Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Etude de l’efficacité de composés pharmacologiques à visée prophylactique dans un modèle murin syngénique de cancer bronchique non à petites cellules.
- Recherche appliquée
- Cancers
900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chacune reçoit une injection de cellules de carcinome pulmonaire sur le flanc, puis des administrations répétées de principes actifs, son poids et le volume de sa tumeur étant mesurés deux fois par semaine pendant quatre semaines à six mois. L'hypothèse testée est qu'un vaccin à ARN messager dirigé contre les cellules souches cancéreuses empêche la formation de tumeurs bronchiques, les essais chez des personnes à haut risque restant renvoyés au conditionnel. Le porteur justifie le choix de l'espèce par le "souci d'utiliser un nombre minimum d'animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique", et retient une implantation sur le flanc, décrite comme moins douloureuse qu'une greffe dans le poumon.
Objectifs
Le cancer bronchique est la première cause de mortalité par cancer toutes populations confondues (33 100 décès en France en 2018). Il constitue la première cause de décès chez l’homme entre 45 et 64 ans. Il s’agit du deuxième cancer le plus fréquent chez l’homme parmi les tumeurs solides (31200 nouveaux cas ; 22800 décès en 2018) et le troisième chez la femme (15100 nouveaux cas ; 10300 décès en 2018). Le pronostic associé au cancer bronchique demeure sombre, avec une survie à cinq ans de moins de 5%. Les données de la recherche convergent vers l'idée que les cellules souches cancéreuses (CSCs) sont responsables de l'échappement pharmacologique et de l'échec thérapeutique. L'hypothèse émise pour ce projet est que la mise en place d'une vaccination prophylactique à ARN messager (ARNm) contre les CSCs, en ciblant ces protéines anormales produites par ces CSCs, permettra de freiner, voire d'empêcher la formation de tumeurs bronchiques. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l'efficacité d'un vaccin à ARNm prophylactique ciblant les CSCs pour empêcher la formation de tumeurs bronchiques.
Bénéfices attendus
Un vaccin contre le cancer bronchique représenterait une avancée majeure en termes de santé publique et suscite de ce fait beaucoup d'intérêt et de recherche. En cas de résultats positifs, ce projet déboucherait sur des études cliniques testant ce même vaccin à ARNm chez l’homme, chez des patients à haut risque de cancer bronchique. Le développement d'un vaccin contre le cancer du poumon reste un objectif ambitieux, mais les bénéfices potentiels justifient largement les efforts de recherche en cours. Une telle avancée pourrait transformer le paysage de la prévention et du traitement du cancer du poumon, améliorant considérablement les perspectives de santé pour des millions de personnes dans le monde.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les souris subiront les interventions suivantes : - L’induction des tumeurs se fera selon une procédure d’injection d’une suspension de cellules tumorale, réalisée sous anesthésie. L’intervention dure environ 10 minutes et n’est réalisée qu’une seule fois. - Une administration préventive ou curative de principes actifs évalués, en aigu ou chronique, qui sera délivrée aux souris vigiles ou anesthésiés selon une voie d’administration en adéquation avec les propriétés pharmacodynamiques et pharmacocinétiques du principe actif. Un suivi du poids des souris ainsi que de l’évolution des diamètres et volumes tumoraux dont les données seront récoltées 2 fois par semaine à partir de l’injection des cellules tumorales jusqu’à la mise à mort des animaux. - La durée totale du suivi est comprise entre 4 semaines et 6 mois. Des prélèvements d’organes et de sang total ainsi que des tumeurs seront effectués à la fin de l’étude après euthanasie des animaux pour évaluer les effets des traitements sur certains tissus ou afin d’évaluer des biomarqueurs.
Impact sur les animaux
Bien que l’injection de cellules tumorales soit réalisée sur des animaux anesthésiés, une sensation d’inconfort peut apparaître chez la souris après cette procédure. De même, l’administration des composés peuvent entraîner un stress et ou une sensation d’inconfort chez les souris. Enfin, le développement de la tumeur au cours du temps ainsi que la manipulation des souris afin de mesurer la taille des tumeurs peut constituer une source d’inconfort et de stress chez les souris.
Devenir
Les animaux seront injectés en sous-cutané par une suspension de cellules cancéreuses. L’efficacité des nouveaux traitements va être évalués par l’analyse de l’évolution de la taille des tumeurs sur les animaux vivants, ainsi que les différents prélèvements de sang, d’organes ou de tumeurs obtenu une fois les animaux euthanasiés. Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude.
Remplacement
Afin de proposer une thérapie vaccinale chez l’homme, il est important de démontrer l’efficacité thérapeutique des candidats vaccin dans un modèle pré-clinique pertinent chez l’animal. Les modèles in vitro ne suffisent pas seuls à évaluer l’efficacité de ces traitements. Le modèle syngénique de progression tumorale permet d’étudier l’efficacité d’interventions thérapeutique dans un contexte de système immunitaire compétent, ce qui se rapproche le plus de la pathologie humaine. De plus, le traitement prophylactique envisagé dans cette étude vise des cibles thérapeutiques qui sont à la fois présente chez la souris et chez l’homme, augmentant ainsi la pertinence du modèle choisi.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires à ce projet a été calculé de manière à minimiser le nombre de souris tout en assurant des résultats robustes sur le plan scientifique et statistique. Le modèle animal ainsi que le protocole expérimental choisis permettent une faible variabilité inter-individuelle, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires à une interprétation fiable des résultats. Enfin, une réduction du nombre d’animaux en testant plusieurs doses à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence.
Raffinement
Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible : - Les souris sont hébergés à au moins 3 souris par cage, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un enrichissement de leur milieu sera effectué par un ajout de frisure de papier pour leur permettre de nicher et de bûchettes de peuplier pour ronger. - Un suivi quotidien de toutes les souris sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). - Des points limites sont fixés afin que les zootechniciens puissent signaler aux responsables des soins et du projet l’apparition des critères nécessitant les traitements nécessaires pour arrêter les souffrances. - L’administration de traitements ainsi que l’injection de cellules tumorales se font sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les souris sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et notamment dans le domaine du cancer. Le choix modèle de souris syngénique de CBNPC (modèle C57BL/6), inoculée avec la lignée Lewis Lung Carcinoma a été réalisé car présentant plusieurs avantages dont : - L’utilisation d’une lignée cancéreuse syngénique (pas de rejet des cellules greffées) ainsi que la présence d’un système immunitaire fonctionnel (souris C57BL/6 non immunodéficiente) sont des conditions sin qua non à l’étude d’efficacité d’un composé vaccinal. - L’induction de tumeur au niveau d’un site ectopique (sur le flanc de la souris) est modèle expérimental est très bien décrit dans la littérature, est relativement simple à mettre en place et présente moins de risque d’induire de la souffrance comparé aux modèles par injection orthotropique. - L’utilisation de souris consanguines C57BL/6 permet de réduire la variabilité inter-individuelle et de diminuer ainsi le nombre d’animaux utilisés. Des souris adultes de plus de 8 semaines seront employées, âge auquel les organes sexuels sont à maturité pour les deux sexes. Ce choix est justifié par la littérature scientifique.
Etude de la réversibilité de la réponse induite par des perturbateurs endocriniens à l’aide de poissons zèbres génétiquement modifiés
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Une lignée de poissons zèbres génétiquement modifiés, dont la fluorescence suit l'activité d'un gène du métabolisme intestinal, est mise au point pour évaluer les perturbateurs endocriniens au niveau réglementaire, dans le cadre d'un projet européen. 700 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue pour le prélèvement de leurs intestins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Exposés à des substances entre 72 et 120 heures après la fécondation, ils passent cinq séances d'imagerie au microscope sans anesthésie, à 5, 7, 10, 15 et 20 jours, et sont suivis jusqu'à trois mois. Le porteur qualifie cette expérience d'"essentielle" à la caractérisation de la lignée et invoque l'"organisme entier" pour écarter les cellules en culture.
Objectifs
Dans le cadre de l’étude des perturbateurs endocriniens en lien avec les pathologies métaboliques telles que l’obésité, le diabète ou la stéatose, nous développons une lignée transgénique de poisson zèbre apte à rendre compte d’effets de substances au niveau du métabolisme intestinal, y comprit chez l’Homme. La quantification de la fluorescence dans cette lignée transgénique permet de suivre l'expression de notre gène d'intérêt et est réalisée après exposition d’embryons issus de cette lignée à des substances pendant 48h, de 72 heures post-fécondation (hpf) à 120hpf. Afin d’étudier la réversibilité de la réponse de ce modèle nous souhaitons poursuivre les mesures de fluorescence au microscope au-delà de 120hpf, jusqu’à 3 mois. Les animaux ne seront donc pas exposés aux substances passé 120hpf. L’utilisation de la lignée transgénique apportera des informations complémentaires sur les mécanismes d’action des substances sans augmenter le nombre de poissons nécessaires à la réalisation des essais pour l’identification des perturbateurs endocriniens. A terme, le modèle que nous développons permettra d’évaluer l’impact de perturbateurs endocriniens en ayant recours à des embryons âgés de moins de 120hpf et les données générées au cours de ce projet permettront le développement/l’amélioration de voies de toxicité impactant le métabolisme qui pourront être utilisées pour une meilleure évaluation des dangers et des risques des perturbateurs endocriniens au niveau réglementaire.
Bénéfices attendus
L’étude la réversibilité de la réponse après exposition des embryons de poissons zèbres aux substances de 72hpf à 120hpf permettra d’approfondir notre connaissance des mécanismes régulant cette réponse. Nous pourrons ainsi analyser si l’expression de la fluorescence, induite ou inhibée à la suite de l’exposition aux substances, persiste ou au contraire revient à la normale alors que les poissons n’y sont plus exposés. Ainsi, la fluorescence étant relative à l’expression de notre gène d'intérêt, acteur clé du métabolisme intestinal chez le poisson zèbre, cette expérimentation permettra d’étudier les effets au long terme (jusqu’à 3 mois) sur ce métabolisme à la suite d’une exposition courte (48h) aux substances inductrices ou inhibitrices de de ce gène. Dans le cadre du développement d’un modèle de poisson zèbre apte à rendre compte des impacts des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme intestinal, y comprit chez l’Homme, l’étude de la réversibilité de la réponse aux substances a toute son importance. Ces données participeront à la caractérisation du modèle et de fait à l’élaboration d’un outil d’évaluation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme chez l’Homme, au cœur des objectifs du projet européen dans lequel s’inscrivent ces travaux.
Procédures
Les poissons zèbres seront soumis à des prises d'image en microscopie à fluorescence. Les animaux (5, 7, 10, 15 et 20 jours post fécondation) ne seront pas anesthésiés mais resteront dans de l'eau tout le temps de l'imagerie qui ne durera que 10 secondes environ. Chaque animal sera soumis à 5 imageries au cours de l'expérimentation.
Impact sur les animaux
L’exposition aux substances réalisée en début d’expérimentation (de 72hpf à 120hpf) aura un effet sur l'expression de notre gène d'intérêt (et probablement d'autres qui ne seront pas mesurés) sur le court terme et peut être le long-terme mais aucun effet toxique ou développemental n'est attendu aux concentrations sélectionnées. Les manipulations répétées tout au long de l’expérimentation (la prise d'image au microscope à fluorescence) pourraient entrainer un stress chez les animaux.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l'expérimentation afin de prélever les intestins pour réaliser des mesures d'expression du gène d'intérêt à l'aide de techniques de biologie moléculaire.
Remplacement
L’étude de la réversibilité de la réponse dans le modèle poisson zèbre que nous développons ne peut s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants. En effet, cette expérimentation est essentielle à la caractérisation de ce modèle biologique, permettant de renseigner de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme à l’échelle de l’organisme entier, une problématique encore peu investiguée. Les modèles cellulaires ne permettent pas cette approche. Quant aux modèles mathématiques, s’agissant d’une problématique émergente, la modélisation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme est encore balbutiante. A terme, l’expérimentation menée ici permettra d’établir un modèle de poisson zèbre pertinent pour l’évaluation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme.
Réduction
L'utilisation d'animaux transgéniques pour le suivi des effets dans le temps des substances permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés en réutilisant les mêmes individus à chaque temps d'étude. Les effectifs ont été calculé en tenant compte de la variabilité de l'expression de notre gène d'intérêt et de la mortalité normale au cours du développement afin de pouvoir mettre en évidence des effets des substances de plus de 50% (test statistique).
Raffinement
Les animaux sont conservés dans un environnement controlé connus pour engendrer un minimum de stress (aquariums teintés en bleu si possible avec un fond en décors graviers, paramètres physico-chimiques de l'eau et photopériode contrôlés). Ils sont hébergés en groupe afin de respecter leur comportement grégaire et limiter l’anxiété que pourrait entrainer l’isolement, en gardant des populations faibles afin d’éviter les comportements agressifs. Les poissons sont également nourris en partie avec des artémies vivantes, leur permettant ainsi d’enrichir l’éventail de leurs comportements sociaux, notamment celui de la chasse. Tout au long des expérimentations, les animaux seront suivi avec une grille de bien-être adaptée à chaque stade de développement. L'ensemble de ces procédures est réalisé par des personnes formées et sensibilisées à l'évaluation de la souffrance animale.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est une des espèces recommandées pour la réalisation de tests réglementaires sur les perturbations endocriniennes. Sa petite taille permet des expositions dans de faibles volumes d’eau d’où une faible consommation de substances toxiques et une quantité de déchets générés moindre. Ces dernières années un nombre croissant de lignées de poissons zèbres génétiquement modifiés ont été développées et se sont avérées être des outils pertinents pour la détection des perturbateurs endocriniens tout en réduisant le nombre d'animaux.
Evaluation thérapeutique de virus oncolytiques seuls ou en combinaison avec une thérapie antitumorale dans des modèles de xénogreffes et de greffes syngéniques chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
Greffées de cellules tumorales sous la peau du flanc, dans le ventre ou dans une veine, des souris peuvent développer des tumeurs qui s'ulcèrent ou se nécrosent, des métastases pulmonaires qui gênent leur respiration ou des nodules qui remplissent leur abdomen de liquide. 5 408 souris, immunocompétentes ou immunodéficientes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour tester environ neuf virus anticancéreux par an, seuls ou associés à d'autres traitements. Elles reçoivent jusqu'à trois injections de virus, un traitement antitumoral jusqu'à cinq fois par semaine pendant trois semaines et des prises de sang jusqu'à 120 jours après le virus, gestes dont le porteur écrit que chacun "ne dure que quelques secondes". Les souris greffées en surnombre, pour compenser les greffes qui ne prennent pas, peuvent être réutilisées pour former des techniciens, jusqu'à 200 en cinq ans, ou sinon tuées, et toutes celles qui reçoivent les virus sont tuées au point limite ou à la fin de l'étude.
Objectifs
Le but du projet est d’évaluer sur différents modèles de xénogreffes et de greffes syngéniques chez la souris l’activité antitumorale de nos virus candidats-médicaments seuls ou en combinaison avec des therapies antitumorales. Nos virus oncolytiques sont produits en supprimant plusieurs gènes viraux afin de diminuer la réplication du virus dans les tissus sains, tout en gardant la capacité de réplication dans les tumeurs et ainsi de limiter sa toxicité. Avant d’être testés en modèles murins, les virus candidats ont été évalués sur des modèles alternatifs, notamment par culture cellulaire sur de nombreuses cellules tumorales établies et caractérisées, ainsi que dans des cellules primaires (non tumorales). Ne seront évalués chez l’animal que les virus ayant une activité antitumorale et ne présentant pas de cytotoxicité sur les modèles alternatifs. Concernant les combinaisons avec les thérapies antitumorales, ne seront évaluées chez l’animal, que les combinaisons efficaces. En conclusion, nous testerons chez l’animal uniquement les virus candidats-médicament et les combinaisons préalablement sélectionnée avec un rapport bénéfice/risque significatif.
Bénéfices attendus
Les progrès scientifiques de ces dernières années sur la compréhension de la croissance tumorale ont permis d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la lutte contre le cancer. La mise au point de ces nouveaux médicaments n’est possible qu’en passant par des modèles animaux adaptés. Les bénéfices portent sur la mise au point des traitements plus efficaces contre les cancers chez l’homme. Les virus oncolytiques du fait de leur réplication spécifique dans la tumeur induisent moins d’effets secondaires que les traitements standards (chimiothérapies, …) utilisés aujourd’hui. A court terme, ces bénéfices porteront sur l’amélioration de la prise en charge des patients atteints de cancer et à long terme sur l’allongement de la survie des patients.
Procédures
Dans ce projet, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Implantation des cellules tumorales par injection sur animal vigile ou sous anesthésie légère puis 3 injections maximum (espacées de 30h minimum) de virus sur animal vigile puis administration d’une substance antitumorale sur animal vigile (maximum 5 fois par semaine pendant 3 semaines), un minimum de 3h est respecté entre chaque substance, - Imagerie sous une anesthésie légère, -Prélèvement de sang (espacés d'une semaine minimum et jusqu'à 120 jours après l'administration du virus). Chaque geste ne dure que quelques secondes, sauf l’anesthésie pour l’imagerie qui dure environ 15 minutes.
Impact sur les animaux
Malgré toute l’attention portée aux évaluations précédentes des études chez l’animal, nous ne pouvons pas exclure la survenue d’effets secondaires des médicaments. Ils peuvent se manifester sous la forme d’une perte de poids, des troubles gastro-intestinaux ou de troubles du comportement. Les injections répétées peuvent être une source de stress, de douleur pour l’animal et peuvent parfois engendrer une induration ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Une ulcération ou nécrose des tumeurs sur le flanc peut être observée. Une gêne dans la mobilité de la souris peut également être observée en fonction de l’implantation sur le flanc. Le développement de métastases pulmonaires peut entrainer une difficulté respiratoire. La présence de nodules dans l’abdomen peut provoquer de l’ascite. Tous ces symptômes sont décrits dans une grille de score.
Devenir
Les animaux supplémentaires pourront être utilisés dans le cadre de la formation continue et/ou initiale de nos techniciens en s’appuyant sur un projet dédié et en accord avec le responsable de la SBEA (structure en charge du bien-être animal). Nous prévoyons la réutilisation de maximum 200 animaux sur 5 ans pour la formation. Dans le cas où aucune formation n’est nécessaire, ces animaux seront mis à mort. Toutes les souris inclues dans l’évaluation des virus seront mises à mort soit après atteinte d’un point limite, soit à la fin de l’étude pour le prélèvement de tissus. En raison des modèles et de l’utilisation de virus oncolytiques, ces animaux ne peuvent être réutilisés, replacés ou adoptés.
Remplacement
Avant d’être testés chez l’animal, les virus candidats et leur combinaison avec les thérapies antitumorales ont été évalués et sélectionnés pour leur rapport bénéfice/risque significatif dans les modèles alternatifs disponibles. Ces modèles étant incomplets, il reste indispensable de tester les candidats sélectionnés chez l’animal. L’étude de l’activité antitumorale d’un candidat médicament nécessite un modèle intégré faisant intervenir un ensemble complexe de phénomènes biologiques, impossible à modéliser, conduisant au développement de la tumeur, à la distribution, à la toxicité et à l’élimination des médicaments.
Réduction
La réalisation de ces procédures par un technicien rompu à ces manipulations, et la standardisation du protocole garantissent une bonne reproductibilité et permettent de réduire le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux par groupe est choisi selon des contraintes statistiques. Du fait de la variabilité des prises de greffes tumorales, des animaux supplémentaires sont intégrés dans chaque expérience. Ces animaux ne recevront qu’une injection de cellules tumorales pour assurer l’obtention d’un nombre suffisant de souris présentant la croissance tumorale attendue dans le modèle sous-cutané, ou pour vérifier la bonne prise tumorale dans les modèles d’implantation en intra-péritonéale ou intra-veineux. Des tests statistiques seront utilisés sur les données obtenues (volumes tumoraux). Il est prévu l’utilisation de 5408 souris pour l’évaluation d’environ 9 virus candidats-médicaments par an et la combinaison avec 4 thérapies antitumorales.
Raffinement
Seuls les virus oncolytiques et leur combinaison avec les thérapies antitumorales présentant le meilleur rapport efficacité/non toxicité dans nos modèles alternatifs seront étudiés chez l’animal. De précédents dossiers déposés et apptouvés nous ont permis et nous permettent de tester la toxicité des nouvelles souches de virus. Seuls les virus ne risquant d'induire une souffrance chez l'animal seront testés dans ce projet. Durant l’étude in vivo, nous portons une attention particulière au bien-être de l’animal. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux afin de réduire le stress et un enrichissement du milieu est prévu (coton et tunnel de change) dans chaque cage avec eau et nourriture ad libitum. Les animaux sont toujours manipulés en douceur. Une période d’acclimatation et d’habituation aux gestes sont respectées avant de démarrer un protocole pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et ainsi, diminuer le stress lié au transport et à la manipulation. Des points limites ont été établis pour permettre de soustraire l’animal à la souffrance. L’implantation des cellules en sous-cutanée, en intraveineux, l’injection des virus et l’administration des substances à activité anti tumorale s’effectueront sur animal vigile. Une anesthésie légère est prévue lors de l’injection des cellules en intra péritonéale ainsi que dans le cas de la mesure de bioluminescence. Afin d’éviter une hypothermie due à l’anesthésie, l’animal est placé sur un tapis chauffant de son endormissement à son réveil. Pour le prélèvement de sang terminal une anesthésie et une analgésie sont prévues. Nous veillons à limiter l’angoisse et la souffrance des animaux, en surveillant l’apparition d'éventuels effets secondaires occasionnés par les traitements et en appliquant le cas échéant des critères d’interruption de l’expérimentation en fonction de l’aspect clinique des animaux.
Choix des espèces
Tous les traitements standards que nous souhaitons tester en combinaison avec nos virus oncolytiques sont décrits dans la littérature dans de nombreux modèles de cancers de souris. Par conséquent, la souris est un modèle de référence en oncologie, avec de multiples modèles expérimentaux disponibles. De nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires sont disponibles dans cette espèce. Des souris immuno compétentes et immuno déficientes seront utilisées dans ce projet afin d’évaluer nos virus oncolytiques dans différents modèles de tumeurs solides de type carcinome. Animaux âgés entre 6 et 8 semaines lors de l’injection des cellules tumorales (avec un âge plus avancé il y a un risque non négligeable de prise tumorale moins homogène et par conséquent la nécessité d’augmenter le nombre d’animaux).
Evaluation de l’effet des antidépresseurs sur l’épilepsie des souris modèles de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Quinze jours seules en cage, des électrodes implantées dans le cerveau et reliées à un câble pour un enregistrement continu : 96 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Opérées sous anesthésie pendant 90 minutes au plus, elles reçoivent ensuite pendant dix jours, mêlé à leur eau de boisson, l'un des quatre traitements comparés, dont trois antidépresseurs. L'équipe soupçonne certains de ces médicaments d'aggraver l'épilepsie liée à la maladie d'Alzheimer, au risque, écrit-elle, de crises sévères et d'une mort précoce des souris. Le porteur qualifie cette lignée, qui développe des plaques amyloïdes et une activité épileptique, de "modèle idéal" pour cette étude.
Objectifs
Dans ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui développent la maladie d’Alzeihmer et des activités épileptiques. Nous étudierons les effets de 3 antidépresseurs sur les activités épileptiques présentes chez nos souris. Pour cela, nous utiliserons des techniques d’enregistrement continu de l’activité cérébrale par électroencéphalographie intracrâniale. Compte tenu des connaissances actuelles sur les mécanismes d’action des antidépresseurs et de nos travaux antérieurs, nous suspectons un effet aggravateur de certains anti-dépresseurs et un effet protecteur pour d’autres sur l’activité épileptique dans le cadre de la MA. Notre projet pourrait, à long terme, permettre de limiter la survenue de l’épilepsie chez les patients atteints de la MA en remplaçant les traitements antidépresseurs aggravateurs par d’autres traitements ayant des bénéfices au moins similaires mais non responsables de l’accélération du déclin cognitif
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de déterminer si certains antidépresseurs exacerbent les activités épileptiques présentes chez les souris modèles de la maladie d’Alzheimer et si d'autres antidépresseurs ont un rôle protecteur vis-à-vis de ces mêmes activités. Ainsi, si notre hypothèse se vérifie, ce projet justifiera la mise en place d’études cliniques permettant de tester cette hypothèse chez les patients. A long terme, ce projet pourrait donc permettre de mieux adapter les traitements et ainsi apporter un bénéfice considérable aux patients atteints de la maladie d’Alzheimer (MA) en évitant de majorer leur épilepsie.
Procédures
Les animaux anesthésiés et analgésiés auront une chirurgie implantatoire (d'une durée maximale de 90 minutes) pour la pose d’électrodes afin de réaliser des électro-encéphalogrammes. Les encéphalogrammes des animaux seront réalisés en continu pendant 15 jours. Les anti-dépresseurs seront administrés par voie orale en les mélangeant à l’eau de boisson durant 10 jours.
Impact sur les animaux
La chirurgie implantatoire est susceptible d’induire une douleur modérée au stade post opératoire durant 24-48 heures. L’isolement des animaux au cours des enregistrements électrophysiologiques durera 15 jours : ceci peut induire un stress modéré. Cet isolement est indispensable à la conduite des enregistrements. Habituellement, les évènements épileptiques des souris modèles de la MA sont essentiellement des pointes isolées qui surviennent pendant le sommeil et ne sont pas associées à une modification comportementale. Mais l’administration chronique de certains antidépresseurs pourraient exacerber ces activités épileptiques et provoquer des crises d'épilepsie sévères et ainsi provoquer une mortalité précoce des souris. Les pesées peuvent entrainer un stress léger de quelques dizaines de secondes. Le génotypage des animaux pourra entrainer une douleur légère de courte durée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récuperer leurs cerveaux en vue d'analyses histologiques.
Remplacement
Le projet a pour objectif d’évaluer les effets des antidépresseurs couramment utilisés en clinique sur l’épilepsie dans la maladie d’Alzheimer (MA). L'épilepsie comme la dépression dépendent d'interactions qui se font entre différentes régions cérébrales au sein de larges réseaux, qui ne peuvent pas, à l'heure actuelle, être mimées dans de simples cultures cellulaires. Une approche par modélisation informatique des interactions entre maladie d'Alzheimer, épilepsie et antidépresseur ne pourra se faire que sur la base de données expérimentales qui ne sont que parcellaires pour le moment. Ainsi, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle murin de la MA qui ne peut donc être remplacé par aucun autre modèle.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe (n=12) a été déterminé sur la base de nos études antérieures de l’activité épileptique des souris modèles de la MA, de sorte à avoir une puissance statistique suffisante pour les analyses nécessaires aux comparaisons intergroupes (4 différents traitements) et intragroupes (comparaisons entre chacun des 10 jours de traitement à la baseline).
Raffinement
Les souris sont hébergées à 4 dans des cages contenant du matériel de nidification ainsi qu'une buchette pour l'enrichissement. Les animaux sont habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation de 10 minutes par souris (handling) avant le début des enregistrements. Les animaux seront suivis quotidiennement par des personnels formés au soin. Si une altération de l’état est observée, une grille de scoring sera utilisée pour déterminer la conduite à tenir. Les critères évalués sont : l’aspect général de l’animal (pelage, peau, yeux, bouche), les fonctions corporelles (respiration altérée), le comportement (posture, locomotion, isolement, réaction à la manipulation), le poids (pesée une fois par semaine puis quotidienne en cas de perte de poids). Pour ce dernier, le poids en fin de chirurgie sert de référence pour calculer le pourcentage de perte (pour prendre en compte le poids du connecteur). Nous avons identifié deux situations pour lesquelles une attention particulière sera portée aux souris : d’une part, la chirurgie (implantation intracérébrale des électrodes d’éléctroencéphalographie (EEG) et période post opératoire) qui pourrait provoquer de la douleur ou de la souffrance ou l'angoisse et, d’autre part, l’isolement lors des enregistrements EEG, qui pourrait affecter le bien-être des animaux. Pour les chirurgies (acte avec réveil), les animaux seront d’abord anesthésiés par inhalation d’isoflurane puis analgésiés 15 minutes avant le début de la chirurgie. Une injection d'anti-inflammatoires sera réalisée en fin de chirurgie et le lendemain pour éviter d’éventuelles douleurs post opératoires. Pendant les deux semaines qui suivront la chirurgie, les animaux seront inspectés tous les jours. Les animaux doivent rester isolés les uns des autres lors des enregistrements électrophysiologiques pour éviter qu’ils ne rongent les câbles les uns des autres et pour éviter qu’ils ne perturbent le sommeil de leurs congénères. Or, il a été montré qu’un isolement peut provoquer une souffrance de l’animal et des modifications neurologiques si l’isolement dure plusieurs semaines (les isolements durent 5 semaines dans la plupart des études sur le sujet). Une attention particulière a donc été portée à la réduction du nombre de jours d’isolement (15 jours). La procédure s’achèvera ainsi par la mise à mort les animaux dès que les enregistrements seront terminés.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous utiliserons des souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer. Cette lignée reproduit de nombreuses caractéristiques de la pathologie observées chez l’humain : plaques amyloïdes, déclin cognitif progressif et activités épileptiques, entre autres. Cette lignée constitue donc un modèle idéal pour l’étude des effets des antidépresseurs sur l’épilepsie dans la MA. Les animaux seront inclus dans le protocole à l’âge adulte, entre 3 et 5 mois. A cet âge, les souris modèles de la MA sont à un stade précoce de la maladie d’Alzheimer mais présentent déjà des activités épileptiques qui ne progressent pas avec l’âge.
Etude de pharmacocinétique d’une molécule administrée chez le rat ou la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Rats : 4350
12 050 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chaque rat subissant jusqu'à onze prélèvements sanguins et chaque souris jusqu'à sept. Les composés sont administrés une à deux fois par jour pendant sept jours au maximum, par voie orale, intraveineuse, sous-cutanée ou intrapéritonéale, et jusqu'à quatre prélèvements par ponction rétro-orbitale ou submandibulaire sont pratiqués sous anesthésie gazeuse. Une partie des animaux arrive déjà cathétérisée, d'autres reçoivent une pompe osmotique implantée, et la collecte des excreta impose un séjour en cage à métabolisme dont le porteur reconnaît qu'il induit un stress. Le bénéfice mis en avant est de "réduire le nombre d'animaux utilisés en pharmacologie", pour un projet qui en mobilise lui-même 12 050.
Objectifs
L’objectif du projet est la mesure des paramètres pharmacocinétiques chez le rat et la souris. Les caractéristiques pharmacocinétiques sont les premières données générées in vivo après que les tests in vitro aient été concluants. Ils vont permettre de décrire les différentes phases que va subir le composé quand il entre dans l’organisme du rongeur par différentes voies. Les informations obtenues impactent la progression des produits dans le projet, le design par les chimistes d’analogues ayant des meilleures propriétés pharmacocinétiques, ou les protocoles d’études de pharmacologie in vivo (choix de la dose, de la voie d’administration, et de la fréquence d’administration (une fois ou deux fois par jour).
Bénéfices attendus
La connaissance des propriétés pharmacocinétiques d’un produit chez l’animal avant le design des études de pharmacologie permet d’utiliser le meilleur traitement (dose, voie d’administration) et participe à réduire le nombre d’animaux utilisés en pharmacologie. Ces études permettront un lien avec les prévisions faites à partir des modèles in vitro. Ce lien entre données in vivo et données in vitro est critique pour prédire la pharmacocinétique chez l’homme, où seulement des données in vitro sont disponibles aux stades précoces de la recherche. Les données fournies permettront la sélection de meilleurs candidats pour les tests précliniques. Toutes les données obtenues sur les produits d’un projet permettront aux chimistes de concevoir des molécules ayant des propriétés pharmacocinétiques optimisées donc de réduire le nombre d’animaux utilisés avant d’obtenir un candidat médicament.
Procédures
Administration des composés à tester, par voie intraveineuse, orale, sous-cutanée ou intra-péritonéale, une à deux fois par jour jusqu’à 7 jours : durée quelques secondes (ou quelques minutes de perfusion) à chaque administration, sur animaux vigiles sauf dosages IV (anesthésie isoflurane). Prélèvement sanguin, 7 fois maximum pour la souris et 11 fois maximum chez le rat pendant l’étude, durée quelques secondes sur animaux vigiles si prélèvements en veine caudale, saphène ou submentale. Les prélèvements en veine submandibulaire ou rétro-orbital (maximum 4 sur la durée de l’étude) sont effectués sous anesthésie isoflurane. Pose de pompes osmotiques sous anesthésie Isoflurane chez la souris : 15 min par animal avant le début de l’étude.
Impact sur les animaux
Au cours des études de ce projet, les composés sont en général testés pour la première fois sur l’animal entier. Tous les signes cliniques sont donc surveillés et enregistrés. Au cours des administrations ou prélèvements, les animaux seront manipulés avec douceur afin de leur éviter le stress de la manipulation. L’injection IV peut provoquer un inconfort passager de 30 secondes qui sera limité par l’anesthésie gazeuse légère de la souris. La toxicité cellulaire des composés est évaluée en amont des études in vivo et seuls les composés ne présentant pas de toxicité à la dose administrée en vivo seront testés chez l’animal. Dans ce contexte, nous n’attendons pas de réaction important lors de l’administration de nos composés en in vivo. Des points limites ont été établis, permettant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. La pharmacocinétique nécessite le prélèvement de petites quantités de sang à des intervalles répétés ce qui peut générer du stress et de l’inconfort. La pharmacocinétique nécessite le prélèvement de petites quantités de sang à des intervalles répétés. Le volume de sang prélevé et le nombre de prélèvements sera adapté en fonction du poids des animaux inclus dans l’étude. La collecte des excreta implique de mettre les animaux en cage à métabolisme, ce qui induira un stress pour ces animaux.
Devenir
A la fin de nos études, tous les animaux sont mis à mort de façon ethique. Pour des raisons éthiques, les animaux cathétérisés ne peuvent pas être réutilisés dans nos procédures pendant plus d’une semaine après réception. Pour les animaux non cathétérisés, nous prélevons des organes à la fin de nos administration afin d'évaluer la concentration des nos composés dans les tissus. De plus, nous pourrions observer des risques pour la validité des résultats car les animaux, réutilisés après la periode de réccuperation, seront décalés en poids, en âge et en physiologie par rapport à ceux utilisés dans les modèles de pharmacologie, donc moins prédictifs.
Remplacement
Il n’existe pas de modèle fiable in vitro permettant de prédire de manière exacte et approfondie le comportement pharmacocinétique d’un produit chez l’homme. L’utilisation d’animaux est donc indispensable pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques d’un composé et établir des corrélations in vivo/in vitro qui permettront d’avoir une prévision fiable des propriétés pharmacocinétiques chez l’homme.
Réduction
Les composés testés in vivo ont été sélectionnés sur la base de leurs propriétés in vitro. Un grand nombre de composés synthétisés sont donc éliminés sur la base des résultats des tests in vitro et ne sont pas évalués in vivo. Nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux qui permet d’obtenir des résultats avec une variabilité acceptable pour l’objectif de l’étude. Ainsi dans le premier test d’un nouveau composé en pharmacocinétique, 2 animaux sont utilisés pour la voie intraveineuse et 3 animaux pour la voie extravasculaire pour décrire la pharmacocinétique des produits. Une étude pharmacocinétique est réalisée par prélèvements multiples, qui permet aussi une réduction du nombre des animaux impliqués dans les études. Des mélanges de produits peuvent être administrés pour sélectionner les meilleurs produits en réduisant le nombre d’animaux nécessaires à l’étude (exemple : 3 produits administrés en mélange à 2 animaux au lieu de 3 fois 2 animaux si les composés sont administrés séparément).
Raffinement
A l’arrivée des animaux : Contrôler que le dispositif des animaux cathétérisés est bien mis en place et qu’il n’y a pas de lésion particulière. Si c’est le cas, mis à mort sur avis du vétérinaire. Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi dès leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (maisons en carton, carrés de coton et feuilles de cellulose). Cet enrichissement sera adapté pour les animaux cathétérisés (pas de maison, risque de dommages au cathéter). Afin de minimiser l'inconfort du au procédures, les animaux pourront recevoir une analgésie adaptée. Pour favoriser la vasodilatation de la veine caudale au moment des prélèvements, les souris pourront être placées quelques minutes dans une thermocage. Les animaux feront l’objet d’une surveillance journalière. Si les points-limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera euthanasié de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. Lors de la mise à mort les animaux seront placés sous anesthésie profonde à l’isoflurane (induction 4% et maintien de 2%).
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat qui sont les espèces utilisées pour les modèles précliniques de notre établissement. Les rats et les souris utilisés dans ce projet seront des adultes afin que leur métabolisme soit mature.
Evaluation du bénéfice thérapeutique systémique d’une molécule innovante de thérapie génique permettant la réexpression de dystrophine
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Les rats utilisés sont génétiquement dépourvus de dystrophine, donc atteints d'une dégénérescence musculaire progressive qui rend, passé dix mois, la mastication difficile et une tumeur musculaire probable. 54 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, 30 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 24 un niveau modéré. Chacun reçoit jusqu'à vingt-quatre injections intraveineuses précédées d'un sédatif, une dizaine de prélèvements sanguins mensuels complétés par des séries de six ponctions étalées sur 168 heures, et des sessions répétées de mesure de force musculaire de trente minutes sous anesthésie. Ils sont maintenus en vie jusqu'à treize mois, âge où la maladie a le plus progressé, puis tués pour les analyses histologiques, le porteur retenant le rat plutôt que la souris parce qu'il "mime les maladies humaines similaires de manière beaucoup plus fidèle".
Objectifs
Les dystrophies musculaires sont des myopathies génétiques rares qui touchent principalement les muscles et le cœur. Certaines dystrophies sont causées par des changements dans le gène DMD, porté par le chromosome X. Pour cette raison, cette maladie touche surtout les hommes. Le gène DMD produit normalement une protéine appelée "dystrophine". Chez les patients, la production anormalement faible ou absente de dystrophine induit une détérioration progressive des muscles, provoquant une faiblesse musculaire. La forme la plus sévère (absence de dystrophine) apparaît dès l'enfance et entraîne un déclin progressif de la mobilité et du fonctionnement cardiaque, fatale de façon prématurée. L’objectif de notre étude est de comparer l’efficacité à long terme d’une thérapie génique qui permettra de contourner les changements dans le gène DMD afin de produire à nouveau de la dystrophine chez le rat. La dystrophine produite dans le cadre de ce traitement, plus petite que la dystrophine naturelle, conserve une partie importante de son activité. En adoptant un protocole le plus proche possible de celui réalisé chez les enfants actuellement suivis dans le cadre d'un essai clinique, ce projet permettra d’obtenir des données complémentaires précieuses impossibles à obtenir en un temps court chez les enfants. Ces données éclaireront donc les cliniciens pour optimiser les prochaines étapes de l'essai clinique.
Bénéfices attendus
L’absence totale de dystrophine au sein du muscle le fragilise et précipite la mort des fibres qui le composent. L’hypothèse sous-jacente propose que la conversion dystrophique du muscle squelettique, au moins en partie, peut être réversible après une restauration efficace et à long terme de la dystrophine. Comme chez la souris, nous espérons que le traitement restaurera la dystrophine de façon homogène le long de la fibre entière avec une large distribution homogène dans les fibres. Cette restauration répandue est probablement essentielle au succès thérapeutique. L’étude va permettre de fournir des preuves de l’efficacité thérapeutique à long terme. Nos résultats seront comparés à ceux obtenus chez les enfants enrôlés dans l'essai clinique en cours en vue d’affiner les futures analyses réalisées lors de sa probable extension.
Procédures
Le projet se décompose en deux parties distinctes, une première pour déterminer la dose idéale du composé à injecter et une seconde pour mesurer son bénéfice thérapeutique. Pour la première procédure, chaque animal recevra en 2 mois 8 injections intraveineuses durant 30 secondes, chacune précédée d'une injection sous-cutanée (20 secondes) d'un sédatif. La première et la dernière injection seront suivies de 6 prélèvements sanguins de 30 secondes étalés sur 168h. À trois reprises et 1 mois d'intervalle, les animaux réaliseront trois tests non invasifs (test d’agrippement, électrocardiogramme et analyse du patron ventilatoire) pour une durée respective de 20, 10 et 25 minutes. De plus, la locomotion spontanée et les comportements quotidiens seront investigués par le biais d’une évaluation cognitive en filmant les animaux dans une cage à furet pendant une heure. A l'issue du traitement, les animaux recevront une injection sous-cutanée (20 secondes) et la force isométrique produite par leur muscle tibial antérieur (TA) sera mesurée pendant des sessions de 30 minutes via un ergomètre. Avant le début de la seconde procédure, chaque animal vigile réalisera test d’agrippement, un ECG et une pléthysmographie pour une durée respective de 20, 10 et 25 minutes. Puis les animaux seront anesthésiés par une injection sous-cutanée (20 secondes) et la force isométrique produite par leur muscle tibial antérieur sera mesurée pendant des sessions de 30 minutes à l’aide d’un ergomètre. Le traitement sera ensuite dispensé sur 8 mois par 16 injections intraveineuses d’une durée de 30 secondes, chacune précédée d'une injection sous-cutanée (20 secondes) d'un sédatif. À 9 reprises (au début de la procédure puis tous les mois), les animaux se verront prélever leur sang au moyen d’un geste de 30 secondes. Les deux premières prises de sang seront également suivies de 6 autres prélèvements sanguins de 30 secondes étalés sur 168h. À 5 reprises pendant 8 mois (tous les 2 mois), les animaux vigiles réaliseront les tests fonctionnels, test d’agrippement, ECG et pléthysmographie pour une durée respective de 20, 10 et 25 minutes. À 3 reprises pendant 8 mois (tous les 4 mois), les animaux seront anesthésiés par une injection sous-cutanée (20 secondes) et la force isométrique produite par leur muscle TA sera mesurée pendant des sessions de 30 minutes via un ergomètre. Enfin, les animaux anesthésiés en fin de procédure seront également soumis à une échocardiographie de 20 minutes.
Impact sur les animaux
Pour la première partie de ce projet, les animaux DMD seront mis à morts à l’âge de 3 mois, bien avant l’expression des signes cliniques évocateurs d’un effet délétère majeur du phénotype sur les animaux. Jusqu’à 10 mois, aucune entrave majeure à une qualité de vie autonome et globalement compatible avec la vie dans une cage n’a été observée. Pour la seconde partie, les animaux DMD seront mis à morts à l’âge de 13 mois, soit après l’âge de 10 mois à partir duquel les nuisances majeures du phénotype dystrophique sont observées (difficulté croissante à mastiquer et probabilité croissante du développement d’une tumeur musculaire).. Il est attendu que le traitement atténue, réduise voire annule l'ensemble de ces nuisances. Toute observation ou signe clinique anormal dans le décours de la maladie (gêne, douleur ou souffrance exprimée par l'animal) sera quantifiée par le remplissage de la grille d’évaluation dédiée. En fonction du score, les actions décrites sur la grille seront mises en œuvre. L'équipe sera donc mobilisable 7 jours sur 7 pour préserver ces données dans un contexte de décision médicale rapide et centrée sur le bien-être des animaux. Les cas d’insuffisance cardiaque décompensée et mortelle n’ont été observés qu’au-delà de 13 mois. Un effet indésirable du test d’agrippement est la cassure d’une griffe trop longue lors du saisissement de la barre, raison pour laquelle nous vérifions les griffes avant le test et les raccourcissons si besoin. Les rats DMD peuvent exprimer une réponse aiguë de stress supérieure à la normale. Ils se figent pendant quelques minutes. Nous connaissons cette réaction et l'évitons à travers l'habituation progressive des animaux à la manipulation et aux différentes procédures. Nous pouvons aussi- avoir recours à un sédatif administré qui protège l'animal des problèmes cardiaques éventuellement induits par l'excès de cette réponse de stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Ce qui a pu être testé de l’efficacité des composés sans l’usage d’animaux a été réalisé en amont de ce projet. L’innocuité dans un organisme mammifère a été validée chez des souris. Cette étape est indispensable pour évaluer l’éventuelle toxicité des produits administrés, mais aussi de tous leurs métabolites issus de leur transformation par les organes du corps, en particulier le foie. Sur ces bases robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à la question qui ne peut être obtenue que chez l’animal vivant avec l’ensemble de ses organes en interrelation constante : l’action du composé testé permet-elle de limiter la progression de la maladie ou même d’inverser les signes cliniques associés à cette maladie et ce, de façon très large, incluant bien entendu la musculature mais aussi le système nerveux.
Réduction
De nombreuses données ont été cumulées sur les modèles de rats utilisés dans ce projet. Nous avons optimisé la correction des données avant analyse statistique. Le calcul de puissance statistique nous recommande de n’utiliser qu'un maximum de 8 rats par groupe. Ce nombre a été validé avec d’autres projets similaires terminés, pour lesquels nous avons pu conclure qu'il était suffisant. En raison du nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sains et atteints traités avec un placebo, l’histoire naturelle de la maladie est documentée avec fiabilité en comparaison avec les congénères sauvages. Pour la première partie du projet concernant la pharmacocinétique du composé, des projets antérieurs ont permis de s’assurer que 6 animaux par groupe étant suffisant pour obtenir des données fiables.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu’ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Le cycle d’éclairage respecte l’alternance jour/nuit. Les rats, des animaux sociaux, sont hébergés avec des congénères, l’isolement n’existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel par ailleurs compétent pour reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Une grille d’évaluation critériée de la douleur et des points limites ont été établis et affichés. Les rats seront constamment évalués en observant individuellement les animaux, week-ends et jours fériés inclus. Toute atteinte des points limites sera suivi d’une action correctrice. En cas d’absence de bénéfice (trouble irréversible), nous procéderons à la mise à mort compassionnelle de l’animal avant qu’il ne souffre.
Choix des espèces
Le rat est une espèce de mammifère évolutivement proche de nous et constitue donc un modèle biomédical apprécié. Les récents outils d’édition du génome ont permis d’en faire un modèle de choix pour l’analyse des affections musculaires. Nos modèles de rats déficients en dystrophine miment les maladies humaines similaires de manière beaucoup plus fidèle que ne le font les modèles historiques de la souris. Le rat conserve néanmoins certains atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). En médecine translationnelle, le rat s’insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d’environnement, format). Pour la première procédure de ce projet, les animaux utilisés seront âgés de 4 à 12 semaines. À cet âge, l’impact de la maladie sur les muscles est détectable par des analyses de sang, de force, cardiaques et respiratoires. En utilisant des animaux de cet âge, il sera possible de conclure sur l’efficacité d’un traitement à un stade précoce de la malade. Pour la seconde procédure, les rats seront âgés de 5 à 13 mois, ce qui correspond au stade où la maladie progresse le plus et les muscles sont de plus en plus impactés, fonctionnellement et morphologiquement. Cet âge correspond également chez le rat au stade de développement de la maladie des enfants, âgés de 6 ans ou plus, pour lesquels une thérapie est envisagée.
Effets à court terme de six composés à visée thérapeutique en développement chez la souris sauvage soumise à une alimentation enrichie en graisse
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Six candidats médicaments d'un client pharmaceutique sont évalués sur leur capacité à réduire la prise alimentaire et le poids de souris nourries avec une alimentation enrichie en graisses. 78 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Hébergées seules en cage, elles reçoivent quatorze administrations par voie orale, sont pesées treize fois, puis anesthésiées et tuées pour le prélèvement de leur tissu adipeux. Le porteur reconnaît que l'isolement constitue une nuisance, la relativise par le maintien d'un contact visuel et olfactif, et affirme qu'il n'existe "aucune méthode de substitution" permettant d'étudier l'effet d'un composé sur le poids corporel.
Objectifs
L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'une famille de six candidats médicaments de notre client et vise à tester leur efficacité à réduire la prise alimentaire et le poids corporel à court terme chez la souris non obèse mais nourrie avec une alimentation enrichie en graisse. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement subaigu du candidat médicament sur l'appétit et le poids corporel du modèle d'obésité. Les composés les plus efficaces seront alors étudiés sur de plus longues durées, chez la souris obèse.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait, à terme, aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (13 mesures au cours de l’étude ; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule ou d’un candidat médicament par voie orale (14 administrations ; durée de la mesure : 1 minute); 3) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée : 10 minutes).
Impact sur les animaux
De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements par voie orale pourraient être source de de stress mais ne sont que très peu douloureux lorsque réalisés par des expérimentateurs habitués à ce type de pratique. Enfin, le maintien sous alimentation enrichie en graisse de courte durée (ici 14 jours) pourrait être une source de très léger inconfort pour les animaux du fait du changement d’habitudes alimentaires.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements de tissu adipeux sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.
Remplacement
Bien que le développement des composés testés ait fait l'usage d'approches in vitro dans ces premières étapes, l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques reste une étape obligatoire et règlementaires pour poursuivre le développement des candidats médicaments, notamment dans le but de poursuivre vers ders études cliniques. Par ailleurs, il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel et la prise alimentaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle employé et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non soumis à l'alimentation enrichie en graissees a été réduit à 8 animaux, contre 10 pour les autres groupes expérimentaux, compte tenu de la moindre variabilité des paramètres étudiés. Enfin, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement des candidats médicaments, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle pour un des composés testés, une seconde étude sera menée en condition chronique chez les deux genres afin de s'assurer de son efficacité.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie orale seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. en utilisant des canules de gavage souples pourvues d'un embout en silicone, prévent ainsi toute lésion potentielle du carrefour aéro-digestif. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée (Buprénorphine).
Choix des espèces
Le modèle de souris C57BL/6J nourris avec une alimentation enrichie en graisses est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte, afin de mimer au mieux la population humaine ciblée par les candidats médicaments.
Evaluation in vitro de produits naturels pour réduire la méthanogenèse chez le ruminant
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Rendus à leur élevage à l'issue d'un unique prélèvement, 16 bovins subissent une intubation oro-ruminale de vingt minutes au maximum pour recueillir du contenu de leur rumen. Le geste peut provoquer une toux, qui cesse au retrait de la sonde, et relève d'un niveau de souffrance léger, aucun produit ne leur étant administré. Le contenu prélevé alimente des tests de fermentation en éprouvette destinés à mesurer l'effet de plantes ou d'extraits végétaux sur la production de méthane. Ces essais répondent à la sollicitation d'acteurs de l'industrie agroalimentaire, l'objectif affiché étant de réduire les émissions des bovins tout en maintenant leur productivité.
Objectifs
Le méthane (CH4) émis par les ruminants est le principal responsable des émissions de gaz à effet de serre provenant de l'agriculture. Il provient en grande partie des fermentations par le microbiote ruminal. Réduire les émissions de méthane constitue un défi environnemental majeur et donne lieu à des initiatives politiques. Lors de la 26ème conférence des Parties (COP26) sur le climat qui s'est tenue en 2021, l'Union Européenne a lancé en partenariat avec les États-Unis l'engagement mondial concernant le méthane, dans le cadre duquel plus de 100 pays se sont engagés à réduire leurs émissions de méthane de 30 % d'ici à 2030 par rapport aux niveaux de 2020. Dans cette optique, des recherches sont activement menées pour trouver des stratégies permettant de réduire les émissions de méthane des bovins, tout en maintenant leur productivité et leur santé. Certaines solutions nutritionnelles pourraient moduler la structure et la composition du microbiote ruminal, ainsi que les processus de fermentation, limitant ainsi le méthane produit. Nous avons été contactés par plusieurs acteurs de l’industrie agroalimentaire pour tester la capacité de différentes plantes ou extraits de plantes à réduire la méthanogenèse. Les premières étapes de sélection des produits seront réalisées in vitro, lors de différents tests de fermentations. L’objectif de chaque test sera de mesurer et comparer, in vitro, l’effet de différents produits, à différentes doses, sur la cinétique de production de méthane d’un écosystème ruminal.
Bénéfices attendus
Les produits testés lors des tests de fermentation in vitro dans ce projet, pourraient permettre de réduire les émissions de méthane par les bovins tout en maintenant leur productivité et leur santé.
Procédures
Chaque animal ne subira qu'un seul prélèvement de contenu ruminal par intubation oro-ruminale de 20 minutes maximum.
Impact sur les animaux
L'intubation oro-ruminale pour le prélèvement de contenu ruminal peut parfois provoquer une toux qui cesse alors dès le retrait de la sonde.
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie et resteront dans leur élevage à l'issu de cette prodécure, car leur santé ne devrait pas être affectée. Aucun produit ne leur sera administré au cours de ce projet, ils ne subiront qu'un prélèvement de contenu ruminal.
Remplacement
Afin de pouvoir réaliser les tests de fermentation in vitro, du contenu ruminal de bovin est nécessaire. En effet, il n'est pas possible de reproduire la complexité de l'écosystème ruminal sans partir d'un échantillon prélevé sur des animaux vivants.
Réduction
Ces essais menés in vitro permettent d'utiliser un nombre réduit d'animaux en comparaison d'essai in vivo qui nécessiteraient des cohortes bien plus importantes. Etant donné les variations inter-individuelles de l'écosystème ruminal bovin, du contenu ruminal de trois animaux est nécessaire pour la préparation de chaque inoculum. Quatre animaux seront donc inclus dans chaque test de fermentation, au cas où un animal ne pourrait pas être prélevé. Cependant si les trois premiers bovins peuvent être prélevés, le quatrième ne sera pas utilisé.
Raffinement
La collecte de contenu ruminal est un geste couramment pratiqué dans la médecine vétérinaire qui ne nécessite pas d'analgésie ou de sédation. Pendant le prélèvement, les animaux seront pris au cornadis comme ils en ont l'habitude lorsque des gestes techniques doivent être réalisés (par exemple administration de vermifuges ou prophylaxie). Pratiquer le prélèvement dans un environnement où les animaux ont l’habitude d’être manipulés permet d’éviter une source de stress supplémentaire. De plus, pour éviter un stress trop important de l'animal, le prélèvement sera stoppé au bout de 20 min même si la quantité de contenu prélevé n'est pas suffisante. Ces prélèvements seront réalisés par un vétérinaire formé à l'expérimentation animale et ayant l'habitude de travailler sur bovin. Il utilisera une sonde souple d’un diamètre adapté à l’œsophage, et d’une longueur permettant d’atteindre le rumen en laissant une partie assez longue à l’extérieur pour suivre les éventuels mouvements de la tête de l’animal sans le contraindre.
Choix des espèces
Les essais doivent nécessairement être conduits avec des bovins, car il s'agit de l'espèce cible du produit testé et la composition du microbiote ruminal est propre à chaque espèce. Les animaux utilisés seront adultes car à ce stade physiologique la fermentation ruminal est bien implantée et fonctionnelle.
Caractérisation de nouveaux modèles murins pour l’étude de la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue, dont 1 248 opérées sous anesthésie sans jamais reprendre conscience, 1 934 souris vont être utilisées pour caractériser quatre nouveaux modèles génétiques de la maladie de Huntington. Les 686 autres relèvent d'un niveau de souffrance léger. Certaines lignées sont maintenues jusqu'à onze mois pour que des symptômes neurologiques et moteurs apparaissent, symptômes que le porteur dit jamais handicapants, avant une série de tests comportementaux d'une semaine au maximum puis une chirurgie terminale. Ces tests, présentés comme très fins et seuls capables de révéler les symptômes en question, ne sont nommés nulle part dans le résumé.
Objectifs
La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Afin de pouvoir répondre à des questions fondamentales sur les mécanismes de cette maladie, quatre nouveaux modèles murins génétiquement modifiés ont été développés. Cependant, avant de pouvoir les utiliser en recherche, une description complète de leur comportement est indispensable. De plus, il faut également analyser si les modifications génétiques ne perturbent pas le développement des animaux afin de valider la fiabilité de ces nouveaux modèles. Cette étape est primordiale pour s'assurer que de futurs projets de recherche dans lesquels ces modèles seront utilisés ne seront pas biaisés.
Bénéfices attendus
Les différents modèles murins déjà existants pour étudier la maladie de Huntington ne permettent pas d’étudier et de visualiser directement et à l'état normal les protéines défaillantes et responsables de la maladie. Pour cela, il faut utiliser des intermédiaires cellulaires permettant de tracer et marquer les protéines. Cependant, l'ajout de ces intermédiaires peut engendrer des modifications cellulaires indésirables et fausser certains des résultats. Ainsi, ces nouveaux modèles murins vont être de précieux outils pour atteindre les objectifs des projets qui visent à mieux comprendre les mécanismes de mise en place de la maladie de Huntington et à aboutir à des innovations thérapeutiques permettant de retarder la progression de la maladie et/ou d’empêcher l’apparition des symptômes. Ainsi, la caractérisation du développement, du comportement et des fonctions physiologiques de ces souris est essentielle.
Procédures
Parmi les animaux de ce projet, certains développent un phénotype dommageable avec l'âge. Tous les animaux effectueront une seule série de tests comportementaux pendant une durée maximale d'une semaine, puis une chirurgie terminale sera réalisée.
Impact sur les animaux
Certains des nouveaux modèles présentés ici peuvent développer avec l’âge des symptômes légers de la maladie de Huntington. Ces symptômes neurologiques et moteurs associés au modèle ne sont observés que lors de tests comportementaux très fins conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte de poids excessive ni une perte d'autonomie. Il est possible d’identifier 3 nuisances légères potentielles : 1) un stress léger pendant leur transport d'une animalerie vers l'autre. 2) un stress léger lors de la manipulation par l'expérimentateur pendant la mise en place des croisements et pendant la réalisation des tests comportementaux. 3) un stress léger d'une femelle ayant mis bas lorsque les animaux seront prélevés.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin des procédures. Leurs tissus cérébraux ainsi que d'autres organes clés dans la maladie de Huntington seront prélevés et conservés afin de réaliser des expériences ultérieurement.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs des projets de recherche et reproduire la complexité d’un organisme vivant. De plus, les nouveaux modèles murins de la maladie de Huntington qui ont été développés vont permettre d'étudier le rôle de plusieurs protéines impliquées dans le développement de la maladie en conditions physiologiques et/ou pathologiques sans devoir utiliser des intermédiaires pouvant biaiser les résultats. Le modèle murin est indispensable pour comprendre le rôle de la protéine huntingtine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier.
Réduction
Le nombre total d’animaux pour ce projet a été calculés en considérant que les expérimentations doivent être validées avec au minimum deux groupes de souris afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables. Dans une démarche de réduction, les souris utilisées vont permettrent de faire plusieurs études et de répondre à différentes questions fondamentales. De plus, à la fin de chaque étude, les tissus cérébraux ainsi que d’autres organes clés dans la maladie de Huntington seront prélevés. Ceci permettra d’obtenir du matériel biologique précieux sans devoir générer des animaux supplémentaires.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez ces animaux. Les animaux seront hébergés dans des cages adaptées et équipées d’une litière stérile ainsi que de la paille permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. De plus, différents matériaux pour divertir les rongeurs seront ajoutés dans la cage avec une rotation chaque semaine pour que les animaux aient chaque semaine un nouveau divertissement. Ces cages seront changées toutes les semaines. L’accès à l’eau et à la nourriture sera illimité. Les biberons d'eau et les croquettes seront également changés toutes les semaines. Le transport des animaux d’une animalerie à l’autre sera effectué en cages occultées avec au moins un matériau de divertissement et des croquettes mouillées à disposition. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. L’état de santé des animaux sera surveillé toutes les semaines ou tous les jours si besoin jusqu'à la fin de leur vie. Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude de la maladie de Huntington. Certaines souris seront utilisées au stade de jeunes adultes, c'est-à-dire entre 8 et 12 semaines, d’autres devront atteindre l’âge de 11 mois afin qu'elles développent les symptômes légers de la maladie de Huntington et permettre que l’étude soit pertinente. Concernant les études développementales, les animaux seront utilisés à différents stades de développement cérébrale car cette période est fondamentale pour la mise en place des tissus cérébraux. En outre, de plus en plus d'études montrent que des dyfonctionnements cérébraux s’installent très tôt, bien avant l'apparition des symptômes de la maladie de Huntington.
Effets d’une thérapie ciblée dans des modèles murins de tumeurs à cellules squameuses
- Recherche appliquée
- Cancers
Trois injections intraveineuses par semaine pendant trois mois, une injection de chimiothérapie par semaine sur la même période, des tumeurs mesurées deux à trois fois par semaine : 780 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Des cellules cancéreuses humaines leur sont greffées sous la peau, des plaies peuvent s'ouvrir sur les tumeurs et s'infecter, et la chimiothérapie provoque chez certaines un affaiblissement important avec forte perte de poids. Le projet teste un anticorps seul ou associé à une chimiothérapie contre des cancers de l'épiderme, un essai clinique avec cet anticorps étant déjà à l'étude. Le porteur retient la souris immunodéficiente précisément pour que son système immunitaire, amputé d'une partie de ses cellules, n'élimine pas les cellules humaines greffées.
Objectifs
Les cancers de l’épiderme (à la surface de la peau) sont des cancers qui touchent principalement les cellules squameuses (cellules qui se détachent au fur et à mesure que de nouvelles se forment) au niveau de la tête, du cou et des poumons entre autres. Le taux d’incidence de ce type de cancer a augmenté de 200% sur les 30 dernières années avec 1,8 millions de cas diagnostiqués chaque année malgré les campagnes de prévention. Sans traitement mis en place, les tumeurs peuvent se développer dans des couches plus profondes et engendrer des métastases dans d’autres parties du corps. Actuellement le traitement de choix contre ce genre de tumeurs est principalement différents types de chirurgie d’ablation des tumeurs lorsqu’elles sont détectées de manière précoce et possibles puis en combinaisons ou non avec de la radiothérapie, de l’immunothérapie et/ou de la chimiothérapie. Néanmoins, une proportion importante de patients ne répondent pas ou rechutent suite à ces traitements. Il convient donc de développer de nouvelles alternatives thérapeutiques offrant une nouvelle option aux patients atteints de stade avancé de la maladie. L'objectif principal de ce projet est d’étudier l’effet d’un anticorps (ciblé contre une protéine) seul ou en association avec une chimiothérapie sur le développement de certaines formes de cancers de l'épiderme dans des modèles cellulaires humains greffés chez la souris.
Bénéfices attendus
L'hypothèse de ce travail est que la protéine ciblée par notre anticorps joue un rôle dans le développement des cancers de l’épiderme. Ceci est basé sur l'expression de cette protéine ciblée dans les tumeurs de patients atteints de cette maladie. Dans le cadre de cette étude, l’effet anti-tumoral de notre anticorps seul ou en combinaison avec une chimiothérapie sera évalué dans des modèles de souris. Un projet d’essai clinique portant sur le traitement de ces cancers avec cet anticorps est actuellement à l’étude. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement de cet anticorps sur ce type de cancer et de son fonctionnement en association avec des chimiothérapie (si l’anticorps est capable d’améliorer l’effet des chimiothérapies). Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.
Procédures
Toutes les souris prévues dans le protocole subiront différentes manipulations 2 à 3 fois chaque semaine pour des prises de poids, les mesures des tailles des tumeurs pendant 3 mois. Mais aussi des injections intraveineuses d'anticorps = traitement (3 injections par semaine pendant 3 mois) et/ou des injections dans l’abdomen de chimiothérapie (1 injection par semaine pendant 3 mois). Mais aussi une seule injection sous-cutanée de cellules cancéreuses en début de protocole. 3 prises de sang réalisées par du personnel qualifié représente un stress de 1 à 2minutes et les volumes de sang prélevés sont inférieurs aux volumes maximums recommandés avec une semaine de récupération entre chaque prise de sang.
Impact sur les animaux
Dans les trois procédures il est possible d’observer l’apparition de plais sur les tumeurs à la surface de la peau qui peuvent dans de rares cas provoqués des infections. Dans les traitements avec chimiothérapie, un affaiblissement important de l’organisme associé à une forte perte de poids peut être observée chez certains individus. Toutes les souris prévues dans le protocole subiront différentes manipulations chaque semaine pouvant engendrer un stress pour des prises de poids et le suivi de la croissance tumorale. Le stress liés aux injections intraveineuses d'anticorps dure moins d’une minute ainsi que moins de 20 secondes pour les autres injections et la douleur est restreinte aux quelques secondes de la piqûre. 3 prises de sang seront réalisées seulement dans la dernière procédure et nécessitant une contention et donc un stress de 1 à 2 minutes ainsi qu’une douleur restreinte au moment de la piqure. Dans de rare cas ces prises de sangs peuvent entrainer des saignement anormales (volume plus important ou de l’oreille ou du nez). Ces nuisances sont diminuées par la mise en place de précautions spécifiques à chaque geste.
Devenir
Tous les animaux porteurs de tumeurs seront donc mis à mort en fin de procédure expérimentale selon les critères décrits dans le projet.Les animaux non porteurs ne pourront pas être réutilisés et devront également être mis à mort en cas de développement de tumeurs de manière tardive.
Remplacement
Les cancers de l’épiderme nous intéressent pour la diversité des cellules qui les composent ainsi que toutes les interactions entre elles = microenvironnement tumoral. Ces éléments sont nécessaires à la compréhension des mécanismes d’action de notre thérapie ciblée. Les modèles retrouvés dans la littérature montrent que cette diversité n’est pas retrouvée dans les cultures cellulaires (qui contiennent en général un nombre très limité de types cellulaire différents) mais uniquement dans les greffes de cellules cancéreuses chez la souris où l’on retrouve un microenvironnement tumoral complet avec tous les types cellulaires comme les cellules cancéreuses, les cellules immunitaire, les cellules des tissus touchés par ce type de cancer.
Réduction
Tout d'abord nous testons 6 lignées cellulaires cancéreuses de cancer de l’épiderme (3 groupes de 2 qui forment des tumeurs à des endroits différents) pour voir si une fois injectées chez la souris elles forment des tumeurs. Nous nous basons sur des données de la littérature scientifique pour décider du nombre de cellules injectées. Nous utilisons 5 souris par lignée cellulaire injectée à 2 endroits différents pour tester la prise tumorale de 10 tumeurs tout en utilisant moins de souris. Dans le cas où aucune tumeur ne se forment, 5 nouvelles souris par lignée cellulaire pourront être utilisées pour tester une nouvelle condition de prise tumorale. Les lignées cellulaires n’ayant montré aucune croissance tumorale ne seront pas utilisées pour les prochaines procédures, ce qui limitera donc le nombre de conditions testées. Une nouvelle procédure permet cette fois-ci de tester l’efficacité de notre anticorps en combinaison ou non avec une chimiothérapie sur la croissance tumorale. Pour cela et selon des tests statistiques nous aurons besoin de 15 souris par groupe de traitement. Nous testerons 4 groupes de traitement différents. Si les des 2 groupes de traitement contenant notre anticorps ne montrent aucune efficacité antitumorale dans cette procédure sur une lignée cellulaire, celle-ci ne sera pas testée dans la dernière procédure conduisant à une nouvelle réduction du nombre d’animaux. Enfin une dernière procédure permettra de répéter le schéma de traitement précédent en mettant fin au protocole de manière plus précoce (arrêt de la procédure à partir d’un volume tumorale 3 fois inférieur à la procédure 2) dans le cas d’efficacité antitumorale de notre anticorps afin de nous permettre d’étudier les mécanismes d’action de cette thérapie dans les temps précoces du traitement.
Raffinement
A leur arrivées les animaux ont une période d’habituation à leur nouvel environnement d’hébergement et aux expérimentateurs qui vont suivrent le protocole. Les souris seront élevées et hébergées par groupes, avec un milieu enrichi pour favoriser la nidation (maison en carton, coton). Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux (pesées, mesure de la croissance tumorale etc.) plusieurs fois par semaine permettra la recherche de tout signe de souffrance. Toutes les souris immunodéficientes (manque d’une partie de leurs cellules immunitaires) sont hébergées en cage ventilée et manipulées sous hotte qui leur permettent de rester dans des zones stériles limitant les risques d’infections de ces souris plus fragiles que les autres. Des points limites adaptés sont mis en place au-delà desquels, si aucun moyen de correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort. Toutes les injections et les mesures de croissance tumorale sont réalisées par du personnels qualifiés afin de réduire au maximum le temps de manipulation et le stress des animaux. Une prise de sang réalisée par du personnel qualifié représente un stress de 1 à 2minutes et les volumes de sang prélevés sont inférieurs aux volumes maximums recommandés avec une semaine de récupération entre chaque prise de sang.
Choix des espèces
La souris immunodéficiente (manque d’une partie des cellules immunitaires) est le modèle le plus approprié pour injecter des cellules cancéreuses humaines et éviter que le système immunitaire de la souris ne s’en prennent à ces cellules et les élimine. Par ailleurs les schémas d'administration des anticorps et chimiothérapies sont bien standardisés chez la souris (voie, doses, et fréquence des injections) contrairement à d'autres modèles animaux. De plus la protéine étudiée dans ce projet n'est pas exprimée dans toutes les espèces. On retrouve une forte ressemblance entre la forme humaine et murine, justifiant encore l'usage des souris. En dernier lieu, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils destinés à l'analyse des tumeurs qui n'existent pas tous pour d'autres espèces que l'homme et la souris. Les expérimentations seront effectuées sur des souris adultes.
Evaluation de la pathogénicité des anticorps anti HMGCR et anti SRP dans un modèle murin de myopathies nécrosantes auto-immunes
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
55 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant sept jours des injections quotidiennes d'anticorps purifiés à partir de plasmaphérèses de patients atteints de myopathie nécrosante, subissent trois microprélèvements de sang et deux tests de force par traction, avant le prélèvement de leurs muscles gastrocnémiens. L'objet du projet est de vérifier si les anticorps de quatre nouveaux malades déclenchent bien la maladie chez la souris, pour disposer d'un modèle où tester des médicaments. Le porteur écrit que l'atteinte musculaire n'a pas de répercussion visible en termes de souffrance ou de perte de poids, tout en prévoyant une gêne de la mobilité du train arrière et un traitement antidouleur quotidien pour tous les lots.
Objectifs
Au sein des myopathies inflammatoires, les myopathies nécrosantes auto-immunes (MNAI) sont définies histologiquement par la présence d'une importante nécrose des fibres musculaires sans infiltrat inflammatoire. La nature auto-immune des myopathies nécrosantes a été suggérée par leur association fréquente à la présence d'autoanticorps (aAc) anti-Signal Recognition Particle (SRP) ou, plus récemment, d'aAc anti-3-hydroxy-3-méthylglutaryl- Coenzyme A réductase (HMGCR) et la corrélation de leur titre avec le myolyse. Notre laboratoire a établi un modèle murin de MNAI par injection à des souris C57BL/6J d'IgG purifiées issues de patients porteurs d’aAc anti- HMGCR ou anit-SRP. Ce transfert induit une myopathie clinique avec diminution de la force musculaire associée à un dépôt d’IgG et de C5b-9 (ensemble de protéines formant un pore dans la membrane) à la surface des fibres musculaires, démontrant le caractère directement pathogène des aAc et suggérant un rôle cytotoxique exclusif du complément. Ce modèle nous a permis récemment de tester de nouvelles thérapies avec succès. Cependant, les aAcs de certains malades n'induisent pas de myopathies chez la souris pour des raisons inexpliquées. Les IgG anti-HMGCR et anti-SRP sont purifiées à partir de plasmaphérèse de patient qui sont extrêment rares à obtenir. En relation avec différents hôpitaux en France, nous avons réussi à obtenir des plasmaphérèses de 4 nouveaux malades. L'objectif général de notre programme est d'évaluer la pathogénicité des anticorps de ces nouveaux patients dans le but de les utiliser en cas de résultat positif dans des protocoles d'évluation de l'efficacité de nouveaux médicaments. L’étude des animaux se fera par (i) une observation clinique (suivi du poids), (ii) une mesure de la force musculaire chez l’animal anesthésié et (iii) par une analyse sanguine et des tissus musculaires.
Bénéfices attendus
Lors de précédents protocoles expérimentaux avec ce modèle animal , nous avons pu démontré l'efficacité de molécules thérapeutiques dans (i) l'apparition et (ii) le traitement de la myopathie. Cela s'est traduit par respectivement (i) une absence d'atteinte histologique et de diminution de la force musculaire et (ii) par une réduction significative de l'atteinte histologique et une restauration de la force musculaire. Les plasmaphères de pateints sont rares et épuisables. La possibilité de disposer de nouvelles sources d'anticorps de malades permettra de tester de nouvelles molécules thérapeutiques qui ne peuvent pas être testées dans les modèles in vitro que nous développons parallèlement.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à 3 microprélèvements de sang, d'une durée de moins de 5 secondes chacun. Les souris seront injectées quotidiennement en IP durant 7 jours soit 7 injections d'une durée de moins de 10 secondes chacun. 2 grip test seront réalisés pour chacune des souris à 8 jours d'intervalle, durée moins de 10 secondes. Les gastrocnémiens de tous les animaux seront prélevés sur les souris euthanasiées en fin de protocole.
Impact sur les animaux
L'injection d'anticorps de malades atteints de MNAI chez la souris entraine l'apparition d'une myopathie se traduisant par une diminution de la force musculaire. L’expérience acquise lors de précédents protocoles expérimentaux autorisés avec ce modèle animal a montré que l'atteinte musculaire n'avait pas de répercution visible chez l'animal en terme de souffrance ou de perte de poids. Lors des injections IP les souris pouront ressentir un peu de stress du à la contention et l'injection en elle même, mais qui sera de très courte durée. Pour les souris de l'étude qui développeront une myopathie consécutive à l'action pathogéne des anticorps testés une gêne dans la mobilité du train arrière pourra être observée.
Devenir
Le prélèvement des gastrocnémiens pour analyse histologique ne permettra pas de maintenir les animaux en vie.
Remplacement
Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivie des réponses immunitaires. L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable pour l'évaluation de la pathogénicité des anticorps de malades dans une perspective d’approche à visée thérapeutique. Il n’existe actuellement pas de modèles in vitro pour une telle étude combinée de la réponse humorale et de la physiologie du muscle. Ce projet ne peut donc être réalisée que chez l'animal.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été réduit à son minimum grâce l'expérience acquise lors d'autre protocoles expériementauxautorisés utilisant ce modèle murin de myopathie par transfert d'aAcs chez la souris. L'analyse rétrospective des résultats obtenus a permis de faire un calcul statistique excat des effectifs nécessaires. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum en tenant compte également de la variabilité des mesures de la force musculaire, ainsi que de la variabilité des réponses notamment immunologique obervées lors de ces protocoles.
Raffinement
L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, où les conditions d’hébergement sont contrôlées : température, hygrométrie, cycle jour/nuit, change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec un abri de celllose et des fibres de coton. L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Une échelle de gravité des symptômes observés a été établie et permet de déterminer un point limite dans l’ensemble des expériences. Elle permettra également d’évaluer la douleur des animaux et de mettre en place une procédure visant à la limiter. En effet, les animaux seront observés quotidiennement et l'apparition de signes cliniques, poils hirsutes, perte de poids visible (sans pesée) ou prostration ou lorsque le score 1 de l’échelle de gravité des symptômes seront atteints entraineront la mise en place de des dispositions pour réduire la douleur (conférer paragraphe suivant). Un traitement préventif quotidien (par voie orale) de la douleur sera mis en place pour les animaux de tous les lots. En cas de douleur, un traitement en sous cutané (s.c) sera administré. Le protocole sera arrêté lorsque le score 2 ou le point limite qui a été défini seront atteints. Un analgésique sera administré 30 minutes avant la mesure de la force musculaire in situ (injection en s.c).
Choix des espèces
Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivi des réponses immunitaires. Le modèle de souris offre également la possibilité d’utiliser des modèles transgéniques largement éprouvés. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Il permet également de n'utiliser que de faibles quantités d'anticorps purifiés à partir de plasmaphérèses de malades qui sont difficiles à obtenir. Animaux âgés de 8 semaines, âge requis pour que le système immunitaire soit totalement mature.
Maintien d’un élevage de tiques Ixodes ricinus
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Lapins : 8
Réutilisés jusqu'à trois fois, 8 lapins sont utilisés pour nourrir des tiques déposées sur leurs oreilles sous anesthésie, cinquante nymphes ou dix couples d'adultes par oreille, avec une collerette maintenue pendant le gorgement. 200 souris reçoivent chacune cinquante à cent larves et restent isolées jusqu'à sept jours avec un enrichissement appauvri, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les souris sont tuées après la collecte des tiques, faute d'être réutilisables ou adoptables selon le porteur, alors que quatre lapins sont réutilisés et quatre adoptés. Sur le remplacement, il décrit des systèmes de gorgement artificiel jugés prometteurs mais pas encore prêts, avec 57 % de femelles pondeuses, et annonce une veille documentaire régulière.
Objectifs
Le but de ce projet est de maintenir une lignée de tique, afin de disposer de lignées de laboratoire au fond génétique commun. Ces tiques constituront un matériel pour : - Analyser la transmission de différents microorganismes aux animaux. En effet, bien que l'inoculation des microorganismes soit possible à la seringue, celle-ci reproduit de façon très imparfaite la transmission des agents infectieux par les tiques et ne permet pas de l’étudier. - Elles permettront également d’analyser les déterminants susceptibles de provoquer une attractivité plus importante des tiques chez certains individus.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de maintenir pour fournir des tiques possédant un fond génétique commun afin de réaliser plusieurs expériences dont les principaux axes sont les suivants : - Étude des déterminants favorisant l’attractivité des tiques. Chez les moustiques, une attractivité différentielle entre individu a été mise en évidence. En effet, certains individus sont plus « attracteurs » que d’autres définissant ce que l’on peut appeler une « peau à moustiques ». Les déterminants chimiques de cette attractivité sont en partie connus et seraient liés au microbiote cutané. Empiriquement, une attractivité différentielle entre individus est observée pour les tiques. Les déterminants de cette dernière demeurent inconnus. Un des buts de l’élevage est d’étudier les déterminants de cette activité in vitro en utilisant les tiques de l’élevage. - Mesure de la compétence vectorielle et analyse de la transmission des microorganismes. Les tiques hébergent différents microorganismes susceptibles d’être transmis à l’homme. Disposer de tiques de laboratoires dont le fond génétique est commun et maitrisé permet de savoir si ces microorganismes sont d’abord effectivement transmis lors du repas sanguin, c’est-à-dire si cette espèce est un vecteur compétent. Une fois la compétence vectorielle affirmée, nous nous intéresserons aux modalités de cette transmission (localisation des microorganismes lors des phases de diapause des tiques ou lors du repas sanguin), ainsi qu’aux déterminants permettant cette transmission. Pour cela les tiques seront nourri sur animaux porteur du microorganisme d’intérêt. Ces projets feront l’objet d’autorisations spécifiques séparées de la présente saisine.
Procédures
- Lapin : dépôt des tiques (50 nymphes ou 10 couples d’adultes/oreille) confection du manchon en tissu et fixation à l’aide d’un sparadrap médical. Gestes réalisés sous anesthésie générale (protocole décrit dans la procédure - Souris : dépôt des tiques (50 à 100 larves/individu) sur animal vigile. La durée de gorgement est de maximum 10 jours pour les lapins et de maximum 7 jours pour les souris.
Impact sur les animaux
Concernant les lapins les effets indésirables sont concomitants au repas sanguin, des réactions inflammatoires locales à la piqure de tiques peuvent s’observer jusqu’à 4 semaines après le repas sanguin : - inconfort lié au port de la collerette - irritation du cou à cause du port de la collerette et irritation de la base des oreilles - au site de piqure, les tiques peuvent provoquer une réaction inflammatoire locale susceptible de démanger le lapin. - Les procédures peuvent induire de la fièvre. Concernant les souris, les effets indésirables sont concomitants au repas sanguin et correspondent à des réactions locales inflammatoire à la piqure des tiques. A noter que lors du repas sanguin (5-7 jours) les souris seront isolées avec un enrichissement apauvri. Un tunel transparent et un barreau à rongé seront néanmoins à leur disposition.
Devenir
Concernant les lapins, il n'ont pas été en contact avec des tiques porteuses de microorganismes, les lapins peuvent petre adoptés. De plus, ils ont été en contact avec l'homme pendant leur vie. Il font d'excellent candidats à l'adoption. Concernant les souris, elle ne peuvent être réutilisée et son difficilement adoptable, elles seront donc mise à mort.
Remplacement
Les systèmes de gorgement artificiel pour tiques, bien qu'étudiés, ne sont pas encore commercialisés et présentent des limites qui empêchent le remplacement des hôtes animaux pour l'élevage de tiques. Des travaux, montrent que le nourrissage artificiel nécessite une grande expertise, avec des résultats variables avec seulement 57% des femelles qui ont pondu. Des recherches similaires confirment ces résultats sans pour autant détailler l'efficacité sur les générations successives ou le taux de développement des tiques. Les comparaisons entre les tiques nourries artificiellement et celles sur des hôtes animaux révèlent des taux de réussite inférieurs pour la reproduction et le nourrissage dans le cas d'un nourrissage artificiel. Une étude apporte une contribution significative en explorant tout le cycle d'Ixodes ricinus mais soulève des questions sur l'approche statistique utilisée et l'impact des antibiotiques sur le microbiote des tiques, un aspect crucial pour la conservation de lignées en laboratoire. En conclusion, bien que prometteurs pour certaines recherches, les systèmes de nourrissage artificiel ne sont pas encore prêts pour remplacer l'élevage sur animaux en laboratoire. Une veille scientifique sur le site de l’ECVAM concernant ce point sera régulièrement réalisée et présentée en SBEA.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux utilisés pour le maintien de l’élevage de tiques est minimisé au mieux. L’expérience des années précédentes sur l’élevage de tiques ainsi que l’expérience de nos collègues de Neuchatel nous permet d’estimer à 100 souris/an et 4 lapins par an pendant la durée de ce protocole. Afin de minimiser l'utilisation des lapins, ils seront utilisés 3 fois.
Raffinement
Durant la procédure, les souris sont isolées pour un maximum de 7 jours, avec des contrôles réguliers pour évaluer leur état et collecter les tiques gorgées, tout en maintenant un contact olfactif avec leurs congénères. Elles disposent d'un tunnel, d'un barreau à ronger et de coton. L'absence de douleur au point d'injection élimine le besoin d'analgésiques. Après le sevrage et avant la procédure, les souris s'acclimatent à une manipulation douce, visant à réduire le stress via des interactions et des caresses. Les souris sont euthanasiées après la collecte des tiques, sans dépasser 7 jours. Les lapins, quant à eux, suivent un entraînement bi-quotidien de 20 minutes incluant la contention, l'habituation à des manipulations et à la collerette, et l'introduction de récompenses pour encourager les comportements désirés. En outre, ils bénéficient de minimum une heure d'activité quotidienne dans un enclos de 1m² pour leur bien-être physique. Pour le dépôt des tiques, une sédation est administrée aux lapins. Cette approche assure le bien-être animal tout en facilitant les procédures expérimentales.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les hôtes naturels des larves et les nymphes de tiques. Les lièvres ou les lapins sont piqués par des tiques (toutes les stases, y compris les femelles) dans la nature. Le lapin de laboratoire constitue donc une bonne alternative pour le repas sanguin des stases nymphales et adultes et les souris permettent le gorgement à la fois des nymphes et des larves. A noter que nous allons privilégier les lapins pour les stases nymphales car ces derniers sont réutilisés et adopté au terme des procédures. Cela limite donc le nombre de souris. Age pas d’impact. Nous pourrons utiliser les animaux disponibles à l’animalerie