Recherche appliquée
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Étude du rôle du génome silencieux sur l’immunogénicité de lignées cancéreuses.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées est immunodéficiente, dépourvue des défenses qui lui permettraient de rejeter les cellules tumorales qu'on lui greffe. 8 172 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Éveillées, elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses sous la peau du flanc, puis des traitements deux fois par semaine jusqu'à l'atteinte du point limite, environ trois semaines pour les groupes non traités, et pour certaines quatre injections directement dans la tumeur dès qu'elle atteint 100 mm3. Leur mort permet les analyses post-mortem, le porteur revendiquant la nécessité de valider dans "un organisme dans son intégralité" des observations qu'il a d'abord obtenues sur lignées cellulaires.
Objectifs
Les immunothérapies anti-tumorales visent à détruire les cellules cancéreuses en stimulant ou en réorientant le système immunitaire (SI). Ces traitements sont prometteurs et permettent déjà de guérir des patients, mais certaines tumeurs échappent au SI et il est essentiel d’améliorer ces approches. Les lymphocytes T tueurs sont des cellules essentielles pour l’immunité anti-tumorale. Pour fonctionner, elles ont besoin de reconnaître un peptide (appelé néoantigène - néoAg), exprimé par les cellules cancéreuses. Identifier les mécanismes de production de néoAgs et des stratégies pour moduler leur expression est un enjeu central de la recherche en immunothérapie. Les chercheurs ont longtemps cherché des néoAgs provenant de gènes codants, dérivant de mutations acquises par les cellules tumorales pendant le développement du cancer. Mais ces mutations sont souvent spécifiques à chaque patient, et donc difficiles à cibler. Il faut donc trouver d’autres sources de néoAgs. On parle souvent du rôle des gènes dans le développement de pathologies humaines, mais ils représentent seulement 2% du génome. On a longtemps pensé que le reste du génome (dit silencieux) ne s’exprimait pas. Plusieurs études récentes ont montré que le génome silencieux peut s’exprimer dans les tumeurs et favoriser leur destruction par le système immunitaire. L’inactivation de gènes impliqués dans « la mise sous silence » du génome silencieux permet son expression et conduit à une meilleure reconnaissance des tumeurs par le SI. Ils sont donc des candidats prometteurs pour le développement de thérapies. Il reste cependant beaucoup à comprendre sur la nature exacte de la régulation de ce génome silencieux et c’est le but de ce projet. Le premier objectif est d’identifier des gènes participant à sa « mise sous silence ». Le deuxième est de cibler ces gènes pour améliorer la réponse immunitaire anti-tumorale. Le troisième est de déveloper un traitement pour spécifiquement réveiller une partie du génome silencieux codant pour un néoAg pour améliorer les réponses immunitaires anti-tumorales. L’objectif général du projet est de comprendre les mécanismes de régulation du génome silencieux pour mieux instruire l’établissement de protocoles d’immunothérapie.
Bénéfices attendus
Il est essentiel de noter que la très grande majorité des cancers développent des mécanismes très efficaces qui inhibent la réponse immunitaire. Un enjeu actuel de la recherche en immunothérapie est d’identifier des mécanismes de productions de néoantigènes (qui seraient des nouvelles cibles) par les cellules tumorales et d’établir des traitements ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses. C’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet. Ces expériences vont permettre de mieux caractériser le ou les mécanismes de régulation du génome silencieux dans les cellules tumorales. En effet, certains éléments du génome permettent de produire des protéines spécifiques de la tumeur et capables d’augmenter la réponse immunitaire dirigée contre la tumeur et non les tissus sains. Par ailleurs, ce projet cherche à mettre en place un protocole permettant d’augmenter l’expression de ces néoantigènes afin de pouvoir les utiliser dans des stratégies thérapeutiques pour améliorer de manière large la réponse des cancers à l’immunothérapie.
Procédures
Dans une première procédure, des cellules tumorales seront injectées à des souris par voie sous-cutanée au niveau d’un des flancs, sur animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 10 sec). Un à deux prélèvements sanguins (2 semaines après injection) et/ou au moment de la mise à mort des animaux seront réalisés sur animaux vigiles (durée de chaque prélèvement inférieure à 10 sec). Dans une deuxième procédure, après l’injection de cellules tumorales (identique à la 1ère procédure), les animaux seront traités par injection sur animaux vigiles 2 fois par semaine (durée du geste inférieure à 10sec), jusqu’à l’atteinte du point limite (environ 3 semaines pour les souris recevant les tumeurs sans traitement) ou pour un maximum de 60 jours (si les tumeurs sont rejetées). Un à deux prélèvements sanguins (2 semaines après injection) et/ou au moment de la mise à mort des animaux seront réalisés sur animaux vigiles (durée de chaque prélèvement inférieure à 10 sec). Dans une troisième procédure, les animaux seront injectés par voie sous-cutanée au niveau du flanc (1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 10 sec). Dans une quatrième procédure, des cellules tumorales seront injectées sur les animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 10 sec). Dès que les tumeurs atteignent environ 100mm3, le traitement sera injecté dans la tumeur des animaux vigiles à raison de 4 injections tous les 4 jours ( durée du geste inférieure à 10 sec). Un des groupes d’animaux sera également injecté en intraveineuse 24h avant le début du traitement.
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Pour les expériences d’injections de cellules tumorales ou des traitements, il est attendu une douleur directe associée à l’utilisation d’une aiguille. Pour le prélèvement de sang, il est attendu une douleur légère liée à la réalisation (gène de courte durée). En ce qui concerne les injections intratumorales, nous utiliserons un format de traitement utilisé en routine pour traiter des patients par injections locales. Aucune inflammation n’est attendue après ce traitement, mais les souris peuvent ressentir de la douleur pour un temps limité après l’injection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour des analyses post-mortem
Remplacement
Les lignées tumorales ont d’abord été étudiées in vitro (marqueurs de surface, croissance). Dans le cas des traitements visant à manipuler spécifiquement l’expression de néoantigènes dérivant du génome silencieux, des expériences ont été réalisées in vitro dans les lignées cancéreuses, nous savons donc qu’elles réagissent à ce traitement. Le projet est aussi avancé que possible, cependant des tests in vivo sont maintenant nécessaires pour comprendre le rôle de ces lignées sur la réponse immunitaire dans un contexte physiologique entier. En effet, dans le cas des lignées cellulaires déficientes pour des gènes de régulation, nous allons analyser la présence de cellules immunitaires entre les conditions déficientes et contrôles grâce à un prélèvement de sang.
Réduction
Lorsque cela est possible, afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés, les études sont réalisées au préalable sur des lignées cellulaires in vitro, modifiées pour les gènes d'intérêt. Nous pouvons ainsi tester un nombre important de paramètres, puis passer aux modèles animaux uniquement quand le projet est aussi avancé que possible. Cela permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet. Néanmoins, il est nécessaire de valider ces observations dans le contexte d'un organisme dans son intégralité plus physiologique. Le nombre d'animaux par groupe est défini à l'aide d'un outil statistique.
Raffinement
Les animaux seront suivis régulièrement afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer de façon objective l’état des animaux. Les animaux seront mis à mort dès l’atteinte des points limites. Dans le cas des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés 2 à 3 fois par semaines pour leur état général et pour mesurer la taille de la tumeur.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. D’autre part, la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris immunodéficientes. Enfin, il existe un grand nombre de modèles de tumeurs transplantables disponibles.
Etude du cervelet dans un modèle murin d’ataxie cérébelleuse pour trouver de nouvelles cibles thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris subissent une biopsie de la queue, puis une anesthésie de cinq minutes avant la mise à mort. 176 souris porteuses d'une mutation du gène de l'ataxine-1 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées au niveau de souffrance modéré, une partie à cinq semaines, l'autre à vingt semaines. Ce qu'elles subissent tient surtout à leur génotype, les mutantes grandissant moins vite que les témoins et portant une ataxie qui atteint chez les patients la marche, la coordination et l'équilibre. Le porteur annonce les tuer à vingt semaines "avant l'apparition des symptômes les plus sévères", sans nommer les symptômes moteurs qui apparaissent avant ce terme ni la manière dont il les mesure.
Objectifs
Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies génétiques rares qui affectent un groupe spécifique de neurones dans une partie du cerveau appelée le cervelet. Elles entraînent des problèmes de mouvement tels que des difficultés à marcher, à coordonner les mouvements et à maintenir l’équilibre. L’une de ces maladies est l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1), qui se développe généralement à un âge avancé et est causée par une mutation génétique. Cette mutation empêche une protéine appelée ataxine-1 de fonctionner correctement. Malgré les progrès, les causes précises de cette maladie et pourquoi seulement certains types de cellules du cervelet sont affectés restent encore inconnus. L’objectif de cette étude est d’utiliser un modèle de souris génétiquement modifié pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires. Le modèle souris utilisé porte une mutation du gène de l’ataxine-1 comparable aux mutations retrouvées chez les patients et développe des symptômes récapitulant fidèlement les caractéristiques de la maladie chez l'homme. Les objectifs détaillés de cette étude sont : - d’identifier le profil d’expression des gènes de chaque type de cellules du cervelet chez des souris mutantes en comparaison des souris contrôles afin de détecter les changements d’expression de gène induit par la mutation dans un ou plusieurs types de cellules du cervelet - réaliser cette étude de profil d’expression des gènes à deux moments du développement de la maladie : avant et au moment de l’apparition des symptômes Ces résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans l’apparition de la maladie SCA1.
Bénéfices attendus
Ce modèle murin présente les caractéristiques typiques de la maladie humaine SCA1, c’est pourquoi nous pensons qu’il est le bon modèle pour rechercher et étudier les voies moléculaires qui sont dérégulées. Trois bénéfices principaux sont attendus : -Identifier les voies moléculaires responsable pour le développement et la progression de la maladie qui nous permettra de mieux comprendre la maladie. -Identifier les régions du cervelet qui sont le plus touchés par cette mutation, ce qui nous permettra de mieux comprendre la maladie. -Identifier des défauts moléculaires précoces qui pourront être des nouvelles cibles thérapeutiques à long terme.
Procédures
Les animaux seront soumis aux procédures suivantes (toutes sont incluses dans la classe modérée) : - biopsie au niveau de la queue pour génotypage, 1x par souris. Cette procédure dure 1 seconde. - anesthésie avant la mise à mort. Cette procédure dure 5 minutes. - injection des analgésiques et anesthésie avant la mise à mort. Ces procédures durent 15 minutes.
Impact sur les animaux
Au cours de la période couverte par le plan expérimental, les souris présentant une mutation de l’ataxine 1 présentent une croissance ralentie par rapport aux souris témoins. De plus, une douleur légère et transitoire est attendue au moment de la biopsie au niveau de la queue ainsi que lors des injections d’analgésique et d’anesthésique.
Devenir
Pour les analyses moléculaires, biochimiques et histologiques, une mise à mort est nécessaire à la fin de la procédure, en respectant les points limites et la progression de la maladie.
Remplacement
L’objectif de cette étude est de caractériser la dérégulation moléculaire dans chaque type de cellules du cervelet. Pour ce faire, nous devons utiliser des modèles animaux car il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. Afin d’évaluer les modifications de transcription des gènes nous devons collecter des tissus (cervelet) de souris mutantes et sauvages.
Réduction
Pour mener à bien ce projet, nous prévoyons d'utiliser 176 souris sur une période de 5 ans, ce nombre comprenant la maintenance de la lignée et les procédures expérimentales. Toutes les procédures sont organisées de manière à réduire le nombre de souris, tout en tenant compte du nombre minimum d’animaux nécessaires pour appliquer des tests statistiques afin d'évaluer la robustesse des résultats finaux.
Raffinement
Les souris seront manipulées par contention douce (dans le creux de la main ou dans un tube en carton servant d’enrichissement). Les souris seront soumises à une anesthésie générale avant la mise à mort. De plus, pour la procédure chirurgicale nécessaires à la préparation du cerveau avant prélèvement pour analyse histologique, les souris recevront un traitement antalgique avant l'induction de l'anesthésie terminale. Les animaux seront mis mort à 20 semaines avant l’apparition des symptômes les plus sévères du phénotype. Néanmoins, en cas de difficulté d’accès à l’alimentation,de la nourriture gélifiée sera mise à disposition dans la cage.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous avons choisi d'utiliser les souris parce que ces présents des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. Nous prévoyons d'analyser les animaux à deux âges différents : à 5 semaines quand les souris n’ont aucun problème moteur mais avec des dérégulations moléculaires déjà présentes, et à 20 semaines quand les symptômes débutent. La comparaison des souris témoins et des souris mutantes à ces deux moments du développement des symptômes nous fournira des indications intéressantes sur les dérégulations moléculaires dans cette maladie, ainsi que sur les mécanismes impliqués dans la progression de la maladie.
Evaluer l’efficacité thérapeutique d’un nouveau traitement contre les complications des radiothérapies cérébrales sur un modèle de souris C57BL/6J – 2/3
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Le crâne des souris est irradié sous anesthésie gazeuse, dix minutes par séance, puis leur mémoire et leur locomotion sont testées quatre fois sur six mois. 644 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs structures cérébrales, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 98 d'entre elles, modéré pour 378 et sévère pour 168. L'objet est de tester des vésicules extracellulaires issues de cellules souches contre les troubles de l'attention et de la mémoire qui touchent 50 à 90 % des patients dans les six mois suivant une radiothérapie cérébrale. Le porteur provoque donc délibérément des lésions du cerveau, mais sa liste des nuisances attendues ne retient que le stress du transport, un inconfort transitoire après les injections et les effets possibles des anesthésies répétées.
Objectifs
La radiothérapie dans le traitement des tumeurs cérébrales peut conduire à la mort de cellules non tumorales comme les cellules constituant les vaisseaux sanguins et les neurones. En effet, chez 50-90% des patients suite au traitement de tumeurs du cerveau par radiothérapie il est observé dans les 6 mois des troubles neurologiques avec des troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes. Il est donc indispensable de proposer de nouveaux traitements afin d’améliorer la qualité de vie des patients. Dans ce projet, nous allons évaluer l’efficacité thérapeutique des vésicules extracellulaires issues de cellules souches mésenchymateuses (CSM) pour limiter les impacts de la radiothérapie. Les CSM sont un type de cellules souches adultes très utilisées en médecine dite régénérative. Elles ont la capacité de se renouveler pour créer des cellules spécialisées capable de réparer la fonction d’un organe. Elles sont prélevées chez une personne à partir de la moelle osseuse ou de la graisse corporelle. Elles sont mises en culture puis administrées à l’homme. Cependant, cette stratégie thérapeutique cellulaire a ses limites telles que la transplantation autologue des CSM (prélèvement et administration chez la même personne). Cette technique limite le nombre de patients pris en charge en raison du temps nécessaire à la mise en culture. On note surtout une efficacité des cellules diminuées en fonction de l’âge et de facteurs de risques associés (hypertension, cholestérol). Les cellules peuvent être aussi inutilisables si elles ont été irradiées lors du traitement par radiothérapie. Des études ont démontré que l’effet thérapeutique des CSM serait majoritairement lié à la sécrétion de vésicules extracellulaires (VE). Elles sont produites en grand nombre par les CSM suite à leur activation par des facteurs stimulants. Une production de VE in vitro permet de s’affranchir des limites liées à l’utilisation des CSM via le patient. Les VE sont stockées et conservées sous forme lyophilisée simplifiant leur administration. Les VE permettent de limiter la destruction des vaisseaux sanguins (qui est observée après exposition aux rayonnements ionisants) et donc pourraient permettre de limiter le développement des troubles cognitifs.
Bénéfices attendus
Les bénéfices que ce projet apportera sont multiples tel que - une nouvelle thérapie non-invasive - une réduction des troubles cognitifs (troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes) - une amélioration de la qualité de vie. .
Procédures
Prélèvement sanguin 1 fois sous anesthésie gazeuse isoflurane avant euthanasie, durée du prélèvement sanguin 15 secondes, Prélèvement sanguin répétés sous anesthésie gazeuse isoflurane, durée du prélèvement sanguin 15 secondes Perfusion intracardiaque sous anesthésique, durée 15 minutes Irradiation cérébrale sous anesthésie gazeuse : 10 min sous anesthésie gazeuse isoflurane Administration intra-veineuse sous anesthésie : environ 1 min par administration Les animaux subiront plusieurs fois les interventions qui suivent à différents temps. Tests comportementaux (mémoire, locomotion) réalisés 4 fois sur une période de 6 mois Analyse échodoppler sous anesthésie : 10 min.
Impact sur les animaux
Pour les irradiations (EU2), les animaux étant anesthésiés pour limiter les mouvements, il peut y avoir un effet des anesthésies répétées et les effets potentiels de l’anesthésie sur les variables physiologiques. Pour les administrations et les prélèvements (EU1), même si les animaux sont légèrement anesthésiés, il est possible de noter un inconfort transitoire immédiatement après l’administration. Il peut être noté après des difficultés à respirer, une atteinte des yeux. Pour les transports, il peut être noté un stress chez les animaux suite aux changements des conditions environnantes. Pour les analyses d’imagerie des vaisseaux cérébraux (EU3), les animaux étant anesthésiés pour limiter les mouvements, il peut y avoir un effet des anesthésies répétées et les effets potentiels de l’anesthésie sur les variables physiologiques. Pour les tests de comportements (EU2), il peut être noté un stress chez les animaux suite aux changements des conditions environnementales.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser les prélèvements des structures cérébrales.
Remplacement
Le nouveau développement de stratégie thérapeutique doit être validé sur des modèles précliniques (modèles animaux). En effet, lors des demandes d’Autorisation de mise sur le marché (AMM) ou des médicaments de thérapie innovante auprès de l’ANSM les études précliniques (modèle rongeurs, porcins ou primates) sont demandés. De plus, les modèles in vitro (culture isolée de cellules en boîte de pétri) ne permettent pas d’évaluer le réseau vasculaire ni les troubles cognitifs. Par conséquent l’utilisation d’un modèle murin est indispensable pour valider notre approche thérapeutique.
Réduction
Les modèles d’expérimentation animale présentent une certaine variabilité de réponse. De plus le retour d’expérience des médecins, chercheurs et biostatisticiens déterminent qu’un nombre de 12 ou 15 animaux dans chaque groupe expérimental est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement robustes afin de valider notre nouvelle thérapie.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera réalisé par les personnes compétentes impliquées dans ce projet, afin d’appliquer les points limites pour réduire la souffrance des animaux. De plus, lors de leur transport, les animaux seront placés dans des boites avec sciure, coton et gel qui remplace l’eau et les croquettes (5 animaux par boites de transport, nous ne mélangeons pas les groupes d’animaux). Si un animal présente des signes de souffrance, une mise à mort anticipée sera réalisée. Pour les techniques (échodoppler, irradiation et injection) les animaux seront maintenus sous anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Afin de développer et proposer des thérapies, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle in vivo. Le modèle murin sélectionné pour ce travail est le plus pertinent puisqu’il est le plus utilisé dans les études précliniques. Également, nous avons déjà démontré dans différents modèles murins soumis aux rayonnements ionisants l’efficacité thérapeutique des VE-CSM dans les processus de néovascularisation et la réparation tissulaire. Enfin, nous maîtrisons les techniques indispensables afin d’évaluer les paramètres vasculaires, inflammatoires et cognitifs pour démontrer l’efficacité de notre traitement. De plus, les animaux seront utilisés entre 8/12 semaines, correspondant au stade adulte. Ce stade a été choisi afin d’éviter une hétérogénéité liée à l’âge qui pourrait modifier les paramètres étudiés. A cet âge les animaux présentent des réseaux vasculaire et neurologique matures et stables. Les animaux seront utilisés entre 8/12 semaines, correspondant au stade adulte. Ce stade a été choisi afin d’éviter une hétérogénéité liée à l’âge qui pourrait modifier les paramètres étudiés.
Édition génomique par CRISPR Cas9 pour traiter les cardiomyopathies liées aux mutations du gène LMNA, dans un modele murin Lmna p.H222P homozygote.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris sont tuées à six mois d'âge, avant l'insuffisance cardiaque qui frappe 80 % d'entre elles vers dix mois chez les mâles et douze chez les femelles. 120 souris porteuses d'une mutation du gène LMNA vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. À deux jours de vie, encore éveillées, elles reçoivent une injection intraveineuse d'outils d'édition génomique, puis passent une échocardiographie sous anesthésie chaque mois pendant six mois, l'anesthésie pouvant provoquer une hypothermie et, plus rarement, une défaillance cardiorespiratoire. Le porteur annonce des répercussions "majeures" en santé humaine pour une maladie sans traitement, tout en fixant l'objectif immédiat à la démonstration chez la souris d'une correction déjà obtenue sur des cardiomyocytes dérivés de cellules souches humaines.
Objectifs
Ce projet a pour but l’évaluation de l’effet bénéfique de la correction de la mutation des lamines (protéines fibreuses) chez des souris atteintes d’une maladie génétique touchant le muscle cardiaque. Il a été démontré que cette approche était un moyen de corriger le défaut génétique sur des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) différenciées en cardiomyocytes, porteurs de la mutation des lamines étudiées. Il est nécessaire de réaliser cette approche sur un modèle murin avec la même mutation afin de prouver ce concept en in vivo.
Bénéfices attendus
Correction génique et phénotypique pour les souris traitées. Ce projet peut aboutir à la première démonstration du bénéfice de la correction du génome sur l'atteinte cardiaque dans la cardiomyopathie due à des mutations du gène LMNA. Les repercussions peuvent etre majeures en santé humaine, en tant que medecine personnalisee pour cette pathologie, pour laquelle aucun traitement n'est actuellement disponible.
Procédures
1) Injection intraveineuse à l'âge de 2 jours dans un etat vigile de l'animal. Dans son intégralité (contention+injection), le geste s'effectue rapidement en une dizaine de secondes; 2) Echocardiographie tous les mois, pendant 6 mois, sous anestesie. La durée d’une échocardiographie est de 5 à 10 minutes par souris.
Impact sur les animaux
L'injection intraveineuse est une modalité d’administration peu invasive et facile à mettre en oeuvre, elle peut tout de même engendrer un stress et une faible douleur de courte durée chez le nouveau-né. La fonction cardiaque sera évaluée par échocardiographie, sous anesthésie. Cette technique d'imagerie cardiaque n'est pas invasive, mais l'anesthésie peut induire une hypothermie et dans de rare cas une défaillance cardiorespiratoire. Les effets indésirables attendus sur les animaux sont surtout dûs à un éventuel développement précoce du phénotype dommageable de la lignée. Notre connaissance approfondie de l’histoire naturelle du développement de ce phénotype permet de déterminer précisément la progression de l’atteinte cardiaque et en particulier l’âge (10 mois pour les males et 12 mois pour les femelles) auquel 80pourcents des souris entrent en insuffisance cardiaque. Afin d’éviter toutes douleurs liées à l’insuffisance cardiaque, dans ce projet, les souris sont euthanasiees à 6 mois d'âge. Il peut egalement y avoir une inflammtion au site d'injection de nos AAV. Cependant cela n'a pas ete observé dans d'autres protocoles en place dans notre centre de recherche.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure (thérapie génique et suivi par échocardiographie). Les organes des animaux seront prélévés pour une étude moléculaire de la correction génique et du recouvrement des mécanismes cellulaires.
Remplacement
Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour optimiser le traitement pour la cardiomyopathie causée par des mutations d'un gène spécifique. Pour cela il est nécessaire d’étudier le rôle de notre approche corrective, et les effets du traitement dans un modèle animal tel que la souris pour avoir accès à la fonction cardiaque. Pour réaliser cette étude, l’utilisation du modèle murin est donc indispensable. La pathologie d'intérêt est modélisée uniquement dans l'espèce mus musculus. Les souris mutantes récapitulent à l’état homozygote toutes les caractéristiques phénotypiques de la cardiomyopathie humaine liée aux mutations du gène étudié.
Réduction
Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité permettant une analyse statistique. Néanmoins, 24 animaux par groupe (5 groupes pour un total de 120 souris) seront malgré tout nécessaires pour permettre une analyse statistique. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et que l’on n’ait pas à la refaire.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Les souris sont stabulées sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (les lumières s'allument automatiquement à 6h du matin et s’éteignent le soir à 18h). Les zootechniciens assurent un contrôle quotidien des animaux afin de relever le moindre signe de souffrance, un changement régulier ds cages, un nombre réduit d’animaux par cage (5 maximum hors cages d’accouplement) et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de lanières de papier Kraft afin que les souris puissent faire un nid ainsi que des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage et de la bouillie pourra être introduite dans les cages si nécessaire. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne jusqu’à leur euthanasie (suivi de poids hebdomadaire, évaluation du bien-être général, vérification de l’absence de lésions). Nous avons des mesures mises en place pour réduire la douleur pendant la procédure expérimentale (avec des points limites adaptés)
Choix des espèces
La pathologie d'intérêt est modélisée uniquement dans l'espèce mus musculus. Nous utilisons une souche sur laquelle la mutation Lmna a été dérivée. Les souris mutantes récapitulent à l’état homozygote les caractéristiques phénotypiques de la cardiomyopathie liée aux mutations d'un gène spécifique. Les premiers symptômes sont détectés entre 3 et 6 mois chez les mâles homozygotes et évoluent rapidement jusqu’au décès des animaux provoqué principalement par l’aggravation du phénotype cardiaque. Les souris seront utilisées à deux jours de vie en pré-symptomatique, pour une injection intraveineuse de nos outils de correction génique. Les souris seront ensuite maintenues pour 6 mois car cela permet d'observer l'apparition et l'évolution de phénotype avant l'apparition des premiers symptomes. Le phenotype devient dommageable à 6 mois.
Evaluation de l’efficacité de la combinaison de techniques innovantes en radiothérapie et immunothérapie
- Recherche appliquée
- Cancers
Les rats qui atteignent un point limite de la grille de score sont mis à mort, seuil d'autant plus proche que le critère d'évaluation retenu est la durée de survie après irradiation. 198 rats vont être utilisés, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour évaluation histologique. Une tumeur cérébrale leur est implantée sous quarante-cinq minutes d'anesthésie, puis le crâne est irradié deux semaines plus tard, ce qui provoque apathie, perte de poids et ulcérations du cuir chevelu pendant cinq à six jours. Le porteur écrit que la preuve de concept de ces techniques de radiothérapie existe déjà et situe le projet sur le chemin d'éventuels premiers essais cliniques.
Objectifs
La radiothérapie est l’une des méthodes les plus efficaces et les plus utilisées pour traiter les cancers. Au moins 50% des patients atteints d’un cancer sont traités par radiothérapie durant leur maladie. Le principal défi de la radiothérapie est de parvenir à déposer une dose curative dans la tumeur tout en s’assurant que les tissus sains environnants soient préservés dans leur intégrité. Pour certains types de tumeurs radiorésistantes comme les gliomes (tumeurs cérébrales), la radiothérapie ne peut être que palliative. Pour parvenir à une dose de radiation curative, le risque de dommages graves aux tissus sains est trop élevé pour pouvoir être considéré. Dans ce contexte, notre objectif principal s’inscrit dans l’amélioration des traitements de radiothérapie. Dans le cadre de ce projet, nous nous focaliserons sur des techniques innovantes utilisant de nouvelles modalités de traitement qui ont montré un intérêt significatif dans la préservation des tissus sains (même à des doses très élevées) ainsi qu’un effet très efficace sur le contrôle de la croissance tumorale et une activation efficace du système immunitaire chez des rongeurs. Nous cherchons à améliorer encore l’indice thérapeutique de ces techniques innovantes qui utilisent du fractionnement spatial de la dose en les combinant avec des nouvelles substances immunomodulatrices telles que des gels polymères chargés de nanotransporteurs de gènes pour l’expression forcée de molécules immunostimulantes. Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur l’ augmentation de la survie des animaux
Bénéfices attendus
Ce projet pionnier a un fort impact sociétal. Il explore des techniques novatrices en radiothérapie (RT), avec moins d’effets secondaires dans les tissus sains et permet un contrôle tumoral égal ou supérieur à la RT conventionnelle Le gain en matière d'épargne/récupération tissulaire contribuera à l'élimination du principal obstacle dans les traitements de cancer par RT : les doses de tolérance des tissus normaux. A la fin du projet, nous disposerons d'études radiobiologiques complètes qui nous permettront de procéder à des essais cliniques pouvant bénéficier à des patients qui actuellement reçoivent un traitement seulement palliatif ou pour lesquels les conséquences sur les tissus sains sont très impactantes pour leur qualité de vie et pouvant également ouvrir une voie vers un traitement efficace des tumeurs très radiorésistantes comme les gliomes. En outre, les connaissances biologiques acquises permettront d'améliorer d'autres techniques de RT et peut-être de changer certains des paradigmes de la RT conventionnelle. La preuve de concept de ces techniques innovantes existe déjà, le projet est sur la voie qui va de la conception de l'idée aux éventuels premiers essais cliniques.
Procédures
Dans un premier temps, des cellules tumorales seront implantées dans le cerveau de rats anesthésiés (anesthésie environ 45 minutes). 13 jours après l’implantation des cellules tumorales, les animaux recevront des injections de traitements 5 à 7 jours post irradiation, sous anesthésie générale (durée de l’anesthésie : 30 minutes). 14 jours après l’implantation des cellules tumorales les animaux seront irradiés sous anesthésie générale (durée de l’anesthésie : 20 minutes) au niveau du cerveau . Tous les rats implantés dans le cerveau avec des cellules tumorales seront imagés 1 fois 1 à 3 jours avant irradiation sous anesthésie générale (durée de l’anesthésie : 3-4 minutes) afin de s’assurer de la présence de la tumeur.
Impact sur les animaux
L’implantation intracérébrale de cellules tumorales aura pour conséquence le développement d’une tumeur dans le cerveau. Suite à ces chirurgies et à l’irradiation, des signes d’ apathie peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids transitoire et d’une réduction de la mobilité pendant 3 à 5 jours. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations au site d’irradiation pendant 5 à 6 jours.
Devenir
tous les animaux seront mis à mort pour une évaluation histologique.
Remplacement
Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur la préservation des tissus sains environnants la tumeur et sur le contrôle de la croissance des tumeurs irradiées. De même, les mécanismes inflammatoires et vasculaires induits par l’irradiation ne pourront être étudiés que dans la globalité d’un organisme vivant intégré. Il est donc impossible de faire nos d’études avec des approches in vitro ou en utilisant des organoïdes. Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux à utiliser a été calculé à l'aide d'outils statistiques. Ce nombre est ajusté au plus bas mais permet tout de même de pouvoir conclure.
Raffinement
Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Une étape de socialisation des rats sera mise en place avant toute expérimentation : les rats seront manipulés quotidiennement pour les habituer au manipulateur et à la préhension et permettre ainsi une réalisation plus aisée et moins stressante des procédures expérimentales par la suite. Dans un souci de raffinement, nous veillerons quotidiennement au bien-être des animaux (une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux) pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal-être (détail des points limites appliqués dans la description de la procédure). L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie générale associée à des analgésiques adaptés aux interventions chirurgicales mises en place. Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant quelques jours (3 à 5 jours). Pour y remédier, des aliments appétants seront ajoutés dans la cage. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations sur le dessus de la tête, à l’endroit de l’irradiation pendant quelques jours (5 à 6 jours), une crème, apaisante cicatrisante sera administrée sur la peau pour permettre la cicatrisation (au minimum 1 semaine, application quotidienne). En cas d’atteinte d’un point limite, conformément à la grille de score, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Les rongeurs sont particulièrement utilisés en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. Notre projet va nécessiter de travailler sur des rats chez lesquels la taille plus importante du cerveau va être plus adaptée aux types d’irradiation proposés dans le cadre des procédures expérimentales. Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes de 6-7 semaines, âge compatible avec un développement suffisant et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.
Développement d’un nouveau traitement anti-cancéreux utilisant le 212Pb avec un schéma de traitement novateur
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Cancers
5 500 souris vont être utilisées, chacune recevant de trois à plus de quinze injections, et 5 280 d'entre elles portant une tumeur greffée sous anesthésie. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré pour 4 300 animaux, avec perte de poids, dos voûté, réactions allergiques pouvant aller jusqu'à la léthargie, et pour les survivantes suivies au-delà de quatre mois une anémie liée à l'atteinte des reins par la molécule radioactive. Toutes sont tuées, 3 350 lors d'une prise de sang terminale sous anesthésie. Le porteur commande 10 à 20 % de souris en plus pour couvrir les pertes, et indique que les animaux écartés des études sont le plus souvent utilisés pour entraîner le personnel.
Objectifs
Dans ce projet de radioimmunothérapie préciblée (PRIT), deux anticorps modifiés dirigés contre les cellules tumorales sont utilisés pour les pré-cibler et servent donc de vecteurs de ciblage. Une petite molécule chélatrice, contenant un radionucléide émettant des particules alpha, est ensuite utilisée comme vecteur de destruction des cellules cancéreuses. Cette approche en deux temps, plus spécifique que la radioimmunothérapie classique, évite d’irradier et ainsi d’endommager les cellules saines, tout en gardant un fort pouvoir de destruction des cellules cancéreuses. L'objectif principal du projet est d'évaluer la tolérabilité, la biodistribution et l’efficacité thérapeutique de ce traitement de radioimmunothérapie pré-ciblé dans différents modèles tumoraux et murins. Cet objectif n’est envisageable qu’après une phase d’optimisation des paramètres du traitement, comme par exemple l’évaluation de la dose injectée d’anticorps, de l’activité injectée de la molécule radioactive ou du temps d’attente entre les deux injections. Deux objectifs secondaires sont également visés lors de ce projet, le premier est de trouver d’éventuels partenaires thérapeutiques afin d’améliorer l’efficacité de ce traitement. Le second consiste à évaluer le potentiel thérapeutique du PRIT sur d’autres cibles thérapeutiques surexprimées à la surface d’autres cellules tumorales afin d’élargir le nombre de patiients pouvant bénéficier de ce traitement.
Bénéfices attendus
Ce projet consiste à développer un nouveau traitement de radioimmunothérapie pré-ciblé utilisant le 212Pb. L’objectif final est donc le passage de ce traitement en phase 1 d’un essai clinique en 2025. Concernant le projet de recherche appliquée, il vise différents objectifs à court et long terme. À court terme, la biodistribution des différents composés, l’efficacité thérapeutique et la tolérabilité de ce nouveau traitement sont à évaluer. Pour ce faire, différentes études utilisant des souris seront réalisées (incluant une première phase d’optimisation du schéma thérapeutique). Ensuite, l’étude des mécanismes d’action est également à réaliser pour permettre une meilleure compréhension des phénomènes mis en jeu (effet direct des rayonnements ionisants, activation du système immunitaire...). Ceci permettra le test de nouvelles opportunités de combinaison basées sur une analyse rationnelle des mécanismes d’action, afin de moduler les réponses au traitement pour augmenter son efficacité/tolérabilité. Enfin ce traitement de radioimmunothérapie pré-ciblé peut également être dirigé contre d’autres cibles thérapeutiques que celle choisie pour ce projet. Ainsi, une phase d’évaluation de nouvelles cibles thérapeutiques sera également réalisée afin d’élargir le nombre de patients pouvant bénéficier de ce traitement extrêmement prometteur. A long terme, toutes ces études ont pour objectif final d’appuyer les dossiers de demande d’essais cliniques.
Procédures
Les gestes techniques réalisés sur les souris sont : inoculation sous-cutanée de cellules tumorales, implantation de cellules tumorales par chirurgie ou injection intraveineuse ou intrapéritonéale, traitement par injection intrapéritonéale ou intraveineuse, gavage ou prise de sang. L‘inoculation des cellules tumorales est réalisée sous anesthésie générale. Cela concerne 5280 souris. Les 10% des animaux restant (soit 220 souris) subissent l’injection intraveineuse ou intrapéritonéale des cellules tumorales en vigile. N.B. Dans de très rare cas, des animaux ne sont pas greffées avec des cellules tumorales dans le but de simplement évaluer la tolérabilité d’un traitement. Un protocole d’analgésique, pour diminuer la gêne et la douleur des souris au maximum lors de l’implantation des cellules tumorales par chirurgie, est réalisé toutes les 12h en injection sous-cutanée pendant 48h et débutant entre 30 min et 3h avant l’intervention chirurgicale associée à une mise à disposition dans l’eau de boisson. Cela représente 540 souris. Les injections intraveineuses, intrapéritonéales ou par gavage en vigile sont réalisées sur 100% des souris. Les souris reçoivent en général entre 3 et 9 injections de traitement (ou de solutions véhicules pour les groupes non traités) pouvant aller jusqu’à plus de 15 injections si le nombre de cycles de traitement est augmenté. Les prises de sang sont réalisées sous anesthésie en terminal (sans réveil) sur 3350 souris. Des prélèvements de sang répétés peuvent également être réalisés, sous anesthésie générale (de 3 à 10 prélèvements espacés d’une semaine à plusieurs mois) en respectant les volumes prélevés et le temps de rétablissement recommandé. Cela concerne 1070 souris.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, nous sommes amenés à réaliser plusieurs injections aux souris (cellules, traitements…), ce qui entraine la nuisance aux souris la plus importante. De plus, des anesthésies peuvent également être réalisées, générant un stress chez l’animal. Un léger stress lié aux manipulations est également observable mais est fortement diminué grâce à l’habituation mise en place au préalable. Cette demande étant un renouvellement, nous avons un retour d’expérience important sur les nuisances générées après notre traitement. Ce traitement peut engendrer de façon très transitoire certains effets indésirables (perte de poids et fatigue passagère le plus souvent démontrée par le dos vouté, poil négligé, baisse d'activité). Ces effets secondaires sont légers à modérés et transitoires. Un complément alimentaire en gel est ajouté pendant les 7 jours suivant l’injection de la molécule radioactive pour une meilleure récupération. Ce complément est maintenu si les souris présentent une perte de poids supérieure à 10% de leur poids initial. Dans le cas d’un suivi à très long terme des souris guéries (> à 120 jours post traitement), certains symptômes peuvent apparaitre (ex : anémie ou surconsommation d'eau). Cela serait lié à une diminution des fonctions rénales due à la voie d’élimination de la molécule radioactive via les reins. L’injection répétée d’anticorps humains peut engendrer des réactions immunitaires (type réaction allergique) chez la souris si celle-ci est immunocompétente. La réaction peut-être plus au moins forte : démangeaison, vasodilatation, somnolence pouvant allez jusqu'à la léthargie, gonflement de la face, etc. Ces réactions ne sont que transitoires (entre 5 minutes à 2h). Une surveillance accrue des souris est faite jusqu’au rétablissement complet de la souris. La déplétion au préalable des lymphocytes B ou le choix d’un modèle murin humanisé, ou immunodéprimé lorsque cela est possible, permettent d'éviter ce type de réactions. Le choix des souris immunocompétentes est fait que lorsque l’objectif de l’étude est l’analyse des mécaniques d’action ou d’une combinaison mettant en jeu le système immunitaire mais n’est pas fait de manière systématique sur ce projet.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans ce projet sont euthanasiés à la fin des études. Ce choix est justifié car l’adoption est impossible. En effet, les souris sont transgéniques et/ou immunodéficientes. De plus, dans la majorité des cas, elles sont porteuses d’une tumeur et/ou ont été injectées avec notre traitement. Certaines souris sont exclues d’une étude au moment de la création des groupes (développement tumoral ou poids non conforme aux autres animaux, problème de comportement, etc.). Ces souris peuvent être utilisées pour le maintien des compétences du personnel ou pour l’analyse d’organes ex vivo pouvant servir pour des analyses futures.
Remplacement
Tous les tests de mise au point des anticorps ont été réalisés par des tests in vitro. De plus, chaque étude in vivo est murement réfléchie et une alternative in vitro est envisagée le cas échéant. Par exemple, des tests réguliers de vérification sont faits en amont des études pour garantir le bon fonctionnement des anticorps et de la non-contamination des cellules tumorales utilisées. Cependant, l’étude d’un organisme complexe avec l’organisation biologique mimant un patient est indispensable dans le développement d’un radiopharmaceutique. C’est pour cela que le modèle murin a été choisi. Malheureusement aucune méthode de substitution n’est connue à ce jour.
Réduction
Basé sur des analyses statistiques, la comparaison de deux moyennes observées nécessite 10 souris/groupe pour obtenir une puissance statistique de 0.8 associé à un α de 0.05 (paramètres utilisés : moyenne 1 = 1500 mm3, moyenne 2 = 800 mm3, écart-type = 600 mm3). De plus, notre retour d’expérience nous permet de savoir que 10 souris/groupe permet d’obtenir des résultats statistiquement analysables. Ainsi, pour mettre en place des nouveaux modèles tumoraux ou évaluer la croissance tumorale (en fonction des traitements), un minimum de n=10 souris est généralement utilisée. Pour évaluer la biodistribution in vivo de la molécule radiomarquée, les expériences sont conçues en utilisant un nombre compris entre 3 et 6 souris par groupe. Le choix est fait en fonction d’expériences antérieures dans des études similaires, des résultats attendus ainsi que de l’objectif final de l’étude afin d’utiliser le nombre juste de souris. Pour chaque expérimentation une analyse au préalable pour définir le nombre de souris par groupe est réalisée en fonction des résultats attendus et de la puissance statistique souhaitée. L’analyse statistique à posteriori des données est automatisée et est effectuée à l’aide des logiciels spécifiques. Pour pallier à tout problème de perte de souris avant ou pendant les études (ex : malocclusion, blessures, perte de poids…), ou aux problèmes d’hétérogénéité de prise de greffe, des souris supplémentaires sont incluses dans les commandes de souris. Ce nombre de souris supplémentaires est défini en fonction de l’objectif des études et du retour d’expérience sur la lignée tumorale utilisée et est généralement de 10% avec un maximum de 20% lors d’utilisation de lignées tumorales avec un faible taux de prise de greffe ou un geste technique plus risqué pour les souris (ex : chirurgie). Ceci dans le but d’empêcher de recommencer une étude non analysable par manque de souris, pour être en accord avec la règle des 3R. Les souris exclues des études sont utilisées le plus souvent pour le maintien des compétences du personnel réalisant les expérimentations in vivo. Cela permet de réduire le nombre d’animaux commandé pour la formation du personnel et permet d’utiliser l’ensemble des souris à des fins scientifiques. Les souris exclues peuvent également être utilisées pour des prélèvements d’organes qui seront eux-mêmes utilisés pour différents tests in vitro et/ou mis en banque histologique pour une utilisation ultérieure.
Raffinement
Un minimum de 5 jours d’acclimatation est réalisé. Les animaux sont habitués à la manipulation, à la pesée, etc. Le lapse de temps entre l’inoculation des cellules tumorales et l’obtention de tumeurs de tailles suffisantes avant le début des traitements est également utilisé pour continuer l’habituation. Nous mettons différents éléments, à disposition dans les cages, permettant aux souris d’exprimer des comportements spécifiques à leur espèce (coton, pièce de bois, tunnel, maisonnette). Ces enrichissements peuvent être amenés à évoluer dans une optique d’amélioration continue et en fonction des situations (conflit, souche de souris plus sensible au stress, etc.). Des enrichissements supplémentaires sont également utilisés afin d’améliorer leur bien-être (graine de tournesol ou encore mezzanine). Des gestes simples mais indispensables sont également réalisés afin d’optimiser le confort des souris et de réduire le stress tels que : l’utilisation d’un gel pour le confort des yeux lors des anesthésies, la diffusion de musique classique via une radio installée dans la salle d’hébergement pour masquer les bruits environnants, un filtre rouge placé sur la fenêtre de la porte cachant la vision des souris sur l’extérieur (va-et-vient du personnel devant la porte), la température corporelle des souris est maintenue (tapis et lampe chauffante). Lors des chirurgies, un analgésique est utilisé en pré et post opératoire pour supprimer la douleur. Une fiche de score pour le suivi de l’état physique et comportemental de chaque animal est utilisée quotidiennement. Cette fiche permet de ne pas aller au-delà de nos critères de terminaison prédéfinis au début de l’étude expérimentale.
Choix des espèces
L'utilisation de la souris est justifiée par le développement de la biologie moléculaire qui a abouti à la création de nombreux modèles murins génétiquement modifiés, et par l'existence de lignées immunodéficientes (SCID, Athymique nue, etc.) qui autorisent la greffe de cellules tumorales humaines. Le séquençage complet du génome de la souris a démontré la proximité phylogénétique des souris et des hommes : 90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Le remplacement dans le génome du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées et ainsi de travailler sur des modèles très proches de ce que l'on pourrait voir chez l'homme. Nous utilisons des souris adultes ou en fin de développement pour nos expérimentations afin que leur système immunitaire soit mature. De plus nous avons besoins qu'elles soient assez jeunes pour un suivi à long terme, c'est pourquoi les souris intégrées aux études ont généralement 8 semaines. Cependant, l’utilisation de souris transgéniques nous contraint parfois à utiliser des souris plus jeunes car le nombre limité de ces souris ne nous permet pas d’avoir un lot du même âge pour débuter l’étude. De plus, nous essayons de recevoir les animaux de 6 à 15 jours avant le début de leur utilisation dans un protocole expérimental afin de réaliser l’acclimatation et l'habituation des souris.
Etude des mécanismes de l’anaphylaxie aux curares
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Un choc anaphylactique aux curares est déclenché chez 5 440 souris génétiquement modifiées pour porter des récepteurs humains aux anticorps, avec deux prélèvements de sang obtenus par section du bout de la queue. Les procédures sont classées en souffrance modérée et toutes les souris sont tuées, le résumé se bornant sur ce point à deux mots, "mise à mort". Le projet cherche les mécanismes cellulaires d'une réaction dont le porteur rappelle qu'elle tue 4,1 % des patients qui la subissent en France malgré l'adrénaline. La rubrique des effets attendus ne mentionne, elle, que le stress de la contention et la douleur de la piqûre, sans un mot sur le choc lui-même.
Objectifs
Le choc anaphylactique est l’expression la plus sévère des réactions d’hypersensibilité immédiate. La période périopératoire est associée à un risque particulièrement élevé de choc anaphylactique. C'est particulièrement le cas pour les curares, qui sont utilisés en anesthésie pour provoquer un relâchement musculaire, en agissant sur la jonction neuro-musculaire, ce qui empêche les muscles de se contracter. Le choc anaphylactique impliquant un curare est associé à une mortalité élevée, estimée à 4,1% en France, et ce, malgré une reconnaissance rapide de la réaction et l’administration très précoce d’adrénaline, le traitement de référence. Ceci indique que les mécanismes de l’anaphylaxie aux curares ne sont pas encore bien identifiés. L'objectif est de disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’anaphylaxie aux curares, ce qui permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour traiter cette pathologie.
Bénéfices attendus
Le présent projet a pour but d’identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires de l’anaphylaxie aux curares. Ces travaux pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter l’anaphylaxie aux curares et en réduire la mortalité.
Procédures
Les procédures sont de sévérité modérées et seront réalisées dans le strict respect des règles mises en place pour veiller au bien-être des animaux. Les animaux vigiles subiront un stress au moment de l'anesthésie, lors de la contention de l'animal, mais ce geste n'est pratiqué que par des expérimentateurs habilités à le réaliser (donc rapidement). Une douleur peut être ressentie au niveau du site de piqure de l’aiguille lors de l’injection de l’anesthésiant (durée 5 s). Tous les autres gestes invasifs sont réalisés sur souris anesthésiées : il s’agit des traitements administrés par injection: soit 48h, soit 24h, soit 30 min ou 5 min avant le début des mesures. Ces injections ont une durée de 10s. Il s’agit également d’un prélèvement de petit volume de sang réalisé à deux reprises (durée de 15 s) espacées de 24h.
Impact sur les animaux
Les animaux vigiles subiront un stress au moment de l'anesthésie, lors de la contention de l'animal. Une douleur peut être ressentie au niveau du site de piqure de l’aiguille lors de l’injection de l’anesthésiant. Une douleur peut être ressentie à l’extrémité de la queue après section pour prélèvement sanguin.
Devenir
mise à mort
Remplacement
Le recours à l’utilisation d’animaux est justifié par le fait que les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’anaphylaxie sont difficiles, voire impossible à étudier chez l’homme, vue l’imprévisibilité de l’évènement et sa rareté. De plus, l’anaphylaxie est un phénomène multifactoriel qui implique plusieurs types de cellules sanguines (basophiles, neutrophiles, monocytes, plaquettes) et tissulaires (mastocytes, macrophages) et faisant intervenir des intercommunications complexes entre les cellules circulantes, la paroi vasculaire et les cellules résidantes des tissus environnants, qui ne peuvent pas être reproduites de façon complète in vitro, tant sur le plan des identités en jeux que sur le plan temporel. La compréhension des processus physiopathologiques intégrés est donc pratiquement impossible chez l’homme et le recours à des études in vivo chez l’animal s’avère nécessaire. Occasionnellement, des études in vitro seront réalisées sur du sang de souris ou sur cellules isolées (plaquettes, neutrophiles). Cependant, elles ne pourront représenter à elles seules la pathologie étudiée.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum afin d’obtenir des données statistiquement significatives. Le n a été calculé par une analyse de puissance. Il s’agit de 4 animaux/groupe. Le maximum de prélèvements sera réalisé sur une même souris (organes, sang, liquides broncho-alvéolaires).
Raffinement
Le modèle animal est choisi dans le but de reproduire, le plus fidèlement possible, la pathologie étudiée et d’en tirer le maximum d’information. Les expériences seront raffinées afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés aux procédures expérimentales: - Au moins 72h avant la procédure, les animaux sont répartis par groupes et mis dans les cages (tout en respectant les groupes sociaux) qu’ils occuperont tout au long du processus.
Choix des espèces
Le recours à l’étude in vivo chez l’animal est nécessaire, car l’anaphylaxie est un phénomène multifactoriel qui implique plusieurs types de cellules sanguines et tissulaires et faisant intervenir des intercommunications complexes entre les cellules circulantes, la paroi vasculaire et les cellules résidantes des tissus environnants, qui ne peuvent pas être reproduites de façon complète in vitro, tant sur le plan des identités en jeux que sur le plan temporel. Pour comprendre les mécanismes de l’anaphylaxie nous utilisons des souris modifiées génétiquement, dites «humanisées » pour l’expression du récepteur FcER1 des IgE ou pour le récepteur FcGRIIA (CD32A) pour les IgG. Les techniques de transgénèse sont maîtrisées chez la souris et ces souris sont disponibles au laboratoire. Ces modèles animaux nous permettent d’étudier in vivo les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de l’anaphylaxie. Le modèle d’anaphylaxie active ou médié par les IgE pratiqué chez la souris non transgénique, fait consensus dans la communauté scientifique car il représente fidèlement l’anaphylaxie survenant chez l’homme. Les animaux sont utilisés au stade adulte, entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.
Développement, validation et caractérisation d’un anticorps chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Jusqu'à seize prises de sang dans la joue sur animal vigile, réparties sur vingt-quatre semaines : 1 440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse du cœur et des organes. Une partie subit une chirurgie de trente minutes provoquant un infarctus du myocarde, avec douleur postopératoire et mobilité réduite pendant huit heures. L'objectif est de mettre au point un anticorps ciblant une population immunitaire, à administrer chez des patients en phase aiguë d'infarctus. Le porteur retient la souris parce qu'elle se reproduit vite et donne beaucoup de petits, et parce que les lignées mutantes voulues n'existent que chez elle.
Objectifs
L’incidence de l’insuffisance cardiaque consécutive à un infarctus du myocarde (IM) est en augmentation constante et la mortalité à moyen et long termes reste élevée, ce qui constitue un enjeu médical et sociétal majeur. Si la prise en charge aigüe a permis de diminuer la mortalité dans les premiers jours, les conséquences chroniques de la perte de fonction cardiaque restent importantes et sont associées à une perte de qualité de vie et un coût conséquent pour la société. Notre projet a pour but de développer un outil thérapeutique à utiliser en clinique à la suite d'un infarctus du myocarde afin de limiter l'atteinte cardiaque. A cette fin, nous utiliserons des modèles de souris génétiquement modifiées pour développer un anticorps ciblant une population immunitaire particulière. Nous traiterons des souris avec cet anticorps pour confirmer son effet en condition non pathologique. Pour valider son efficacité, nous l'utiliserons dans des modèles de souris soumises à un infarctus du myocarde induit chirurgicalement sous anesthésie générale. L’analyse consistera à étudier la fonction cardiaque, le remodelage cardiaque et la réponse inflammatoire post-infarctus.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de développer une stratégie thérapeutique innovante visant à limiter les dommages tissulaires après un infarctus du myocarde et par conséquent, réduire la mortalité post-infarctus et limiter le développement de l’insuffisance cardiaque. Ce développement d'un nouveau traitement à utiliser en phase aiguë de l'infarctus du myocarde et visant à réduire les dommages et le remodelage cardiaque présente de nombreux avantages potentiels, permettant d’améliorer la qualité de vie des patients, diminuer les ré-hospitalisations, réduire les coûts de santé et diminuer la morbidité.
Procédures
Une partie des animaux va subir des prélèvements sanguins répétés par voie submandibulaire, étant vigile. Ces prélèvements sont d'une durée inférieure à 1 minute. Il y aura jusqu'à 16 prélèvements, espacés au minimum d'une semaine et répartis sur une durée allant jusqu'à 24 semaines. Une partie des animaux va subir une chirurgie de 30 min au cours de laquelle un infarctus du myocarde est réalisé sous anesthésie générale. Un minimum de quatre injections sous-cutanées d’analgésiques (durée inférieure à 30 secondes pour chaque injection) sont prévues, dont une en préopératoire. A différents temps après l’opération, une échocardiographie non-invasive indolore sera réalisée sous anesthésie générale, d’une durée maximale de 15 minutes. Une partie des animaux va subir une injection intraveineuse d'une durée maximale de 30 seconde sous anesthésie générale. Une autre partie des animaux va subir deux injections par voie intraveineuse d'une durée maximale de 30 secondes sous anesthésie générale, espacées de 3 jours.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension et contention des animaux, potentielle douleur au point d'injection, stress lié à l'anesthésie, stress/potentielle douleur lors de la pose de la bague à l'oreille pour identification; douleur au site de prélèvement dans les cadre des prélèvements sanguins répétés. Effets de la chirurgie : douleur post-opératoire, mobilité transitoirement réduite suite à l'anesthésie (8 heures).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur et les organes.
Remplacement
Afin de respecter le principe des 3R, les anticorps seront générés en utilisant des lignées cellulaires. Par ailleurs, les différents clones seront au préalable caractérisés sur des cellules afin pré-sélectionner les clones les plus intéressants à tester chez la souris. Ces modèles animaux représentent une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes survenant au cours de l’infarctus du myocarde. En effet, ces événements sont des phénomènes complexes impliquant un grand nombre de types cellulaires, ce que des modèles artificiels ne pourraient pas permettre de recréer dans leur entièreté. Nous voulons étudier chez l'animal, le phénomène de réparation tissulaire consécutif à une atteinte cardiaque. Ces modèles murins pré-cliniques sont également un préalable absolument nécessaire et indispensable pour la validation des stratégies thérapeutiques afin de les mettre en application chez des patients présentant un infarctus du myocarde.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste. En utilisant des calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux, nous obtenons une taille d’échantillon de 15 souris par groupe. En tenant compte des aléas inhérents à la procédure chirurgicale, nous estimons une taille de groupe à 20 animaux. Les résultats seront analysés à l'aide des tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Par ailleurs, il y aura un enrichissement complémentaire dans certains cas particuliers. La souffrance animale sera réduite au maximum par l'utilisation d’anesthésie générale et d’analgésie adaptées, et par l’établissement et l'application de points limites stricts et spécifiques au projet. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière et renforcée par les expérimentateurs confirmés et par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Les grilles de score de suivi des points limites seront remplies sous contrôle de la personne responsable de la mise en oeuvre du projet.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. De plus, c’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées mutantes que nous souhaitons étudier. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications vasculaires dans un espace de temps raisonnable. Grace à ces modèles murins, nous pourrons obtenir rapidement des résultats très importants pour notre projet, ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce qui prendrait beaucoup plus de temps à se reproduire et où le nombre de naissance serait nettement moins important. Nous utiliserons des souris adultes, âgées de 8 à 10 semaines minimum et chez lesquelles le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité.
Évaluation de l’effet de nanocomposites en bioverre et polyester ayant des propriétés ostéogénique, angiogénique et antibactérienne dans un modèle de défaut critique de calvaria chez le rat.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Tester des biomatériaux censés combler une perte osseuse de la mâchoire chez l'humain passe ici par le crâne de 180 rats, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux trous de quatre millimètres sont percés dans la voûte crânienne de chaque animal, un par os pariétal, ce qui permet au porteur de doubler le nombre d'implants testés sans augmenter l'effectif. Deux injections de colorant précèdent la mise à mort, qui sert à prélever les calvarias pour analyse, les cadavres étant ensuite évacués. Le suivi repose sur un décompte de signes cliniques, un signe déclenchant des croquettes humidifiées, deux un analgésique toutes les douze heures, trois la mise à mort.
Objectifs
L’objectif du projet est de tester de nouveaux matériaux pour le comblement d’une perte osseuse mandibulaire avec une taille de défaut critique > 1 cm2 chez l’homme, tout en servant de support à la repousse osseuse, possédant des propriétés de revascularisation et antibactériennes. L’expérimentation que nous projetons, sera menée chez le rat. La zone d’étude (zone dans laquelle le défaut osseux sera créé) choisie est la calvaria (partie supérieure du crâne cérébral) plutôt que la mandibule afin, de simplifier la chirurgie et d’améliorer le bien-être et le taux de survie des animaux (risques de sous-alimentation, de douleur et d’infection plus élevés dans la zone buccale). A noter que la calvaria est un os dont l’origine embryonnaire est proche de la mandibule . Ces biomatériaux forment un réseau poreux constitué de polymère biodégradable (PLA ou acide polylactique) et de particules de bioverres plus ou moins supplémentés par un ion cationique (ion possédant des propriétés antibactériennes). Les biomatériaux possèdent une porosité orientée, bimodale et interconnectée ainsi que des propriétés mécaniques suffisantes pour supporter la manipulation par les chirurgiens et la repousse osseuse. Enfin, les propriétés biologiques des matériaux ont été évaluées telles que la dégradation en solution aqueuse, la cytotoxicité (propriété d'un agent biologique à être toxique pour les cellules) et les propriétés antibactériennes. Des essais préliminaires ont été réalisés dans un modèle de défaut critique chez le petit animal (calvaria de rat) avec des biomatériaux du même type que ceux qui seront utilisés dans ces prochaines expérimentations, en résulte aucun effet adverse.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de valider chez les animaux le potentiel de régénération osseuse et de revascularisation d’un matériau poreux constitué d’un réseau de bioverres (supplémentés ou non avec un ion cationique) et d’un polymère biodégradable. Cette étude pourrait participer à l’élaboration d’un nouveau traitement pour la reconstruction osseuse consécutive à l’ORN (ostéoradionécrose, une complication sévère de la radiothérapie, liée à un défaut de cicatrisation du tissu osseux). Ce matériau a pour objectif d’être pratique à utiliser pour les cliniciens et efficace pour la repousse osseuse, la revascularisation et ayant effet antibactérien (propriété de l’ion cationique).
Procédures
Les animaux seront soumis à l’implantation d’un biomatériau chargé ou non en cation au niveau d’un défaut osseux critique de calvaria de rats réalisé au préalable (temps opératoire max : 20 minutes). Cette procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et une analgésie adaptée sera appliquée. Les animaux vigiles seront aussi soumis à deux injections intrapéritonéales de colorants vitaux de quelques secondes, 14 et 2 jours avant leur mise à mort. Aucun prélèvement sur animaux vigiles ne sera réalisé.
Impact sur les animaux
Un des modèles les plus pertinents utilisés pour étudier la régénération osseuse est le défaut critique (4 mm) de calvaria chez le rongeur. Par conséquent, ce modèle d’étude sur le rat consanguin Lewis a été étudié depuis plusieurs années, validé et publié. Les effets indésirables attendus peuvent être une difficulté de récupération de l’animal suite à l’anesthésie, l’apparition de douleurs au site d’implantation, une gêne fonctionnelle due à une réaction inflammatoire ou une mauvaise cicatrisation. De façon générale, différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué…) seront attentivement regardés.
Devenir
En fin d’expérimentation, tous les animaux seront mis à mort. Les cadavres des animaux seront évacués exceptés les calvarias qui seront prélevées, fixés et préparées pour réaliser les analyses radiologiques et histologiques au laboratoire qui permettront l’évaluation de la néoformation osseuse et des propriétés angiogéniques des biomatériaux.
Remplacement
L’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des biomatériaux fonctionnalisés en termes de biocompatibilité et d’ostéoconduction. Il n’existe malheureusement pas de solution de remplacement complet ou pas par des invertébrés en raison de l’étude menée sur le tissu osseux. Des études in vitro de cytocompatibilité des composites ont été réalisées, il est maintenant nécessaire de tester in vivo sur le petit animal.
Réduction
Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les biomatériaux utilisés ont été sélectionnés en amont et déjà testés in vitro et in vivo (expérience pilote) pour leur biocompatibilité. Lors de la procédure, les défauts osseux seront réalisés sur chaque os pariétal qui compose la calvaria de rats, soit 2 défauts par animaux, réduisant de fait le nombre d’animaux tout en préservant la puissance statistique. De plus, l’étude de la bibliographie nous a permis de déterminer au nombre de 7 la quantité d’implants nécessaires à l’obtention de résultats significatifs. Cela nous permet ainsi de constituer des groupes avec un nombre d’animaux nécessaires et suffisants pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs, reproductibles et permettant à la valorisation des résultats de cette étude. Le nombre d’animaux est ainsi réduit au strict minimum. Le logiciel Prism 10.0.0 sera utilisé pour mener à bien l'ensemble des analyses statistiques.
Raffinement
Afin de raffiner la méthodologie, les procédures de manipulation et de surveillance régulière sont élaborées avec l’objectif d’éliminer toute forme de souffrance animale. Chaque étape de l’étude tiendra compte du bien-être de l’animal, de son arrivée dans l’animalerie spécialisée à sa mise à mort en fin d’étude. Une analgésie chimique est assurée en pré- et post-opératoire. Les rats sont anesthésiés par inhalation gazeuse durant toute la procédure. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 20 minutes, sera effectuée sur tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie éventuelle. Les rats seront ensuite transférés dans une couveuse chauffante le temps de récupérer suite à ce réveil. Le reste du temps, les rats seront hébergés en groupe sociaux de 2 individus par cage avec enrichissement physique sous forme de tunnel en carton, un bâton de bois à ronger et recevront une nourriture standard et de l’eau de boisson ad libitum. De façon générale, un suivi hebdomadaire des animaux permettra d’évaluer leur état de santé. Dans les cas particuliers du suivi post-opératoire et du suivi post-injection, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant les 3 premiers jours. Si des signes cliniques sont observés, la gestion de la douleur se fera comme suit : 1 signe notable = visite 3 fois/semaine, mise à disposition de croquettes humidifiées dans la cage ; 2 signes notables = administration d'un analgésique en sous-cutanée toutes les 12h ; 3 signes notables ou un signe sévère (point limite) = euthanasie. S’ajoute à cette observation une surveillance réalisée par les animaliers lors de l’entretien des cages des animaux (une fois tous les 10 jours).
Choix des espèces
L’utilisation du rat est justifiée car il s’agit d’un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques. De plus, de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Le modèle de défaut osseux critique de calvaria chez le rongeur est couramment utilisé dans la littérature pour l’étude de la régénération osseuse et est parfaitement validé. Les animaux inclus dans cette étude seront des rats mâles âgés de 12 semaines au début de la procédure. Ceci permet d’avoir des animaux matures sans pathologies associées au vieillissement tout en limitant les biais liés à la croissance osseuse physiologique.
Etude d’efficacité de vaccins vétérinaires chez le chien.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Tester des formulations de vaccins pour un donneur d'ordre avant leur mise sur le marché conduit ici à utiliser 750 chiens beagles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit jusqu'à trois vaccinations et des prises de sang répétées, d'abord toutes les deux semaines puis tous les mois, certaines études se prolongeant sur plusieurs années. Aucun n'est tué dans le cadre de ce projet, tous restant disponibles pour une autre procédure expérimentale après un repos jugé suffisant. Le porteur indique qu'aucune analyse statistique ne sera menée et que l'essai sur l'espèce cible est une étape obligatoire pour l'autorisation de mise sur le marché.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité de différentes formulations de vaccins vétérinaires chez le chien beagle mâle ou femelle.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la mise à disposition de nouveaux vaccins canins permettant de mieux protéger les chiens face à différentes maladies canines.
Procédures
Les interventions suivantes seront réalisées : - Prélèvements sur animaux vigiles : plusieurs prélèvements sanguins espacés de façon croissante et régulières durant toute la durée de l’étude (environ un prélèvement toutes les deux semaines puis tous les mois pour les études sur le long terme). - Administrations de vaccin sur animaux vigiles selon la posologie, la fréquence et la voie d’administration recommandée par le fabricant (jusqu’à 3 vaccinations espacée de 2 semaines à 1 an) - Examens cliniques sur animaux vigiles : diverses mesures non invasives (prise de température rectale, pesée).
Impact sur les animaux
Aucune réaction sévère n’est attendue, la non-toxicité de tous les vaccins vétérinaires testés aura au préalable été vérifiée par le Donneur d'Ordre. Les nuisances attendues liées aux prélèvements sanguins des animaux sont celles liées au stress de la contention et de l’introduction de l’aiguille sous la peau entraînant une sensibilité légère et transitoire au point d’introduction.
Devenir
A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre procédure expérimentale, suite à un repos suffisant.
Remplacement
Le recours aux chiens sur ce projet est justifié car ils représentent l’espèce cible du vaccin et qu'il n’existe pas de méthode alternative pour ce type de test. L’étude sur l’espèce cible est une étape obligatoire pour le développement et la mise sur le marché d’un nouveau vaccin.
Réduction
Aucune approche statistique ne sera réalisée pour ce projet. Le nombre d’animaux utilisés correspond au minimum pour que chaque test inclut le nombre d’animaux requis afin d’obtenir des résultats interprétables, selon les guidelines européennes le cas échéant. Le nombre d’animaux sera ajusté pour chaque étude en fonction des besoins définis par les objectifs scientifiques. Le nombre d’animaux pourra être réduit par des études pilotes pour évaluer les doses ou concentrations optimales.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’âge des animaux avec divers enrichissements (jouets suspendus, tunnel/plateforme). Les animaux pourront être hébergé dans un milieu protégé (avec des précautions prises par le personnel) pour éviter toutes contaminations des animaux non vaccinés par un virus sauvage ou un virus vaccinal provenant d’animaux vaccinés sur le même site. Pour les procédures expérimentales longues (plusieurs mois, voire années), en fonction de leur statut vaccinal, les animaux auront accès à l’extérieur à l’issue des 4 premiers mois. Des mesures protectives tels que des barrières anti-rongeurs resteront en place également sur ces hébergements extérieurs en fonction de l’antigène testé. Tout au long de la procédure, les animaux auront accès à volonté à l'eau et à une nourriture adaptée à leur âge et répondant à leur besoin énergétique. Si la procédure expérimentale commence sur de jeunes chiots, ils seront si possible sevrés à l’âge standard, ou en tout cas le plus tard possible en fonction des contraintes scientifiques de l’étude. Si le projet commence sur des adultes, ils seront acclimatés aux conditions environnementales du site depuis au minimum 2 semaines. Les volumes et les fréquences de sang prélevés et les doses administrées respecteront le bien-être des animaux en fonction de la voie d’administration. En cas d’apparition d’un signe de souffrance ou d’un signe clinique sévère chez l’animal (exemple : vomissements très intenses à répétition, prostration de l’animal, difficultés respiratoires…), il sera pris en charge par le vétérinaire désigné et pourra recevoir un traitement adapté pour le soulager et si nécessaire être exclus de la procédure expériementale.
Choix des espèces
Le chien est l’espèce cible du vaccin en développement. L'efficacité du traitement doit être mesurée et validée pour le bon développement du vaccin. Il n’existe pas de méthode de remplacement pour ce type d’évaluation. Chiens d'âge correspondant à celui indiqué pour le traitement.
Role de la dérégulation de la voie BMP dans l’hypertension pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Repris d'un projet en cours pour éviter d'en commander de nouveaux, les rats témoins non malades rejoignent ici une cohorte de 560 individus soumise à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Placés à quatre semaines dans une atmosphère à 10 % d'oxygène pendant trois semaines consécutives pour reproduire l'altitude, ils reçoivent une injection abdominale par jour, subissent deux anesthésies pour échocardiographie puis un cathétérisme cardiaque, avant d'être tués pour le prélèvement des poumons et du cœur. Le porteur qualifie les effets de cette hypoxie prolongée de bénins, au motif que seule la phase précoce de la maladie est étudiée. Il affirme par ailleurs que trois modèles animaux complémentaires sont "indispensables" pour établir la preuve de concept, alors que les résultats de départ viennent d'échantillons pulmonaires humains et de cultures cellulaires.
Objectifs
L'hyperTension Artérielle Pulmonaire (HTAP) est une maladie qui affecte les petits vaisseaux du poumon qui vont s'épaissir par un processus appelé remodelage vasculaire pulmonaire. Cette altération va imposer un effort au cœur qui à terme va aboutir à une insuffisance cardiaque. Bien que les mécanismes restent encore méconnues, il est maintenant établi que les protéines osseuses morphogénétiques joue un rôle important dans ce remodelage vasculaire pulmonaire. Cependant, les connaissances autour du mode de fonctionnement de ces protéines dans les petits vaisseaux du poumon sont très limitées. C'est pourquoi nous souhaitons étudier leurs rôles dans l'HTAP et tester l’efficacité de molécules ciblant ces protéines pour lesquelles nous avons trouvé une efficacité sur des cellules de vaisseaux pulmonaires en culture.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet seront multiples et devraient permettre non seulement de mieux comprendre le rôle des protéines présentes dans les petits vaisseaux du poumon, mais aussi leur contribution au développement de l'HTAP. De plus, ce projet permettra de tester l'efficacité de certaines molécules ciblant ces protéines pour lesquelles de premiers résultats in vitro sont encourageants.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés pour effectuer une échocardiographie afin de valider le modèle avant les traitements (temps : 5 min/ rat). En fin de traitement les animaux seront à nouveaux anesthésiés afin de mesurer tous les paramètres nécessaires à l'étude (échographie et cathétérisme). Les rats seront en hypoxie à 10% d’oxygène pendant 3 semaines consécutives afin de mimer l’air ambiant en altitude. Les traitements effectués seront en intrapéritonéales et seront de la fréquence suivante : 1 fois par jour pendant 2 semaines pour la procédure 1 ; 1 fois par jour pendant 3 semaines pour la procédure 2.
Impact sur les animaux
Les procédures appliquées à ce projet nécessitent d'effectuer 2 types d'injection chez le rat : 1 injection sous-cutanée et des injections intra-péritonéales pour les traitements ou du placébo. Ces injections induisent une douleur légère de courte durée limitée par l'application d'une crème lidocaïne. La contention nécessaire pour effectuer l'injection induit un stress de courte durée. Également, deux anesthésies gazeuses (isoflurane) seront pratiquées sur l'animal : la première pour valider le modèle expérimental avant traitement par échographie, et la deuxième pour évaluer l'efficacité du traitement par échographie et cathétérisme. L'anesthésie nécessite une légère contention de l'animal pour le placer dans une cage d'induction et n'induit pas de douleur hormis un léger stress de courte durée. Le modèle implique une exposition à 3 semaines d'hypoxie (10% d'oxygène) afin de mimer l'effet de l'altitude. Ces effets seront bénins dans notre projet car nous étudierons la mise en place de la maladie en phase précoce.
Devenir
Des prélèvements d'organes (poumons et cœur) seront réalisés afin de valider l'efficacité des traitements dans les tissus biologiques. De plus, comme décrites dans notre demande, différentes expérimentations biologiques seront réalisées au laboratoire pour démontrer les mécanismes mis en jeu.
Remplacement
Nous avons obtenu des résultats sur des échantillons pulmonaires humains et des cultures de cellules qui indiquent une altération de voies de signalisation dans les cellules endothéliales HTAP et que celle-ci peuvent être restaurées sous l'effet d'une molécule spécifique. Dans l'objectif de valider l'importance de ce défaut sur la fonction cardiaque et sur le remodelage des petites artères pulmonaires, nous souhaitons restaurer ces voies dans 3 modèles complémentaires d'HTAP reconnus internationalement et conclure sur son potentiel thérapeutique. L'HTAP est une maladie multifactorielle où plusieurs organes sont impliqués dont le coeur et le poumon. C'est pourquoi, le recours à des modèles animaux, différents et complémentaires, sont indispensables pour établir une preuve de concept avec cette molécule.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d'animaux, nous avons choisi de cibler nos traitements sur les protéines de la voie ayant la plus forte dérégulation que nous comparons aux contrôles positifs et négatifs d'hypertension pulmonaire. De plus, les effectifs ont été calculés à l’avance et se basent sur nos études passées et celles récemment publiées autour de ce type de molécules. Le critère déterminant pour évaluer l'efficacité du projet est la mesure de la pression artérielle pulmonaire moyenne. Les données de ce projet seront traitées statistiquement à l'aide d'un logiciel spécifique. Egalement, nous réutiliserons les animaux non malades traîtés avec les différentes molécules d'un projet en cours pour ne pas réutiliser des rats similaires dans cette demande. Par ailleurs, les échantillons provenant d'animaux témoins non malades et témoins d'HTAP pourront être réutilisés pour d'autres projets de recherche en cours.
Raffinement
Les rats bénéficieront d'un enrichissement de milieu avec du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois. Ces animaux ne seront jamais hébergés seuls dans des cages séparées et feront l'objet d'une période d'adaptation d'une semaine après leur arrivée avant de débuter une procédure. Pour la réalisation de la procédure, nous avons établi des points limites au moyen d'un score afin d'évaluer le bien-être animal. Les animaux seront donc suivis quotidiennement afin de veiller à ce bien-être et de prendre les mesures nécessaires développées dans la description de la procédure. Les rats seront anesthésiés 2 fois pour valider le modèle et les traitemants avec de l'isoflurane. Lors des traitements, une crème lidocaïne sera appliquée sur la zone où s'effectueront les injections.
Choix des espèces
Les rats sont des modèles standards d’études de maladies cardiovasculaires. Afin que nos résultats soient comparés aux travaux de la littérature dans ce domaine, des rats âgés de 4 semaines et pesant 100 grammes chacun seront utilisés.
Modélisation des maladies inflammatoires de l’intestin au TNBS chez les rongeurs et évaluation prophylactique et thérapeutique de molécules thérapeutiques.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Anesthésiées le temps de recevoir dans le rectum du TNBS dissous dans l'éthanol, qui déclenche une inflammation de l'intestin, les souris reçoivent ensuite des composés par gavage, dans l'eau de boisson ou par injection, et subissent des prises de sang au fil de l'étude. Sur cinq ans et 50 études, 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont des souris immunodéficientes au système immunitaire humanisé. Le porteur annonce une diarrhée qui peut être sévère, une perte de poids, une déshydratation, des coliques ou une anémie, auxquelles s'ajoutent les effets toxiques possibles des composés, issus de laboratoires académiques, de sociétés de biotechnologie et de l'industrie pharmaceutique. Toutes les souris sont mises à mort en fin de procédure.
Objectifs
La maladie inflammatoire chronique des intestins (MICI) est une pathologie caractérisée par une inflammation de la paroi du tube digestif entrainant une dégradation significative de la qualité de vie des patients. Les MICI les plus courantes sont la colite ulcéreuse (ou rectocolite hémorragique) et la maladie de Crohn. A l’heure actuelle, les mécanismes d’apparition de cette pathologie sont peu connus et aucun traitement curatif n’est disponible sur le marché. L’objectif de ce projet est de développer un modèle d’étude fiable des MICI pour permettre d’en accroitre la compréhension et d’évaluer les propriétés immunitaires, thérapeutiques et toxicologiques de molécules issues de laboratoires académiques, biotechnologiques et pharmaceutiques.
Bénéfices attendus
Les MICI sont des maladies inflammatoires. En basant notre modèle sur des souris ayant un système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les MICI et des potentiels traitements avec davantage de spécificité pour l’espèce cible de ces recherches : l’Homme.
Procédures
Administration intra-rectale sous anesthésie générale, durée de l'intervention 4 à 5 minutes. Administration des composés à visées thérapeutiques par voie enterale (gavage ou incorporation dans l'eau de boisson) ou parentérale (intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire ou sous-cutanée). Leur nombre est à déterminer, leurs durées seront de 10 à 15 secondes chacune. Prélèvements sanguins pour le suivi de la pathologie et des effets des traitements selon un schéma établis par le vétérinaire d'établissement et le comité de bien-être. Chaque prélèvement aura une durée de 15 à 30 secondes, environ.
Impact sur les animaux
Les MICI se caractérisent par une diarrhée pouvant être sévère et entrainer une perte de poids, une déshydratation, des coliques ou une une anémie. Des nuisances peuvent également être induites par l'injection intra-rectale de TNBS solubilisé dans l'éthanol ainsi que par les prélèvements sanguins, l'administration des composés de recherche et les effets potentiellement toxiques de ces composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique. Ces nuisances et effets indésirables peuvent se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
Il n’est à l’heure actuelle pas possible de recréer in vitro un modèle étudiant les interactions complexes qui peuvent exister entre le système immunitaire et un système digestif fonctionnel qui permettrait de reproduire les MICI tout en objectivant les effets thérapeutiques et toxicologiques de composés médicamenteux destinés à leurs traitements. Les modèles murins constituent donc une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 1500 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 5 ans, permettant de réaliser 50 études afin de mettre en place le modèle et de réaliser les premières études précliniques. Chaque étude comprendra un minimum de 4 groupes (contrôle négatif, contrôlé positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 à 10 animaux par groupe afin d’obtenir des résultats fiables malgré la variabilité intrinsèque liée au modèle. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série.
Raffinement
En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 6 heures par semaine. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 5 jours et seront habituées à la présence humaine régulièrement. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire d’établissement aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est de 200µL en routine, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8mL/kg. De plus, les prélèvements RO sont interdits et remplacés par des prélèvements à la veine saphène. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction des scores cliniques et de la perte de poids. Les administrations intra-rectales seront réalisées sous anesthésie générale à l'isoflurane et le volume d'injection ne pourra dépasser 200 μL.
Choix des espèces
Le séquençage complet du génome de la souris a démontré la proximité phylogénétique des souris et des hommes : 90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes orthologues produisent des effets différents entre souris et homme, le remplacement dans le génome du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. Ainsi, les souris SCID (Severe Combined ImmunoDeficiency), leurs dérivées et leurs analogues, toutes immunodéficientes, ont permis le développement des modèles humanisés. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur système immunitaire. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.