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Etude de l’effet d’une supplémentation alimentaire en glycérides d’acide laurique (GLA) sur la vaccination contre le virus du Syndrome Dysgénésique et Respiratoire Porcin (SDRP) chez le porcelet
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Les porcelets qui présenteront des signes cliniques graves seront tués par anesthésie profonde suivie d'une saignée. 34 porcelets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun subissant dix-sept prises de sang à l'état vigile, tous tués à l'issue pour chercher des lésions et quantifier le virus dans leurs tissus. Vingt-quatre sont vaccinés, et le virus du syndrome dysgénésique et respiratoire porcin est inoculé par le nez à trente porcelets selon la description des procédures, alors que le total déclaré est de trente-quatre, ce qui doit provoquer selon le porteur deux à trois jours de fièvre, de baisse d'activité et d'appétit. L'objet est de savoir si un complément alimentaire, des glycérides d'acide laurique, améliore la réponse au vaccin, contre une maladie que le porteur présente d'abord par son "fort impact économique pour la filière porcine".
Objectifs
Le Syndrome Dysgénésique et Respiratoire Porcin (SDRP) est une maladie virale spécifique des porcins, à fort impact économique pour la filière porcine. L’infection par le virus du SDRP (SDRPV) induit des troubles de la reproduction chez les femelles gestantes et des problèmes respiratoires et retards de croissance chez les porcelets. En raison de son caractère immunodépresseur, ce virus favorise les infections avec d'autres virus et bactéries au niveau respiratoire chez les porcs en croissance, ce qui se traduit par une augmentation de l'utilisation des antibiotiques dommageable à la santé des animaux et des humains. Le SDRP est une maladie à distribution mondiale qui est particulièrement présente dans les zones à forte densité de production porcine. Ainsi, cette infection est présente dans plus de 60% des élevages de porcs en Bretagne. La vaccination à l’aide de vaccins vivants atténués (MLV) est un outil fréquemment utilisé en élevage pour lutter contre le SDRP. Cependant ces vaccins présentent une efficacité partielle qu’il convient d’améliorer. L'acide laurique est un acide gras à chaîne moyenne dont on a démontré qu'il possédait des propriétés antimicrobiennes et antivirales. Certains composés issus de cette molécule, dont les glycérides d'acide laurique ou GLA, ont la particularité de renforcer son activité biologique. Ainsi, une supplémentation de l’aliment avec des GLA a montré un effet immuno-stimulant lors de la vaccination contre la maladie du Gumboro (bursite infectieuse, maladie immunosuppressive) chez le poulet. Par ailleurs des études récentes ont montré que les GLA ont également un effet antiviral et immuno-stimulant chez les porcs infectés par le virus du SDRP. Dans ce contexte l’objectif de ce projet est d’évaluer si une supplémentation en GLA chez le porcelet peut permettre d’améliorer la réponse immunitaire, l’efficacité vaccinale et le contrôle du virus du SDRP.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre d’améliorer l’efficacité de la vaccination et le contrôle du SDRP en élevage de porcs grâce à une supplémentation en glycérides d’acide laurique. De façon plus globale, ce projet permettra de mieux comprendre l’effet d’une supplémentation en GLA sur le système immunitaire des porcs et sur leur réponse à une vaccination ainsi qu’à une épreuve virale.
Procédures
Les animaux des groupes vaccinés (n=24) seront immunisés à J0 par voie intramusculaire. Cette vaccination prend moins de 30 secondes par animal. Tous les animaux de l’étude (n=30) recevront à J28 du virus du SDRP par voie intranasale ; une inoculation intranasale prend moins de 30 secondes par animal. Les animaux des groupes vaccinés (n=24 puis n=20 à partir de J28) et non vaccinés (n=10) seront soumis à 17 prises de sang sur animal vigile ; ces prélèvements ne durent que quelques dizaines de secondes.
Impact sur les animaux
Lors de la vaccination (voie intramusculaire), les animaux subiront (i) un stress dû à la contention (ce stress sera d’environ 30 secondes et son intensité est estimée comme légère) et (ii) une douleur liée à l’injection vaccinale (cette douleur sera d’intensité légère et de courte durée). Lors de l’inoculation intranasale par le virus du SDRP, les animaux subiront un stress dû à la contention. Ce stress sera d’environ 30 secondes et son intensité est estimée comme légère. Suite au challenge par le virus sauvage du SDRP (souche de faible virulence), les animaux développeront une maladie d’intensité légère (fièvre modérée, légère diminution d’activité et d’appétit) qui durera 2 à 3 jours. Lors des prélèvements sanguin, les animaux subiront (i) un stress dû à la contention (ce stress sera d’environ 30 secondes et son intensité est estimée comme légère) et (ii) une douleur liée au prélèvement (cette douleur sera d’intensité légère et de courte durée).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d’évaluer la présence de lésions induites par l’infection SDRPV et de quantifier le virus présent dans différents tissus prélevés lors de l’examen nécroscopique.
Remplacement
Il existe des modèles d’infection in vitro ou bien ex vivo (cultures cellulaires par ex.) pour le virus du SDRP. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’évaluer la réponse immunitaire post-vaccinale ou bien l’efficacité vaccinale. Ainsi le recours au modèle animal est indispensable et dans la mesure où seuls les suidés sont sensibles à l’infection par le SDRPV, le modèle porc reste obligatoire.
Réduction
Tous les lots comporteront 10 à 12 animaux chacun de façon à avoir une puissance statistique suffisante. L'effectif par groupe a été déterminé par calcul statistique.
Raffinement
Les animaux seront élevés en groupes stables au cours de toute la durée du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Les porcs auront à leur disposition des matériaux manipulables (mordilles, boules en matière plastique, tourniquets et tubes à relever et à abaisser) qui seront renouvelés au cours de l’expérimentation. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine sera distribuée aux animaux. Si les animaux manifestent des signes cliniques graves (atteinte d’un point limite), ils seront mis à mort (par anesthésie profonde suivie d'une saignée) après concertation avec les personnes responsables de la mise en œuvre du projet.
Choix des espèces
Le porc est l’espèce cible du SDRPV. Le virus étant spécifique de cette espèce, il n’est pas possible d’utiliser un autre modèle animal. En effet il n’existe pas d’autre modèle animal (ex : modèle murin) sur lequel le virus du SDRP a été adapté. A 3 semaines d’âge, les animaux seront sevrés et transférés dans nos installations. Les animaux du groupe VAC sup recevront la supplémentation en GLA pendant une dizaine de jours avant la vaccination qui aura lieu au début de leur 5ème semaine de vie ; âge auquel les porcelets sont habituellement vaccinés contre le SDRP en élevage.
Effets de différents traitements dans des modèles murins de mort subite et inattendue en épilepsie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une stimulation sonore de soixante secondes au maximum, appliquée une fois à chaque souris pour déclencher une crise convulsive qui peut la tuer : 3 168 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les survivantes étant tuées à la fin pour prélever leurs organes. Certaines reçoivent une substance une seule fois, d'autres deux fois, et 576 jusqu'à vingt-huit fois, à raison de deux administrations par jour pendant quatorze jours. L'objet déclaré est de tester des traitements contre la mort subite inattendue en épilepsie, faute de traitement spécifique existant, en cherchant une dose efficace puis une éventuelle synergie entre deux molécules. Ces souris appartiennent à des souches sensibles aux crises audiogènes et sont testées vers le vingt-et-unième jour après la naissance, âge auquel le porteur indique que les crises létales sont les plus fréquentes, et jusque-là hébergées avec leur mère et leur portée.
Objectifs
La mort subite inattendue en épilepsie (SUDEP) est une cause de décès importante, dont l’incidence est évaluée autour de 1 cas pour 1000 patients épileptiques. Plusieurs hypothèses ont été émises sur les causes de cette mortalité : une anomalie du rythme cardiaque, secondaire à une crise généralisée, un arrêt respiratoire, ou encore une dépression générale des activités électriques cérébrales. Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de traitements contre les crises épileptiques provoquant une SUDEP. Pour cela, nous allons utiliser un modèle animal de crises audiogènes où une crise tonique pouvant provoquer la mort est induite par un stimulus audio. Ce modèle est reconnu comme un modèle de SUDEP. Nous proposons ici de tester plusieurs types de traitements : traitement aigu d’une substance (afin de définir la dose efficace pour prévenir des crises et de la mortalité, ainsi que pour définir le temps d’activité de la molécule), traitement répété d’une substance (afin d’évaluer si une exposition prolongée à une substance permet une meilleure protection contre les crises létales), et enfin un traitement associant 2 molécules (afin de définir une possible synergie entre ces molécules).
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’évaluer l’efficacité de différents traitements contre le SUDEP à l’aide d’un modèle murin validé par la littérature. Il n’existe pas de traitement spécifique au SUDEP, ces travaux permettront d’évaluer le potentiel des substances évaluées et de leur association contre cette mortalité.
Procédures
Les animaux seront administrés vigiles: une fois pour 1728 animaux, deux fois pour 864 animaux, et au maximum 28 fois (si 2 fois/jour pendant 14 jours) pour 576 animaux. Tous les animaux seront exposés une fois à une stimulation audio (max 60s) induisant des crises audiogènes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont la survenue de crises létales et non létales à la suite de la stimulation audio et un stress du aux administrations de substance.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes, pour compléter cette étude.
Remplacement
Les méthodes expérimentales in vitro ne reproduisent pas l’ensemble des propriétés des crises d'épilepsie survenant dans un cerveau entier. De plus, la modélisation in silico nécessite des données expérimentales encore insuffisantes pour produire des données applicables chez l’humain.
Réduction
Nous ferons une planification rigoureuse des expériences, en réalisant d’abord des études sur chaque molécule administrée seule pour mieux les caractériser avant d’évaluer l’intérêt d’une administration répété ou de l’association de 2 molécules. De plus, selon les résultats des substances testés lors de la première partie du projet, nous ne retesterons que celles aux résultats positifs pour la 2ème partie. L’utilisation d’un modèle murin déjà validé comme modèle de SUDEP nous permet de ne pas passer par une procédure de validation du modèle. Le calcul du nombre d'animaux est fait selon une approche statistique, sur la base de la variabilité du comportement des souris modèles de SUDEP qui est décrite dans la littérature, nous estimons qu’il nous faut au minimum 12 animaux par groupe pour pouvoir évaluer leur phénotype épileptique. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous n’utiliserons pour chaque procédure que la moitié des animaux administrés par un contrôle véhicule.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec leur mère et leurs congénères de même portée jusqu’à l’expérimentation à P21 ou jusqu’à leur sevrage à P21. Ils seront ainsi hébergés dans des conditions environnementales répondant à leurs besoins, avec un enrichissement adapté (papier tork ou frisure de carton). Les animaux seront manipulés par du personnel expérimenté afin de réduire le stress global. La stimulation audio induisant les crises est limitée à une par animal et pendant 60s maximum.
Choix des espèces
L’espèce que nous avons choisie (souches de souris sensibles aux crises audiogènes) est le modèle animal décrit dans la littérature comme reproduisant au mieux le SUDEP. Les animaux seront principalement testés vers le jour postnatal 21, où les crises audiogènes létales sont les plus fréquentes selon la littérature et selon nos précédents travaux internes.
Développement de nouveaux outils biométrologiques pour l’évaluation des expositions professionnelles aux PFAS
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Modéliser la distribution et l'élimination de mélanges de PFAS dans l'organisme, pour choisir quels prélèvements pratiquer chez des travailleurs exposés : 60 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes. Ils reçoivent une dose orale unique par gavage, sont tondus deux fois, subissent dix prélèvements sanguins sous anesthésie locale et passent 72 heures consécutives en cage à métabolisme, puis cinq séjours de 24 heures répartis sur les 60 jours du protocole. Le porteur désigne la cage à métabolisme comme la plus grande source d'inconfort après exposition, et écrit ne pas attendre que la quantité de PFAS administrée ait une "incidence majeure sur le bien-être des animaux". Le rat est retenu parce que la ligne directrice 417 de l'OCDE le préconise, le porteur indiquant qu'il est "utilisé de manière quasi exclusive dans les études toxicologiques".
Objectifs
Les composés perfluoroalkylés et polyfluoralkylés, connus sous le nom de PFAS (ou encore « polluants éternels »), représentent une famille de composés chimiques regroupant plusieurs milliers de molécules produits par l’activité humaine. En raison des multiples liaisons carbone-fluor qui les caractérisent, les PFAS sont très stables et dotés de propriétés physico-chimiques intéressantes pour de nombreuses applications. Ils sont largement utilisés dans l’industrie pour leurs propriétés imperméables, antiadhésives et de résistance à la chaleur. À ce jour, plus de 200 applications ont été recensées pour environ 1 700 composés (fartage, cosmétiques, textiles, ustensiles de cuisine, semi-conducteurs, plastiques, batteries, dispositifs médicaux, peintures, emballages, mousse anti-incendie, pesticides, encres…). Leur persistance dans l’environnement suscite des inquiétudes quant à leur impact potentiel sur la santé humaine et les écosystèmes, ce qui fait des PFAS une préoccupation majeure en termes de pollution chimique.
Bénéfices attendus
L'étude vise à modéliser la distribution et l'élimination dans l'organisme (toxicocinétique) de mélanges de PFAS pour optimiser les stratégies de prélèvement en milieu professionnel et identifier les matrices biologiques les plus pertinentes. Elle cherche également à repérer des métabolites (exogènes et endogènes) pouvant servir de marqueurs biologiques d'exposition ou d'effets précoces liés aux poly-expositions.
Procédures
Les animaux recevront une seule fois par voie orale les produits chimiques étudiés ou le véhicule (huile végétale). Ils seront tondus 2 fois (avant l’administration orale et à la fin de l’expérimentation) afin de récupérer leurs poils. Cette opération sera réalisée par 2 opérateurs et n’excèdera pas 2 min. L’administration orale par gavage des substances se fera chez l’animal vigile et demandera une contention inférieure à 1 min. Les animaux seront placés en cage à métabolisme permettant le recueil de l’urine pendant 72 h au début de l’expérimentation et pendant 5 périodes de 24 h réparties sur la durée du projet (60 jours). Dix prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie locale, chaque prélèvement nécessitant une contention de l’animal de quelques minutes. En fin d’expérimentation, les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et d’échantillons biologiques.
Impact sur les animaux
L’administration par voie orale ainsi que les prélèvements sanguins à la veine de la queue entrainent un stress physique mineur de courte durée. Le placement en cage à métabolisme (maximum 72 h consécutives) constituera la plus grande source d’inconfort post-exposition. Il n’est pas attendu que la quantité de produits administrée ait une incidence majeure sur le bien-être des animaux.
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort en fin d’expérimentation afin de prélever différents organes et échantillons biologiques.
Remplacement
À ce jour, en l’absence de connaissances suffisantes, il est nécessaire d’utiliser des animaux de laboratoire pour étudier la biodistribution et l’excrétion de mélanges de PFAS. L'étude vise à modéliser la toxicocinétique de mélanges de PFAS pour optimiser les stratégies de prélèvement en milieu professionnel et identifier les matrices biologiques les plus pertinentes. Elle cherche également à repérer des métabolites (exogènes et endogènes) pouvant servir de biomarqueurs d'exposition ou d'effets précoces liés aux poly-expositions.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum nécessaire pour pouvoir interpréter les résultats obtenus. En l’absence de données de toxicocinétique pour la majorité des substances testées, des animaux des 2 sexes seront utilisés. En se basant sur la ligne directrice 417 de l’OCDE relative à la conduite des études de toxicocinétique, un minimum 4 animaux de même sexe doivent être utilisés.
Raffinement
Après une semaine d’acclimatation à l’animalerie, une technique de manipulation positive dite de « tickling » sera mise en place. Cette méthode consiste à reproduire, par des stimulations tactiles douces et répétées, les comportements de jeux sociaux entre jeunes rats. L’efficacité du tickling sera contrôlée par l’émission de vocalisation sonores mesurables associées à des états émotionnels positifs. Il sera ensuite pratiqué avant chaque manipulation des animaux pendant toute la durée du projet. Les animaux seront habitués progressivement à la préhension/contention avant le début des expérimentations afin de limiter le stress lié à ces manipulations. Tout au long de la procédure, les animaux seront placés en groupe et de manière hebdomadaire dans une aire de jeu comportant différents enrichissements (tunnels, abris, éléments d’exploration). Cet environnement favorisant les interactions sociales, stimule l’activité exploratoire naturelle et contribue à réduire le stress lié à l’hébergement et aux manipulations expérimentales, améliorant ainsi le bien-être général des animaux. La semaine précédant l’administration orale, les animaux seront habitués en introduisant la canule de gavage vide dans l’œsophage. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel formé, une attention toute particulière sera portée au moment du gavage et des prélèvements sanguins.
Choix des espèces
Actuellement, peu de données toxicocinétiques sont disponibles pour les PFAS. Dans ce cas, le rat est l’espèce préconisée par la ligne directrice 417 de l’OCDE car utilisé de manière quasi exclusive dans les études toxicologiques. Des rats femelles et mâles âgés de 12 à 14 semaines au moment de l’administration orale seront utilisés, ce qui correspond à un stade adulte de développement.
Administration de substances interdites par les codes des courses dans le cadre du contrôle antidopage des chevaux et prélèvements.
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
Des stéroïdes anabolisants, des substances agissant sur la production de globules rouges ou des facteurs de croissance seront administrés à 10 chevaux, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, pour vérifier qu'un laboratoire accrédité sait détecter les substances interdites par le code des courses. Chacun subit des prélèvements sanguins, urinaires, de crottins et de poils, deux ou trois le premier jour puis un à deux par jour pendant dix à quinze jours, et parfois pendant plusieurs mois. Aucun cheval n'est tué pour ce projet : le champ structuré déclare dix réutilisations, tandis que le porteur écrit qu'ils seront engagés dans d'autres protocoles jusqu'à quinze ans environ avant d'être adoptés, adoption que ce décompte ne fait pas apparaître. Le porteur affirme qu'il est "indispensable d'administrer une substance interdite à un cheval" pour répondre aux exigences du contrôle antidopage, et que les échantillons ainsi obtenus sont "nécessaires" au développement et à la validation de ses méthodes.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de vérifier la détection de l’administration des substances interdites au regard du code des courses (article 6). On appelle substances interdites dans le code des courses (article 6), les substances dont l’usage est strictement interdit aussi bien en course qu’à l’entraînement. Par définition, une substance interdite est une substance appartenant à l’une des familles suivantes : stéroïdes anabolisants, substances agissant sur la synthèse des globules rouges, transporteurs d’oxygène synthétiques, facteurs de croissance, toxines peptidiques, protéines, anticorps et dérivés ou toute substance ayant des propriétés analogues aux substances précitées. La détection de l’administration des substances interdites consiste à identifier la molécule elle-même administrée dans un échantillon biologique, ou à identifier une autre molécule, marqueur de l’administration. Des approches indirectes telles que les approches globales dites « omiques » sont aussi utilisées comme méthodes de screening.
Bénéfices attendus
Il est indispensable d’administrer une substance interdite à un cheval afin de répondre aux exigences du contrôle antidopage des chevaux comme défini dans l’article 6 du code des courses et ainsi de vérifier que le laboratoire est capable de détecter l’administration d’une substance interdite ou de ses métabolites. De plus, le laboratoire est accrédité par le COFRAC sous la norme 17025. Dans ce contexte, les échantillons obtenus après administration de substances interdites sont nécessaires pour : -le développement de nouvelles méthodes -des validations de méthodes (validation de la détection des substances et de l’identification de métabolites) -la préparation éventuelle de contrôles inter laboratoires dans le cadre d’échanges inter-laboratoire. Les échantillons obtenus après administration de substances interdites sont aussi utiles pour valider des dossiers de confirmation (rapport de cas positifs) en l’absence de métabolites disponibles sur le marché.
Procédures
Les animaux sont soumis à des administrations et des prélèvements ( principalement sanguins et urinaires). Avant administration, le protocole comporte le plus souvent un ou deux prélèvements (exceptionnellement 3 ou 4) sanguins, urinaires et éventuellement de phanères et de crottins. S’il s’agit d’administrations répétées, le protocole peut comporter un ou deux prélèvements sanguins ou urinaires/jour pendant les administrations. Après l’administration, le protocole comporte un nombre variable de prélèvements sanguins ou urinaires, 2 ou 3 le premier jour puis un ou deux par jour pendant quelques jours (jusqu’à 10-15 jours). Des prélèvements sont réalisés pendant plusieurs semaines ou mois (rarement plus de six mois) principalement dans le cas d’études omiques. Quand la durée de prélèvements dépasse 20 jours, les prélèvements s’espacent à raison de 1 tous les 10 ou 20 jours. En ce qui concerne les phanères, les prélèvements sont généralement faits une fois tous les deux mois selon le protocole défini au préalable et notamment pour les projets concernant des substances anabolisantes.
Impact sur les animaux
Pas de nuisances ou d’effets indésirables à l’exception de rares réactions cutanées éventuelles.
Devenir
Les chevaux seront engagés dans d’autres protocoles jusqu’à l’âge de 15 ans environ avant d’être adoptés par des propriétaires ou des associations.
Remplacement
Les différents protocoles ne peuvent être réalisés que chez l’animal vivant et sur l’espèce cheval. Dans le cas de cette saisine, il est toutefois possible de réaliser dans certains cas des études in vitro ou in silico préliminaires afin de mettre en évidence certains métabolites de phase I ou de phase II. Dans le cas où les tests in vitro sont possibles, ils sont réalisés mais les résultats obtenus doivent toujours être complétés et/ou vérifiés par une étude in vivo dans l’espèce cible.
Réduction
Le nombre d’animaux impliqués est réduit au maximum. Ces essais sont généralement conduits sur un, deux (dans le cadre d’expérimentation pilote), quatre chevaux voir plus selon l’étude envisagée (étude omique par exemple). Pour certains projets, le nombre de chevaux impliqués peut être réduit en s’associant à d’autres laboratoires européens.
Raffinement
Les chevaux sont quotidiennement surveillés et observés autant que nécessaire pendant la journée en fonction du protocole. Tout éventuel signe d’inconfort est noté afin d’optimiser les tests ultérieurs. Ces chevaux sont tous logés dans le même barn d’un établissement récent et confortable aménagé pour des chevaux de compétition dans le souci de leur bien-être. Les propositions éducatives pendant les sorties au paddock (ou éventuellement aux boxes) sont principalement les suivantes : ballon adapté, bouteille en plastique ou brosse pour grattage. Un pansage est réalisé au moins une fois par jour pendant une durée de 10-15 minutes environ et cela en fonction de la saison et des conditions climatiques. Ces méthodes d’enrichissement suivent les recommandations des stages Medical training équidés suivis par l’équipe.
Choix des espèces
Répondre aux exigences du contrôle anti-dopage des chevaux. Le cheval est l’unique espèce concernée. Les chevaux utilisés sont des chevaux adultes, de 3 ans à 15 ans environ, dont l’âge est similaire à celui des chevaux de compétition (courses et sport).
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Déjà incluses dans d'autres études, dont l'une comporte des interventions chirurgicales, 38 brebis gestantes sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Quatorze seront tuées à l'issue, mise à mort que le porteur rattache au protocole de l'autre étude et non au sien, et vingt-quatre seront placées à l'adoption. Chacune passe deux à cinq séances de mesure d'une heure au maximum, échographie, capteurs électriques de surface, test d'appui, test d'aspiration, photographie en trois dimensions et caméra thermique, sur animal éveillé maintenu à la main, avec un calmant léger en cas d'agitation. Sur le remplacement, le porteur indique que les tissus prélevés après la mort se dégradent trop vite et que les simulations informatiques doivent elles-mêmes être calibrées sur des mesures faites chez des brebis vivantes, ce qui rend selon lui l'étape sur brebis gestantes obligatoire.
Objectifs
Notre projet vise à mieux protéger les femmes lors de l'accouchement en prévenant les déchirures du périnée. Le périnée désigne la zone musculaire située entre le vagin et l'anus, qui joue un rôle essentiel lors du passage du bébé. Ces déchirures surviennent lors de plus de la moitié des accouchements par voie naturelle et peuvent entraîner des douleurs persistantes, des fuites urinaires ou fécales, une gêne sexuelle, ainsi que des difficultés dans la vie quotidienne pouvant durer des mois ou des années. Malgré leur fréquence, elles restent encore trop souvent inévitables, faute d'outils permettant de les détecter et de les anticiper au bon moment. Aujourd'hui, les sages-femmes et les médecins n'ont pas la possibilité de mesurer en temps réel si le périnée risque de se déchirer pendant l'accouchement. Ils doivent s'appuyer uniquement sur leur expérience et leur observation directe, sans pouvoir évaluer objectivement ce risque. Notre projet cherche à combler ce manque en développant un dispositif de surveillance innovant, capable de détecter automatiquement les signes d'alerte et d'en informer le professionnel de santé à temps, afin qu'il puisse adapter sa pratique et réduire le risque de blessure pour la patiente. Pour concevoir et valider ce dispositif en toute sécurité, nous procédons par étapes progressives. Nous commençons par tester nos appareils de mesure sur des tissus prélevés sur des animaux décédés, ce qui permet d'effectuer les premiers réglages sans recourir à des animaux vivants. Nous menons ensuite des essais sur des brebis gestantes, dont l'anatomie du périnée est proche de celle de la femme enceinte. Ces essais nous permettent de vérifier que nos dispositifs fonctionnent correctement dans un corps vivant et de mieux comprendre comment les tissus du périnée évoluent tout au long de la grossesse et après l'accouchement. Ces connaissances sont indispensables pour garantir la fiabilité et la sécurité du futur outil. Les données ainsi recueillies serviront à concevoir un dispositif fiable et sûr, qui sera ensuite proposé à des femmes volontaires lors d'accouchements réels. L'objectif final est d'améliorer concrètement la prise en charge des femmes pendant l'accouchement et de réduire significativement les complications liées aux déchirures du périnée, pour le bénéfice des patientes et des professionnels de santé.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des bénéfices concrets à plusieurs niveaux, aussi bien pour l'avancement de la recherche médicale que pour la santé et la qualité de vie des femmes. Dans un premier temps, les essais sur brebis gestantes nous permettront de vérifier que nos appareils de mesure fonctionnent correctement sur un corps vivant, avant de les utiliser chez des femmes enceintes. Cette étape préalable est essentielle : elle garantit que les dispositifs sont fiables et bien adaptés à leur usage futur. Elle nous permettra également d'identifier et de corriger d'éventuels problèmes techniques en amont, évitant ainsi des erreurs coûteuses lors des futurs essais cliniques. Les tests proposés aux femmes volontaires pourront ainsi se dérouler dans de meilleures conditions de sécurité et d'efficacité, ce qui renforcera la valeur scientifique des résultats obtenus. Ces expériences nous fourniront également des informations scientifiques inédites sur la façon dont les tissus du périnée se transforment tout au long de la grossesse, au moment de l'accouchement et dans les semaines qui suivent la naissance. Ces données n'existent pas encore dans la littérature médicale actuelle. Elles seront précieuses pour mieux comprendre les mécanismes qui conduisent aux déchirures et pour développer des outils informatiques capables de prédire, en temps réel pendant l'accouchement, si une déchirure risque de survenir. Ce type d'outil constituerait une avancée majeure pour la médecine obstétricale. À plus long terme, ces résultats guideront la conception d'un système de surveillance médical certifié, destiné à être utilisé dans les maternités. Cet outil aidera les sages-femmes et les médecins à mieux protéger les femmes en adaptant leurs gestes selon le niveau de risque détecté à chaque instant. L'objectif est de réduire les déchirures du périnée, qui touchent plus de la moitié des femmes accouchant par voie naturelle et peuvent altérer leur qualité de vie pendant des années, en entraînant des douleurs chroniques, des fuites urinaires ou fécales, et des difficultés au quotidien. Enfin, notre approche s'inscrit dans une logique responsable vis-à-vis du bien-être animal : en utilisant des brebis déjà incluses dans d'autres études scientifiques en cours, nous évitons de recourir à des animaux supplémentaires, tout en obtenant des résultats essentiels pour la santé des femmes
Procédures
LLes brebis seront soumises à des séances de mesure entièrement non invasives, c'est-à-dire sans aucune coupure, piqûre ni blessure. Pendant ces séances, différents appareils sont placés sur ou à proximité du périnée de l'animal afin de recueillir des informations sur ses tissus à différents stades de la grossesse et dans les semaines qui suivent l'accouchement. Six techniques sont utilisées successivement au cours de chaque séance. Une échographie mesure l'élasticité des tissus par ondes sonores inoffensives, en environ quinze minutes. Des capteurs de surface enregistrent l'activité électrique des muscles du périnée, sur le même principe qu'un électrocardiogramme pour le cœur, en cinq minutes. Un test de résistance évalue la fermeté des tissus par un appui doux de quelques millimètres, sans douleur ni gêne pour l'animal, en cinq minutes. Un test d'adhérence mesure les propriétés des tissus par une légère aspiration, en cinq minutes. Une photographie en trois dimensions capture des images sans aucun contact avec l'animal pour mesurer les déformations des tissus, en trois minutes. Enfin, une caméra thermique placée à distance enregistre les variations de température de surface de la zone étudiée, en trois minutes également. Une séance complète dure environ une heure maximum. Pendant ce temps, la brebis reste éveillée et est maintenue doucement par le personnel soignant, formé à la manipulation des animaux. Si elle montre des signes d'inconfort ou d'agitation trop importants, un léger calmant peut lui être administré afin de préserver son bien-être. Toutes les mesures sont regroupées au sein d'une même séance pour limiter au maximum le nombre de manipulations et la gêne occasionnée pour l'animal. Les brebis sont réparties en trois groupes selon l'étude scientifique à laquelle elles participent par ailleurs. Le premier groupe, composé de quatorze brebis, participera à deux séances de mesure au total. Le deuxième groupe, de douze brebis, participera à deux ou trois séances selon que l'accouchement est déclenché artificiellement ou se produit naturellement. Le troisième groupe, également de douze brebis, participera à cinq séances réparties depuis le début de la grossesse jusqu'après l'accouchement, avec au minimum un mois de repos entre chaque séance. Aucune intervention chirurgicale n'est prévue dans le cadre de ce projet.
Impact sur les animaux
Les mesures réalisées sur le périnée des brebis ne causeront aucune douleur ni blessure, car tous les appareils utilisés se contentent d'un contact léger avec la peau ou fonctionnent à distance, sans aucune incision ni injection. La gêne attendue est donc minimale et de très courte durée. Les séances sont conçues pour être le plus confortables possible pour les animaux, et le personnel encadrant est spécifiquement formé à la détection et à la prise en charge des signes d'inconfort. Si une brebis montre des signes d'agitation trop importants pendant une séance de mesure, un léger calmant peut lui être administré. Celui-ci la rendra simplement somnolente pendant quelques minutes et elle sera surveillée attentivement par le personnel soignant jusqu'à son réveil complet, sans effet durable sur sa santé ni sur le déroulement de sa grossesse. Pour le premier groupe de quatorze brebis, des effets indésirables sont attendus, mais ils proviennent non pas de nos mesures, mais des interventions chirurgicales réalisées dans le cadre de l'autre étude scientifique à laquelle ces animaux participent. À la suite de ces opérations, elles pourront ressentir des douleurs modérées pendant quelques jours. Ces douleurs seront systématiquement prises en charge par des médicaments antidouleurs adaptés, administrés de façon préventive pendant les trois jours suivant chaque intervention chirurgicale. Pour les brebis dont l'accouchement sera déclenché artificiellement dans le cadre des deuxième et troisième groupes, des effets temporaires sont possibles. Elles peuvent présenter des contractions plus intenses que lors d'un accouchement naturel, ressentir un léger inconfort semblable à des douleurs de ventre, ou plus rarement développer une légère fièvre ou de l'agitation passagère. Une surveillance rapprochée sera assurée en permanence afin de pouvoir intervenir rapidement si nécessaire, notamment en administrant des antidouleurs ou en interrompant le déclenchement si l'animal en montre le besoin. En dehors de ces effets temporaires et limités dans le temps, aucune autre gêne ni souffrance n'est attendue pour les animaux participant à ce projet. Le bien-être de chaque brebis sera suivi en permanence par du personnel qualifié, et toute procédure sera immédiatement interrompue en cas de signe de détresse ou d'inconfort persistant.
Devenir
Notre projet ne prévoit pas de mise à mort des animaux pour ses propres besoins scientifiques. Cette position est le résultat d'un choix délibéré et réfléchi : en s'appuyant sur des brebis déjà incluses dans d'autres études, notre équipe a pu concevoir un projet utile et rigoureux sans nécessiter de sacrifices supplémentaires. Le sort des brebis à l'issue des procédures dépend donc du groupe auquel elles appartiennent et des règles fixées par les études scientifiques auxquelles elles participent en parallèle. Pour le premier groupe de quatorze brebis, une mise à mort est prévue à l'issue des procédures, mais elle est décidée et justifiée uniquement par l'autre étude scientifique à laquelle ces animaux participent, et non par notre projet. Elle est réalisée par injection d'un produit vétérinaire standardisé, administré via un cathéter déjà en place sur l'animal pour les besoins de cette autre étude. Cette méthode, reconnue et encadrée par la réglementation française et européenne sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques, assure un décès rapide et sans souffrance pour l'animal. Notre équipe n'intervient pas dans cette décision, qui relèvent entièrement du protocole de l'étude initiale. Notre rôle se limite strictement à effectuer nos mesures avant que cette étape n'intervienne. Pour les brebis des deuxième et troisième groupes, aucune mise à mort n'est prévue dans le cadre de notre projet, ni pendant ni après les séances de mesure. Une fois toutes les données recueillies, ces animaux seront replacés dans un environnement adapté à leurs besoins et à leur espèce, conformément aux réglementations en vigueur sur le bien-être animal. Leur devenir à plus long terme est encadré par les protocoles des études scientifiques auxquelles elles participent par ailleurs, lesquels prévoient des conditions d'hébergement, de suivi vétérinaire et de soins appropriées pour garantir leur confort tout au long de leur présence dans l'établissement. En n'induisant aucune mise à mort liée à ses propres objectifs scientifiques et en limitant au maximum l'impact sur les animaux impliqués, notre démarche s'inscrit pleinement dans une approche d'expérimentation animale responsable, éthique et respectueuse du bien-être animal, telle qu'elle est encouragée par les autorités compétentes en matière de recherche scientifique.
Remplacement
Avant de recourir à des animaux vivants, nous avons soigneusement examiné toutes les alternatives disponibles et les avons intégrées autant que possible dans notre projet. Ces alternatives sont utilisées en priorité dans les premières étapes de notre travail, conformément aux principes éthiques qui encadrent l'expérimentation animale. Cependant, aucune d'entre elles ne permet à ce jour de se substituer entièrement à l'expérimentation sur animal vivant pour atteindre nos objectifs scientifiques. Nous utilisons en premier lieu des tissus prélevés sur des animaux décédés, ce qui nous permet d'effectuer les premiers réglages de nos appareils de mesure sans recourir à des animaux vivants. Ces essais préliminaires sont précieux mais ne suffisent pas à eux seuls : les tissus d'un animal mort se dégradent rapidement après le décès et ne reproduisent plus fidèlement le comportement des tissus dans un corps vivant. En particulier, ils ne permettent pas d'observer la circulation sanguine, l'activité musculaire, ni l'élasticité naturelle des tissus sous l'effet des hormones de grossesse, qui jouent un rôle essentiel dans la préparation du corps à l'accouchement. Nous avons également étudié la possibilité d'utiliser des simulations informatiques et des mannequins artificiels reproduisant le périnée. Ces outils sont utiles pour modéliser certains comportements mécaniques, mais ils doivent eux-mêmes être alimentés et calibrés à partir de données mesurées sur des animaux vivants pour être fiables et pertinents. De plus, ils ne permettent pas de reproduire l'évolution progressive des tissus tout au long de la grossesse, sous l'effet des hormones, de la croissance du fœtus et des forces naturelles de l'accouchement. Ils ne constituent donc pas une alternative suffisante à ce stade de nos travaux. C'est pourquoi l'expérimentation sur brebis gestantes reste une étape indispensable de notre recherche. Les brebis présentent une anatomie du périnée et des mécanismes d'accouchement proches de ceux de la femme enceinte, ce qui en fait le modèle le plus pertinent pour tester nos appareils dans des conditions physiologiques réelles, avant toute application chez l'être humain. Cette étape est le préalable nécessaire à tout essai clinique chez des femmes volontaires.
Réduction
Notre projet met tout en œuvre pour utiliser le nombre d'animaux le plus faible possible, tout en garantissant la qualité et la fiabilité scientifique des résultats obtenus. Plusieurs stratégies complémentaires ont été combinées pour y parvenir, et ce dès la conception même du projet. Le premier levier de réduction est la décision de greffer notre projet sur des études scientifiques déjà existantes plutôt que de créer un protocole entièrement indépendant. Cette approche nous a permis d'éviter d'avoir recours à vingt-six brebis supplémentaires qui auraient été nécessaires si nous avions mené nos expériences de manière isolée. Chaque animal contribue ainsi simultanément à plusieurs objectifs scientifiques complémentaires, ce qui permet d'en tirer le maximum d'informations utiles tout en limitant le nombre total d'animaux impliqués dans la recherche. Le nombre total de trente-huit brebis sur cinq ans a été fixé au minimum nécessaire pour obtenir des résultats exploitables sur le plan scientifique. Pour chaque groupe, une marge prudente a été intégrée pour anticiper les situations où certaines données ne pourraient pas être analysées, par exemple en cas de complications pour le premier groupe, ou de pertes lors de la mise bas pour les autres groupes. Dans chaque cas, l'objectif est d'obtenir au moins huit à dix dossiers complets et analysables par groupe, conformément aux recommandations scientifiques en vigueur. La conception du troisième groupe constitue un autre levier important. Chaque brebis y est suivie à cinq moments différents au cours de la grossesse et après l'accouchement. Cette méthode longitudinale permet de recueillir une grande quantité de données sur l'évolution des tissus au fil du temps, à partir d'un nombre limité d'animaux, plutôt que d'utiliser un groupe distinct pour chaque moment de mesure. Elle réduit ainsi significativement le nombre total d'animaux requis pour documenter cette évolution. Enfin, les essais préalables sur tissus d'animaux décédés ont permis de tester et sélectionner les meilleurs appareils avant les essais sur animaux vivants. Le protocole a été optimisé pour limiter les mesures non exploitables grâce à une organisation rigoureuse des séances et à une sédation légère si nécessaire, réduisant le risque d'avoir à mobiliser des animaux supplémentaires
Raffinement
Le bien-être des animaux est une priorité tout au long de notre projet, depuis les conditions d'hébergement jusqu'à la fin des procédures. Des mesures concrètes ont été prises à chaque étape pour minimiser la gêne, la douleur et le stress des brebis. Pendant toute la durée du projet, les brebis sont logées en petits groupes d'au moins deux individus, afin de préserver leurs interactions sociales et d'éviter l'isolement, qui peut être une source importante de stress pour ces animaux. Leurs enclos respectent les normes réglementaires en matière d'espace et de confort. Des enrichissements sont également mis à leur disposition pour stimuler leur activité naturelle, comme des jouets, des dispositifs d'alimentation adaptés et une litière confortable, contribuant à leur bien-être quotidien. Pendant les séances de mesure, les brebis sont maintenues doucement par le personnel soignant, spécifiquement formé à la manipulation des animaux. Si une brebis montre des signes d'agitation trop importants, un léger calmant à courte durée d'action peut lui être administré, uniquement si nécessaire, afin de réduire son stress sans effets durables sur sa santé ni sur le déroulement de sa grossesse. Tous les appareils de mesure utilisés sont non invasifs et ne causent aucune blessure ni douleur. Les mesures sont regroupées en une seule séance d'environ une heure pour éviter les manipulations répétées et limiter la durée des contraintes imposées à l'animal. En cas de signe de détresse, toute procédure peut être immédiatement interrompue. Pour les brebis du premier groupe, des médicaments antidouleurs sont administrés systématiquement après les interventions chirurgicales de l'autre étude à laquelle elles participent, et une surveillance est assurée pendant plusieurs jours pour veiller à leur confort et à leur rétablissement. Pour les brebis dont l'accouchement est déclenché artificiellement dans les deuxième et troisième groupes, des antidouleurs sont également prévus en cas d'inconfort lié aux contractions. À l'issue du projet, les brebis des deuxième et troisième groupes sont adoptées dans un environnement adapté à leurs besoins. Pour le premier groupe, la mise à mort est réalisée dans le cadre de l'étude initiale, par une méthode réglementaire garantissant un décès rapide et sans souffrance.
Choix des espèces
Le choix des brebis gestantes comme modèle animal repose sur plusieurs raisons scientifiques solides, qui en font le modèle le plus adapté à nos objectifs de recherche parmi ceux disponibles. La première raison est la grande similarité entre l'anatomie du périnée de la brebis et celui de la femme enceinte. La taille, la structure et les propriétés des tissus périnéaux sont comparables entre les deux espèces. Lors de l'accouchement, les tissus subissent des étirements et des transformations profondes sous l'effet des hormones de grossesse et des forces mécaniques liées au passage du fœtus. Ces phénomènes sont très proches de ceux observés lors d'un accouchement humain, ce qui rend les résultats obtenus chez la brebis particulièrement utiles pour mieux comprendre ce qui se passe chez la femme et pour développer des outils médicaux adaptés à la réalité clinique. La deuxième raison est la durée de gestation de la brebis, d'environ cinq mois, qui constitue un modèle bien adapté pour étudier les modifications progressives des tissus périnéaux tout au long de la grossesse. La taille du fœtus et l'évolution du volume utérin entraînent sur les tissus du périnée des contraintes mécaniques et des transformations biologiques proches de celles observées chez la femme enceinte, ce qui renforce la pertinence scientifique de ce modèle pour notre projet. Enfin, l'utilisation de la brebis comme modèle pour l'étude du périnée est déjà reconnue et documentée dans la littérature scientifique internationale. Notre choix s'appuie sur des précédents bien établis, ce qui renforce la validité et la crédibilité de notre approche auprès de la communauté scientifique et des autorités éthiques. Les brebis utilisées dans notre projet sont des adultes en cours de gestation. Ce stade de développement est indispensable, car ce sont précisément les transformations des tissus pendant la grossesse et au moment de l'accouchement que nous cherchons à observer et à mesurer. L'utilisation d'animaux jeunes ou non gestants ne permettrait pas d'observer ces phénomènes et ne serait donc pas pertinente pour atteindre nos objectifs. Les mesures sont réalisées à plusieurs moments clés tout au long de la grossesse et après l'accouchement, afin de suivre l'évolution des tissus dans le temps, à partir d'un nombre limité d'animaux
Etude du role des vaisseaux sanguins sur les cancers du sang chez la souris 3/3
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Injection de cellules leucémiques, implantation de tissus sous la peau, prélèvements de sang ou de moelle osseuse chaque semaine jusqu'à la fin, jusqu'à six séances de microscopie pouvant durer deux heures, et jusqu'à vingt et un jours d'isolement en cage individuelle. 4 296 souris, en partie immunodéficientes, vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère, toutes tuées pour prélèvement. Le porteur indique qu'à un stade avancé de la maladie les souris peuvent perdre leur tonicité, avoir des difficultés de locomotion et voir leur état général s'altérer. Le résumé ne nomme aucun des "différents traitements" administrés, n'avance aucun chiffre à l'appui d'un effectif calculé selon lui "à l'aide d'outils statistiques", et tient l'exposé du devenir de ces 4 296 souris en une seule phrase.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre comment certains cancers du sang, comme les leucémies, interagissent avec les vaisseaux sanguins dans leur tissu. L’objectif est d’identifier les anomalies présentes dans cet environnement lors du développement de la maladie. En utilisant des modèles de souris et des outils d’imagerie avancés, on veut repérer les mécanismes qui favorisent la croissance des cellules cancéreuses et tester de nouvelles approches pour les bloquer. Le projet sera réalisé dans 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce projet pourraient permettre d’améliorer l’efficacité des traitements contre certaines leucémies, en ciblant l’environnement tumoral. Comprendre comment l'environnement vasculaire influence la progression de la maladie pourrait conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques, plus ciblées et mieux tolérées par les patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections de cellules leucémiques (1 fois, duree:
Impact sur les animaux
Les seances d'imagerie répétées peuvent entraîner un stress modéré chez les animaux, notamment en raison des manipulations et du transport associés aux séances d’imagerie. L’implantation des systèmes utilisés pour l’imagerie peut gêner légèrement le comportement de l’animal, sans toutefois compromettre sa mobilité ou son alimentation. L'hébergement individuel pendant une durée maximale de trois semaines peut induire un stress lié à l’isolement. À un stade avancé de la maladie, les animaux peuvent présenter des signes de souffrance (perte de tonicité, difficultés de locomotion, altération de l’état général). Les injections en sous-cutané, intra-vein, intra-peritoné peuvent cause une gene legere aux souris.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement
Remplacement
Pour « Remplacer », nous avons mis en place un système de culture 3D qui reproduit le tissu leucemique humain et permet certaines expériences sans utiliser d’animaux. Afin de limiter le nombre de souris utilisées, nous veillons à ce que toutes les expériences possiblement réalisables in vitro sur système de culture 3D le soient. Cependant, celui-ci ne mimant que les interactions locales et pas systemiques, le développement de modèle in vivo reste nécessaire.
Réduction
L’étude directe des tumeurs humaines étant très limitée, nous utilisons des souris immunodéficientes pour mieux comprendre les leucémies humaines. Ce modèle est aujourd’hui le seul qui permette d’étudier ces maladies de manière fiable. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons développé des modèles d’organoïdes de leucémie humaine greffés chez ces souris. Ces greffes sont plus efficaces et plus reproductibles que les méthodes classiques, ce qui permet d’utiliser moins de souris par expérience. Nous utilisons également des techniques d’imagerie qui permettent de suivre l’évolution de la leucémie au cours du temps chez un même animal. Cela évite de devoir euthanasier les souris à chaque étape de l’étude. Les expériences sont réalisées avec des souris mâles et femelles, car le sexe n’influence pas le développement de la leucémie dans nos modèles. Enfin, le nombre de souris nécessaires est calculé à l’avance à l’aide d’outils statistiques afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant au maximum l’utilisation des animaux.
Raffinement
Pour éviter toute souffrance, les procédures d’imagerie et l’implantation d’organoïdes se feront sous anesthésie générale et avec administration d’analgésique. De plus, afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux souris, leur état fera l’objet d’une surveillance continue. Les souris seront hébergées dans des cages adaptées, incluant des éléments d’enrichissement appropriés. Enfin des points limites spécifiques ont été mis en place. Une dérogation à l’hébergement en groupe est demandée pour certains animaux. Cette dérogation est scientifiquement justifiée par la nécessité d’éviter toute blessure ou stress. Des mesures compensatoires seront mises en œuvre pour limiter l’impact de l’isolement sur le bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris est l'espèce de choix pour les expériences menées pour la recherche en oncologie thérapeutique du cancer. En effet, la connaissance complète du génome de la souris permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt, ainsi qu’un grand nombre de modèles de cancers. De plus, la grande homologie avec l’Homme permet d’envisager de transposer les résultats obtenus chez la souris vers des applications cliniques. Nous utiliserons des souris adultes de 6-12 semaines. Cela représente l’âge permettant une bonne prise de greffe, et qui laisse le temps a la maladie de se développer sans que la souris vieillisse.
Developpement d’approches thérapeutiques pour le Syndrome de Sanfilippo Type B
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
La production des données précliniques exigées par la réglementation avant tout essai chez l'humain fait partie de la finalité déclarée de ce projet sur le syndrome de Sanfilippo de type B, aux côtés de l'évaluation d'une thérapie génique et d'un traitement anti-inflammatoire. 2 244 souris vont être utilisées, toutes tuées par perfusion intracardiaque après anesthésie profonde pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 1 320 reçoivent une injection dans la veine de la queue à l'état vigile, 660 subissent une chirurgie cérébrale de quarante minutes avec pose d'une canule guide, et 1 408 passent des tests d'anxiété, d'activité locomotrice et de reconnaissance d'objets. Le porteur affirme que seul un "organisme entier" permet de suivre la biodistribution du vecteur et les réponses immunitaires, et écrit que les données de cette lignée murine sont "indispensable avant tout essai chez l'humain".
Objectifs
Le syndrome de Sanfilippo de type B (ou MPS IIIB) est une maladie pédiatrique génétique rare, touchant environ 0,5 naissance sur 100 000 en Europe. Elle est causée par un déficit d'une enzyme lysosomale qui entraîne l’accumulation de certaines molécules appelées oligosaccharides d’héparane sulfate dans le cerveau et d’autres tissus. Cette accumulation provoque des problèmes cellulaires, notamment un dysfonctionnement lysosomal, un stress oxydatif, une neuroinflammation et l’activation des cellules immunitaires du système nerveux, qui contribuent aux lésions neuronales et à la progression de la maladie. Les patients présentent un déclin intellectuel progressif et des troubles du comportement, avec une espérance de vie moyenne de 17 à 19 ans. Malgré les avancées en thérapie génique et en traitement enzymatique, aucun traitement ne permet aujourd’hui d'arrêter ou de ralentir l’évolution de la maladie. L’objectif de notre projet est de développer une approche thérapeutique pour le syndrome de Sanfilippo de type B, sur un modèle murin approprié, selon deux stratégies complémentaires : - Une thérapie génique, visant à restaurer l’activité enzymatique déficiente chez les enfants asymptomatiques, afin d’évaluer son potentiel curatif à un stade précoce de la maladie. - Un traitement anti-inflammatoire, destiné aux enfants non éligibles à la thérapie génique, visant à réduire la neuroinflammation, ralentir la progression des symptômes et améliorer la qualité de vie. Pour cela nous utiliserons le modèle de souris génétiquement modifiée MPSIIIB développé par le laboratoire Jackson. Il s'agit du seul modèle murin MPSIIIB qui reproduit les principales caractéristiques de la maladie humaine, notamment l'accumulation de HSO, la neuroinflammation, le déclin comportemental et la mort prématurée.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de développer et d’évaluer deux stratégies thérapeutiques complémentaires pour le syndrome de Sanfilippo type B. L’utilisation du modèle murin MPSIIIB permettra d’obtenir des données précliniques essentielles pour déterminer le potentiel thérapeutique de ces approches et indispensable avant tout essai chez l’humain. En effet, les données générées constituent un prérequis réglementaire pour toute application clinique. Au plus long terme, elles contribueront au développement de thérapies innovantes pour une maladie pédiatrique grave et actuellement incurable et à une meilleure compréhension des maladies lysosomales et neuroinflammatoires.
Procédures
Les interventions concerneront: 1) une injection IV dans la veine caudale sur animaux vigiles (1320 souris, chaque injection prend quelques minutes); 2) une injection intracerebroventriculaire un type de chirurgies sous anesthésie générale (660 animaux, 40 minutes); 3) traitement par alimentation pendant 21 jours; 4) une évaluation comportementale de l'anxiété et de l'activité locomotrice (une seule session de 10 minutes par animal), des processus cognitifs ( toutes les souris (1408), sur 15 jours au total, tests d'objets (3 sessions chacune de 10 minutes d'exploration libre sur 2 jours par animal); 5) un prélèvement sanguin à la veine caudale ou mandibulaire (sous anesthésie) pour test sérologique (2240 animaux, quelques secondes).
Impact sur les animaux
Pour l’injection IV, l’injection intraveineuse à la queue est susceptible d'induire un stress au moment de la préhension des animaux pour les placer dans l’appareil de contention et/ou de la douleur chez l'animal sur une durée inférieure à cinq minutes. Pour l’injection ICV, malgré l'aseptie rigoureuse pratiquée lors de l'étape chirurgicale, il est possible que l'animal présente de légères complications (infections) au niveau de la zone incisée. Pendant les 48 premières heures post-chirurgie, l’injection intra-cérébrale et l’installation des canules guide peuvent parfois entrainer une angoisse ou une prostration, anxiété et perte de poids. L'installation de la canule guide chez l'animal peut également entraîner de légères douleurs post-opératoires les premières 48 heures. Durant l'expérimentation, les animaux seront prélevés une ou deux fois en cours d'étude (prélèvement de sang) à la veine mandibulaire ou caudale, ce qui peut provoquer du stress et/ou de la douleur chez l'animal. L'état général des animaux pourrait être de ce fait altéré.
Devenir
A l'issue des 3 procédures, les 2244 souris seront mises à mort par perfusion intracardique après anesthésie profonde, afin de réaliser le prélèvement d'échantillons d'organes, pour réaliser des analyses biochimiques, cellulaires ou moléculaires ou réaliser une biobanque.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires (fibroblastes de patients MPSIIIB et lignée de microglie murine) qui ont démontré l’effet bénéfique des procédures thérapeutiques proposées dans ce projet. La thérapie génique et les traitements anti-inflammatoires agissent sur plusieurs tissus et impliquent des interactions immunitaires complexes. Seul un organisme entier permet de suivre la biodistribution du vecteur ou du traitement, d’évaluer l’efficacité dans le cerveau notamment par des tests de comportement et cognitifs, de mesurer les effets collatéraux ou indésirables, et d’observer les réponses immunitaires et inflammatoires au niveau systémique. Par conséquent, les études in vitro ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Une telle pertinence est essentielle pour garantir la robustesse des résultats et leur transposabilité dans des applications cliniques.
Réduction
Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Nos études antérieures ont montré que des groupes de 12 animaux par expérience comportementale étaient nécessaires pour les souris MPSIIIB et de 10 pour le groupe Wild-type. Pour les procédures 1 et 3, nous répéterons les expériences à 3 temps post-traitement différents afin de rendre nos résultats comparables à ceux de nos études antérieures. Pour la procédure 2, nous répéterons les expériences à 5 temps post-traitement différents. Le calcul de puissance réalisé avec G*Power, basé sur une différence attendue de 20% entre groupes, une variabilité estimée à 15 % et une puissance de 70 %, indique un effectif nécessaire de 10 animaux par groupe. Pour le groupe MPSIIIB, nous prévoyons 12 souris par groupe afin de tenir compte d’une éventuelle mortalité ou exclusion. Ce nombre garantit la détection de l’effet recherché tout en limitant l’utilisation d’animaux au strict minimum et avoir des résultats significatifs. Nous maximiserons également les données par animal : réalisation de multiples analyses (tests comportementaux, histologie, biologie moléculaire, analyses biochimiques...) sur les tissus prélevés afin de limiter l'utilisation d'animaux supplémentaires. Comme dans nos études précédentes, l’expérimentateur principal reste systématiquement en aveugle vis-à-vis du génotype et du traitement administré.
Raffinement
Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées sera assurée soit par l’expérimentateur soit par le personnel de la zootechnie. Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48 heures se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - perte de poids >10 % du poids normal maintenue sur 72 heures ; -hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - faiblesse ou paralysie des membres, se traduisant par des défauts de locomotion; - lésion non résorbée dans la zone d'implantation de la canule guide malgré les soins; - infection non contrôlée dans la zone d'implantation de la canule guide malgré les antibiotiques. Si un de ces points limites est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement. Pour la procédure 2 – chirurgie pour injection intracérébrale et installation de la canule guide- un tapis chauffant sera positionné sous l’animal pendant l’anesthésie ainsi que sous la cage pour le réveil des animaux afin de prévenir l’hypothermie et un gel oculoprotecteur sera appliqué systématiquement aux souris anesthésiées afin de prévenir le dessèchement oculaire. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et par administration d'analgésique ( administrée 1 heure avant la chirurgie et toutes les 24 heures en fonction de l’état des souris dans les 48 heures postopératoires). La pose d'une canule guide va permettre un meilleur confort de l'animal puisqu'elle implique une réduction du nombre de contentions et d'administrations répétées chez ce dernier. Les expérimentateurs qui effectueront la chirurgie de la pose de la canule guide sont exclusivement des personnels formés à la chirurgie et maîtrisent les bons gestes garantissant l'aseptie pendant la chirurgie ainsi que le bien-être animal en pré-, per- et post-opératoire. Enfin, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. Notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés, spécifiquement la souris MPSIIIB. Cette souche mutée pour l’enzyme lysosomale est le seul modèle à reproduire fidèlement les caractéristiques humaines : accumulation d’héparane sulfate, dysfonction lysosomale, neuroinflammation, troubles cognitifs et comportementaux et réduction de l’espérance de vie. De plus, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, une très bonne adaptation aux conditions expérimentales et surtout être un modèle de choix pour les études comportementales. Les animaux seront utilisés à 1 mois, ce qui correspond à l’âge avant l’apparition des symptômes de la maladie pour mimer l’état des patients asymptomatiques qui seront éligibles à ce type de traitement (thérapie génique). De plus, ça permet de laisser 1 semaine entre le sevrage et le début de l’expérimentation pour limiter le stress dû au sevrage. les animaux seront également utilisés à partir de 2 mois afin d'étudier les premiers signes et la progression de la neuro-inflammation. Et des animaux seront utilisés à partir de 21 jours afin d'étudier l’efficacité de la modulation de l’inflammation. Ce choix est en accord avec les précédentes études déjà menées au laboratoire.
Evaluation de la fibrose hépatique par IRM in vivo sur un modèle de souris développant une surcharge ferrique EU2/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
Huit souris seront tuées en cours d'étude pour prélever foie, cœur, reins et rate, les deux couples reproducteurs après la période de reproduction, et le sort des autres, âgées de 14 mois à la fin, reste ouvert : le porteur écrit qu'elles pourront être maintenues en vie pour d'éventuels projets compatibles ou être tuées. Le champ structuré du résumé annonce pourtant 4 mises à mort et 26 réutilisations sur 30 souris, un décompte que cette narration ne recoupe pas. Certaines sont génétiquement modifiées pour accumuler du fer, douze reçoivent une alimentation enrichie en fer pendant environ douze mois, et toutes passent cinq examens d'IRM sous anesthésie gazeuse pouvant durer deux heures, précédés d'un jeûne, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur indique que la faisabilité de sa méthode d'imagerie est déjà démontrée chez des souris saines et qu'il est désormais "nécessaire" de la valider chez des souris en surcharge de fer.
Objectifs
La surcharge en fer correspond à une accumulation excessive de fer dans l’organisme pouvant avoir différentes origines. Son importance dépend de la cause sous-jacente et de la durée d’évolution sans traitement. Souvent peu symptomatique au début, elle est généralement diagnostiquée tardivement. Le foie est l’un des premiers organes touchés. L’excès de fer peut entraîner des lésions hépatiques progressives, notamment une fibrose hépatique, caractérisée par une accumulation anormale de tissu cicatriciel. L’évaluation de cette fibrose est essentielle pour suivre l’évolution de la maladie et adapter la prise en charge des patients. La biopsie hépatique constitue actuellement l’examen de référence pour évaluer la fibrose. Cependant, elle est invasive, douloureuse et peut souffrir d’un biais d’échantillonnage, le prélèvement n’étant pas toujours représentatif de l’ensemble du foie. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) permet d’obtenir des informations anatomiques, structurelles, fonctionnelles et biomécaniques sur les tissus. Parmi les techniques disponibles, l’élastographie par résonance magnétique (ERM) fournit une cartographie non invasive de la rigidité hépatique, paramètre étroitement lié au degré de fibrose. Toutefois, la présence d’une forte concentration de fer dans le foie constitue une limite importante de cette technique. Le taux d’échec de l’ERM augmente avec la quantité de fer présente, rendant difficile, voire impossible, l’évaluation de la fibrose chez les patients souffrant de surcharge ferrique. L’objectif de ce projet est de valider une méthode d’imagerie alternative (ERM-alt), développée au sein du laboratoire, permettant d’évaluer la fibrose hépatique même en présence de fer. La faisabilité de cette approche a déjà été démontrée sur des objets tests puis in vivo chez des souris saines. Il est désormais nécessaire de la valider chez des souris présentant différents niveaux de surcharge ferrique afin de confirmer sa robustesse et d’envisager son transfert vers la clinique. Ce projet porte ainsi sur la validation expérimentale d’une méthode innovante destinée à améliorer le diagnostic non invasif de la fibrose hépatique chez les patients atteints de surcharge en fer.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche translationnelle permettra : 1. De comparer les teneurs en fera quantité de fer dans le foie hépatique mesurées par IRM avec les valeurs histologiques (technique de référence) sur des cohortes de souris malades. 2. De comparer laes rigidité du foies hépatiques mesurées par IRM avec les stadifications stade de fibrose hépatiqueréalisées par obtenue par analyse histologiquee sur des cohortes de souris malades. 3. De déterminer les seuils de fer hépatique compatibles avec les techniques IRM et dDe montrer que la technique IRM (ERM-alt) développée au laboratoire permet de surmonter les problèmes limitations de la méthode classiquesoulevés par la présence importante de fer. Les résultats positifs sur souris serviront alors de base pour une étude clinique chez l’humain sur sujets sains dans un premier temps puis sur patients souffrant de surcharge ferrique. La méthode proposée sera et ainsi offrir clé pour pouvoir faire une solution non-invasive pour stadifier la stadification non-invasive de la fibrose hépatique chez ces patients, ce qui n’est pas possible aujourd’hui évitant ainsi une biopsie du foie.
Procédures
Un groupe recevra une alimentation enrichie en fer pendant environ 12 mois, tandis que l’autre groupe suivra une alimentation standard. À partir de l’âge de 8 semaines, les souris seront suivies pendant environ 12 mois. Elles seront pesées toutes les deux semaines afin de vérifier leur état de santé et le bon suivi du régime alimentaire. Les animaux seront soumis à 5 examens. Chaque examen durera au maximum 2 heures et sera réalisé sous anesthésie générale gazeuse. Avant chaque examen d’IRM, les animaux seront soumis à un jeûne d’environ 1 heure afin de standardiser les conditions d’imagerie.
Impact sur les animaux
Certaines souris auront une modification génétique entraînant une accumulation progressive de fer dans l’organisme. Un groupe de 12 souris recevra une alimentation enrichie en fer afin d’augmenter cette accumulation au niveau du foie, ce qui devrait entraîner des modifications modérées de la rigidité du foie correspondant à un stade précoce de fibrose. Le retour à une alimentation standard devrait permettre une réduction du niveau de fer hépatique et une régression de la fibrose. Les animaux seront âgés de 14 mois à la fin du projet, ce qui pourrait induire des problèmes de santé liés simplement à la vieillesse. Pendant le transport entre l’établissement hébergeur et le laboratoire les animaux peuvent subir un stress temporaire. Pendant l’anesthésie et l’examen d’IRM, les animaux peuvent présenter une baisse de la température corporelle et une sécheresse oculaire. Les examens seront répétés plusieurs fois au cours de l’étude, ce qui peut entraîner un stress modéré supplémentaire lié aux manipulations répétées. Comme pour toute procédure réalisée sous anesthésie, un risque très faible de décès pendant l’examen existe, bien que cela reste exceptionnel au regard de notre précédente expérience d’imagerie chez des souris saines.
Devenir
Huit animaux seront euthanasiés au cours de l’étude afin de prélever certains organes (foie, cœur, reins et rate) nécessaires à la réalisation d’analyses histologiques permettant d’évaluer l’accumulation de fer et les lésions hépatiques. Les deux couples reproducteurs utilisés pour la constitution de la colonie seront également euthanasiés à l’issue de la période de reproduction, soit environ 15 mois après le début du projet. Les 22 autres animaux (8 du groupe 1, 8 du groupe 2 et 6 du groupe 3) auront environ 14 mois à la fin de l’étude. Leur devenir sera évalué en concertation avec la structure chargée du bien-être animal (SBEA) et le vétérinaire référent de l’établissement. En fonction de leur état de santé et de leur âge, ils pourront soit être maintenus en vie pour d’éventuels projets compatibles, soit être euthanasiés conformément à la réglementation en vigueur.
Remplacement
De plus, pour pouvoir passer à une étude clinique, il est demandé des preuves de l’applicabilité de la méthode IRM développée (ERM-alt) in vivo sur un modèle animal pertinent tel que la souris.La fibrose hépatique est une maladie complexe qui se développe sur plusieurs années. Elle implique des interactions entre différentes cellules et une organisation très précise du tissu hépatique. Aujourd’hui, avec les technologies disponibles (comme les cultures de cellules ou les organoïdes en laboratoire), il est impossible de reproduire fidèlement tous ces mécanismes. Comme cette étude vise à valider une nouvelle méthode d’imagerie médicale par IRM pour évaluer la fibrose du foie, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux, comme la souris, car ils permettent de reproduire les processus biologiques réels de la maladie. Enfin, avant de tester cette méthode sur l’humain, il faut d’abord prouver son efficacité et sa faisabilité in vivo, ce qui n’est possible qu’avec des modèles animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum au maximum pour chaque groupe sans compromettre l'interprétation des résultats suite à une analyse robuste des résultats par des tests statistiques non paramétriquespour garantir des résultats fiables en termes de significativité statistique. Cette estimation tient compte des prélèvements d’organes réalisés à des fins depour les biopsies et d’une éventuelle mortalité au cours du protocole. Cela permet de garantir que les objectifs scientifiques pourront être atteints sans avoir recours à des animaux supplémentaires ni d’interrompre l’étude en cours faute d’animaux en nombre suffisant. Le groupe contrôle (G3) est également constitué du stricte minimum (3 mâles et 3 femelles) permettant de comparer les résultats entre les groupes tout en respectant les différences liées au sexe.d’avoir des résultats comparatifs avec les groupes 1 et 2 en fonction du sexe. Enfin, pour éviter d’utiliser davantage d’animaux, les mêmes animaux seront suivis au cours du temps. Cela permet de suivre l’évolution de la maladie, sans avoir besoin d’une quantité élevée d’animaux.
Raffinement
Les souris du groupe 1 auront une alimentation riche en fer pour qu’elles développent une surcharge de fer dans le foie. Cette solution permet d’obtenir le modèle expérimental sans nécessité d’acte invasif. Les examens IRM seront réalisés sous anesthésie générale (gazeuse par isoflurane) et pourront durer jusqu’à 2 heures. Une goutte d’Ocrygel sera instillée dans chaque œil juste après l’installation de l’animal sur le lit IRM afin de limiter le dessèchement oculaire. Une couverture chauffante sera utilisée pour maintenir la température de l’animal tout le long de l’examen. Cette température ainsi que la respiration de la souris seront suivies pendant toute la durée de l’examen. L'apport en isoflurane sera couplé à un concentrateur d'oxygène pour favoriser la respiration de l'animal et sa récupération au réveil. En fin de procédure, si l'animal a été anesthésié plus de 2 heures, il recevra une injection sous cutanée de 0,5mL de sérum glucosé chauffé à température corporelle pour recevoir une réhydratation rapide et éviter une possible hypoglycémie. La phase de réveil se fera en isolement dans une cage à part, l’animal sera déposé sur un tapis chauffant évitant une hypothermie. Des points limites prédictifs et spécifiques de ce projet ont été établis afin d'anticiper tout effet dommageable sur les animaux, avec une surveillance adaptée à chaque étape de la procédure jusqu’à la mise à mort des animaux en fin de procédure.
Choix des espèces
Les modèles de souris restent accessiblessont et compatibles bien adaptées à une analyse surpour la recherche dans le domaine de l l’imagerie’IRM préclinique, notamment en IRM, à haut champ magnétique de 7T (plusieurs papiers références) . Les techniques IRM mise en œuvre dans cette demande de projet sont couramment pratiquées au sein du laboratoire sur des souris saines. La proximité génétique entre les souris et l’homme permet d’étudier des mécanismes biologiques comparables. L’utilisation de souris génétiquement modifiées déficientes en hepcidine1 permettra de se rapprocher au mieux des modifications physiopathologiques observées chez l’homme dans le cadre de pathologies caractérisées par une accumulation excessive de fer dans le foie (hémochromatose) pouvant mener à la formation de tissus cicatriciel au niveau du foie (fibrose hépatique). car elles présentent des similitudes biologiques avec l’homme, ce qui permet d’étudier des maladies du foie proches de celles observées chez les patients, notamment l’accumulation excessive de fer (hémochromatose) et le développement d’une fibrose hépatique Les souris des trois groupes suivront le protocole d’imagerie IRM à partir de 8 semaines afin de s’assurer que le système immunitaire soit mature et que le foie ait également atteint une rigidité stabiliséeLes examens d’IRM commenceront lorsque les souris auront 8 semaines. À cet âge, leur organisme est suffisamment développé et le foie a atteint un état stable (démontrée lors d’une étude antérieure sur une petite cohorte). Pour le groupe recevant une alimentation riche en fer, ce régime débutera également à partir de la 8ᵉ semaine afin de coïncider avec le début du suivi par IRM. Le suivi par imagerie durera 12 mois afin d’observer progressivement différents niveaux d’accumulation de fer dans le foie selon les groupes étudiés, ainsi que les premiers stades de fibrose hépatique, sans provoquer d’atteintes sévères chez les animaux.
Endomicroscopie Multimodal Multiphotonique des Plaques d’Athérosclérose 1/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
Trois interventions chirurgicales d'une heure à une heure trente chacune, sous anesthésie générale : 6 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs vaisseaux sanguins. Avant ces opérations, ils reçoivent une alimentation enrichie en cholestérol destinée à faire apparaître des plaques d'athérome dans leurs artères, et sont hébergés en cages individuelles. L'enjeu déclaré est de tester un prototype de sonde d'imagerie endovasculaire miniaturisée, dont le porteur affirme que la validation in vivo reste "indispensable" malgré les essais préalables sur explants et sur fantômes d'artères. Ces lapins pèseront environ 3 kg et auront 10 à 12 semaines, poids minimum retenu par le porteur pour y introduire les cathéters expérimentaux.
Objectifs
L’objectif principal est de tester et valider in vivo un nouveau système d'imagerie optique miniaturisé pour observer les vaisseaux sanguins dans des conditions proches de l’usage clinique. Il s'agit de démontrer la faisabilité d’imagerie intravasculaire in vivo avec une sonde chez le lapin porteur de plaques d’athérosclérose induites par un régime alimentaire spécifique. Cela permettra de caractériser la composition biologique de ces lésions à l’aide des différentes modalités de microscopie développées (dépôts lipidiques, architecture tissulaire, calcifications éventuelles, signes d'inflammation). Cette étude nous permettra de comparer la qualité de cette imagerie innovante avec celles utilisées en clinique, en particulier en évaluant la robustesse, la reproductibilité et la compatibilité opératoire du dispositif (maniabilité, sécurité mécanique, acquisition d’images exploitables), en vue d'une application future en clinique et plus particuilèrement en cardiologie. Le projet se réalisera sur 2 établissements distincts pour sa réalisation.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont multiples. À court terme, cette étude pilote fournira des preuves de concept essentielles concernant la fiabilité, la sécurité d’utilisation et la performance du prototype miniaturisé. Les données obtenues permettront d’évaluer sa capacité à détecter et à caractériser de manière précise les lésions athérosclérotiques, notamment les dépôts lipidiques, l’inflammation et les éventuelles calcifications. Ces informations sont cruciales pour mieux comprendre les mécanismes d’évolution des plaques et identifier plus précocement les lésions à risque. À plus long terme, les résultats du projet pourraient contribuer au développement d’outils diagnostiques plus sensibles et plus spécifiques que ceux disponibles aujourd’hui en clinique (les maladies cardiovasculaires sont la 2ème cause de mortalité en France). Une imagerie intravasculaire plus fine et plus informative pourrait améliorer le dépistage, affiner les indications thérapeutiques et favoriser une médecine cardiovasculaire plus personnalisée, dans un contexte où l’athérosclérose est un processus qui demeure silencieux avant de déclencher des complications.
Procédures
Les animaux recevront une alimentation particulière, riche en cholestérol, destinée à provoquer progressivement la formation de plaques d’athérome dans leurs artères, susceptible de créer des nuisances aux animaux. Le régime enrichi en cholestérol peut entraîner des nuisances modérées et progressives, incluant une prise de poids, une diminution de l’activité, des troubles digestifs légers et une altération métabolique modérée. La formation de plaques d’athérome est attendue mais ne génère pas de douleur spontanée. Ces effets feront l’objet d’une surveillance clinique régulière avec des critères d’arrêt prédéfinis. Ils subiront également 3 interventions chirurgicales, réalisées sous anesthésie générale et analgésie d’environ 1 h à 1 h 30.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent ressentir du stress ou de l’inconfort pendant les phases préparatoires et les manipulations expérimentales. Les interventions sont associées à des nuisances modérées, pouvant engendrer douleur, lésion ou inconfort local au niveau des sites opératoires, ainsi qu’une détresse temporaire liée à l’anesthésie et aux procédures de contention. Les animaux peuvent également ressentir de la peur et du stress en lien avec les manipulations ou la nouveauté de l’environnement. Le régime alimentaire imposé pour induire la formation de plaques d’athérome est susceptible de provoquer des nuisances physiologiques telles que modification du métabolisme, prise de poids, troubles digestifs ou risque accru de maladies systémiques. Enfin, le fait d’être hébergés individuellement peut occasionner des nuisances environnementales, telles qu’un isolement social relatif ou une adaptation limitée à l’environnement de la cage, et des contraintes mineures sur la liberté de mouvement.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour la nécessité des études histologiques sur les vaisseaux sanguins.
Remplacement
L’utilisation d’animaux dans ce projet est justifiée par l’objectif scientifique : évaluer in vivo un prototype de sonde endovasculaire miniaturisée, comparable aux sondes utilisées en routine clinique, pour caractériser les lésions athérosclérotiques. Ce type d’évaluation nécessite un modèle physiopathologique dynamique, intégrant le flux sanguin, la réponse de la paroi artérielle, l’inflammation locale et la cicatrisation vasculaire après lésion ou intervention. Ces phénomènes ne peuvent être reproduits de manière fiable in vitro, sur explants ou sur modèles artificiels de vaisseaux. Avant toute expérimentation animale, des travaux préliminaires ont été réalisés pour limiter le recours aux animaux : essais sur explants ex vivo, tests sur fantômes d’artères et analyses sur lames histologiques. Ces étapes ont permis d’optimiser les paramètres optiques et techniques du dispositif, et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Malgré ces précautions et méthodes alternatives, l’étude in vivo reste indispensable pour valider le fonctionnement du dispositif endovasculaire dans des conditions physiologiques réelles et garantir la pertinence des résultats pour des applications cliniques futures.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est strictement limité à cinq lapins expérimentaux et un témoin. Cet effectif a été déterminé en tenant compte de plusieurs critères : le minimum statistique nécessaire pour obtenir des résultats fiables, la variabilité interindividuelle connue du modèle lapin, la nécessité de recueillir des données longitudinales cohérentes tout au long de l’expérimentation. D’après le design expérimental dans le cadre d’une étude pilote, les mêmes individus serviront tout au long de l’étude : ils permettront d’abord de confirmer le développement des plaques d’athérome sous régime riche, puis seront utilisés pour la phase d’imagerie avec le dispositif expérimental. Ce schéma expérimental permet de maximiser la quantité et la qualité des informations obtenues tout en limitant au strict minimum le recours aux animaux, conformément au principe de réduction des expérimentations animales.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles, mais non étanches et possédant des parois translucides, permettant aux animaux de maintenir des stimuli visuels, olfactifs et auditifs avec leurs congénères. Avant toute procédure, chaque animal bénéficiera d’une période d’acclimatation d’au moins cinq jours, afin de réduire le stress lié au nouvel environnement. Les cages seront aménagées avec un enrichissement adapté, comprenant notamment des bûchettes à ronger et du foin, pour stimuler les comportements naturels et améliorer le confort. Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien, portant sur leur état de santé et leur bien-être tout au long du protocole expérimental, avec un suivi particulier de leur comportement du fait de l’hébergement individuel. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie, et les animaux seront surveillés en continu pendant l’intervention. Un suivi renforcé sera mis en place pendant les premiers jours après chaque procédure pour détecter et traiter rapidement tout signe de douleur ou de malaise. Si nécessaire, des analgésiques seront administrés pour soulager la douleur, et des antibiotiques pourront être utilisés en cas d’infection. Dans le cas où un animal présenterait une souffrance, une maladie ou une altération physique incompatible avec un bien-être acceptable, et qu’aucune mesure de soulagement efficace ne peut être appliquée, l’animal sera retiré de l’expérimentation et mis à mort. Pour les transferts vers l'établissement 2/2, les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages adaptées à l'espèce, en prenant soin de vérifier les conditions de circulation et météorologiques et sous surveillance du vétérinaire.
Choix des espèces
Le lapin a été choisi comme modèle animal en raison de sa pertinence scientifique et technique pour les études de navigation intravasculaire. La taille de ses vaisseaux est suffisamment proche de celle de certains vaisseaux humains ciblés par le projet, permettant d’évaluer le positionnement et le fonctionnement du cathéter endovasculaire dans des conditions comparables à la pratique clinique. De plus, le lapin est un modèle bien établi pour l’athérosclérose induite par l’alimentation, reproduisant de manière fiable la formation de plaques d’athérome et leur progression, telle que décrite dans de nombreuses publications scientifiques. Le choix du lapin répond également à des critères éthiques et réglementaires, car il permet d’obtenir des données pertinentes avec un nombre réduit d’animaux, tout en limitant le risque de douleurs ou de dommages durables grâce à sa taille adaptée. Les animaux utilisés seront des jeunes lapins pesant environ 3 kg, généralement âgés de 10 à 12 semaines. Ce poids correspond au minimum recommandé pour réaliser les procédures de navigation intravasculaire et l’introduction des cathéters expérimentaux. Le choix de ce stade de développement permet de garantir des vaisseaux de taille adaptée.
Endomicroscopie Multimodal Multiphotonique des Plaques d’Athérosclérose 2/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
L'objet du projet est un instrument, un prototype de sonde d'imagerie optique miniaturisée à valider dans des conditions proches de l'usage clinique. 6 lapins, 5 exposés et 1 témoin, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour l'examen histologique de leurs vaisseaux. Ils reçoivent une alimentation enrichie en cholestérol destinée à faire apparaître des plaques d'athérome, puis subissent trois opérations sous anesthésie d'une heure à une heure et demie chacune, hébergés seuls en cage et transportés d'un établissement à l'autre. Le porteur retient le lapin parce que la taille de ses vaisseaux approche celle des vaisseaux humains visés, et parce qu'un poids d'environ trois kilos, atteint vers dix à douze semaines, correspond au minimum permettant d'introduire les cathéters.
Objectifs
L’objectif principal est de tester et valider in vivo un nouveau système d'imagerie optique miniaturisé pour observer les vaisseaux sanguins dans des conditions proches de l’usage clinique. Il s'agit de démontrer la faisabilité d’imagerie intravasculaire in vivo avec une sonde chez le lapin porteur de plaques d’athérosclérose induites par un régime alimentaire spécifique. Cela permettra de caractériser la composition biologique de ces lésions à l’aide des différentes modalités de microscopie développées (dépôts lipidiques, architecture tissulaire, calcifications éventuelles, signes d'inflammation). Cette étude nous permettra de comparer la qualité de cette imagerie innovante avec celles utilisées en clinique, en particulier en évaluant la robustesse, la reproductibilité et la compatibilité opératoire du dispositif (maniabilité, sécurité mécanique, acquisition d’images exploitables), en vue d'une application future en clinique et plus particuilèrement en cardiologie. Le projet se déroulera sur 2 établissements distincts pour sa réalisation.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont multiples. À court terme, cette étude pilote fournira des preuves de concept essentielles concernant la fiabilité, la sécurité d’utilisation et la performance du prototype miniaturisé. Les données obtenues permettront d’évaluer sa capacité à détecter et à caractériser de manière précise les lésions athérosclérotiques, notamment les dépôts lipidiques, l’inflammation et les éventuelles calcifications. Ces informations sont cruciales pour mieux comprendre les mécanismes d’évolution des plaques et identifier plus précocement les lésions à risque. À plus long terme, les résultats du projet pourraient contribuer au développement d’outils diagnostiques plus sensibles et plus spécifiques que ceux disponibles aujourd’hui en clinique (les maladies cardiovasculaires sont la 2ème cause de mortalité en France). Une imagerie intravasculaire plus fine et plus informative pourrait améliorer le dépistage, affiner les indications thérapeutiques et favoriser une médecine cardiovasculaire plus personnalisée, dans un contexte où l’athérosclérose est un processus qui demeure silencieux avant de déclencher des complications.
Procédures
Les animaux recevront une alimentation particulière, riche en cholestérol, destinée à provoquer progressivement la formation de plaques d’athérome dans leurs artères, susceptible de créer des nuisances aux animaux. Le régime enrichi en cholestérol peut entraîner des nuisances modérées et progressives, incluant une prise de poids, une diminution de l’activité, des troubles digestifs légers et une altération métabolique modérée. La formation de plaques d’athérome est attendue mais ne génère pas de douleur spontanée. Ces effets feront l’objet d’une surveillance clinique régulière avec des critères d’arrêt prédéfinis. Ils subiront également 3 interventions chirurgicales, réalisées sous anesthésie générale et analgésie d’environ 1 h à 1 h 30.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent ressentir du stress ou de l’inconfort pendant les phases préparatoires et les manipulations expérimentales. Les interventions sont associées à des nuisances modérées, pouvant engendrer douleur, lésion ou inconfort local au niveau des sites opératoires, ainsi qu’une détresse temporaire liée à l’anesthésie et aux procédures de contention. Les animaux peuvent également ressentir de la peur et du stress en lien avec les manipulations ou la nouveauté de l’environnement. Le régime alimentaire imposé pour induire la formation de plaques d’athérome est susceptible de provoquer des nuisances physiologiques telles que modification du métabolisme, prise de poids, troubles digestifs ou risque accru de maladies systémiques. Enfin, le fait d’être hébergés individuellement peut occasionner des nuisances environnementales, telles qu’un isolement social relatif ou une adaptation limitée à l’environnement de la cage, et des contraintes mineures sur la liberté de mouvement.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour la nécessité des études histologiques sur les vaisseaux sanguins.
Remplacement
L’utilisation d’animaux dans ce projet est justifiée par l’objectif scientifique : évaluer in vivo un prototype de sonde endovasculaire miniaturisée, comparable aux sondes utilisées en routine clinique, pour caractériser les lésions athérosclérotiques. Ce type d’évaluation nécessite un modèle physiopathologique dynamique, intégrant le flux sanguin, la réponse de la paroi artérielle, l’inflammation locale et la cicatrisation vasculaire après lésion ou intervention. Ces phénomènes ne peuvent être reproduits de manière fiable in vitro, sur explants ou sur modèles artificiels de vaisseaux. Avant toute expérimentation animale, des travaux préliminaires ont été réalisés pour limiter le recours aux animaux : essais sur explants ex vivo, tests sur fantômes d’artères et analyses sur lames histologiques. Ces étapes ont permis d’optimiser les paramètres optiques et techniques du dispositif, et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Malgré ces précautions et méthodes alternatives, l’étude in vivo reste indispensable pour valider le fonctionnement du dispositif endovasculaire dans des conditions physiologiques réelles et garantir la pertinence des résultats pour des applications cliniques futures.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est strictement limité à cinq lapins expérimentaux et un témoin. Cet effectif a été déterminé en tenant compte de plusieurs critères : le minimum statistique nécessaire pour obtenir des résultats fiables, la variabilité interindividuelle connue du modèle lapin, la nécessité de recueillir des données longitudinales cohérentes tout au long de l’expérimentation. D’après le design expérimental dans le cadre d’une étude pilote, les mêmes individus serviront tout au long de l’étude : ils permettront d’abord de confirmer le développement des plaques d’athérome sous régime riche, puis seront utilisés pour la phase d’imagerie avec le dispositif expérimental. Ce schéma expérimental permet de maximiser la quantité et la qualité des informations obtenues tout en limitant au strict minimum le recours aux animaux, conformément au principe de réduction des expérimentations animales.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles, mais non étanches et possédant des parois translucides, permettant aux animaux de maintenir des stimuli visuels, olfactifs et auditifs avec leurs congénères. Avant toute procédure, chaque animal bénéficiera d’une période d’acclimatation d’au moins cinq jours, afin de réduire le stress lié au nouvel environnement. Les cages seront aménagées avec un enrichissement adapté, comprenant notamment des bûchettes à ronger et du foin, pour stimuler les comportements naturels et améliorer le confort. Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien, portant sur leur état de santé et leur bien-être tout au long du protocole expérimental, avec un suivi particulier de leur comportement du fait de l’hébergement individuel. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie, et les animaux seront surveillés en continu pendant l’intervention. Un suivi renforcé sera mis en place pendant les premiers jours après chaque procédure pour détecter et traiter rapidement tout signe de douleur ou de malaise. Si nécessaire, des analgésiques seront administrés pour soulager la douleur, et des antibiotiques pourront être utilisés en cas d’infection. Dans le cas où un animal présenterait une souffrance, une maladie ou une altération physique incompatible avec un bien-être acceptable, et qu’aucune mesure de soulagement efficace ne peut être appliquée, l’animal sera retiré de l’expérimentation et mis à mort. Pour les transferts vers l'établissement 2/2, les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages adaptées à l'espèce, en prenant soin de vérifier les conditions de circulation et météorologiques et sous surveillance du vétérinaire.
Choix des espèces
Le lapin a été choisi comme modèle animal en raison de sa pertinence scientifique et technique pour les études de navigation intravasculaire. La taille de ses vaisseaux est suffisamment proche de celle de certains vaisseaux humains ciblés par le projet, permettant d’évaluer le positionnement et le fonctionnement du cathéter endovasculaire dans des conditions comparables à la pratique clinique. De plus, le lapin est un modèle bien établi pour l’athérosclérose induite par l’alimentation, reproduisant de manière fiable la formation de plaques d’athérome et leur progression, telle que décrite dans de nombreuses publications scientifiques. Le choix du lapin répond également à des critères éthiques et réglementaires, car il permet d’obtenir des données pertinentes avec un nombre réduit d’animaux, tout en limitant le risque de douleurs ou de dommages durables grâce à sa taille adaptée. Les animaux utilisés seront des jeunes lapins pesant environ 3 kg, généralement âgés de 10 à 12 semaines. Ce poids correspond au minimum recommandé pour réaliser les procédures de navigation intravasculaire et l’introduction des cathéters expérimentaux. Le choix de ce stade de développement permet de garantir des vaisseaux de taille adaptée.
Etude de l’efficacité et de la biodistribution d’un produit de thérapie génique dans un modèle de rats reproduisant différents stades de la myopathie de Duchenne
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
195 rats porteurs de la dystrophie musculaire de Duchenne vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués pour le prélèvement de leurs tissus. Leur maladie s'aggrave avec le temps et gêne de plus en plus la marche et la respiration. S'y ajoutent un prélèvement de queue pour le génotypage, une injection intraveineuse pratiquée sur rat éveillé, des prises de sang hebdomadaires et, chaque mois, des mesures cardiaques, musculaires et respiratoires pouvant durer une demi-heure. Une partie des rats est traitée entre 1 et 15 jours de vie puis tuée entre 3 et 18 mois, pour représenter des patients de moins de quatre ans. Le porteur écrit que l'agence européenne du médicament lui demande ces études précliniques sur un candidat déjà en essai clinique chez des enfants de 6 à 10 ans, et que les agences réglementaires "imposent de recourir à l'animal" pour ce type d'études.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie neuromusculaire affectant uniquement les garçons. La pathologie est causée par des mutations du gène DMD qui entraînent la perte de la dystrophine, une protéine indispensable à la fonction des muscles. En l’absence de dystrophine, les muscles subissent une diminution progressive et généralisée de force amenant à une perte des capacités motrices, souvent compliquée par une faiblesse respiratoire et/ou cardiaque. La dystrophie musculaire de Duchenne se manifeste dès les premières années de la vie et réduit la qualité et l’espérance de vie des patients. Notre laboratoire a développé un candidat-médicament pour soigner cette pathologie. Le candidat est composé d’un transporteur permettant d’apporter dans les muscles un gène capable de produire la protéine déficiente. Ce produit est actuellement évalué dans un essai clinique chez des patients âgés de 6 à 10 ans. Puisque la maladie est différente selon l’âge du patient, l’agence européenne du médicament nous demande de réaliser de nouvelles études précliniques dans le modèle murin de la pathologie afin d’anticiper l’application de notre produit à une population pédiatrique très jeune (0 à 4 ans), et à une population non ambulante de moins de 18 ans. Dans les études précliniques de ce projet, nous utiliserons le modèle de rongeur le plus pertinent de pathologie de Duchenne, le rat DMD, qui reproduit les symptômes musculaires, cardiaques et respiratoires de la pathologie. L’efficacité thérapeutique sera analysée à court et long terme dans chacune des deux populations animales, en utilisant un intervalle de doses allant de la dose testée en clinique jusqu’à des doses supérieures déterminées sur la base des données de la littérature.
Bénéfices attendus
Le bénéfice thérapeutique des approches thérapeutiques utilisant des produits similaires au nôtre a déjà été démontré dans de nombreux modèles animaux, et dans plusieurs études cliniques (dont la nôtre) chez des patients atteints de la myopathie de Duchenne. Cependant, aucune étude n’a encore permis d’évaluer l’efficacité de notre produit chez des patients très jeunes (moins de 4 ans) ou chez des patients présentant une forme très sévère de la maladie (patients non ambulants de moins de 18 ans). Cette étude nous permettra de déterminer si notre produit présente les mêmes effets thérapeutiques dans ces 2 populations de patients que dans la population en cours de traitement (enfants de 6 à 10 ans). Elle pourrait nous conduire à ajuster la dose si le produit s’avérait moins efficace dans l’une ou l’autre de ces 2 populations (voire dans les deux).
Procédures
Afin d’identifier le fond génétique de l’animal, un prélèvement d’un bout de queue sera réalisé sur chaque animal. En cas de doute sur l’échantillon, un deuxième prélèvement sera réalisé à l’oreille au cas par cas. Chacun de ces gestes ne durera en moyenne pas plus d’une minute. Les molécules thérapeutiques seront délivrées par une injection intraveineuse unique sur rat éveillé (durée moyenne 2 minutes). Des prélèvements sanguins seront réalisés au cours du temps sur rat éveillé (durée moyenne 2 minutes) : ces prélèvements seront réalisés 1 fois par semaine au maximum. Les rats seront soumis à des tests permettant de mesurer la fonction de différents organes (maximum 1 fois par mois): mesure de l’activité électrique du cœur (durée moyenne 30 min), mesure de l’activité électrique du muscle (durée moyenne 15 min), mesure de la fonction cardiaque (durée moyenne 20 min), mesure de la fonction respiratoire (durée moyenne 30 min), mesure d’activité et de mobilité et mesure de composition corporelle (durée moyenne 15min).
Impact sur les animaux
Les animaux ont une maladie qui atteint les muscles, la respiration et le cœur. La maladie s’aggrave avec le temps. Les animaux ont des difficultés de plus en plus importantes pour bouger et respirer. Ils seront maintenus en contention manuelle ou dans une boite à contention, ce qui pourrait entrainer un stress. Certains actes d’évaluation de la fonction des organes seront réalisés sous anesthésie. Des douleurs locales pourraient être ressenties au moment du prélèvement d’un bout de queue ou d’oreille, des injections du traitement thérapeutique, des injections de molécules anesthésiques ou antidouleurs, ainsi qu’au moment des prélèvements de sang. Des lésions locales de type inflammatoire accompagnées de douleurs localisées pourraient apparaitre lors de certains tests de mesure de la fonction musculaire. Des irritations de la peau pourraient être observées à l’endroit de l’épilation nécessaire pour la mesure de la fonction cardiaque. Toutes les nuisances possibles sont localisées et réversibles, ce qui constitue pour l’animal un niveau global de contrainte modérée.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour permettre le prélèvement des tissus et les analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
La maladie de Duchenne est causée par l’absence d’une protéine appelée la dystrophine : les muscles et le cœur perdent progressivement leurs fonctions. Le projet consiste à mesurer l'effet d’un médicament composé d’un virus non pathogène transportant la dystrophine au sein des cellules cardiaques et musculaires malades : ce test n'est pas réalisable dans les modèles cellulaires car il est impossible de cibler différents tissus simultanément dans ces modèles et d’étudier la répartition du médicament entre les différents organes. De plus, l’utilisation de virus transporteurs de notre médicament entraine une réaction de défense immunitaire de l’organisme contre les virus, réaction impossible à recréer en laboratoire à ce jour. Enfin, les agences réglementaires du médicament nous imposent de recourir à l’animal pour ce type d’études. L'utilisation d’animaux ne peut donc pas être remplacée dans ce projet.
Réduction
Le nombre de rats utilisés dans ce projet a été réduit grâce à :1) le calcul par des tests statistiques des effectifs minimaux mais adéquats permettant une analyse fiable et une exploitation garantie des résultats ; 2) L’utilisation de données historiques et la partage de certains groupes de rats témoins entre procédures ; 3) l’analyse d’un maximum de paramètres chez chaque animal (plusieurs dizaines) ; 4) l’obtention des rats non malades et malades en utilisant les mêmes croisements parentaux et 5) un suivi quotidien, des règles strictes de raffinement et le respect des points limites permettant de garantir le bien-être animal et l’exploitation de toutes les données produites.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’une phase d’habituation avant certains tests visant à mesurer le fonctionnement des muscles. Lors de certains de ces tests, il y a un risque exceptionnel de blessures aux griffes : dans ce cas, un traitement avec un désinfectant sera appliqué jusqu’à la guérison. Afin de contrôler la douleur et le stress de l’animal, certains tests seront réalisés sous anesthésie générale et un antidouleur sera administré avant le test. Dans le cas d’animaux anesthésiés, les tests seront réalisés sur une plaque chauffante pour maintenir la température corporelle constante. Une application de crème anti-irritation sera appliquée sur le thorax des animaux après l’épilation nécessaire pour la mesure du fonctionnement du cœur.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les modèles animaux les plus couramment utilisés par la communauté scientifique pour mesurer l'efficacité de médicaments pour la maladie de Duchenne (DMD), pathologie qui affecte le bon fonctionnement des muscles et du cœur. Le modèle de souris de cette maladie permet une évaluation très complète des différents muscles, mais ne reproduit pas l’atteinte cardiaque typique des Hommes affectés par la maladie. Le rat est le seul modèle de rongeur reproduisant tous les aspects de la pathologie (atteinte des muscles et du cœur). L'utilisation du modèle de rats DMD permettra donc de valider l’effet du traitement sur l’ensemble des organes affectés par la pathologie. De plus, afin de pouvoir comparer les résultats avec les données historiques, les agences réglementaires exigent que l’évaluation des effets du produits soit réalisée sur le modèle animal de rats utilisé lors des études précliniques précédentes. Afin de modéliser une population de patients DMD âgés de moins de 4 ans, les rats juvéniles auront entre 1 à 15 jours au moment du traitement puis entre 3 à 18 mois à l’euthanasie afin d’évaluer les effets à court et à long terme. Afin de modéliser une population de patients DMD non ambulants de moins de 18 ans, les rats auront entre 6 à 9 mois en début de traitement et entre 9 à 18 mois à l’euthanasie pour permettre l’évaluation des effets à court et long terme.
Etablir des nouvelles stratégies de thérapies combinées pour augmenter l’efficacité du transfert de gène chez des souris adultes dystrophiques
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
192 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs muscles et de leurs organes. Chacune reçoit une injection intraveineuse sous anesthésie brève, puis des molécules par voie intra-péritonéale ou orale deux à cinq fois par semaine, avec jusqu'à deux prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie. Une première série porte sur des souris adultes non malades, chez lesquelles un gène rapporteur est délivré pour repérer les molécules qui augmentent son expression, la seconde sur des lignées dystrophiques. Le porteur limite le projet aux expériences qu'il juge "absolument indispensables", et affirme que les cultures cellulaires et les organoïdes ne permettent pas d'étudier l'effet de l'âge sur un transfert de gène à l'échelle d'un "organisme entier".
Objectifs
Les myopathies des ceintures sont des maladies génétiques rares qui touchent principalement les muscles des épaules et des hanches. Elles entraînent une faiblesse musculaire progressive et une perte de mobilité. Certaines formes sont actuellement ciblées par des approches de thérapie génique, qui consistent à apporter une copie fonctionnelle d’un gène dans les cellules musculaires grâce à un vecteur viral rendu inoffensif. Notre laboratoire a observé que, chez la souris, cette approche est moins efficace à l’âge adulte qu’à un âge plus jeune. Le projet a donc pour objectif de déterminer si certains traitements pharmacologiques peuvent restaurer cette efficacité chez l’adulte, sans augmenter la dose de vecteur viral administrée. Le projet comporte deux étapes. La première vise à identifier, chez des souris adultes non malades, des molécules capables d’augmenter l’expression d’un gène rapporteur délivré par thérapie génique. La seconde étape vise à vérifier, dans des modèles murins de dystrophie musculaire, si les molécules améliorent également l’expression d’un gène thérapeutique ainsi que certains marqueurs biologiques de la maladie. L’objectif final est de mieux comprendre les limites de la thérapie génique chez l’adulte et d’identifier des pistes d’amélioration pour de futurs traitements.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permet d’approfondir nos connaissances sur la relation entre l’efficacité des thérapies géniques et l’âge. Les approches thérapeutiques destinées aux patients atteints de LGMD-R5 et LGMD-R9 pourraient directement bénéficier des résultats générés par cette étude. Ces résultats pourraient contribuer aux perspectives d’amélioration des traitements de thérapie génique dans le cadre de ces maladies. Les résultats obtenus de ce projet permettraient de développer des stratégies pour d’autres pathologies où nous observons un phénomène similaire.
Procédures
Des injections sont réalisées par voie intraveineuse une seule fois sur la durée de l’étude, sous anesthésie de courte durée, c’est-à-dire moins de 5 minutes. D’autres injections seront faites par voie intra-péritonéale (durée d’injection : moins de 1 minute) ou per os (durée d’administration : moins de 2 minutes), sur animaux vigiles. Dans ce cas les molécules seront injectées entre 2 et 5 fois par semaine en fonction de leur demi-vie. Des prélèvements de sang seront faits pour le suivi biologique au maximum deux fois par semaine sur animaux sous anesthésie de courte durée, c’est-à-dire moins de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont classées légères à modérées. Certaines sont liées à la nature des différents actes réalisés : douleur de l’injection pour administration de vecteur de thérapie génique en intraveineux (classe légère) ou de molécules soit en intra-péritonéale soit par voie orale (classe modérée). Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des muscles et des organes.
Remplacement
Des approches in vitro, y compris des cultures cellulaires ou des organoïdes, peuvent être utilisées pour explorer certains mécanismes moléculaires. Toutefois, elles ne permettent pas d’étudier de façon satisfaisante l’effet de l’âge sur l’efficacité d’un transfert de gène à l’échelle d’un organisme entier, ni les interactions entre muscle, circulation sanguine et métabolisme. Le recours à l’animal reste donc nécessaire pour répondre à la question posée dans ce projet.
Réduction
Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues. Lorsque ce sera possible, nous utiliserons les mêmes souris contrôles pour des expériences différentes en tant que contrôles pour les différentes conditions évaluées. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Un test statistique a été utilisé pour déterminer le nombre de souris par groupe afin de garantir des résultats fiables tout en évitant l’usage excessif d’animaux.
Raffinement
Les animaux sont acclimatés avant le début des procédures et surveillés régulièrement pendant toute l’étude. Les procédures susceptibles d’être douloureuses ou stressantes, notamment les injections intraveineuses, sont réalisées sous anesthésie. Un gel ophtalmique est appliqué pendant les anesthésies pour éviter le dessèchement oculaire. Les prélèvements sanguins sont réalisés avec des méthodes courtes et adaptées. Des points limites cliniques sont définis pour permettre une prise en charge rapide ou une euthanasie anticipée si nécessaire. Les tissus prélevés en fin d’étude sont exploités au maximum afin d’éviter des procédures supplémentaires.
Choix des espèces
Pour ce projet, nous utiliserons l’espèce souris car les modèles existants des pathologies étudiées sont sur cette espèce. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte (entre 1 et 2 mois) et adulte (entre 6 et 8 mois). A ces stades, nous avons observé des données robustes sur plusieurs expériences avec une bonne transduction au stade juvénile et une perte significative de l’efficacité dans les souris adultes. Sa petite taille permet de limiter les volumes biologiques requis tout en assurant une puissance statistique suffisante avec un nombre réduit d’animaux. L’utilisation de ce modèle s’inscrit pleinement dans le respect des principes des 3R, en particulier la réduction, grâce à l’optimisation des conditions expérimentales et à l’exploitation des résultats obtenu.