 fois) seront effectués sous anesthésie, en plus des prélèvements réalisés en fin de procédure. Les animaux seront suivis quotidiennement et hébergés dans des conditions adaptées pour limiter le stress et l’inconfort.
Impact sur les animaux
Le régime alimentaire spécifique peut entraîner une légère perte de poids. Les animaux recevront soit des injections, soit un petit dispositif sous la peau, pouvant provoquer une gêne locale temporaire, prise en charge par des traitements contre la douleur. Les interventions sous anesthésie peuvent entraîner une sécheresse des yeux ou une baisse de température, prévenues par des mesures adaptées. Un isolement temporaire peut être nécessaire après chirurgie pour la surveillance et la protection du site opératoire. Les animaux sont suivis quotidiennement et hébergés dans des conditions adaptées afin de limiter le stress et assurer leur bien-être.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude ou plus tôt en cas d’atteinte des points limites définis dans le protocole. Certains animaux satellites pourront également être utilisés à des temps définis pour des analyses biologiques, biochimiques et anatomopathologiques. Ces derniers permettent d’évaluer l’exposition au traitement, la pharmacocinétique et la toxicité précoce, sans affecter le suivi des autres animaux de l’étude. La mise à mort sera réalisée selon des méthodes réglementaires sous anesthésie générale, afin de limiter toute douleur et stress, et permettra la réalisation de prélèvements nécessaires aux analyses scientifiques. Cette organisation permet de concilier le bien-être animal et les objectifs scientifiques de l’étude.
Remplacement
Cette étude fait suite à des travaux ayant identifié une molécule prometteuse associée à un régime alimentaire spécifique. L’objectif est maintenant de tester des molécules proches afin d’identifier celle qui est la mieux tolérée par l’organisme. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer complètement la sécurité, la toxicité et les effets secondaires à long terme de ces molécules sans utiliser l’animal, car seule l’étude sur un organisme entier permet d’observer leurs effets sur différents tissus et fonctions. Ces études sont donc nécessaires pour vérifier la sécurité globale avant un éventuel passage chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats fiables. L’étude est réalisée de manière progressive, en commençant avec un nombre restreint d’animaux, puis en élargissant uniquement si nécessaire. Les animaux sont surveillés en continu afin de détecter rapidement tout effet indésirable et d’adapter ou arrêter l’étude si besoin. Cette organisation permet de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant des résultats fiables.
Raffinement
Toutes les mesures nécessaires seront mises en place pour limiter au maximum les effets indésirables liés aux manipulations et aux procédures expérimentales. Le bien‑être des animaux sera évalué quotidiennement afin de détecter rapidement tout signe d’inconfort. Avant toute intervention, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation de 7 jours, avec des séances de familiarisation pour les habituer progressivement au contact humain et réduire le stress. Toutes les interventions seront réalisées dans un environnement calme, par du personnel qualifié et formé, afin de limiter la durée des manipulations et les réactions de stress. La douleur ou l’inconfort sera surveillé chaque jour. En fonction du niveau de douleur observé, un traitement adapté sera administré. Si la douleur ne peut pas être soulagée ou si la situation l’exige, l’animal sera immédiatement mis à mort afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
Les souris C57BL/6J constituent un modèle de référence pour les études précliniques de tolérance et sont largement documentées dans la littérature. Cette souche présente un fond génétique stable et homogène, ce qui réduit la variabilité interindividuelle dans les paramètres essentiels évalués en toxicologie (poids, marqueurs biochimiques, analyses histologiques, comportement). Par ailleurs, leur utilisation étendue en pharmacologie, en toxicologie et en neurosciences offre un important historique de données comparables et reproductibles, renforçant la pertinence scientifique de leur choix pour cette étude. Les souris seront accueillies dans l’établissement utilisateur entre 6 et 8 semaines de vie et début des procédures entre 7 et 9 semaines de vie, comme décrit majoritairement dans la bibliographie.
Exploration de la toxicité retardée sur les cellules de Purkinje de produits de référence administrés par voie intra-cérébroventriculaire chez la souris pour le traitement de maladies neurologiques
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Un abord chirurgical de trente minutes sous anesthésie gazeuse pour injecter un produit directement dans les ventricules du cerveau, puis six prélèvements sanguins en vingt-quatre heures sur souris vigiles, chacune maintenue en contention deux minutes. 324 souris mâles jeunes adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le produit dit positif est choisi parce qu'il détruit les cellules de Purkinje du cervelet, et le porteur écrit pourtant que les produits de référence "ne devraient pas induire de signes cliniques modérés ni marqués", les signes neuro-locomoteurs n'apparaissant selon lui que lors d'évaluations dédiées. Toutes les souris ayant reçu une injection sont tuées pour prélever leurs organes et chercher des marqueurs précoces de cette toxicité, seules celles écartées avant la chirurgie pouvant être transférées vers d'autres projets.
Objectifs
Les troubles neurologiques constituent la première cause de handicap et de morbidité mondiale, touchant plus de 3,4 milliards de personnes. Face à l'absence de traitements curatifs pour ces pathologies graves affectant le cerveau et la moelle épinière, la Recherche et Développement accélère le déploiement de thérapies innovantes, notamment les oligonucléotides antisens (ASO). Cette stratégie thérapeutique bloque la production de protéines toxiques avant l’apparition de lésions cérébrales. Le principal obstacle réside dans la difficulté pour ces thérapies de franchir la barrière hémato-encéphalique (BHE), filtre protecteur qui isole le cerveau de la circulation sanguine. Pour contourner ce problème, les médicaments sont injectés directement au niveau des lombaires entre les méninges chez l'Humain. Chez la souris, cette méthode n'est pas possible en raison de sa petite taille, et les médicaments sont administrés directement dans le cerveau par la voie intra-cérébroventriculaire dite ICV. Cependant, l’administration de certains ASOs par voie ICV chez la souris peut provoquer des effets indésirables structurels, notamment la perte de cellules de Purkinje (type de neurones du cervelet, crucial pour le contrôle moteur fin). Ces modifications anatomiques, souvent asymptomatiques au début, peuvent altérer gravement les fonctions neurologiques à terme. L’enjeu de ce projet est d’identifier des biomarqueurs précoces de cette toxicité retardée à la suite de l’injection par voie ICV de produits de référence (provoquant une perte des cellules de Purkinje) chez la souris. C’est un modèle présentant une forte homologie physiologique avec l’Humain et pour lequel cet effet indésirable a déjà été observé. Un suivi de deux semaines maximum post-injection, incluant des prélèvements biologiques à différents temps sont programmés pour effectuer des analyses approfondies. L'objectif scientifique de ce projet est donc de caractériser ces anomalies en intégrant une recherche de biomarqueurs précoces prédictifs d’une potentielle toxicité cérébrale avant même l'apparition de lésions irréversibles telles que la perte de cellules de Purkinje et l’apparition de signes cliniques. L’exploitation des résultats de ce projet pourra être appliquée aux évaluations ultérieures de candidats médicaments (ASOs), dans le cadre d’un autre projet. En identifiant ces signaux d'alerte dès les phases non cliniques, cela permettra de garantir la sécurité des patients lors des futurs essais cliniques.
Bénéfices attendus
Ces études s’inscrivent dans l’optique d’accélérer la mise à disposition de thérapies innovantes pour le traitement de pathologies neurologiques et d’offrir de meilleures perspectives aux patients touchés par ces maladies. Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. A court terme il permettra la détection de biomarqueurs précoces susceptibles de prédire les effets potentiellement toxiques (anomalies cérébrales) des produits de référence. L’exploitation des résultats de ce projet pourra ensuite être appliquée aux évaluations ultérieures de candidats médicaments en développement (à moyen terme) pour renforcer leur profil de sécurité dans le cadre d’un autre projet. A plus long terme, le bénéfice sera de sécuriser l’utilisation de ces thérapies chez les patients
Procédures
• injection unique du produit de référence/véhicule dans le cerveau nécessitant un abord chirurgical sous anesthésie générale gazeuse et une couverture analgésique (durée de la chirurgie 30 min environ) • injection d’analgésique en pré, péri et post opératoire (maximum 2 fois par jour pendant 2 jours) et avant l’euthanasie (moins de 10 sec) • prélèvements de sang de très faibles volumes sur animal vigile : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 1 fois maximum durant l’étude, contention de 2 minutes maximum, durée du prélèvement de moins de 30 sec.
Impact sur les animaux
• injection unique du produit de référence ou du véhicule dans le cerveau nécessitant un abord chirurgical sous anesthésie générale gazeuse et une couverture analgésique (durée de la chirurgie 30 min environ), la phase d’induction de l’anesthésie gazeuse peut générer un stress léger et de courte durée. La phase de réveil post-opératoire peut générer une douleur modérée • Injection de l’analgésique pré et post opératoire (maximum 2 fois par jour pendant 2 jours) et lors de l’euthanasie (moins de 10 sec) douleur légère et de courte durée à l’injection • A des prélèvements de sang de très faibles volumes sur animal vigile : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 1 fois maximum durant l’étude, contention de 2 minutes maximum, générant une douleur légère au moment de la ponction de moins de 30sec et stress lié à la contention nécessaire. - Conséquence indirecte des actes expérimentaux : • Les produits de référence administrés pourraient induire une perte de cellules de Purkinje débutante (produit positif) mais ne devraient pas induire de signes cliniques modérés ni marqués. Toutefois des signes neuro-locomoteurs légers peuvent déjà être observées précocement et uniquement lors d’évaluations comportementales et neuro-locomotrices dédiées pouvant provoquer un inconfort léger pour l’animal.
Devenir
L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un produit de référence ou d’un véhicule seront euthanasiés à l’issue de ce projet pour l’analyse de biomarqueurs et d’organes pour examen de leur structure (analyse histologique) ou analyse de l’activité des gènes (transcriptomique) et des protéines produites dans ces tissus (protéomique)selon les groupes. Les seuls cas de réutilisation possible dans un autre projet concernent les souris pour lesquelles au moins une première administration d’analgésique en préparation de la chirurgie a été réalisée et qui n’ont pas été opérées et n’ont donc pas reçu de produit de référence ou véhicule. Ce cas peut se produire dans de rares cas suite à une décision anticipée d’arrêt de l’étude ou d’un groupe à la suite d’observation de signes cliniques sur un autre animal traité du même groupe par exemple. Ces animaux ayant déjà reçu au préalable une injection d’analgésique avant la chirurgie pourront dans ce cas être réutilisés dans d’autres projets.
Remplacement
Ce projet a pour but d’identifier des biomarqueurs précoces prédictifs d’une toxicité retardée post administration de produits de référence induisant ou non une perte de cellules de Purkinje. Cette approche permet d’identifier de potentiels marqueurs précoces de cette toxicité pouvant être observée avec les ASOs administrés dans le système nerveux. Actuellement, il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux tout comme il n’existe pas de modèle vitro suffisamment complet, pour permettre l’identification de biomarqueurs prédictifs de l’apparition d’une toxicité retardée suite à l’injection de ces produits de référence (ASOs). L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et la souris est l’espèce rongeur la plus adéquate pour répondre à l’ensemble des objectifs du projet (toxicité observée dans cette espèce, processus physiologiques très proches de l’Humain).
Réduction
Les produits de référence sont sélectionnés à l’aide de screening vitro et/ou silico et des études vivo de sécurité avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre d’animaux prévu par étude est de 9 par temps de prélèvement (3 temps envisagés au total par produit de référence/véhicule). Ce choix est dicté par la nécessité de garantir la robustesse des données face à plusieurs sources de variabilité. Par groupe, 5 animaux seront nécessaires pour les analyses biochimiques, analyse de l’activité des gènes et de la synthèse des protéines et 4 pour l'examen des tissus. Ce nombre est nécessaire pour obtenir des résultats robustes pour les analyses complexes ex vivo envisagées et permet de compenser l’hétérogénéité liée à l’injection intra-cérébroventriculaire (diffusion du produit variant d’un sujet à l’autre) et les variabilités interindividuelles. Ainsi le nombre d’échantillons produit permettra d’assurer des données exploitables lors des analyses en laboratoire. Cette approche permettra de détecter avec certitude des signaux d'alerte (biomarqueurs) qui prédisent une toxicité retardée, garantissant ainsi la robustesse de nos conclusions. C’est une approche efficace afin d’atteindre les objectifs de la procédure, générer des données consolidées pour les études ultérieures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint possible. Le choix de ce nombre est basé sur la littérature et sur l’expérience interne (chaque équipe effectuant les analyses ex vivo ayant une bonne connaissance de la variabilité observée chez la souris et spécifique à son type d’analyse). Les études de ce projet permettent la mesure de nombreux paramètres sur un même animal, grâce à différents examens cliniques et paracliniques peu invasifs (observations cliniques, poids) ou terminaux (prélèvement d’organes…) et des cinétiques complètes sur un même animal. Le design expérimental de ce projet est optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. De plus, la sélection préalable des produits de référence qui seront utilisés dans ces études (produit positif induisant des anomalies cérébrales, produite négatif ne présentant pas de toxicité retardée) permet d’explorer dans les meilleures conditions les biomarqueurs prédictifs de toxicité.
Raffinement
Des observations cliniques sont réalisées chaque jour. Le jour de la chirurgie, l’ensemble des animaux sera suivi grâce à une grille de scoring comportemental effectué 1h/3h et 24h (si applicable) post-opératoire. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et les équipes en charge des animaux. Selon les signes cliniques observés, une prescription de soins ou une euthanasie peut être mise en place, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude. Cette décision se base sur le score d’une grille éthique de points limites spécifique à l’espèce étudiée et au projet, mise en place dès l’apparition de signes cliniques marqués. L’utilisation des produits de référence dans ce projet ne devrait pas induire de signes cliniques modérés ni marqués sur la durée de l’étude. Cependant, des signes légers ont déjà pu être observés précocement avec ces produits de référence lors des évaluations hebdomadaires comportementales et neuro-locomotrices dédiées. Par mesure de précaution, la grille éthique dédiée à ce projet pourra être utilisée si jugée nécessaire. L’administration par voie ICV est réalisée dans des conditions d’asepsie optimales, sous anesthésie gazeuse avec tapis chauffant, analgésie et anesthésie locale pré, péri et post-opératoire. Les administrations ICV se font de manière séquentielle afin de s’assurer du bon déroulement de la chirurgie et de ne pas inclure l’ensemble des animaux dans la procédure si des signes cliniques venaient à survenir, bien que les produits de référence soient injectés à une dose précédemment évaluée et ne devant pas induire de signes cliniques. Les animaux sont régulièrement manipulés par l’ensemble du personnel technique formé pour permettre un renforcement positif afin de générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Tous les animaux sont hébergés dans des conditions strictes de confinement avec à disposition un enrichissement spécifique (tunnel, éléments de nidification) et manipulés par du personnel formé au bien-être animal. Enfin, dès qu’un acte expérimental nécessite une incision une analgésie est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Ce projet est réalisé chez la souris car : - La souris présente une forte homologie physiologique, comportementale et anatomique avec l’Humain et ainsi une forte valeur translationnelle. - La perte des cellules de Purkinje, qui constitue une toxicité potentielle liée à l’administration d’ASOs dans le système nerveux, a été observée dans cette espèce (et dans l’espèce Primate également) et doit être investiguée afin d’éviter que cet effet indésirable ne survienne chez l’humain en clinique. Les souris utilisées sont des jeunes adultes mâles et correspondent au sexe et à l’âge des animaux utilisés chez lesquels cette toxicité retardée a été observée avec les produits de référence.
Evaluation de la fibrose hépatique par IRM in vivo sur un modèle de souris développant une surcharge ferrique EU1/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
À partir de huit semaines, 30 souris, dont douze nourries d'une alimentation enrichie en fer, sont suivies pendant environ douze mois et pesées toutes les deux semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit cinq examens d'IRM sous anesthésie gazeuse, de deux heures au maximum, précédés d'un jeûne d'une heure, avec un risque d'hypothermie, de sécheresse oculaire et, exceptionnellement, de décès sous anesthésie. Le porteur écrit qu'un passage en clinique exige des preuves obtenues in vivo "sur un modèle animal pertinent tel que la souris". Huit souris seront tuées en cours d'étude pour prélever leur foie, leur cœur, leurs reins et leur rate, les deux couples reproducteurs après quinze mois, et le sort des vingt-deux dernières, âgées de quatorze mois, reste suspendu à un avis vétérinaire, entre maintien en vie et mise à mort.
Objectifs
La surcharge en fer correspond à une accumulation excessive de fer dans l’organisme pouvant avoir différentes origines. Son importance dépend de la cause sous-jacente et de la durée d’évolution sans traitement. Souvent peu symptomatique au début, elle est généralement diagnostiquée tardivement. Le foie est l’un des premiers organes touchés. L’excès de fer peut entraîner des lésions hépatiques progressives, notamment une fibrose hépatique, caractérisée par une accumulation anormale de tissu cicatriciel. L’évaluation de cette fibrose est essentielle pour suivre l’évolution de la maladie et adapter la prise en charge des patients. La biopsie hépatique constitue actuellement l’examen de référence pour évaluer la fibrose. Cependant, elle est invasive, douloureuse et peut souffrir d’un biais d’échantillonnage, le prélèvement n’étant pas toujours représentatif de l’ensemble du foie. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) permet d’obtenir des informations anatomiques, structurelles, fonctionnelles et biomécaniques sur les tissus. Parmi les techniques disponibles, l’élastographie par résonance magnétique (ERM) fournit une cartographie non invasive de la rigidité hépatique, paramètre étroitement lié au degré de fibrose. Toutefois, la présence d’une forte concentration de fer dans le foie constitue une limite importante de cette technique. Le taux d’échec de l’ERM augmente avec la quantité de fer présente, rendant difficile, voire impossible, l’évaluation de la fibrose chez les patients souffrant de surcharge ferrique. L’objectif de ce projet est de valider une méthode d’imagerie alternative (ERM-alt), développée au sein du laboratoire, permettant d’évaluer la fibrose hépatique même en présence de fer. La faisabilité de cette approche a déjà été démontrée sur des objets tests puis in vivo chez des souris saines. Il est désormais nécessaire de la valider chez des souris présentant différents niveaux de surcharge ferrique afin de confirmer sa robustesse et d’envisager son transfert vers la clinique. Ce projet porte ainsi sur la validation expérimentale d’une méthode innovante destinée à améliorer le diagnostic non invasif de la fibrose hépatique chez les patients atteints de surcharge en fer.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche translationnelle permettra : 1. De comparer les teneurs en fera quantité de fer dans le foie hépatique mesurées par IRM avec les valeurs histologiques (technique de référence) sur des cohortes de souris malades. 2. De comparer laes rigidité du foies hépatiques mesurées par IRM avec les stadifications stade de fibrose hépatiqueréalisées par obtenue par analyse histologiquee sur des cohortes de souris malades. 3. De déterminer les seuils de fer hépatique compatibles avec les techniques IRM et dDe montrer que la technique IRM (ERM-alt) développée au laboratoire permet de surmonter les problèmes limitations de la méthode classiquesoulevés par la présence importante de fer. Les résultats positifs sur souris serviront alors de base pour une étude clinique chez l’humain sur sujets sains dans un premier temps puis sur patients souffrant de surcharge ferrique. La méthode proposée sera et ainsi offrir clé pour pouvoir faire une solution non-invasive pour stadifier la stadification non-invasive de la fibrose hépatique chez ces patients, ce qui n’est pas possible aujourd’hui évitant ainsi une biopsie du foie.
Procédures
Un groupe recevra une alimentation enrichie en fer pendant environ 12 mois, tandis que l’autre groupe suivra une alimentation standard. À partir de l’âge de 8 semaines, les souris seront suivies pendant environ 12 mois. Elles seront pesées toutes les deux semaines afin de vérifier leur état de santé et le bon suivi du régime alimentaire. Les animaux seront soumis à 5 examens. Chaque examen durera au maximum 2 heures et sera réalisé sous anesthésie générale gazeuse. Avant chaque examen d’IRM, les animaux seront soumis à un jeûne d’environ 1 heure afin de standardiser les conditions d’imagerie.
Impact sur les animaux
Certaines souris auront une modification génétique entraînant une accumulation progressive de fer dans l’organisme. Un groupe de 12 souris recevra une alimentation enrichie en fer afin d’augmenter cette accumulation au niveau du foie, ce qui devrait entraîner des modifications modérées de la rigidité du foie correspondant à un stade précoce de fibrose. Le retour à une alimentation standard devrait permettre une réduction du niveau de fer hépatique et une régression de la fibrose. Les animaux seront âgés de 14 mois à la fin du projet, ce qui pourrait induire des problèmes de santé liés simplement à la vieillesse. Pendant le transport entre l’établissement hébergeur et le laboratoire les animaux peuvent subir un stress temporaire. Pendant l’anesthésie et l’examen d’IRM, les animaux peuvent présenter une baisse de la température corporelle et une sécheresse oculaire. Les examens seront répétés plusieurs fois au cours de l’étude, ce qui peut entraîner un stress modéré supplémentaire lié aux manipulations répétées. Comme pour toute procédure réalisée sous anesthésie, un risque très faible de décès pendant l’examen existe, bien que cela reste exceptionnel au regard de notre précédente expérience d’imagerie chez des souris saines.
Devenir
Huit animaux seront euthanasiés au cours de l’étude afin de prélever certains organes (foie, cœur, reins et rate) nécessaires à la réalisation d’analyses histologiques permettant d’évaluer l’accumulation de fer et les lésions hépatiques. Les deux couples reproducteurs utilisés pour la constitution de la colonie seront également euthanasiés à l’issue de la période de reproduction, soit environ 15 mois après le début du projet. Les 22 autres animaux (8 du groupe 1, 8 du groupe 2 et 6 du groupe 3) auront environ 14 mois à la fin de l’étude. Leur devenir sera évalué en concertation avec la structure chargée du bien-être animal (SBEA) et le vétérinaire référent de l’établissement. En fonction de leur état de santé et de leur âge, ils pourront soit être maintenus en vie pour d’éventuels projets compatibles, soit être euthanasiés conformément à la réglementation en vigueur.
Remplacement
De plus, pour pouvoir passer à une étude clinique, il est demandé des preuves de l’applicabilité de la méthode IRM développée (ERM-alt) in vivo sur un modèle animal pertinent tel que la souris.La fibrose hépatique est une maladie complexe qui se développe sur plusieurs années. Elle implique des interactions entre différentes cellules et une organisation très précise du tissu hépatique. Aujourd’hui, avec les technologies disponibles (comme les cultures de cellules ou les organoïdes en laboratoire), il est impossible de reproduire fidèlement tous ces mécanismes. Comme cette étude vise à valider une nouvelle méthode d’imagerie médicale par IRM pour évaluer la fibrose du foie, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux, comme la souris, car ils permettent de reproduire les processus biologiques réels de la maladie. Enfin, avant de tester cette méthode sur l’humain, il faut d’abord prouver son efficacité et sa faisabilité in vivo, ce qui n’est possible qu’avec des modèles animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum au maximum pour chaque groupe sans compromettre l'interprétation des résultats suite à une analyse robuste des résultats par des tests statistiques non paramétriquespour garantir des résultats fiables en termes de significativité statistique. Cette estimation tient compte des prélèvements d’organes réalisés à des fins depour les biopsies et d’une éventuelle mortalité au cours du protocole. Cela permet de garantir que les objectifs scientifiques pourront être atteints sans avoir recours à des animaux supplémentaires ni d’interrompre l’étude en cours faute d’animaux en nombre suffisant. Le groupe contrôle (G3) est également constitué du stricte minimum (3 mâles et 3 femelles) permettant de comparer les résultats entre les groupes tout en respectant les différences liées au sexe.d’avoir des résultats comparatifs avec les groupes 1 et 2 en fonction du sexe. Enfin, pour éviter d’utiliser davantage d’animaux, les mêmes animaux seront suivis au cours du temps. Cela permet de suivre l’évolution de la maladie, sans avoir besoin d’une quantité élevée d’animaux.
Raffinement
Les souris du groupe 1 auront une alimentation riche en fer pour qu’elles développent une surcharge de fer dans le foie. Cette solution permet d’obtenir le modèle expérimental sans nécessité d’acte invasif. Les examens IRM seront réalisés sous anesthésie générale (gazeuse par isoflurane) et pourront durer jusqu’à 2 heures. Une goutte d’Ocrygel sera instillée dans chaque œil juste après l’installation de l’animal sur le lit IRM afin de limiter le dessèchement oculaire. Une couverture chauffante sera utilisée pour maintenir la température de l’animal tout le long de l’examen. Cette température ainsi que la respiration de la souris seront suivies pendant toute la durée de l’examen. L'apport en isoflurane sera couplé à un concentrateur d'oxygène pour favoriser la respiration de l'animal et sa récupération au réveil. En fin de procédure, si l'animal a été anesthésié plus de 2 heures, il recevra une injection sous cutanée de 0,5mL de sérum glucosé chauffé à température corporelle pour recevoir une réhydratation rapide et éviter une possible hypoglycémie. La phase de réveil se fera en isolement dans une cage à part, l’animal sera déposé sur un tapis chauffant évitant une hypothermie. Des points limites prédictifs et spécifiques de ce projet ont été établis afin d'anticiper tout effet dommageable sur les animaux, avec une surveillance adaptée à chaque étape de la procédure jusqu’à la mise à mort des animaux en fin de procédure.
Choix des espèces
Les modèles de souris restent accessiblessont et compatibles bien adaptées à une analyse surpour la recherche dans le domaine de l l’imagerie’IRM préclinique, notamment en IRM, à haut champ magnétique de 7T (plusieurs papiers références) . Les techniques IRM mise en œuvre dans cette demande de projet sont couramment pratiquées au sein du laboratoire sur des souris saines. La proximité génétique entre les souris et l’homme permet d’étudier des mécanismes biologiques comparables. L’utilisation de souris génétiquement modifiées déficientes en hepcidine1 permettra de se rapprocher au mieux des modifications physiopathologiques observées chez l’homme dans le cadre de pathologies caractérisées par une accumulation excessive de fer dans le foie (hémochromatose) pouvant mener à la formation de tissus cicatriciel au niveau du foie (fibrose hépatique). car elles présentent des similitudes biologiques avec l’homme, ce qui permet d’étudier des maladies du foie proches de celles observées chez les patients, notamment l’accumulation excessive de fer (hémochromatose) et le développement d’une fibrose hépatique Les souris des trois groupes suivront le protocole d’imagerie IRM à partir de 8 semaines afin de s’assurer que le système immunitaire soit mature et que le foie ait également atteint une rigidité stabiliséeLes examens d’IRM commenceront lorsque les souris auront 8 semaines. À cet âge, leur organisme est suffisamment développé et le foie a atteint un état stable (démontrée lors d’une étude antérieure sur une petite cohorte). Pour le groupe recevant une alimentation riche en fer, ce régime débutera également à partir de la 8ᵉ semaine afin de coïncider avec le début du suivi par IRM. Le suivi par imagerie durera 12 mois afin d’observer progressivement différents niveaux d’accumulation de fer dans le foie selon les groupes étudiés, ainsi que les premiers stades de fibrose hépatique, sans provoquer d’atteintes sévères chez les animaux.
Étude chez la souris de l’influence conjointe des variants du gène de l’apolipoprotéine E, du sexe et d’une alimentation riche en graisses sur des changements biologiques liés à la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trois tests comportementaux répétés deux fois, un prélèvement sanguin précédé d'un jeûne de trois heures et huit pesées hebdomadaires : 144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour prélever leur sang et leurs structures cérébrales. Une partie d'entre elles reçoit un régime riche en graisses, avec une prise de poids attendue sous les 30 %, pour observer comment l'alimentation et les variants du gène de l'apolipoprotéine E modifient les membranes des cellules du cerveau. Le porteur affirme que l'étude de l'impact des régimes alimentaires sur le cerveau ne peut s'effectuer que sur un "organisme entier" et écrit que cette étude in vivo est "indispensable et irremplaçable". Il annonce trois tests comportementaux qu'il décrit comme indolores, sans préciser lesquels, tout en signalant un stress de manipulation lors de deux d'entre eux.
Objectifs
Les cellules de notre cerveau sont entourées d’une membrane composée de graisses nécessaires pour leur permettre de fonctionner correctement. Mais avec l'âge, sous l’influence d’une mauvaise alimentation ou de certains gènes, la composition en graisses des membranes devient déséquilibrée, occasionnant des dommages pouvant déclencher (bien avant l'apparition des premiers symptômes) une cascade de problèmes et d’anomalies menant à la mort des neurones et à la maladie d’Alzheimer (MA). Notre projet veut élucider, chez les individus de sexe masculin ou féminin, comment l’alimentation riche en graisses et certains gènes (dont un qui est un facteur de risque majeur) perturbent le fonctionnement des cellules nerveuses et favorisent la production de produits hautement neurotoxiques capables d’initier les lésions cérébrales liées à la MA. Notre objectif est de comprendre comment un régime alimentaire trop gras peut perturber les membranes des cellules du cerveau et favoriser les troubles liés à la MA, dans le but ultime de proposer de nouvelles stratégies de prévention.
Bénéfices attendus
Ce projet doit créer des modèles fiables pour étudier l’influence de la génétique, de régimes gras et du sexe sur l’apparition de la maladie d’Alzheimer, dans le but de découvrir des marqueurs biologiques pour identifier les personnes à risque et leur proposer une prévention appropriée.
Procédures
1. Tests comportementaux indolores (3, réalisés 2 fois), d’une durée de 10 à 15 minutes par test 2. Prélèvement unique d’un très faible volume sanguin, d’une durée inférieure à 30 sec 3. Mesure du poids corporel (hebdomadaire sur 8 semaines), d’une durée maximale de 1 min par pesée
Impact sur les animaux
- Stress légers de manipulation et de situation induits lors de deux des trois tests comportementaux - Un jeûne de 3 h préalable au prélèvement sanguin - Stress léger de manipulation lors de la pesée hebdomadaire - Une prise de poids (attendue à moins de 30 %) des animaux sous régime gras
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie à l’issue de l'étude afin de prélever le sang et les structures cérébrales requises pour l’analyse des marqueurs biologiques d’intérêt.
Remplacement
L'étude de l’impact de régimes alimentaires sur le cerveau ne peut s'effectuer que sur un organisme entier. Cette étude in vivo est indispensable et irremplaçable, mais elle s'appuie sur une étude préalable menée sur des cellules en culture et dont les résultats permettent de limiter au strict minimum le nombre d’expérimentations animales.
Réduction
Nous avons minimisé les effectifs de souris en nous appuyant sur l’expérience cumulée par l’équipe lors de diverses études conduites lors des 15 dernières années. Les simulations opérées pour réduire les effectifs au strict nécessaire recommandent un minimum de 9 souris par groupe expérimental, sachant qu’il est indispensable d’évaluer l’impact du sexe. À ceux-ci s’ajoutent 5 animaux par groupe pour les études des tissus cérébraux et 4 animaux par groupe pour l’étude des lipides cérébraux à la moitié du régime.
Raffinement
Toutes les étapes du protocole seront assurées par des expérimentateurs qualifiés et en parfaite maîtrise des gestes techniques et dans le respect scrupuleux des réglementations en vigueur. Les animaux seront hébergés dans des espaces conçus pour minimiser le stress. Ils seront surveillés quotidiennement pour vérifier leur état de santé et détecter d’éventuels signes de détresse (par exemple la posture, l’activité et le poids). Tous les prélèvements seront menés sous anesthésie et les tests sont courts et sans douleur.
Choix des espèces
Ce projet utilise des souris adultes mâles et femelles, couramment utilisées pour la sensibilité aux régimes gras qui en fait de bons modèles afin d’étudier comment la génétique et l’alimentation peuvent augmenter le risque de maladie d'Alzheimer.
Immunotherapie intranasale pour le traitement de l’allergie alimentaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Deux injections à une semaine d'intervalle sur souris vigiles pour installer une allergie à l'ovalbumine, puis jusqu'à cinq administrations orales, jusqu'à six administrations intranasales sous anesthésie générale et jusqu'à trois prises de sang. 930 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les réactions allergiques provoquées comprennent des diarrhées, une baisse de la température corporelle et une perte de poids, plus rarement des difficultés respiratoires et des signes de choc anaphylactique, et que la température et les diarrhées servent de points limites déclenchant la mise à mort. Toutes sont tuées pour récupérer la rate, les ganglions, le tissu nasal et l'intestin.
Objectifs
Les allergies alimentaires touchent 6 à 8 % des enfants et 2 à 4 % des adultes. Elles se caractérisent par des symptômes gastro-intestinaux, cutanés, respiratoires et cardiovasculaires, pouvant conduire à un choc anaphylactique. Si l’absence stricte et contraignante de l'aliment incriminé est la première approche utilisée, l'immunothérapie spécifique de l'allergène gagne en intérêt, mais se heurte toujours à un manque de protection durable et à des effets secondaires sévères. Utilisant le modèle de l’allergie alimentaire à l’ovalbumine, la principale protéine du blanc d'œuf, le projet vise à évaluer l’effet thérapeutique d’un traitement intranasal par une ovalbumine modifiée pour désensibiliser l'organisme et réduire les réactions allergiques. Pour ce projet, une allergie alimentaire à l’ovalbumine sera induite chez la souris selon un protocole défini mimant ce qui se passe chez l’homme. Puis, l’effet d’un traitement avec de l’ovalbumine modifiée administrée par voie intranasale sera analysé.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de démontrer l'efficacité thérapeutique de l'administration intranasale de notre protéine de fusion dans le traitement de l'allergie alimentaire à l'ovalbumine, composante du blanc d’oeuf. Si cette approche s'avère efficace, elle pourrait représenter une avancée majeure dans la prise en charge des allergies alimentaires en général, qui, à l'heure actuelle, offrent peu d'options thérapeutiques durables et souvent insatisfaisantes pour les patients. L’administration intranasale se distingue par son caractère non invasif, ce qui en ferait une alternative potentiellement plus sûre et plus confortable que les traitements actuels. Les résultats attendus pourraient poser les bases d'essais cliniques pour valider cette approche chez l’homme, ouvrant la voie à de nouvelles thérapies pour les patients allergiques.
Procédures
- Injections pendant 10 secondes, effectuées 2 fois à 1 semaines d’intervalle sur souris vigile. - Administration intranasale sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée 6 fois maximum (1/jour). - Administration orale sur souris vigile pendant 2 minutes, effectuée 5 fois maximum (1/jour tous les 2 jours). - Prélèvement de sang effectué 3 fois maximum sur souris vigile pendant 30 secondes, ou effectué 1 seule fois sous anesthésie générale pendant 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les interventions prévues dans le cadre de ce projet peuvent entraîner un stress et quelques effets indésirables. Les injections et administrations orales et intranasales peuvent causer des douleurs légères ou des inconforts localisés et de courte durée (quelques secondes à quelques minutes). Les réactions allergiques incluent des diarrhées, la diminution de température corporelle, la perte de poids, et plus rarement des difficultés respiratoires et des signes de choc anaphylactique dans les cas les plus graves.
Devenir
Les souris sont mises à mort pour récupération de différents organes nécessaires pour répondre à la question scientifique
Remplacement
Des tests cellulaires appropriés seront utilisés pour analyser le mécanisme d'action et l'impact de notre protéine sur les réponses immunitaires. Cependant, ces approches ne peuvent remplacer les expérimentations sur animal vigile, car elles ne reproduisent pas fidèlement la dynamique et la complexité des réactions allergiques. L'expérimentation animale est indispensable pour évaluer sur le vivant l'efficacité thérapeutique des stratégies proposées sur le traitement de l'allergie alimentaire et comprendre les mécanismes immunitaires de la maladie et de l’effet thérapeutique observé dans leur globalité.
Réduction
Le nombre de souris utilisées sera minimisé tout en assurant une analyse statistique fiable des résultats. Pour chaque souris, plusieurs organes seront collectés, notamment la rate, les ganglions, le tissu nasal et l'intestin, afin de maximiser les données recueillies. Aussi, afin de diminuer le nombre de souris utilisé, le protocole donnant le meilleur effet thérapeutique sera déterminé avant de lancer de nouvelles expériences pour comprendre les mécanismes responsables de l’effet thérapeutique.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus (groupes sociaux) dans un environnement enrichi. Pour minimiser le stress, la douleur et l'inconfort des animaux, toutes les manipulations seront effectuées rapidement (quelques minutes) et par des opérateurs expérimentés. Des points limites adaptés ont été établis (notamment la mesure de température, l'observation de diarrhées) permettant de mettre à mort l'animal en cas de signes de souffrance ou de développement d'une réaction allergique trop sévère. Une anesthésie générale de courte durée (quelques minutes) est réalisée pour réduire la douleur de certains gestes.
Choix des espèces
La souris est un modèle largement utilisé pour l’étude des allergies alimentaires en raison de sa pertinence biologique, de la disponibilité d’outils expérimentaux adaptés et de l’abondante littérature existante. Les mécanismes immunitaires impliqués dans les réponses allergiques sont largement conservés entre la souris et l’homme, ce qui rend ce modèle particulièrement approprié pour étudier l’allergie alimentaire et évaluer l’efficacité nouvelles thérapies. Les expériences seront réalisées chez des souris adultes, à partir de 10 semaines d’âge afin que les souris aient un système immunitaire mature.