Recherche appliquée

360 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour que leur cerveau soit prélevé. 324 d'entre elles subissent une chirurgie crânienne destinée à léser le cortex moteur, 312 une seconde chirurgie pour la greffe de neurones issus de cellules souches humaines, et 54 une intervention de deux à quatre heures dont elles ne se réveillent pas. Trois cents animaux passent sept sessions de tests moteurs, préhension de nourriture, équilibre et marche, précédées chaque fois d'un jeûne de quinze heures destiné à les motiver à saisir les boulettes. Le porteur conclut qu'il n'est pas possible de modéliser un cerveau de mammifère in vitro ou in silico et que le recours à des animaux vivants et "intègres" reste "essentiel".

Objectifs

La médecine réparatrice a le potentiel de remplacer les tissus endommagés ou malades. Le cerveau est la cible de nombreuses pathologies dont les traumatismes crâniens. Selon les différentes sources disponibles, on dénombre en France annuellement environ 155 000 traumatismes crâniens, cependant les solutions thérapeutiques proposées demeurent limitées. Le cerveau adulte présente une faible capacité d’autoréparation, que ce soit dans la genèse de nouveaux neurones ou de nouvelles connexions projetant sur de longue distance. La transplantation cellulaire offrirait ainsi une stratégie thérapeutique viable pour les patients en apportant de nouvelles cellules en remplacement de celles perdues suite à une lésion. Malgré les progrès significatifs réalisés au cours des dernières années, la translation de la stratégie expérimentale vers une application clinique reste encore limitée. Nos travaux ont pour finalité de développer une méthodologie de thérapie cellulaire efficace et sûre, laquelle utiliserait des neurones provenant de cellules souches humaines, en combinaison avec de nouveaux biomatériaux, afin d’améliorer l'efficacité de la transplantation cellulaire à long terme. Nous pensons fortement que la combinaison de ces nouveaux neurones avec des biomatériaux est une étape cruciale dans la médecine réparatrice du cerveau. En effet, les biomatériaux devraient favoriser la survie des neurones greffés et donc soutenir la régénération tissulaire. Des tests de comportement permettront d'examiner l'effet sur la récupération motrice des animaux et de comparer l'effet du biomatériau sur la réparation du cerveau.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d'étudier l’effet d’un biomateriau sur la réparation des réseaux neuronaux après transplantation de nouveaux neurones chez le rongeur. Ce biomatériau peut être utilisés pour fournir un support structurel, libérer des facteurs de croissance, ou encore promouvoir la régénération tissulaire dans la zone lésée du cortex cérébral. Les objectifs incluent la réduction de l'inflammation, la promotion de la cicatrisation, la restauration des connexions neuronales et la récupération des fonctions altérées à la suite de lésions corticales. A plus long terme, les bénéfices attendus de ce projet sont le développement de thérapie clinique chez l'Homme autour de la transplantation cellulaire combinée à des biomateriaux, afin d’améliorer la qualité et la fiabilité des transplantations et ainsi améliorer la prise en charge des patients souffrants de lésions cérébrales suite à un traumatisme crânien ou un accident vasculaire cérébral.

Procédures

Sur animaux anesthésiés : -intervention 1 : chirurgie craniale pour induire une lésion : 1 fois (10 minutes par animal, 324 animaux); - intervention 2 : chirurgie craniale avec greffe de neurones : 1 fois (10 minutes par animal, 312 animaux); - intervention 3 : chirurgie craniale sans réveil avec enregistrement de l’activité des neurones : 1 fois (2-4 heures par animal, 54 animaux). Sur animaux vigiles : -en amont de chaque chirurgie, 1 injection sous cutané d'antalgique (360 animaux)- au maximum soixante dix pesées par animal, d'une durée d'environ 1 minute (une fois à 2 fois par semaine, sur toute la durée du projet, 360 animaux); -au maximum 7 sessions de 3 tests de comportement moteur (test de préhension de nourriture, test d'équilibre, test de marche,15 minutes par souris et par test, 300 animaux); - mise à jeun d'une durée inférieure à 16h (7 fois à 2 mois d'intervalle, 300 animaux)

Impact sur les animaux

Suite à l’anesthésie générale et la chirurgie cranienne, les effets indésirables attendus sont la douleur liée à la chirurgie minimisé par le traitement antalgique pendant et après la chirurgie, ainsi qu'une légère perte de poids transitoire. La lésion du cortex moteur entraine potentiellement une légère diminution de la capacité de préhension de la patte antérieure gauche. L’acte de pesée et les tests comportementaux sur animal vigile peuvent induire un léger stress transitoire. Un jeûne de 15 heures sera réalisé avant le test de préhension de nourriture afin que les animaux soient motivés à récupérer les boulettes de nourriture.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de récupérer le cerveau pour des études neuroanatomiques, électrophysiologiques ou transcriptomiques.

Remplacement

L’impact de la composition des biomatériaux utilisés dans cette étude aura été testé au préalable dans un modèle in vitro. Ceci permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la possibilité de la réparation du cerveau lésé sur le plan neuroanatomique et fonctionnel. Les symptômes cliniques des traumatismes crâniens qui nous intéressent concernent la motricité. De ce fait, la nécessité de modèles animaux apparait essentielle à l’étude de cette pathologie. Ces approches nécessitent la présence du réseau neuronal qui est uniquement accessible dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. De nos jours, il n’est pas encore possible de modéliser un cerveau de mammifère in-vitro ou in silico, qui nous permettrait d’étudier l’effet bénéfique de la transplantation sur la motricité.

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux nécessaires en expérimentation tout en s'assurant d'en avoir le nombre suffisant pour avoir une étude interprétable sur le plan statistique par l’utilisation d'un test statistique approprié. Ceci a permis de déterminer un nombre de 360 animaux avec la moitié de mâles et la moitié de femelles. Nous commencerons pas réaliser une étude pilote qui va consister à tester au maximum 10 biomatériaux pour sélectionner le meilleur candidat. Nous procéderons avec une démarche pas à pas (par groupe de 6 animaux) transplantés, répétés au maximum 10 fois, soit 60 animaux maximum au total. Si aucun biomatériau ne donnne de résultat satisfaisant, le projet sera arrêté.

Raffinement

Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : matériel de nidification et tunnel). Avant le début des tests de comportement, une habituation à l'expérimentateur sera réalisée (3 fois/semaine sur 2 semaines). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale avec analgésie et contrôle de la température corporelle à l'aide d'un tapis chauffant. Un traitement antalgique sera poursuivi en postopératoire durant 72h. Durant toute la procédure, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement) et des actions seront mises en place en cas de problème(s) observé(s), avec la mise en place d’une grille de score, avec l’utilisation de points limites adaptés et gradés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée pour les modèles animaux dans le domaine des neurosciences. En effet, il est possible de mimer chez la souris les lésions du cortex moteur qui peuvent survenir chez l'Homme dans différentes situations (accident de la route, traumatisme crânien, accident vasculaire cérébral...). Nous utiliserons des souris âgées de 3 mois au début de cette étude. Nous souhaitons travailler avec des souris adultes matures ce qui correspond à l'âge où le développement biologique est passé, mais pas encore affecté par le vieillissement.

Infectées par le paludisme puis exposées quarante-cinq minutes durant aux piqûres de moustiques, une partie des 860 souris de ce projet est utilisée pour faire circuler le parasite entre rongeur et insecte. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, avec un affaiblissement et une anémie liés à l'infection, et des prises de sang tous les un à deux jours sur animal vigile. Le porteur présente pourtant cette production de parasites comme "une solution de remplacement", au motif que les sporozoïtes ainsi obtenus alimentent des cultures cellulaires qui auraient sinon exigé davantage d'animaux. Toutes sont tuées, les unes sous anesthésie au moment du prélèvement terminal destiné aux stocks congelés, les autres pour éviter qu'elles n'atteignent les points limites de l'infection.

Objectifs

L'objectif du projet est de produire des sporozoïtes de Plasmodium, les formes transmises par le moustique de l'agent du paludisme, à l'aide de modèles murins d'infection par Plasmodium yoelii et Plasmodium berghei. Les sporozoïtes produits serviront à des études in vitro en modèles cellulaires des stades pré-érythrocytaires de ces parasites. Ces études in vitro sont nécessaires pour mieux comprendre la biologie de ces parasites et les mécanismes d'infection, et pour évaluer l’activité de nouvelles molécules antipaludiques ou optimiser l’activité de molécules existantes. Les modèles d’études in vitro reposent sur l’infection de cellules hépatiques par des sporozoïtes isolés à partir de moustiques Anopheles préalablement infectés à partir de souris infectées. Ces modèles d’infection in vitro de cellules hépatiques par les parasites de rongeur P. yoelii et P. berghei reproduisent de nombreux aspects de la biologie des espèces de Plasmodium infectant l'homme, et permettent d’étudier le rôle de facteurs parasitaires ou de l’hôte au cours de l’infection, notamment à l’aide de parasites génétiquement modifiés, ainsi que d’évaluer l’efficacité de molécules à visée antiplasmodiale.

Bénéfices attendus

Le paludisme, avec près de 250 millions de cas annuels et plus de 600 000 décès, pour la plupart des enfants de moins de cinq ans, reste un problème majeur de santé publique. Ce projet, nécessaire pour assurer la production régulière des lots de sporozoïtes requis pour les études in vitro menées dans le laboratoire, devrait permettre d'améliorer nos connaissance des mécanismes fondamentaux d'infection par Plasmodium, afin de définir des cibles thérapeutiques et vaccinales innovantes et de permettre l’évaluation de l’activité de molécules à visée antiplasmodiale dans le but d’élaborer ou d’optimiser de nouveaux traitements antipaludiques.

Procédures

Un premier groupe d'animaux est engagé dans des protocoles de production de parasites pour la congélation, destinés à l'infection standardisée d'autres souris. Ces animaux seront soumis à une injection intra-veineuse unique d’une suspension de sporozoïtes de Plasmodium (durée d'environ 15 secondes, sous anesthésie gazeuse), puis seront soumis à des prélèvement d'une goutte de sang tous les 1 à 2 jours à partir du 4ème jour post inoculation des parasites, pendant au maximum 7 jours (durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles). Ces animaux seront finalement soumis à un ultime prélèvement de sang, sous anesthésie et analgésie, pour la constitution des stocks de parasites cryopréservés (acte unique, durée 10 minutes), et euthanasiés avant leur réveil à l'issu de ce prélèvement. Un autre groupe d'animaux sera engagé dans des protocoles de transmission du parasite plasmodium aux moustiques. Ces animaux seront soumis une à injection intrapéritonéale de parasites (1 injection unique de parasites issus des stocks cryopréservés/standardisé, préparés à partir du premier groupe d'animaux ; durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), puis seront soumis à des prélèvement d'une goutte de sang par jour à partir du 3ème jour post inoculation des parasites, pendant au maximum 3 jours (durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles). Ces animaux seront finalement exposés à des piqûres de moustiques pour transmettre les parasites aux moustiques (acte unique réalisé sous anesthésie et analgésie, durée 45 minutes), puis euthanasiés avant leur réveil.

Impact sur les animaux

Stress lié à la préhension/contention, douleur de courte durée lors des injections intrapéritonéales sur animaux vigiles, douleur de courte durée lors des prélèvements sur animaux vigiles, risques associés à l'anesthésie (hypothermie, détresse respiratoire), contraintes liées à l'infection elle-même (affaiblissement, anémie).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures par des méthodes réglementaires, soit parce que des prélèvements sont nécessaires pour la constitution des cryostocks de parasites dans le cadre de ce projet, soit pour éviter d'atteindre des points limites chez les animaux infectés.

Remplacement

Ce projet vise à produire les parasites au stade sporozoïtes, nécessaires à des expérimentations in vitro pour étudier les stades préérythrocytaires du paludisme. Il s’agit d’une solution de remplacement puisque les expériences menées in vitro à partir de chaque lot de sporozoïte produit permettent de collecter de façon très robuste et reproductible de nombreuses données pour lesquelles il aurait été nécessaire d’utiliser un bien plus grand nombre d’animaux si l’on avait cherché à collecter ses données à partir d’expériences menées in vivo, chez la souris. En particulier, l’utilisation de systèmes de cultures cellulaires (lignées hépatocytaires et hépatocytes primaires) permet d‘analyser l'infection des cellules du foie par les parasites provenant des moustiques infectés. Si quelques protocoles décrivent la production axénique des sporozoïtes de Plasmodium, ils ne permettent malheureusement toujours pas de produire des sporozoïtes complètement matures et infectieux. Les protocoles décrivant la production des sporozoïtes de Plasmodium de rongeurs reposent de plus sur l’utilisation de gamétocytes (formes sexuées mâles et femelles), donc de stade sanguin, pour lesquels il n’existe pas de méthode de culture continue in vitro, et requièrent donc leur production chez l’animal.

Réduction

Au total ce projet utilisera 860 souris sur une durée de 5 ans. Ce nombre a été réduit au minimum pour permettre de réaliser les prélèvements nécessaires à la constitution des stocks de parasites et à l’infection des lots de moustiques nécessaires à la production des sporozoïtes destinés aux études in vitro sur 5 ans. Ces protocoles de production de parasites n'impliquent pas de tests statistiques. Le calcul des effectifs d'animaux nécessaires s'appuit sur une expérience de l'équipe acquise depuis plus de vingt ans dans la réalisation de ces protocoles.

Raffinement

Afin de contribuer au raffinement des procédures, les animaux sont hébergés avec leurs congénères (2 à 5 par cage) dans un milieu enrichi (lanières de papier Kraft ou équivalent). Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée avant le début des expérimentations. Certaines procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie pour prévenir la douleur ou le stress (inoculation de parasites par injection intraveineuse et expériences de transmission aux moustiques notamment). La présence de points limites définis permet d'éviter la souffrance liée aux complications de l'infection, en particulier lors de l’infection par le parasite de rongeur Plasmodium berghei, les souches de Plasmodium yoelii n’engendrant quant à elles que peu de symptômes. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent, pour vérifier l’apparence et l’état clinique des animaux, la prise alimentaire et hydrique ainsi que leur comportement, afin de détecter toute modification suggérant une douleur, une souffrance ou une détresse.

Choix des espèces

Le modèle d'infection chez la souris par les parasites de rongeur Plasmodium yoelii et P. berghei reproduit de multiples aspects de l'infection par les parasites du genre Plasmodium, responsables du paludisme chez l'Homme. Ce modèle permet l'infection du foie par les sporozoïtes (la forme infectieuse du parasite transmise lors de la piqure d'un moustique infecté), une croissance parasitaire sanguine et la transmission de ces parasites aux moustiques pour la production de sporozoïtes infectieux selon le même schéma que ce qui est décrit chez l'Homme. L’infection in vitro de cellules hépatiques par des sporozoïtes de ces espèces parasitaires représente un modèle pertinent pour étudier la biologie des stades précoces du paludisme dans le but d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et vaccinales, et d’évaluer l’activité de molécules à visée antipaludique dans le but de développer de nouveaux médicaments. Dans ce projet, des souris adultes, âgées de 6 à 10 semaines au début des procédures sont utilisées, conformément aux protocoles classiques utilisés dans ce type d'étude.

Pour vérifier si le microbiote intestinal de patientes anorexiques oriente les préférences alimentaires, 252 souris reçoivent par gavage des selles humaines transplantées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour l'étude de leurs tissus. Chaque animal subit six prélèvements sanguins sur animal vigile, un régime riche en fibres qui fait perdre du poids, un hébergement individuel et huit tests comportementaux, les 126 femelles recevant en plus trente-six frottis vaginaux. Le porteur signale un risque de traumatisme de l'œsophage lié au gavage et un risque d'anémie lié aux prises de sang, et renvoie à des points limites dont il ne dit pas lesquels.

Objectifs

L’anorexie mentale (AM) est un trouble des conduites alimentaires (TCA) qui touche jusqu’à 3.6% de la population féminine et dont le taux de mortalité est élevé. Il s’agit d’une maladie psychiatrique chronique qui se caractérise par une restriction alimentaire volontaire, une peur intense de devenir gros alors que le poids est faible et par une perturbation de l’image de son propre corps. La restriction alimentaire est qualitative et quantitative avec une aversion intense pour les lipides et les glucides et une alimentation très riche en fibre et pauvre en protide. Les causes exactes de l’anorexie mentale restent encore mal connues. Il a été mis en évidence la présence d’un déséquilibre du microbiote intestinal chez les patients AM. Ce déséquilibre pourrait être secondaire à la restriction alimentaire, mais aussi responsable de la préférence alimentaire et donc jouer un rôle majeur dans la persistance des symptômes chez les patientes souffrant d’une forme chronique de la maladie. Dans ce projet de recherche, nous émettons l’hypothèse que la préférence alimentaire particulière de l’anorexie mentale est déterminée par l’environnement microbiotique intestinal. L’objectif de l’étude est de mettre en évidence une différence de préférence alimentaire entre les groupes mimant l’anorexie mentale et les sujets sains pour répondre à la l’hypothèse que le microbiote dans patients atteints d’anorexie mentale les pousse à préférer manger des aliments végétaux. Cette étude permettra aussi de montrer le transfert de symptômes de l’anorexie mentale touchant de nombreux organes à travers le microbiote.

Bénéfices attendus

L’étude permettra la validation du modèle de l’anorexie mentale par transfert de microbiote fécal, d’améliorer la compréhension de la physiopathologie de l’anorexie mentale, de la compréhension des mécanismes d’influence microbiote/hôte.

Procédures

Tous les animaux vigiles seront gavés 4 fois soit au total. La contention et le gavage sont réalisés en moins de 10 secondes. Prélèvement de selles : 252 animaux 3 prélèvements par animal seront réalisés. Réalisé après émission naturelle. Durée 1 minute. Prélèvement sanguin : 252 animaux Les prélèvements seront réalisés sur animaux vigiles. Chaque prélèvement dure en moyenne 10 secondes, pour un nombre total de 6 prélèvements par animal soit au total 1 minute de prélèvement sanguin par animal. Prélèvement d’urine : 252 animaux Emis naturellement sur animal vigile. Durée du recueil : 10 secondes, 1 fois au cours du protocole. frottis vaginaux : 126 animaux Réalisation de frottis vaginaux chez les groupes d’animaux femelles. 36 prélèvements par animal durée du recueil 10 secondes. 252 animaux subiront 1 fois chaque test comportemental pour une durée totale de 40 min. Ceci porte le nombre de tests à 8 par animal. La durée cumulée d’épreuves comportementales sera de 145 min sur 6 semaines. Pour 252 souris. Injection sur animal vigil d’une durée de 5 secondes. Soit 1 injection par animal.

Impact sur les animaux

Gavage oral : Risque de traumatisme de l’œsophage lors de la manipulation. Hébergement individuel : Stress induit par l’isolement du fait des caractéristiques communautaires de l’espèce non satisfaites. Régime : perte de poids lié au régime riche en fibre. Prélèvements sanguins: douleurs et stress induit par la prise manuelle et la piqure et la coupure effectuée par la lancette. Les prélèvements seront tous espacés d’un minimum de 7 jours. Risque d’anémie lié aux prélèvements sanguins. Injections: Douleur liée à la piqure et l’injection de liquide Lavage vaginal : stress lié à la prise par la queue et le lavage. Tests comportementaux : induction d’un stress volontaire par la mise en conditions expérimentales. Mise a jeun une fois d’une durée de 4h et une fois d’une durée de 6h. Stress lié à la privation d’aliment dans l’environnement Prélèvement d’urine : émission naturelle, stress lié au placement en pot de recueil

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour l’étude scientifique des tissus

Remplacement

Notre projet nécessite l'utilisation d'animaux de laboratoire car il n'existe pas de techniques actuellement satisfaisantes et éthiques pour étudier le retentissement à un niveau physiologique du déséquilibre bactérien intestinal chez l’humain et ses effets sur la physiologie de l’intestin et le comportement alimentaire. Les techniques in vitro permettent des études à des échelles microscopiques (interactions au sein d’un tissu) mais non à l’échelle globale de l’organisme, ne permettent pas des études d’un point de vue comportemental. Les techniques d’études in silico ne sont pas applicables à l’échelles des interactions microbiote hôte d’un point de vue comportementale et physiologique car les connaissances ne sont actuellement pas assez développées pour créer des modèles informatiques prédictifs.

Réduction

Le nombre d’animaux destiné au projet a été estimé au regard d’une étude autorisée précédemment, et afin de garantir une puissance nécessaire et suffisante d’analyse statistique. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum. Les tests statistiques comportent des analyses descriptives et des analyses de comparaisons.

Raffinement

Les nuisances pour les animaux seront prévenues par une surveillance accrue dans les suites de la transplantation de microbiote fécal sur le plan du comportement, du stress, de la douleur et du poids. Afin de limiter le stress lié aux tests comportementaux, les animaux seront habitués aux procédures et au matériel de manière progressive. Afin de limiter le stress associé à l’hébergement individuel les cages sont transparentes, permettant un contact visuel et olfactif avec les congénères, et enrichies (papier à déchiqueter, matériel de nidification et bâton à ronger). Les points limites déterminés seront appliqués par les expérimentateurs en cas de constatation de leurs manifestations.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris qui est une espèce de référence et un modèle très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines. Cette espèce est bien référencée sur les études comportementales et la littérature existante permettra une analyse de qualité. Les souris seront des jeunes adultes âgés de 6 semaines au début de l'expérience. Ceci est nécessaire pour être au plus proche des conditions de maladie chez l’homme qui débute au jeune âge adulte.

De l'alcool est injecté sous la peau de souris gestantes, neuf fois entre le douzième et le vingtième jour de gestation, pour reproduire une alcoolisation fœtale. 1 921 souris, mères et petits confondus, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur note que les souris vacillent après l'injection, l'alcoolémie étant mesurée trente minutes plus tard, et affirme qu'elles ne montrent pas de signe de souffrance au moment de l'injection. Toutes sont tuées, les mères anesthésiées puis mises à mort pour prélever les embryons, les souriceaux pour prélever leur cervelet à neuf stades de développement.

Objectifs

Les Troubles Causés par l’Alcoolisation Fœtale ou TCAF sont des troubles du neurodéveloppement liés à des consommations modérées ou discontinues d'alcool pendant la grossesse. Cette pathologie, dont la prévalence est évaluée à 1% des naissances, se traduit par l’apparition d’atteintes neurologiques chez l'enfant avec des répercussions fonctionnelles qui se révèlent progressivement avec l’âge. Dès lors, de nombreuses études visant à caractériser les anomalies du neurodéveloppement chez les enfants TCAF se sont portées sur des structures intégratives telles que le néocortex ou encore l’hippocampe. Celles-ci ont notamment révélées une tortuosité significative des vaisseaux sanguins induisant un mauvais positionnement des cellules nerveuses. Pour autant, plusieurs déficits observés chez ces enfants, tels que les troubles orthoptiques ou des défauts de motricité fine, suggèrent que le cervelet pourrait également participer aux déficits induits par une alcoolisation in utero. Les objectifs de ce projet seront donc (i) de caractériser la vascularisation et les interactions neurovasculaires au cours du développement du cervelet, puis ii) d’évaluer l’impact de l’alcoolisation in utero sur la mise en place vasculo-associée des cellules du cortex cérébelleux. A terme, nous pourrons ainsi déterminer si le cervelet participe aux déficits observés chez les enfants TCAF afin d'optimiser leur prise en charge.

Bénéfices attendus

Le présent projet permettra tout d'abord d’identifier pour la première fois le mécanisme de mise en place de la vascularisation dans le cervelet murin en développement. Ainsi, nous pourrons déterminer si une migration vasculo-associée participe à la mise en place du cervelet au cours de l'embryognenèse ou lors de la période postnatale et si celle-ci est altérée en condition d'alcoolisation foetale comme déjà démontré dans le cortex cérébral et la rétine. De plus, l’implication d'un service de pédiatrie néonatale dans ce projet nous permettra d’envisager une transposition de nos résultats immunohistochimiques à l’enfant. Dès lors, une corrélation entre les altérations histologiques du cervelet et les atteintes neurodéveloppementales observées chez les enfants atteints de TCAF pourra être envisagée et la prise en charge de ces enfants pourra alors prendre en compte les déficits neurologiques de manière plus intégrée, i) en orientant la thérapeutique vers la cible vasculaire et ii) en incluant la participation du cervelet lors des traitements symptomatiques.

Procédures

Afin de mimer une alcoolisation foetale, de l’alcool sera administré par voie sous cutanée à des souris gestantes du 12ème au 20ème jour embryonnaire soit 9 injections au total Avant la procédure d'injection, les souris gestantes seront préalablement légèrement anesthésiées afin de limiter le stress. La manipulation dure environ 1 minute pour chaque injection. Ce protocole d'alcoolisation répétée par injection est décrit dans des cas d’alcoolisation maternelle. Lors des prélèvements des embyrons, les mères seront soumises à une anesthésie dans une chambre d'induction avant leur euthanasie. Lors des prélèvements des cervelets chez les souriceaux postnataux, les animaux sont également anesthésiés avant l'euthanasie.

Impact sur les animaux

A la suite de l’injection d’alcool chez les mères gestantes, les souris vacillent reflétant l’alcoolémie mesurée après 30 minutes comme observé chez l’humain après alcoolisation. Au cours de l’injection, les souris ne montrent pas de signe de souffrance. Les études déjà réalisées sur ce modèle murin TCAF n'ont pas démontré d'augmentation de fausses couches ou de mortalité précoce chez les embryons/souriceaux.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés dans cette étude sera euthanasié à la fin de l'expérimentation soit du fait du prélèvement d'organes ou d'embryons, soit du fait qu'ils auront reçu des injections journalières pendant 9 jours (de NaCl 0.9% ou d'alcool) et qu'ils ne pourront donc pas être réutilisés pour d'autres expérimentations (mères gestantes).

Remplacement

Certains déficits observés chez les enfants TCAF, tels que les troubles cognitifs, orthoptiques ou des défauts de contrôle de la motricité fine laissent penser que le cervelet pourrait participer aux déficits induits par une alcoolisation foetale. A l'appui de cette hypothèse, les images d'IRM montrent que ces enfants présentent un volume cérébelleux plus faible. De plus, plusieurs études réalisées sur des modèles animaux ont montré que les populations nerveuses du cervelet présentent une sensibilité importante à l'alcool. Cependant, au regard de ces travaux, il reste difficile d'évaluer l'impact d'une exposition prénatale à l'alcool sur le développement du cervelet. En effet, les modèles utilisés jusqu'alors sont soit des cultures cellulaires, ce qui ne permet pas d'obtenir un système intégré, soit des souris entre le 4ème et le 10ème jour postnatal, ce qui correspond au 3ème trimestre de gestation chez l'Homme, alors que les différents types cellulaires sont déjà présents au sein du cervelet, et ce qui implique d'étudier les effets directs de l'alcool et non l'effet d'une alcoolisation de la mère sur le développement du petit. De plus, il n'existe que peu voire pas de données sur la mise en place de la vascularisation et sur l'existence d'une migration vasculo-associée au cours du développement embryonnaire du cervelet, et, par voie de conséquence, l'impact de l'alcoolisation foetale sur ces événements précoces n'a jamais été étudié. Notre étude vise donc tout d'abord à décrire la vascularisation du cervelet chez des embryons de souris à différents âges pour déterminer si les cellules cérébelleuses utilisent les vaisseaux sanguins en tant que support de migration au cours de l'embyrogenèse. Puis, en utilisant un modèle animal TCAF, nous pourrons identifier les mécanismes impactés par une alcoolisation foetale afin de mieux appréhender la participation du cervelet aux déficits TCAF et d'adapter la prise en charge thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet et obtenir des résultats statistiquement interprétables à l'aide du test non paramétrique Mann-Whitney. 1. Pour la caractérisation de la vascularisation et de la migration vasculo-associée dans le cervelet au cours du développement, les âges d’intérêt ont été identifiés en s’appuyant sur la littérature afin qu'ils soient en corrélation avec les étapes clefs du neurodéveloppement cérébelleux humain. Ainsi 4 stades embryonnaires et 5 stades postnataux seront étudiés à raison de 4 animaux par stade pour obtenir une moyenne statistiquement interprétable des paramètres vasculaires et vasculo-associés. Ces 4 animaux devront être de portées différentes pour prendre en compte la variabilité inter-portée dans l'interprétation des résultats. Pour les marquages immunohistochimiques, 10 anticorps différents sont requis pour identifier l'ensemble des vaisseaux sanguins et des populations cellulaires cérébelleuses. En transparisation, les marquages immunohistochimiques sont obligatoirement réalisés sur des embryons ou cervelets postnataux entiers, ce qui nécessitera 4 animaux de portée différente par stade et par marquage. En revanche, pour l'immunohistochimie sur coupe, la taille du cervelet permettra de réaliser plusieurs marquages différents sur le même échantillon, permettant de réduire le nombre d'animaux. 2. Pour étudier l'impact d'une alcoolisation foetale sur la vascularisation et la migration vasculo-associée, il sera nécessaire de réitérer l'ensemble des marquages précédents sur des embryons « contrôle sham » dont la mère a reçu des injections de NaCl pour confronter les résultats obtenus avec les animaux « alcoolisés in utero » et éviter les biais expérimentaux liés à l'injection en elle-même. Pour les études de PCR et western blot, la taille du cervelet nécessitera un animal par condition et par technique jusqu'à l'âge de la naissance inclus. En revanche, pour les stades plus tardifs, ces 2 techniques pourront être réalisées en parallèle sur un même animal en divisant le cervelet en deux au moment du prélèvement. Enfin, pour la zymographie, un animal par condition sera nécessaire du fait de la préparation de l'échantillon.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation. Ils seront maintenus dans un environnement stabilisé (température 21 ± 1 °C, hygrométrie 55%, luminosité 100 lux avec photopériode régulée (cycle jour/nuit 12h/12h)). Ils auront libre accès à l’eau et à la nourriture, et un enrichissement sera mis en place (tunnel en carton, demi-sphère de cellulose et lanières de papier kraft). Ils seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et leur bien-être sera surveillé après les injections d’alcool/NaCl. En cas de dépassement des points limites identifiés (signe de douleurs extérieurs indexés sur Mouse Grimace Scale, manifestations de signe de détresse ou d’infection) ou de défauts significatifs de développement, les animaux seront mis à mort comme décrit précédemment. Lors de la procédure d'alcoolisation foetale, les mères seront conservées dans leur cage d’hébergement et amenées dans la pièce d’expérimentation 1h avant les injections pour limiter tout stress de l’animal. Cette pièce est calme et isolée d'autres animaux. Les mères ayant reçu l'injection seront surveillées en temps réel pendant 45 min avant leur retour dans leur hébergement. Lors des prélèvements, les animaux en attente de l'euthanasie sont placés à l'écart de la table d'expérimentation pour éviter tout stress environnant.

Choix des espèces

La Souris est un modèle de choix pour l’étude de nombreux systèmes physiologiques complexes dont les mécanismes sont similaires aux mammifères. C'est le cas du développement cérébral par exemple. Or le cervelet suit les mêmes étapes de développement que le reste du cerveau avec des séquences de prolifération, migraion, différenciation et apoptose. L'utilisation de ce modèle est donc tout à fait pertinent dans cette étude. De plus, la majorité des publications antérieures relatives aux TCAF a été réalisée chez la souris. Par souci de cohérence et de vision intégrée de l'effet de l'alcoolisation foetale sur le développement nerveux, il est donc nécessaire de poursuivre avec ce modèle murin avant la transposition clinique. Les stades de développement d’intérêt ont été déterminés sur la base des événements clefs de la neurogenèse du cervelet qui sont également bien identifiés chez l'Homme. Ainsi les stades embryonnaires choisis correspondent respectivement à la naissance des cellules de Purkinje, à l’émergence des précurseurs des cellules en grains puis des cellules de Golgi, et enfin à la mise en place de la couche granulaire externe. Puis, pour les études postnatales, les trois premières semaines postnatales représentent successivement une phase de prolifération des cellules en grains dans la couche granulaire externe, le développement de l'arbre dendritique des cellules de Purkinje, la mise en place du circuit cortical cérébelleux et enfin la fin du développement du cervelet chez le jeune adulte. L'alcoolisation sera réalisée uniquement chez la mère gestante mais pas directement sur le souriceau postnatal.

Des traitements administrés jusqu'à quatre fois par jour pendant six mois attendent 5 370 souris, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour prélèvements post mortem. Elles sont infectées par la tuberculose au moyen d'une suspension bactérienne déposée dans les narines sous anesthésie, geste que le porteur décrit comme non invasif tout en signalant qu'il peut entraîner une détresse respiratoire. Les souris non traitées développent la maladie et peuvent perdre du poids, l'objectif affiché étant de raccourcir un traitement humain de six mois et de contourner les résistances aux antibiotiques. Trois lignées sont utilisées, dont des souris nude, immunodéficientes, choisies pour mimer la co-infection par le VIH et présentées comme porteuses d'un "phénotype dommageable".

Objectifs

La tuberculose est une infection due aux bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis. Elle touche encore annuellement 10 millions de personnes dans le monde et provoque 1,5 millions de décès. Le traitement repose actuellement sur l’association de 4 antibiotiques sur une durée de 6 mois. La longueur et la complexité du traitement ainsi que l’émergence de souches résistantes aux antibiotiques sont des causes d’échec. Dans ce contexte, le but de nos travaux de recherche est 1) de mettre au point de nouvelles stratégies thérapeutiques antibiotiques permettant de simplifier le traitement et d’être actif contre les souches ayant développé une résistance aux antituberculeux existants et 2) de mieux comprendre les mécanismes in vivo de virulence et d’émergence de résistance aux traitements. Ces types d’études sont longues voire impossibles à conduire chez l’homme. Le modèle murin permet donc de tester différentes hypothèses qui peuvent ensuite être confirmées chez l’homme voir même utilisées directement. Notre projet recouvre ainsi l’ensemble des expérimentations à réaliser in vivo dans le modèle murin pour étudier les mécanismes de virulence, d’émergence de résistance et évaluer l’activité des traitements.

Bénéfices attendus

La tuberculose touche encore annuellement 10 millions de personnes dans le monde et provoque 1,5 millions de décès. Le traitement repose actuellement sur l’association de 4 antibiotiques sur une durée de 6 mois. La longueur et la complexité du traitement ainsi que l’émergence de souches résistantes aux antibiotiques sont des causes d’échec. Ce projet vise à évaluer de nouvelles molécules qui pourraient diminuer la durée du traitement ainsi que la fréquence de prise des antibiotiques et élaborer des stratégies pour réduire le risque d’échec due aux mutants résistants aux antibiotiques.

Procédures

Les animaux seront infectés par instillation intranasale (1 instillation par animal) afin de créer une infection bactérienne. Les animaux seront anesthésiés 1 fois avant instillation. La suspension bactérienne sera ensuite déposée au niveau des narines de l'animal anesthésié pour que la suspension soit inhalée lors de la respiration (geste d'une minute). Pour les traitements, les animaux vigiles seront maintenus en contention manuelle puis traités par voie orale ou sous cutanée (fréquence de 1 à 4 fois par jour sur 1 à 7 jours pour une durée de 1 à 6 mois) (geste de 30 secondes) . Pour les prélèvements sanguins qui ne concernera pas tous les animaux, les souris vigiles seront tenues en contention manuelle et un petit volume de sang sera prélevé (geste de 15 secondes). A la fin du prélèvement, une pression sera effectuée pour arrêter le saignement (geste de 30 secondes). Les animaux ne subiront qu’un seul prélèvement au cours de la cinétique. Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de suivi conformément au protocole ou en anticipé en cas d’atteinte de point limite.

Impact sur les animaux

Lors de l’instillation intranasale, les animaux seront anesthésiés ce qui pourrait engendrer un stress thermique. Une douleur de courte durée liée à la piqûre de l’aiguille peut être ressentie par l’animal. La suspension à inoculer sera ensuite déposée au niveau des narines de l’animal anesthésié, sans geste invasif mais pouvant entraîner une détresse respiratoire. Les souris non traitées vont par la suite développer une tuberculose. L’évolution de la maladie peut engendrer une perte de poids et seules les souris des groupes non traités pourront donc présenter une perte de poids. L’administration des traitements se fera par administration orale sur animaux vigiles maintenus par une contention. Ces administrations pourront induire un stress en raison de la contention nécessaire. Enfin, les prélèvements de sang pourraient aussi être générateurs de stress et de douleur de courte durée due à la piqûre lors du prélèvement et entrainer un hématome. Les souris nude présentent un phénotype dommageable, elles sont immunodéficientes et peuvent donc être plus sensibles aux infections.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux à la fin de la procédure.

Remplacement

L’ensemble du projet vise à mesurer l’activité de nouvelles molécules afin d’améliorer le traitement de la tuberculose chez l’homme. En effet, les tests in vitro de mesure de l’activité d’antibiotiques contre le bacille tuberculeux menés en amont de notre projet ne prennent en compte que la bactérie et pas la réponse de l’hôte dans son ensemble. Il est donc nécessaire d’avoir recours au modèle murin avant de débuter un essai clinique chez l’homme.

Réduction

Le projet impliquera au plus un total de 5370 animaux. Les hypothèses testées dans le modèle murin seront uniquement celles qui ont franchi les étapes de sélection dans les modèles in vitro réalisés en amont. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum par groupe permettant de conserver une puissance statistique suffisante pour répondre aux problématiques. Notre projet utilisant une voie d’instillation en intranasal celle-ci permet de réduire la variabilité inter animale et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires dans les expériences.

Raffinement

Les procédures ont été établies dans le respect du bien-être animal en limitant la douleur (utilisation d’une analgésie et anesthésie quand cela est nécessaire) et le stress (période d’acclimatation, gestes réalisés par des personnes formées). Les animaux seront hébergés dans un niveau de confinement 3 et leurs conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation. Une période d’acclimatation d’une semaine est observée avant le début des expériences. Les animaux seront hébergés par 5 et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; un enrichissement sera proposé sous forme de lanières de kraft ou de coton (en fonction des procédures de l’animalerie dont dépend ce projet). L’animalerie dispose d’un cycle nycthéméral, d’une hygrométrie et de température surveillées. Les animaux sont suivis quotidiennement et des points limites ont été définis pour garantir le bien-être des animaux pendant toute la durée du projet.

Choix des espèces

Le modèle murin est utilisé depuis plus de 50 ans pour l’évaluation des antituberculeux. Il permet une prédiction de l’efficacité des antituberculeux chez l’homme car la pharmacocinétique choisie chez l’animal est équivalente à celle obtenue chez l’homme aux doses habituelles des antituberculeux. La variété des profils de résistance limite la reproductibilité d’études cliniques et la longueur des essais (supérieur ou égal à 10 ans) est aussi une limite à l’étude chez l’homme. En parallèle, les études in vitro ne renseignent que sur le versant de la bactérie mais pas sur celui l’hôte. Le modèle murin permet donc une évaluation plus courte et reproductible in vivo. Afin réduire la variabilité et donc mieux mettre en évidence les différences dans les études les souris consanguines balbc sont utilisées (3R : réduction et raffinement). Dans les étapes pré-cliniques et pour permettre de mimer la variabilité observée chez l’humain, les souris swiss non consanguines sont utilisées. Enfin, la co-infection tuberculose et VIH étant une problématique majeure de santé publique avec des enjeux spécifiques, pour mimer l’immunodépression, les souris nude sont utilisées. Tous les animaux auront 4 semaines à leur arrivée et entreront en procédure après une semaine d'acclimatation soit à 5 semaines.

Jusqu'à 36 tests comportementaux, 336 administrations et 44 prélèvements sanguins peuvent être infligés au même animal sur 84 jours. 9 400 souris et 7 200 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Le porteur mesure ainsi l'anxiété et la dépression des rongeurs pour tester des molécules, en les mouillant, en leur injectant un produit qui provoque une apathie de 24 heures, ou un composé panicogène qui déclenche selon ses propres termes un sentiment désagréable d'anxiété dans l'heure. Il annonce 255 études sur cinq ans et présente le bien-être des animaux non-humains comme "primordial".

Objectifs

L’anxiété et la dépression sont des troubles psychiatriques principalement responsables d'invalidité et de mortalité prématurée. Au niveau mondial, on estime qu’environ 300 millions de personnes souffrent de troubles anxieux, soit ~4 % de la population mondiale. Un nombre similaire de personnes souffrent de dépression. On estime que la perte de productivité due à la dépression et à l’anxiété coûtera à l’économie mondiale 1 000 milliards de dollars par an et devrait atteindre 16 000 milliards de dollars d’ici 2030. L’anxiété et la dépression se différencient par les sensations et les sentiments qu’elles provoquent : la peur en particulier pour la première (sentiment général d’insécurité et par une sensation d’inquiétude démesurée), et la tristesse pour la seconde (tristesse profonde, perte de plaisir et d’envie, perte d’énergie et repli sur soi). Ainsi, l’anxiété et la dépression sont des pathologies différentes mais elles sont imbriquées à différents points de vue Les médicaments existants et approuvés présentent des effets secondaires notoires et peuvent être inefficaces chez certains patients. On parle ainsi de forme de résistance aux médicaments. Les comportements d’anxiété et de dépression ne sont pas le propre de l’Homme, on les retrouve également chez les animaux et notamment chez les rongeurs. Ainsi l’utilisation des rongeurs, souris comme rat, sont des modèles couramment utilisés pour évaluer de nouvelles molécules thérapeutiques. Dans ce projet nous allons mettre en œuvre plusieurs procédures permettant de mesurer le niveau d’anxiété et de dépression des rongeurs et ainsi d’évaluer l’effet de nouvelles molécules thérapeutiques. Les procédures seront au nombre de 4 : -La première étudie chez la souris le niveau naturel d’anxiété et de dépression des animaux dans les conditions d’hébergement de notre laboratoire. -La seconde étudie chez le rat le niveau naturel d’anxiété et de dépression des animaux dans les conditions d’hébergement de notre laboratoire. -La troisième étudie chez la souris l’état d’inconfort induit par une inflammation par un traitement. -La quatrième étudie une forme particulière d’anxiété, le phénomène de panique. Il est induit chez le rat par une administration d’un composé panicogénique connu chez l’homme.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter l’anxiété et la dépression. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique, nous participons à une meilleure connaissance de la prédictivité de nos modèles.

Procédures

Les animaux qui réaliseront la procédure 1 ou la procédure 2 pourront être amener à réaliser 36 tests comportementaux anxio-dépressif et/ou de motricité (10-30 min), recevoir un maximum de 336 administrations et de 1 à 44 prélèvements sanguins sur la période de 84j en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire. Les administrations durent moins de 30 seconds en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Concernant les prélèvements de sang, ils durent 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée. Les animaux qui seront en procédure 3 subiront au maximum 4 tests de comportement de dépression et/ou d’activité locomotrice (10-30 min) dans les 48h, de plus les animaux subiront une injection d’une substance induisant un état inflammatoire léger et transitoire et bien entendu le traitement avec la molécule à étudier (le schéma de traitement sera fixé en fonction des données pharmacologiques disponible sur cette molécule). Pour les animaux de la procédure 4, chaque individu sera manipulé quotidiennement de 30sec à 1 min pendant une semaine. Une injection d’un composé panicogénique sera réalisée. Ils subiront au maximum 2 tests de comportement de dépression et/ou l’activité locomotrice (environ 10min). De plus les animaux seront sujet à un traitement avec la molécule à étudier (le schéma de traitement sera fixé en fonction des données pharmacologiques disponible sur cette molécule).

Impact sur les animaux

Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun (

Devenir

Une partie des animaux est mis à mort pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.

Remplacement

Bien qu'il soit possible de disséquer les mécanismes d’action des nouveaux médicaments in vitro, les réponses comportementales des animaux suite aux traitements sont des évènements difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse des comportements d’anxiété et de dépression nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous associons plusieurs tests de comportement sur les mêmes animaux afin de ne pas multiplier les cohortes. Des analyses statistiques finales sont réalisées. Les animaux incluent dans ce projet vont nous permettre de mener 255 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. De plus nous avons établis des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui n’est pas en relation avec les signes attendus du projet. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre Structure du Bien Être Animal (SBEA) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures. De plus dans nos modèles, quand c’est possible, l’environnement des animaux est enrichi. Pour les souris, l’enrichissement du milieu comporte du matériel de nidification, un dôme pour se cacher et un tunnel suspendu pour augmenter la superficie de la cage. Pour les rats, l’enrichissement du milieu comporte un tunnel en carton pour permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Si des animaux se retrouvent mouiller pendant un test de comportement alors ils seront séchés avant leur retour dans leur cage d’hébergement. Chaque fois que les animaux sont soumis à divers tests, le choix des tests, la fréquence de mise en œuvre et leur ordre d’exécution est établi afin d’impacter le moins possible le bien-être des animaux. Une partie des animaux sont habitués à l’Homme par une manipulation quotidienne (30sec-1min/jour, handling).

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris ou des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. C’est le cas pour la souris et le rat dans les études des phénomènes d’anxiété et de dépression. De plus tous nos modèles répondent favorablement aux médicaments déjà sur le marché ce qui prouve leur prédictivité et permettent aux industriels d’étudier l’apport de leurs nouvelles recherches par rapport aux traitements déjà existants. De plus, ces espèces disposent d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Etant donné que nous n’étudions pas une pathologie liée au vieillissement, qui affecte les jeunes adultes et que nous avons une longue expertise dans ce modèle en utilisant des souris de 4 à 5 semaines au début du projet et des rats de 6-7 semaines au début du projet, nous allons continuer avec ce stade de développement.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever sang et organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont d'abord rendues obèses et diabétiques par douze semaines de régime gras, puis soumises à un jeûne de seize heures, à un jeûne intermittent de six semaines ou à un régime cétogène, avec des tests de tolérance au glucose comprenant six heures de jeûne et sept piqûres de la queue en deux heures. Il s'agit de savoir si une protéine du foie explique les effets bénéfiques de ces régimes, déjà observés au laboratoire dans une étude non publiée. Le porteur écrit qu'il est "impossible" de reproduire par des méthodes alternatives le jeu combiné du foie, des tissus adipeux, de l'intestin, du cerveau et du muscle.

Objectifs

Les maladies métaboliques du foie (stéatose hépatique non alcoolique, ou NAFLD pour non-alcoholic fatty liver disease) sont en expansion dans les pays industrialisés, parallèlement à la prévalence croissante de l’obésité. Le premier stade de la maladie correspond à une accumulation de graisses dans le foie et est bénin mais peut évoluer chez certains patients vers une forme inflammatoire, puis vers une cirrhose, à l’origine d’autres complications sévères telles que le cancer du foie. Les mécanismes de progression de ces maladies sont encore mal compris et aucun traitement médicamenteux efficace n’est disponible à ce jour. Dans une étude non publiée du laboratoire, nous avons récemment démontré que plusieurs stratégies alimentaires sont capables de diminuer l’obésité, le diabète et la stéatose hépatique chez la souris. Nous souhaitons à présent déterminer les mécanismes impliqués dans ces effets bénéfiques. Nous émettons l’hypothèse que la protéine PPARa pourrait être impliquée dans ces effets. PPARa est principalement exprimée dans le foie où elle contrôle la dégradation des graisses, faisant d'elle une bonne cible thérapeutique pour traiter les maladies métaboliques. Nous disposons au laboratoire de souris mâles et femelles chez qui le gène PPARa est non fonctionnel dans le foie. Dans ce projet, nous utiliserons des souris mâles et femelles qui n'expriment pas PPARa dans le foie et comme contrôle, des souris chez qui PPARa s’exprime. Elles seront nourries par un régime gras induisant une obésité, un diabète de type 2 et une pathologie hépatique mimant celle observée chez l’Homme. Une fois la pathologie installée, les animaux seront soumis à différentes stratégies alimentaires : un retour à un régime contrôle, un jeûne aigu ou intermittent, un régime cétogène (presque exclusivement constitué de graisses et contenant très peu de sucre). Les effets de ces différentes stratégies alimentaires seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses des prélèvements d’organes (foie, tissus adipeux brun et blanc).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir l’importance de PPARa spécifiquement dans le foie dans les effets bénéfiques des différentes interventions sur la progression de l’obésité, du diabète de type 2 et de la stéatose hépatique. En conséquence, ce projet pourrait identifier un des mécanismes hépatiques pouvant être impliqué dans les effets de ces différentes interventions. En effet, aucun traitement de référence n’est disponible à ce jour pour les patients atteints de ces maladies chroniques du foie qui représentent actuellement la 2e cause de transplantation de foie du monde.

Procédures

Les animaux seront nourris avec un régime standard ou un régime obésogène riche en graisses pendant 12 semaines. A l'issue de ces 12 semaines, les animaux subiront l'une des interventions nutritionnelles suivantes : une mise à jeun pendant 16h, un jeûne intermittent de 16 h par jour pendant 6 semaines, un régime cétogène riche en gras et pauvre en sucre pendant 6 semaines, un régime standard pendant 6 semaines, un groupe contrôle qui restera nourri avec le régime obésogène pendant 6 semaines. Les animaux seront aussi soumis à des tests de tolérance au glucose (OGTT) ou à l’insuline (ITT) au début et à la fin de chaque intervention. Ces tests consistent en : 6h de jeûne, suivi d'une mesure de la glycémie puis un gavage avec du glucose pour les OGTT ou une injection d'insuline pour les ITT, puis des mesures de la glycémie toutes les 15 min pendant 2h. Pour les OGTT, le glucose est administré par gavage une fois et pour les ITT, l'insuline est administrée par injection une fois. Le gavage et l'injection prennent chacun moins de 30 secondes. Pour les mesures de glycémie, le prélèvement d’une seule goutte de sang (

Impact sur les animaux

Les régimes obésogènes vont induire une obésité et des perturbations du métabolisme associées tels qu'un diabète et une stéatose, sans souffrance visible des animaux ni changement de leur comportement. La mise à jeun peut entraîner une hypoglycémie et une hypothermie. Le prélèvement sanguin et le gavage oral de glucose et d’insuline peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car la pathologie étudiée (stéatose non alcoolique) est complexe et fait intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible de mimer la pathologie étudiée grâce à l’utilisation du régime gras.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement. Ainsi, les souris seront en hébergement collectif et dans un environnement contrôlé (température, hygrométrie). Des enrichissements du milieu de vie (cabanes en inox et ouate de coton ou de cellulose) seront disposés dans la cage afin de pouvoir se distraire, se cacher et fabriquer des nids. Pour un meilleur raffinement et limiter le stress, les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons leur consommation alimentaire et hydrique afin de vérifier la bonne tolérance des différentes expérimentations. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres (indice 0 = normal ou léger, indice 3 = changements importants par rapport à la normale). Si un animal présente un signe quelconque de souffrance avec un score de 3 après évaluation de ces paramètres, l’animal sera aussitôt retiré de l’étude et replacé dans des conditions d’hébergement standard (régime standard et aucune procédure réalisée).

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

Un rat qui perd plus de 20 % de son poids ou atteint 15 points sur 27 à la grille de la maladie, qui note diarrhée, gonflement des articulations, lésions de la peau, inflammation des testicules ou de l'œil, est mis à mort. 600 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont des individus porteurs d'un gène humain qui développent d'eux-mêmes une spondylarthrite, avec douleur, perte de poids et parfois mobilité réduite. Pour tester des molécules, une partie reçoit une injection dans l'abdomen chaque jour pendant six à douze semaines, et les rats sont tués à l'issue de chaque procédure pour le prélèvement de leurs organes, hors élevage, dont le sort n'est pas précisé. Le porteur présente ce rat comme "le modèle animal le plus pertinent" de la maladie humaine, et note que des souris portant le même gène ne développent aucun signe de la maladie.

Objectifs

l’objectif majeur de notre projet est de comprendre le rôle pathogène du HLA (Antigènes des Leucocytes Humains)-B27 au cours de la spondyloarthrite (SPA) utilisant le modèle expérimental de SPA : le rat transgénique HLA-B27 afin de proposer des nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Au cours de ces dernières années, nous avons cherché à comprendre pourquoi nous observons une proliferation anormale des lymphocytes T pro-inflammatoires producteurs de la cytokine inflammatoire (IL-17) chez le rat B27, le modèle animal le plus pertinent et le plus proche de la SpA humaine. Nos résultats ont mis en évidence que l’IL-27 (une cytokine anti-inflammatoire) et ICOS (une molécule de costimulation) étaient deux nouvelles cibles thérapeutiques prometteuses pour le traitement de la SpA. En ce qui concerne l’IL-27, elle a eu un effet protecteur en réduisant la sévérité des manifestations inflammatoires chez le rat B27, tout en inhibant les réponses des lymphocytes inflammaoires et la production d'IL-17. Nos résultats ouvrent des nouvelles perspectives même pour des patients qui ne repondent pas aux traitements actuellement disponibles.

Procédures

Post-mortem, des organes lymphoides des animaux seront prélévés en quelques minutes (environ 2-3) pour une analyse cellulaire ou histologique. Durant les essais pré-cliniques, les animaux seront injectés (durée de l'injection quelques secondes) intraperitoneal tous les jours pendant 6-12 semaines. Pour les experiences ex-vivo un minimun de 2 animaux non transgéniques et 2 animaux transgéniques seront utilisés et les experiences seront répétées 5 à 6 fois. Pour les essais pré-cliniques, nous utiliserons des groupes de 6 à 8 animaux par groupe.

Impact sur les animaux

Le rat transgénique pour HLA-B27 est à l’heure actuelle le modèle animal le plus percutant de cette pathologie. Dans ce modèle surviennent spontanément, sous le seul effet du transgène et probablement en association avec le fond génétique du rat, toutes ou une partie des manifestations de la spondylarthrite ankylosante. Ainsi, ces animaux développent des manifestations comme des arthrites et une colite. Certains animaux développent aussi une l’inflammation de la peau ou de l’œil. Ces manisfestations peuvent engendrer chez ces animaux de la douleur, perte de poids et parfois une mobilité reduite.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, à l'exception de l'elevage, les animaux seront mise à mort pour les prélèvements d'organes nous permettant d'etudier les céllules, les organes et les méchanismes impliqués dans la pathogénèse de la maladie. Dans d'autres cas, les animaux seront utilisés pour étudier le potentiel thérapeutique des certaines molécules à partir du prélèvements d'organes et analyse cellulaire.

Remplacement

Toutes les molécules avec un potentiel thérapeutique seront d’abord testées in vitro en utilisant des lignées cellulaires à la place des animaux par exemple. Seulement après validation in vitro, ces molécules seront téstées chez les animaux afin d'étudier leur potentiel thérapeutique dans le traitement contre les spondyloarthrites.

Réduction

Comme prévu, dans les essais pré-cliniques, le nombre d’animaux utilisés dans chaque groupe de traitement sera de 6 et 8. Ce nombre d’animaux par groupe nous permet de réaliser des analyses statistiques robustes permettant d’établir quelques conclusions pertinentes sur des paramètres abordés dans notre projet. Il ne nous paraît pas envisageable de réduire ce nombre d’animaux par groupe dans de futurs projets, si l’on souhaite garder des analyses statistiques pertinentes.

Raffinement

Nous envisageons, en cas de présence d’arthrites causant une difficulté de la mobilité des rats, de mettre de l’alimentation dans la cage afin que les rats puissent s’alimenter correctement. Du change de cages, deux fois par semaine , seront prévus pour les cages où il y aura des animaux très malades avec diarrhées. Nous mettrons en place l'ajout de fromage aux femelles gestantes et aux petits pour améliorer leur croissance. A partir de 7 semaines d’âge l'etat de santé des animaux sera observé et nous utiliserons un tableau de scoring de la maladie (voir tableau ci-dessous). Les animaux présentant une perte de poids supérieure à 20% ou atteignant le score total de 15 (= point limite) seront sacrifiés. Score maximal total = 27 Semaine 7……Semaine X Poids (g) Diarrhée Absente=0 Modérée = 1 Importante= 2 Profuse=3 Anite=+1 Articulations Normale=0 Gonflée = 1 à 4 Patte AV gauche Patte AV droite Patte AR gauche Lésions cutanées 1 à 4 Ongles= +1 Orchite Absence=0 Présence=1 Uvéite Absence=0 Présence=1

Choix des espèces

Le rat transgénique pour HLA-B27 est à l’heure actuelle le modèle animal le plus relevant de cette pathologie. Dans ce modèle surviennent spontanément, sous le seul effet du transgène et probablement en association avec le fond génétique du rat, toutes les manifestations de la spondylarthrite ankylosante. Notre objectif est donc de comprendre le rôle pathogène du HLA-B27 au cours de la pathologie en utilisant ce modèle. Il est important de souligner que des souris portant le même transgène ne développent aucun signe de la maladie. Nous utiliserons des animaux à un état précoce du développement de la maladie (environ 3 semaines) ne présentant pas encore des signes cliniques, par exemple pour les expériences nécessitant d’utiliser des cellules en absence d’inflammation ou dans le cas de traitement in vivo précoce. Dans ce cas, les animaux seront marqués à l’encre et génotypés avant leur utilisation. Pour toutes les autres expériences, en utilisant de rats adultes qui presentent des signes cliniques (la maladie est etablie) nous utiliserons un protocole classique de marquage à l’oreille et génotypage à partir d’échantillons de l'oreille marquée. Des rats adults (entre 3 mois et 6 mois d'âge) seront utilisés pour certaines expériences.

Des souriceaux nouveau-nés, des souris juvéniles sevrées et des femelles gestantes sont commandés selon la demande d'utilisateurs académiques et industriels. 5 120 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, irradiées 218 secondes ou traitées chimiquement, puis greffées par injection de cellules souches humaines sous anesthésie. Environ 80 % passent le contrôle qualité et sont expédiées vivantes aux utilisateurs finaux qui poursuivront les expériences, les autres sont tuées dans les jours qui suivent puisqu'elles ne sont plus utilisables. Le porteur présente cette production de souris humanisées comme un "service" et la range dans la règle des 3R, au motif que ces animaux réduiraient le nombre d'individus utilisés plus tard.

Objectifs

Les souris immunodéficientes sont depuis plusieurs décennies des modèles de choix pour la transplantation de cellules souches humaines capables de générer un système immunitaire humain. Le recours à ces souris humanisées permet de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine. Les objectifs du présent projet sont de générer une gamme de souris humanisées pour le système immunitaire afin de les distribuer à un large panel d’utilisateurs finaux (académiques et industriels) aussi bien dans une perspective de recherche fondamentale que d’évaluation préclinique industrielle dans des domaines tels que l’hématopoïèse, l’immunologie, les maladies infectieuses, la vaccinologie, l’oncologie… Ce projet couvrira la génération de souris humanisées déjà validées en tant que "service" et également la génération de nouveaux modèles immunodéficients humanisés en tant que projet « nouveaux modèles en Recherche et Développement "R&D" ». Ceci permettra d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.

Bénéfices attendus

Le recours à ces souris humanisées devrait permettre de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine (souris humanisées pour des composants cellulaires et moléculaires du système hématolymphoïde).

Procédures

Procédure 1: Afin de rendre les souris permissives à la prise de greffe de cellules souches humaines, les animaux immunodéficients seront soit injectés avec une molécule chimique (1 injection par jour pendant 2 jours d’une durée de 30 secondes), soit irradiés 1 seule fois pendant 218 secondes afin de rendre accessible les niches hématopoïétiques puis, immédiatement traité avec un antibiotique pendant 2 semaines, dans le but de prévenir toute infection. Les animaux seront par la suite humanisés par une unique injection intraveineuse de cellules souches humaines, et ce, après anesthésie générale gazeuse. Cette intervention dure 3 min pour la phase d’endormissement et 30 secondes pour la phase d’injection. Enfin, le contrôle qualité du taux d’humanisation se fera suite à un unique prélèvement sanguin sur souris vigiles pour la partie « Service », ou suite à 9 prélèvements sanguins, toutes les 3 semaines sur une période de 23 semaines pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D". Le prélèvement sanguin dure 30 secondes par souris. Procédure 2: Afin de rendre les souriceaux permissifs à la prise de greffe de cellules souches humaines, les animaux seront irradiés 1 seule fois (durée irradiation dépendante de la souche de la souris) afin de rendre accessible les niches hématopoïétiques. Les animaux seront par la suite humanisés par une unique injection de cellules souches humaines dans le foie. Un prélèvement de phalange sera réalisé afin de permettre leur identification ainsi que leur génotypage. Enfin, le contrôle qualité du taux d’humanisation se fera à l’aide de prélèvement sanguin à entre 9 et 12 semaines après l’humanisation.

Impact sur les animaux

Les effets néfastes du pré-conditionnement apparaissent sur environ 5% des animaux adultes humanisés et tardivement (6 mois après la greffe de cellules souches humaine). Ils se manifestent souvent par une perte de poids et une modification de l’apparence (extrémités blanches) et du comportement naturel de l’animal (animal sans énergie). Les animaux seront surveillés quotidiennement pour prévenir tout inconfort animal et prendre la décision appropriée selon notre grille d’évaluation de projet. Notre surveillance sera donc accentuée à 6 mois notamment pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D" » puisque les souris seront observées jusqu’à 32 semaines. De plus, du stress pourra être généré lors des prises de sang et du transport des animaux vers les utilisateurs finaux.

Devenir

Pour le Service : Tous les animaux humanisés validés par le ‘contrôle qualité’ soit environ 80% des animaux produits, présentant une proportion sanguine de leucocytes d’origine humaine >20% des leucocytes totaux sont expédiés aux utilisateurs finaux (utilisation continue chez l'utilisateur final). Les animaux ne satisfaisant pas le critère requis sont écartés de tout groupe expérimental ultérieur. Ces animaux sont mis à mort dans les jours suivants le contrôle qualité car ils ne pourront plus être utilisés dans d'autres protocoles expérimentaux. Pour les nouveaux modèles : A l’issue des 32 semaines, les animaux seront mis à mort pour caractérisation du système immunitaire reconstitué (=humain).

Remplacement

Ce projet vise à produire des souris humanisées comme modèle expérimental préclinique à destination d’utilisateurs finaux des secteurs académique et industriel. Un tel modèle correspond à une attente forte pour pouvoir tester de nouvelles approches thérapeutiques transposables à l’Homme. En proposant comme modèle la souris humanisée pour le système immunitaire, nous offrons la possibilité d’utiliser un modèle expérimental préclinique permettant le criblage d’approches thérapeutiques directement adaptées à la situation humaine. Par ailleurs, les souris humanisées permettent d’approcher la situation physiologique humaine sans avoir recours aux modèles de primates non humains.

Réduction

Nous réalisons le projet d’humanisation en fonction des besoins exprimés ou pressentis de nos partenaires utilisateurs finaux. De plus, notre savoir-faire et l’optimisation de nos protocoles permettent d’utiliser peu d’animaux pour un rendement maximum. En exprimant le système immunitaire humain, la souris humanisée permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire dans ses applications ultérieures. Grâce au contrôle qualité systématique sur chaque souris implantée et au retour d’expérience qui en découle, nous optimisons sans cesse notre modèle de souris humanisée pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine, ce qui diminue la variabilité intrinsèque au modèle et réduit d’autant le nombre d’animaux à implanter pour obtenir le nombre de souris humanisée souhaité. De plus, la génération de nouvelles lignées humanisées permettra de se rapprocher au plus près du système immunitaire humain et d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera également à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Nous veillerons au bienêtre animal par une surveillance quotidienne des animaux par du personnel qualifié. Tout fait notable sera consigné sur une grille de score évaluant la souffrance et le stress des animaux. Les points limites sont clairement déterminés et les animaux identifiés par une alerte feront l’objet d’une surveillance accrue et des actions seront mises en place pour palier à divers problèmes tels qu’une observation bijournalière par le personnel expérimentateur ; l’ajout de gel Diet, l’ajout de coton…

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. De plus, les conditions zootechniques actuelle et le niveau d’ingénierie génétique des souris de laboratoire sont tels qu’il est possible de construire à façon, des lignées profondément immunodéficientes, une condition sine qua non pour une prise efficace et durable de xénogreffe hématopoïétique humaine. L’âge des animaux au moment de leur inclusion dans le présent projet dépendra de la demande et de l’objectif scientifique de l’utilisateur final. Le projet pourra donc utiliser aussi bien des souriceaux nouveaux nés que des souris juvéniles après sevrage (4 à 5 semaines). Les doses, volumes et voies d’administration seront adaptés au stade de développement des animaux utilisés. Dans le cas de la procédure 1 nous pourrons : recevoir directement des souris sevrées avant envoie (juvénile) ; ou recevoir des femelles gestantes et réaliser la procédure sur les nouveau-nés une fois l’âge de 4 à 5 semaines atteint.