Recherche appliquée

Amenées dans une case à l'écart du troupeau, la tête maintenue par la personne qui pratique le geste, 14 chèvres laitières reçoivent dans la bouche puis dans l'œsophage un tube flexible par lequel on aspire le contenu de leur rumen. Chaque intubation dure une à deux minutes, à raison de huit prélèvements par an au maximum et de quarante sur les cinq années du projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le liquide prélevé ensemence des mini fermenteurs destinés à évaluer in vitro l'effet des rations sur la digestion et sur la production de méthane, dispositif que le porteur présente comme un moyen de limiter les mesures sur les animaux, tout en reconnaissant que le jus de rumen doit toujours être prélevé sur une chèvre. Elles reçoivent une récompense alimentaire après chaque intubation et retournent avec leurs congénères du troupeau laitier.

Objectifs

L’objectif est d’améliorer les modes d’alimentation des ruminants, en vue de couvrir leurs besoins nutritionnels, préserver leur santé et limiter l’impact de l’élevage sur l’environnement (production de gaz à effet de serre dont le méthane). Cela nécessite d’étudier les facteurs qui modifient la capacité du microbiote à prédigérer les aliments, les fourrages en particulier, et à se multiplier en produisant de la biomasse. Les mini fermenteurs continus, en cours de validation, permettent de cultiver le microbiote in vitro, ns des conditions proches de celles du rumen durant plusieurs semaines et de déterminer sa composition et ses activités biochimiques dans de nombreuses configurations expérimentales contrôlées. Le projet a trois objectifs principaux. 1) Evaluer les capacités du nouveau dispositif miniaturisé à reproduire les effets des rations types des ruminants sur les fonctions digestives du microbiote. 2) Evaluer in vitro les caractéristiques nutritionnelles de différents aliments/compléments/ modulateurs de la flore microbienne, en particulier les fermentations et flux d’hydrogène et de méthane 3) Mettre au point un dispositif d’étude in vitro de la colonisation des parois végétales par la microflore ruminale. Ces 3 objectifs nécessitent le prélèvement de contenu du rumen chez les chèvres afin d’ensemencer les fermenteurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider un dispositif in vitro d’évaluation des principales fonctions fermentaires y compris la production de méthane et d’évaluer l’impact de différents modulateurs de la flore microbienne ou d’aliment sur les principales fonctions digestives sans recours à des mesures physiques chez l’animal. Pour ces travaux, nous allons utiliser la chèvre, comme modèle du ruminant laitier car il est important de caractériser l’effet de certains modulateurs de la flore ou de compléments alimentaires chez cette espèce importante pour la production de fromage. Les études menées avec des inocula de chèvres sont importantes à mener en raison des spécificités de son microbiote à mieux digérer les parois végétales en comparaison des autres ruminants associées au développement d’un dispositif d’étude in vitro de la colonisation des parois végétales par la microflore ruminale. L’apport des connaissances qui en découleront seront importantes dans le contexte de transition et de développement des pratiques agroécologiques, notamment par optimiser la valorisation des fourrages.

Procédures

Chaque animal sera intubé en vigile (1 à 2 minutes environ). Cette procédure est réalisée sur 6 animaux successivement. Chaque prélèvement sur un animal sera espacé au minimum d’une semaine et chaque animal ne sera pas prélevé plus de 8 fois par an et au maximum 40 fois.

Impact sur les animaux

Ce projet nécessite le prélèvement de jus de rumen chez des chèvres afin d’inoculer les dispositifs in vitro. Cette collecte ponctuelle de contenu de rumen par intubation de l'œsophage et aspiration est une source d'inconfort et de douleur légère de très courte durée (quelques minutes). Elle nécessite d’amener l’animal dans une case séparée des autres chèvres, d’effectuer la contention de la tête de l’animal par la personne pratiquant l’intubation puis d’introduire dans la bouche puis dans l’œsophage un tube flexible de petit diamètre. Cela peut générer un stress.

Devenir

Les chèvres, retournent avec leurs congénères du troupeau laitier et suivent les pratiques liées à l’élevage.

Remplacement

Les dispositifs in vitro permettent d’évaluer le métabolisme microbien dans différentes situations nutritionnelles en limitant l’impact sur le bien-être animal. L’avantage des dispositifs in vitro en continu avec renouvellement des phases liquide et solide est qu’ils permettent une habituation de la flore microbienne aux conditions alimentaires dans le dispositif sans obligation de l’effectuer in vivo. Le dispositif miniaturisé que nous souhaitons finir de valider présente l’avantage de permettre l’évaluation d’un plus grand nombre de modalités à partir d’un même échantillon de jus de rumen que le dispositif habituel. Cependant, quel que soit le dispositif, du jus de rumen doit être prélevé chez l’animal, mais notre projet permet de minimiser les fréquences de prélèvements et donc les situations de stress ou d’inconfort de l’animal.

Réduction

Pour ces dispositifs, le prélèvement de chaque chèvre permettra d’inoculer 4 à 6 flacons en raison de la taille du prélèvement restreint par intubation. De plus, il est nécessaire de garder une variabilité liée à l’individu et à son microbiote dans nos évaluations, c’est pourquoi, nous souhaitons utiliser 14 chèvres laitières sur les 5 années du projet.

Raffinement

Un protocole d’habituation au geste d’intubation sera effectué systématiquement avant réalisation du prélèvement de jus de rumen. Cela se terminera par une récompense alimentaire donnée à l’animal. Ce protocole d’habituation sera répété 3 fois espacés d’au moins 24h, 2 semaines avant la 1ère intubation et une fois la semaine précédant l’intubation. Enfin, à la fin de chaque prélèvement par intubation, les chèvres recevront une récompense alimentaire. Les animaux seront en permanence hébergés en groupe avec leurs congénères de l’élevage sur aire paillée, selon les pratiques d'élevage habituelles. Elles disposeront de brosses (enrichissement) et de brumisation en cas de forte chaleur et recevront une alimentation équilibrée en fonction de leur production.

Choix des espèces

Pour ces travaux, nous allons utiliser la chèvre comme modèle du ruminant laitier car il est important de caractériser l’effet de certains modulateurs de la flore ou de compléments alimentaires chez cette espèce importante pour la production de fromage. De plus, cette espèce est intéressante en raison des spécificités de son microbiote à bien valoriser les parois végétales peu digestibles en comparaison des autres ruminants. Nous utiliserons des chèvres laitières adultes car il s’agit des animaux en production dans les élevages dont il est intéressant d’étudier le métabolisme digestif de leur microbiote.

Rendues sensibles à l'infection par une antibiothérapie qui altère leur microbiote, 360 souris reçoivent par gavage la bactérie Clostridioides difficile puis quatre injections intrapéritonéales, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes. L'objet déclaré est de savoir si les biofilms de la bactérie expliquent les rechutes chez les patients, en vue de stratégies anti-biofilms. Le porteur annonce des points limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de la souffrance sans préciser lesquels, et justifie huit animaux par groupe pour cinq temps de prélèvement, ce qui laisse l'effectif de 360 souris sans explication.

Objectifs

Clostridioides difficile (C. difficile) est une bactérie première cause de diarrhée nosocomiale chez l’adulte dans les pays développés et en particulier en France (> 24000 cas par an, dont 14 % de formes compliquées, la plus connue étant la colite pseudomembraneuse, associée à 3% de mortalité). Depuis les années 2000, l'impact de l'infection à Clostridioides difficile (ICD) dans les hôpitaux a considérablement augmenté avec une multiplication par 5 de sa prévalence, des taux de rechutes plus élevés jusqu'à 48% et une augmentation des formes graves (2,5 fois) et de la mortalité (3 fois). Par conséquent, les ICD ont un impact économique majeur sur la santé publique avec un coût direct de plus de 4 milliards d'euros/an dans l'UE, une charge financière qui devrait doubler dans la prochaine décennie en raison de la population vieillissante. Il est donc urgent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant les principales étapes de l'ICD et notamment la persistance de C. difficile au niveau intestinal. Cette persistance pourrait être associée à la formation de biofilms mono ou multi-espèces responsables des rechutes des ICD. Dans ce projet, notre but est d’étudier le rôle du biofilm dans la persistance de C. difficile et la rechute des ICD en utilisant le modèle murin.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but d'évaluer le rôle des biofilms de C. difficile dans la rechute des ICD. Si les biofilms contribuent aux rechutes des ICD, le projet permettra de développer des stratégies anti-biofilms contribuant à la diminution des rechutes au niveau clinique.

Procédures

Le modèle d'infection des souris par la bactérie Clostridioides difficile nécessite un gavage oral de la bactérie (réalisé en moins de 5 secondes). Les souris recevront 4 injections intrapéritonéales au cours du projet (réalisées en moins de 5 secondes et avec une qualification de gravité légère).Aucune procédure chirurgicale n'est nécessaire dans le cadre du projet.

Impact sur les animaux

Les souris conventionnelles ne deviennent sensibles à l'infection par C. difficile qu'en cas de dysbiose intestinale obtenue après antibiothérapie. L'infection par C. difficile entraine des diarrhées résolutives en quelques jours et une perte de poids légère (

Devenir

Le prélèvement d'organes à des fins expérimentales nécessite l'euthanasie des animaux.

Remplacement

Plusieurs tests in vitro permettent la sélection de la souche de C. difficile productrice de biofilms. Il en est de même pour la souche mutante non productrice de biofilms. Bien que les organoïdes représentent un modèle très intéressant pour l’étude des interactions d’un pathogène avec les cellules intestinales, il n’est pas encore possible d’introduire un microbiote dans les organoïdes et d’étudier ainsi l’impact du microbiote perturbé dans les infections aiguës et récurrentes de C. difficile. De plus, le projet a une durée de 40 jours et la viabilité de C. difficile au sein des organoides ne peut excéder quelques heures.

Réduction

Les différentes conditions sont testées le plus possible ensemble afin de ne pas avoir à démultiplier les animaux utilisés comme contrôles. 8 animaux par groupe seront nécessaires par temps de prélèvement (5 temps). En effet, les analyses statistiques seront faites par un test de Mann-Whitney pour échantillons non appariés, avec pour paramétres une puissance de test de 0.9 et un effet size de 1.5.

Raffinement

Les litières seront changées quotidiennement, les animaux pouvant avoir la diarrhée. Des points limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Différents modèles animaux (souris et hamsters) ont été utilisés pour étudier l'infection à C. difficile. Le modéle le plus adapté pour étudier la rechute des infections à C. difficile est le modéle de souris conventionnelles, les hamsters succombant à l'infection en 48 h. Suite à une antibiothérapie visant à altérer le microbiote digestif, l'administration de C. difficile par voie orale permet une implantation reproductible et maîtrisée de la bactérie au niveau du tube digestif. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité de travailler à la fois sur des animaux ayant atteint l'âge adulte et répondant au modèle d'infection par la bactérie.

Vingt injections et vingt prélèvements de sang à la queue en dix semaines : 75 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus et organes. Le peptide évalué contre l'obésité est déjà testé en phase III chez des patients pour une autre maladie inflammatoire, ce que le porteur retient comme gage de sécurité. Les souris appartiennent à une souche obèse que le porteur qualifie de "drastique sur le plan métabolique", et il écrit que la perte de poids ne pourra pas servir de point limite. Il fixe le "phénotype dommageable" à 40 grammes et prévoit d'interrompre le protocole pour toutes les souris si trois animaux par groupe dépassent les points limites.

Objectifs

Le surpoids et l’obésité se définissent comme une accumulation anormale ou excessive de graisses qui nuit à la santé de l'individu (définition de l'organisation mondiale de la santé). Une récente étude de 2023 montre qu'en 2022, 1 personne sur 8 dans le monde était obèse. L'obésité chez les adultes a plus que doublé à l'échelle mondiale depuis 1990 et l'obésité chez les adolescents a quadruplé. En 2022, 2,5 milliards d'adultes taient en surpoids. En France et plus particulierement en région Grand Est, pres d'une personne sur deux est obèse ou en surpoids. Cela représente près de 8,5 millions de français en situation d’obésité, soit une hausse de la prévalence de cette maladie chronique de 13 % depuis 2012, et même de 66 % pour les formes les plus sévères. La haute autorité de santé, dans son dernier communiqué recommande donc une amélioration de la prise en charge des patients. Ainsi la pierre angulaire de l’approche thérapeutique implique un changement profond du mode de vie et de l’alimentation, avec une réduction de poids obtenue grâce à la réduction des calories, à l’exercice et à une alimentation plus saine. Cependant, la mise en œuvre de ces changements dans la pratique quotidienne s’avère difficile et si elle n'est pas accompagnée, est vouée à l'échec. Quant aux traitements thérapeutiques, leur efficacité reste extrêmement limitée. Il n'existe aucun médicament capable de corriger l'obésité, seule la lourde chirurgie semble efficace. L'objectif est d'évaluer l'efficacité d'un peptide médicament innovant sur la réduction de l'obésité dans une étude préclinique incluant des souris obéses. Ce modèle, bien que drastique sur le plan métabolique se rapproche de la pathologie humaine. Enfin le peptide médicament que nous souhaitons évaluer, est aujourd'hui testé chez le patient (phase III) pour une autre pathologie inflammatoire. L'absence d'effets secondaires, observée dans ce dernier cadre tant chez l'homme que chez la souris, en fait une molécule sure pour notre étude sur l'obésité. Notre peptide devrait restaurer les fonctions perturbées du tissu adipeux chez les souris obèses et permettre aux individus de réduire leur poids. La perte de poids ne pourra donc pas etre considérée comme un point limite dans notre projet.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont importants. D’un point de vue scientifique, les données obtenues permettront de contribuer aux connaissances générales sur les mécanismes pathologiques et notamment inflammatoires dans l'obésité et leur potentiel résolution. D’un point de vu clinique, cette étude permettrait d’apporter des données majeurs et solides pour l’utilisation de cette thérapie chez les patients atteints d'obésité et pourrait s’avérer être une alternative efficace aux futurs traitements en cours de développement.

Procédures

Les 75 animaux impliqués dans le projet, seront soumis au traitement anti-obésité avec le peptide médicament ou avec du liquide physiologique sur une durée de 10 semaines à raison de 2 injections hebdomadaires. Avant chaque injection, un prélevement sanguin d'environ 10µl au niveau de la queue sera réalisé pour controler le niveau de sucre dans le sang.

Impact sur les animaux

Inconfort de la locomotion expliquée à la prise régulière de poids de la souris - Douleur légère de courte durée de la piqure d'une aiguille.

Devenir

A la fin de l'unique procédure les animaux seront anesthésiés avant d'être euthanasiés afin de prélever leurs tissus et organes à des fins d'histologie ou d'autres analyses moléculaires.

Remplacement

Préalablement aux futurs tests in vivo, nous avons réalisé des approches in vitro incluant la lignée cellulaire adipocytaire cultivées en milieu favorisant l'obésité qui ont mis en évidence un effet protecteur du peptide sur l'homéostasie adipocytaire, nous rendant confiant sur l'efficacité du peptide dans un modèle murin d'obèsité. L'utilisation de modèles murins est indispensable en raison de la complexité de cette maladie qui implique le système immunitaire et plusieurs organes comme la rate, le tissu adipeux, le tissu vasculaire... Ainsi les modèles in vitro ne sont pas adaptées en une telle étude intégrative. En effet, notre stratégie thérapeutique repose sur la modulation 1- du système immunitaire (i.e rate) pour atténuer la progression de l'obésité, 2- d’une réduction de l’accumulation de graisses dans le tissu adipeux, ce qui rend indispensable l'étude de ces interactions complexes. Les modèles murins permettent de reproduire de manière fidèle les conditions in vivo, offrant ainsi une compréhension plus complète de la maladie et de l'effet de la modulation immunitaire sur son évolution ce qui rend difficile de simplifier l'étude en utilisant des systèmes in vitro ou ex vivo, comme les modèles 3D par exemple. Les modèles murins permettent de prendre en compte cette complexité et d'analyser comment différents organes et tissus interagissent pour déterminer et faire progresser la maladie. Il n'existe actuellement aucune alternative non animale satisfaisante pour répondre à nos questions. Ainsi, les modèles murins restent la meilleure option pour générer des données pertinentes qui pourraient ultérieurement avoir un impact translationnel chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux dans le projet est estimé en considérant la nécessité de réduire l’utilisation d’animaux à un nombre minimum mais suffisant pour obtenir des résultats biologiquement, statistiquement valides et significatifs pour les objectifs de cette étude. La taille de chaque groupe d’animaux est de n = 15 souris. Elle a été calculée, en tenant en compte du risque de décès prématurés et en utilisant un logiciel statistique adapté. Une logique d’arrêt de la procédure est mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux pour chaque groupe des points limites, la procédure sera interrompue pour la totalité des animaux. Pour que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique, un nombre minimum d’animaux sera utilisé. L'expérimentation sera réalisée en 3 fois afin que scientifiquement nous ayons 3 expériences indépendantes (soit 5 animaux/groupe/ période expérimentale). Cette façon de procéder nous permettra de travailler avec des petits effectifs faisant 1- qu'en cas des points limites atteints, d'arreter la procedure, de la revoir (i.e. temps d'injection, quantité injectée du peptide, age des souris...) après discussion avec le comité d'éthique... voire de stopper définitivement la procedure; 2- qu'en cas d'obtention de résultats statistiquement significatifs apres le 1er et/ou le 2e essais, les essais suivants (2 et 3, respectivement) pourront alors ne pas avoir lieu. Les variables quantitatives seront analysées par des tests statistiques. Dans le but de renforcer les données statistiques, l’étude sera randomisée (tirage au sort de l’ordre groupes pour les injections et clause d’ignorance) et contrôlée. Enfin toujours dans le but de réduire le nombre d'animaux, les tissus issus de nos différents groupes seront prélevés pour être utilisés dans d'autres projets en cours ou futurs.

Raffinement

La litière sera changée deux fois par semaine, voire trois fois en cas de production d'urine excessive des souris obèses (valable surtout en fin de procédure pour les souris obèses non traitées). Au cours des phases de stabulation, plusieurs animaux du même sexe seront hébergés dans la même cage. En revanche, lors des phases d’expérimentation, les animaux seront isolés (une souris / boîte, 30 minutes maximum) afin de limiter la transmission du stress inter-individu. La manipulation se fera en dehors du champ de vision des animaux en attente d’expérimentation. Pour le bien-être de l’animal, les souris seront anesthésiées lors de certaines méthodologies (injections) ou habituées au moins une semaine à l’avance à la contention (prise de sang). Cela devrait réduire le stress au minimum. Toute modification du comportement de l’animal (prostration, anxiété, isolement, troubles de l’équilibre), d’une variation significative du poids (environ 20% de gain de la masse corporelle) ou d'un taux élevé de sucres dans le sang (> 6g/l ) seront des points limites clés afin de juger de la nécessité ou non de l'euthanasie de l’animal. Au cours de l’expérimentation et notamment juste avant les phases des injections, des anesthésiques généraux seront administrés. Une grille de score définie nous permettra d'évaluer l’état dans lequel se trouvent les individus. Afin de limiter les perturbations locomotrices, l'age de 2 mois post-natals des souris pour le début du traitement et la durée de 10 semaines (pour le traitement) ont été choisis afin que le phénotype dommageable ne soit pas atteint. Ainsi cette nuisance devrait être limitée dans la durée de la procédure (10 semaines). Au moment de l'euthanasie, de part l'expérience que nous avons de ce modèle nous estimons que les souris non traitées ne devraient pas atteindre le phénotype dommageable (e.i poids >40 g). Si c'est le cas avant la date d'euthanasie, initialement déterminée, alors nous interromprons l'ensemble du protocole pour la totalité des souris. Ces dernières seront alors euthanasiées pour l'analyse tissulaire.

Choix des espèces

Les souris ont un génome très proche de celui de l’Homme, et leur système physiologique récapitule assez bien les observations faites chez l’Homme. Aujourd’hui, la souris représente le meilleur modèle pour tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques et le meilleur compromis entre les besoins expérimentaux et le respect du critère de choix de l’espèce. Deux souches seront nécessaire à l'étude, les souris obèses qui subiront les traitements et des souris controles non diabétiques, non obéses, non traitées qui représenteront le témoin négatif et la référence de poids normal. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 2 mois à l’initiation de la procédure. Elles seront agées de 4.5 mois à la fin de la procédure, c'est à dire avant l'apparition du phénotype dommageable.

700 cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, dont 100 truies gestantes, la moitié recevant chaque jour des sucres anisés et des contacts avec l'humain pour que leurs fœtus apprennent l'odeur. Les porcelets passent ensuite, seuls ou par paires, des tests d'environnement nouveau, de soudaineté, de réunion et de discrimination sociales, et 48 d'entre eux enchaînent douze sessions de labyrinthe en six jours. 20 porcelets subissent une IRM fonctionnelle sous anesthésie, puis sont tués sans réveil par injection de T61, parce que les produits injectés les excluent de la filière viande, les autres porcelets rejoignant "le circuit classique de production de viande". Le projet, mené avec une entreprise qui formule des arômes pour l'élevage, cherche des stratégies d'enrichissement "peu onéreuses" pour les porcheries conventionnelles, et le porteur affirme qu'il "ne génère donc pas de souffrance animale".

Objectifs

Le projet vise à évaluer si une exposition prénatale à une odeur, associée à un renforcement maternel positif, a des effets bénéfiques sur les réponses comportementales, sociales, émotionnelles et cognitives de leurs porcelets lors de challenges sociaux ou environnementaux caractéristiques de l’élevage conventionnel, et à identifier les mécanismes cérébraux sous-jacents. Pour répondre à cet objectif de recherche, nous testerons 5 hypothèses. Chez les porcelets sevrés issus de truies exposées régulièrement pendant la gestation à une odeur ingérée dans un contexte positif (i.e. renforcement sucré et contact positif à l’homme), le rappel de l’odeur apprise prénatalement : (1) favorisera une meilleure adaptation comportementale à un mélange social au sevrage, un évènement particulièrement stressant en élevage porcin ; (2) diminuera les réponses émotionnelles indicatrices de stress lors de tests d’environnement nouveau et de soudaineté ; (3) améliorera les performances cognitives (mémoire et apprentissage) lors d’une tâche d’apprentissage spatial via un effet bénéfique de l’odeur sur le stress pendant la tâche ; (4) aura des effets bénéfiques sur les interactions sociales lors de situations de confrontation sociale ; Enfin, (5) la perception de l’odeur apprise pendant la vie fœtale dans un contexte positif pour les mères va générer, chez le porcelet, des réponses dans les régions cérébrales impliquées dans le traitement hédonique de la récompense, ainsi que dans les structures liées à l’apprentissage et la mémoire.

Bénéfices attendus

L’élevage conventionnel porcin est caractérisé par des environnements pauvres et monotones, et offrant peu de stimulations sensorielles aux animaux, ce qui peut engendrer un sentiment d'ennui et de frustration et avoir des effets délétères sur le bien-être. Ce projet apportera une preuve de concept et des connaissances scientifiques sur l’efficacité d’une stratégie à base d’odeurs associées à un enrichissement des conditions de vie des mères (récompense alimentaire, contacts humains positifs) pour l’amélioration de la santé mentale et physique de porcelets en agissant sur l’environnement maternel. Sur le plus long terme, cette preuve de concept pourrait permettre d'envisager le développement de stratégies d'enrichissement peu onéreuses et faciles à implémenter via l'odorisation de l'aliment ou de l'air dans des systèmes qui offrent parfois peu d'opportunité d'aménagement. Cela sera rendu possible notamment par l’implication dans ce projet d’un partenaire privé spécialisé dans la formulation d'actifs aromatiques à destination des animaux de rente.

Procédures

Les truies gestantes seront soumises soit à aucun traitement (n = 50 truies témoin), soit à des traitements positifs quotidiens (n = 50 truies odeur), notamment l'ingestion de sucres anisés et des contacts positifs avec l'homme pendant l'administration des récompenses sucrées. La majorité des porcelets du projet seront soumis uniquement à des tests comportementaux (tests d'environnement nouveau, de soudaineté, d'apprentissage spatial, de réunion sociale ou de discrimination sociale). Environ 2 semaines après la naissance, des porcelets sous la mère (n = 20 porcelets/traitement) seront soumis individuellement à un test unique d’environnement nouveau. A partir de 5 semaines d’âge, soit une semaine après le sevrage, des porcelets (n = 24 porcelets/traitement) seront soumis individuellement à un test unique d’environnement nouveau combiné à un test de soudaineté. Ces mêmes porcelets (n = 24 porcelets/traitement) seront ensuite testés individuellement dans une tâche d’apprentissage spatial (labyrinthe récompensé), avec 12 sessions de tests sur 6 jours. Au même âge, d’autres porcelets (n = 24 porcelets/traitement) seront testés par paire dans un test unique de réunion sociale. Une partie de ces porcelets (n = 15 porcelets/traitement) sera ensuite testée individuellement dans un test de discrimination sociale en présence de deux animaux stimuli. Autour de 8 semaines d’âge, 20 porcelets (n = 10/traitement) seront soumis à une session unique d’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) durant laquelle ils seront anesthésiés et suite à laquelle ils seront euthanasiés sans levée d’anesthésie.

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux peuvent induire un léger état de stress lié à la séparation du groupe social et/ou au déplacement dans un environnement relativement nouveau. Ces effets seront réduits pour des phases d’habituation aux expérimentateurs, aux manipulations et déplacements et aux dispositifs de tests.

Devenir

Les porcelets soumis à l’imagerie cérébrale seront mis à mort (car ils ne peuvent pas repartir dans le circuit classique de production de viande suite à l'injection de produits nécessaires à la réalisation de la procédure). Ils seront euthanasiés sans levée d'anesthésie par injection de T61. Les porcelets soumis uniquement aux observations et tests comportementaux seront gardés en vie et seront replacés dans le système d'élevage pour rejoindre le circuit classique de production de viande.

Remplacement

Ce projet visant à explorer les effets d’une programmation gestationnelle olfactive sur les comportements de la descendance, et l’activité cérébrale sous-jacente chez le porc. Il est donc absolument nécessaire de travailler sur des animaux vivants et vigiles (hormis pour l'imagerie cérébrale qui s'effectue sur animaux anesthésiés). L’utilisation du porc ne peut donc pas être remplacée.

Réduction

Les effectifs d'animaux utilisés pour cette expérience ont été calculés sur la base de la variabilité interindividuelle des mesures enregistrées en tests de comportements et imagerie cérébrale. Sur la base de notre expérience et de nos travaux précédents, nous estimons qu’un minimum de 10 à 12 animaux par lot expérimental est nécessaire pour s’assurer de pouvoir traiter les données avec des statistiques paramétriques à la fois pour les données comportementales et d’imagerie cérébrale. Par ailleurs, dans la mesure du possible, une partie des animaux sont testés dans plusieurs tests comportementaux successifs afin de maximiser la quantité de données comportementales acquises par animal et diminuer les effectifs totaux.

Raffinement

L'objectif de ce projet est d'étudier les effets bénéfiques d’une odeur apprise in utero dans un contexte positif pour les mères (odeur associée à un renforcement positif) sur les réponses socio-émotionnelles et cognitives de leur descendance. Le projet ne génère donc pas de souffrance animale et propose, au contraire, à la moitié des animaux (groupe odeur) des améliorations au milieu de vie standard habituellement rencontré en élevage conventionnel (groupe témoin), ce qui peut donc engendrer une potentielle amélioration de l'état émotionnel de ces animaux. L’évaluation des réponses cérébrales sous-jacentes au traitement central des informations olfactives nécessite de travailler sur des animaux vivants. Néanmoins, le recours à l’anesthésie générale pendant l’ensemble de la procédure d’imagerie assure une absence de souffrance.

Choix des espèces

Ce projet sera réalisé sur le porc qui est l'espèce cible du projet, avec des perspectives d'application à la filière porcine. En effet, le projet pourrait possiblement conduire au développement de stratégies d'enrichissement du milieu à base d'odeurs alimentaires dans les élevages conventionnels. De plus, le projet pourrait aboutir à l'identification de nouveaux indicateurs précoces de bien-être et de santé dans cette espèce, utilisables par la suite pour évaluer les modes d'élevage existants. Nous utiliserons des truies gestantes et leurs porcelets après la naissance car le protocole repose sur le développement d'apprentissages olfactifs in utero, en association avec un renforcement positif procuré aux mères par l'enrichissement sensoriel (sucre, odeur et contacts positifs avec l’humain). Dans l'essai préliminaire, nous souhaitons vérifier le transfert des odeurs aux fœtus et la bonne acquisition de l'apprentissage olfactif. Ainsi, nous testerons les porcelets dès la période de lactation pour s’assurer de la réussite de l’apprentissage au plus près de la fin de l’exposition olfactive prénatale. Les porcelets sous la mère seront testés dans des tests d’environnement nouveau en présence de l’odeur ou non ou dans des tests de choix d'odeurs. Dans les 2 essais du projet principal, nous souhaitons vérifier que la perception d'une odeur familière, apprise prénatalement dans un contexte positif, permet de réduire les réponses de stress induites lors de challenges cognitifs, sociaux ou environnementaux. Pour ce faire, les porcelets seront testés autour du sevrage, car cette étape est particulièrement sensible en élevage, avec des changements environnementaux (changement de logement), alimentaires (sevrage du lait et passage à une alimentation solide), et sociaux (séparation de la mère et mélange avec des porcelets issus d'autres portées). Ils seront ensuite testés lors de tests comportementaux qui nécessitent des périodes plus ou moins longues de familiarisation à l’expérimentateur et aux dispositifs de tests. L’imagerie cérébrale sera quant à elle réalisée lorsque les animaux auront atteint un poids de 25 kg minimum pour des raisons de compatibilité avec les dispositifs d’imagerie et les atlas cérébraux disponibles.

Privés d'accès au distributeur automatique d'aliment de 17 h à 8 h pendant 21 jours, 720 porcs en croissance subissent une restriction alimentaire assortie de prises de sang à la veine jugulaire, pour comparer la réponse de la race Créole, adaptée au climat tropical, et celle de la race Large White, sélectionnée pour sa productivité. 760 porcs au total vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance déclaré léger, dont 40 reproducteurs sur lesquels une biopsie de cartilage est pratiquée. Le porteur reconnaît que la restriction déclenche une compétition entre animaux à l'ouverture du distributeur, puis qualifie cette nuisance de légère au motif qu'"une hiérarchie se met rapidement en place". Aucun porc n'est tué dans le cadre du projet, dont la finalité est d'orienter la sélection génétique des élevages porcins tropicaux, les animaux partant au renouvellement du troupeau ou à la coopérative une fois le poids d'abattage atteint.

Objectifs

Avec le réchauffement climatique et l’augmentation de la production animale dans les pays tropicaux et subtropicaux (FAO, 2015), l’efficience des productions animales en conditions de stress (thermique, social, sanitaire) devient un enjeu essentiel. Le changement climatique augmente la vulnérabilité des productions animales en affectant le bien-être et les performances zootechniques. Lorsqu’ils sont soumis à un stress thermique, les porcs réduisent leur consommation d’aliment, ce qui entraine une réduction de leur croissance. Cette diminution de consommation a des conséquences directes sur le bien-être des animaux et indirectement sur la durabilité des élevages porcins en zones tropicales et subtropicales, ou lors d’évènements extrêmes en milieu tempéré. Dans ce contexte, l’animal efficient est celui qui est capable de réorienter, ou de déplacer l’équilibre entre, ses voies métaboliques, selon les contraintes du milieu d’élevage. Les objectifs de l’étude sont donc d’étudier: 1) les effets d’une restriction alimentaire d’une durée de 21 jours durant l’engraissement sur les performances de croissance, le comportement alimentaire, le métabolisme et le microbiote intestinal et 2) la différence de réponse entre deux races, la race Créole (CR), bien adaptée aux conditions tropicales et la race Large White (LW), sélectionnée pour sa productivité, via une analyse multi-omique.

Bénéfices attendus

En amont de la construction d’objectifs de sélection pertinents pour l’élevage porcin, il est indispensable de comprendre le contrôle génétique et physiologique de cet arbitrage entre voies métaboliques, et de maîtriser ainsi l’interaction entre adaptation au milieu d’élevage et croissance. La connaissance de ces mécanismes permettra sur le long terme de mieux appréhender la gestion des périodes de restriction alimentaire dans les élevages porcins par une amélioration combinée des pratiques d’élevage et des choix génétiques de l’éleveur. De plus, des études sur le microbiote intestinal du porc montrent un lien entre les microorganismes présents et les caractères de production et de santé, ainsi qu’avec les conditions environnementales. Cette étude permettra d'évaluer le rôle du mcirobiote intestinal dans la réponse à une restriction alimentaire ainsi que dans les intéractions gènes x environnement. L'analyse multi-omique permettra une étude intégrative des différents paramètres physiologiques mesurés ainsi que l'identification de potentiels biommarqueurs de restriction alimentaire. Les données de génotypage des animaux phénotypés en lien avec les données zootechniques, ainsi que les données de séquençage (20X) des parents, permettront d’identifier de potentiels SNPs liés à la réponse à la restriction alimentaire dans les 2 races.

Procédures

La prise de sang à la veine jugulaire est nécessaire pour faire des génotypages, des dosages d’hormones et de métabolites sanguins liés à la restriction alimentaire. Les prélèvements de fèces sont nécessaires pour l’étude du microbiote. Les prélèvements sont réalisés de façon non invasive par récupération des fèces avant contact au sol lorsque les animaux sont en attente de pesée. 720 animaux : -180 LW ad-libitum -180 LW en restriction alimentaire -180 CR ad-libitum -180 CR en restriction alimentaire. Les biopsies de cartilages sont nécessaires pour réaliser le séquencage de l'ADN et les études génomique. Ces prélèvements ne concerneront que les reproducteurs parents des animaux phénotypés, soit 40 animaux (20 LW, 20CR dont 10 males et 10 femelles).

Impact sur les animaux

La restriction alimentaire se faisant de façon temporelle, elle entrainera une modification du rythme alimentaire des animaux car le Distributeur Automatique de Concentré (DAC) ne sera pas accessible de 17h à 8h. Cependant, en alimentation ad-libitum, la majorité de l'alimentation des porcs a lieu durant la journée, la restriction n'affecte donc pas de façon drastique le comportement alimentaire. De plus, une adaptation du rythme alimentaire se met rapidement en place durant les premiers jours de restriction. Cette nuisance est donc qualifée comme légere. Une seconde nuisance liée à la restriction alimentaire est qu'elle peut entrainer un stress chez les animaux lié à la compétition lors de l'ouverture du DAC. De façon similaire au point précédent, une hierarchie se met rapidement en place, cette nuisance est donc qualifée comme légere.

Devenir

Les animaux seront soit conservés pour le renouvellement du troupeau soit entreront dans les circuits de commercialisation et seront vendus à la coopérative lorsqu’ils atteindront le poids d’abattage.

Remplacement

L'objectif est de caractériser les mécanismes physiologiques et génétiques liée à l’allocation des ressources durant une restriction alimentaire. De manière générale, les traits liés à l’allocation des nutriments sont des caractères complexes dont le déterminisme est très probablement polygénique. De nombreux facteurs, organes et tissus sont impliqués dans l’expression de ces caractères, notamment le stade physiologique, le statut nutritionnel et le sexe. Il n’existe pas à ce jour de modèle in vitro pertinent permettant d’appréhender l’étude de ces caractères complexes.

Réduction

Un calcul du nombre d'animaux nécessaires par un test de puissance a été réalisé afin d'estimer au plus juste le nombre minimum d'individus à inclure en théorie dans le projet pour une bonne précision (± 0,01) des paramètres génétiques. Un calcul des composantes de variance et des paramètres associés (génétique, environnemental, résiduelle, héritabilités et corrélations) des différents caractères sera réalisé après 2.5 ans pour réévaluer le nombre d’animaux nécessaire.

Raffinement

Les conditions d'hébergement sont raffinées par des installations prenant en compte l'enrichissement du milieu des animaux et où le personnel est formé à l'expérimentation animale, aux notions de santé des animaux et aux notions de points limites pour favoriser leur bien-être. L'état de santé des animaux sera suivi quotidiennement. Les animaux soumis à une restriction alimentaire seront particulièrement suivis. Ainsi des comportements anormaux (prostation, absence ou faible ingestion) pourront permettre la détection précoce des pathologies et de situations de mal-être. Le suivi alimentaire sera fait quotidiennement grâce aux données des DAC. En cas de réduction trop importante de l'ingéré (>50% pendant plusieurs jours), les animaux seront retirés de l'experimentation et nourris ad libitum. Les prises de sang et les biopsies seront réalisées par des personnes compétentes et formées pour réaliser ces prélèvements en moins d'une minute entre la contention, le prélèvement, la désinfection et la libération de l'animal. Les animaux prélevés seront observés afin de prévenir d'éventuelles complications.

Choix des espèces

Le porc est particulièrement sensible au stress thermique, qui induit une diminution de sa consommation alimentaire. La compréhension des mécanismes d’allocation des nutriments permettrait d’améliorer la robustesse des animaux et leur bien-être en réponse aux différents stress induisant une diminution de la consommation alimentaire. Nous utiliserons des porcs en croissance car ils sont particulièrement soumis au stress thermique et donc à des périodes de restriction alimentaire dans les élevages.