Recherche appliquée

Injectées d'acroléine directement dans un ventricule du cerveau, gavées six jours sur sept pendant quatre semaines, puis soumises à des injections quotidiennes dans le nez ou l'abdomen pendant deux semaines, 484 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des tests comportementaux sont annoncés à raison d'un par jour, sans que le RNT dise lesquels. L'objectif est de vérifier si une molécule dérivée d'un polyphénol protège du déclin cognitif un modèle de maladie d'Alzheimer construit par intoxication chimique. Toutes sont tuées à la fin pour analyser leur tissu cérébral.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est la forme la plus fréquente de maladie neurodégénérative associée à une démence chez les sujets âgés. L'élaboration et la mise sur le marché de nouveaux traitements pour lutter contre ce fléau est un défi sanitaire et économique majeur. Le stress oxydant induit par de nombreux facteurs environnementaux (notamment l'exposition à des polluants chimiques) est un évènement extrêmement précoce et jouant un rôle majeur dans la maladie. En effet, l’oxydation des lipides et du glucose favorise l’accumulation d’espèces carbonylées réactives (ECR, stress carbonylé) dont la réaction avec les acides aminés entraîne des modifications et pertes de fonctions irréversibles des protéines cellulaires. Parmi les molécules capables de combattre ce phénomène, les polyphénols, métabolites secondaires du règne végétal, présents dans de nombreux fruits et légumes de notre alimentation, ont été largement étudiés. L'obstacle majeur à l'utilisation de ces composés en thérapeutique est leur très faible biodisponibilité. Pour contourner ce problème, une équipe de chimistes a synthétisé un composé capable de réduire à la fois le stress oxydant et le stress carbonylé. Un polyphénol naturel, le phloroglucinol (Phloro) a été modifié chimiquement afin de pouvoir piéger les espèces responsables du stress carbonylé. Afin d’augmenter sa biodisponibilité, le phloroglucinol modifié a ensuite été couplé à un acide gras à longue chaîne (DHA) pour donner le Phloro-OiP-DHA. Son activité a été validée in vitro et in vivo dans un modèle murin présentant une dégénérescence des photorécepteurs induite par la lumière. L'objectif de ce projet est de déterminer le potentiel thérapeutique de ce composé dans un modèle de stress carbonylé induit par une exposition chronique à une ECR (l'acroléine), mimant le développement de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra : -de confirmer que l'exposition chronique à l'acroléine, conduisant à l'apparition d'un stress carbonylé, s'accompagne de troubles comportementaux et de neurodégénérescence. -de déterminer le potentiel thérapeutique du lipophénol Phloro-OiP-DHA dans ce modèle. Avec cette étude, nous posons donc l'hypothèse d'un mécanisme reliant le stress carbonylé aux processus neurodégénératifs asssociés à la maladie d'Alzheimer, et en particulier ceux associés à la formation des dépôts amyloïdes et l'hyperphosphorylation de la protéine tau. Ce projet nous permettra d'en appréhender les mécanismes biochimiques sur le long terme et de tester le potientiel thérapeutique d'une molécule ciblant le stress carbonylé, le Phloro-OiP-DHA.

Procédures

Les animaux, en fonction de leur groupe, pourront être soumis à : -un gavage quotidien pendant 4 semaines (6j/7) -une injection intracérébroventriculaire d'acroléine -des injections intrapéritonéales ou intranasales quotidiennes pendant 2 semaines - des tests comportementaux (un test par jour) - ils seront euthanasiés en fin de projet.

Impact sur les animaux

La dose d'acroléine utilisée est basée sur des travaux précédemment publiés . Les animaux seront observés quotidiennement afin d'évaluer les potentiels effets indésirables. L'inconfort lié au traitement peut provenir de la répétition quotidienne du gavage pendant 4 semaines et/ou des administrations intranasales pendant 2 semaines. Ces administrations seront toutefois effectuées par une personne qualifiée et après une période d'habituation à l'expérimentateur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de pouvoir procéder à des analyses biochimiques et immunohistologiques du tissu cérébral.

Remplacement

De manière générale, il est aujourd’hui très difficile en neurosciences d’étudier le fonctionnement du cerveau sur des modèles simplifiés (in vitro ou in silico) et donc de remplacer l’étude sur l’animal dans sa globalité. En effet, il n'existe pas de modèles alternatifs (in vitro ou in silico) validés pour étudier la neurodégénérescence et le déclin cognitif dans leur globalité. Il est primordial d’avoir des circuits neuronaux in vivo associés aux cellules gliales et vasculaires, pour caractériser les modifications moléculaires liées à la maladie d’Alzheimer d’un point de vue spatiotemporel. Les modèles utilisés sont acceptés, bien documentés, et très utilisés par la communauté des neurosciences.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum pour répondre aux objectifs du projet. Le nombre d'animaux dans chaque groupe, ainsi que le nombre de groupes est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe et a été déterminé par une analyse de puissance statistique basée sur nos études précédentes. Pour les analyses comportementales, histologiques et biochimiques, les tests seront de type non appariés, paramétriques sur les moyennes à variances égales ou différentes suivants les résultats des analyses précédentes. Ici, 10 animaux par groupe seront nécessaires pour observer d’éventuels changements. A ce nombre d’animaux une marge de 10% sera ajoutée afin de compenser les aléas expérimentaux.

Raffinement

Afin de minimiser les effets du stress qui pourraient fausser les résultats (en particulier sur les analyses comportementales), mais également de contrôler l’état général des animaux, les souris seront manipulées chaque jour par l’expérimentateur en charge de l’expérience, avant la procédure expérimentale. Tous les incidents et toutes observations anormales (comportement, poids, pelage, plaie,…) seront transmis à l’expérimentateur afin d’être traités dans les plus brefs délais et seront notés dans un tableau de suivi expérimental.

Choix des espèces

Il s'agit d'une espèce de choix au niveau international pour l’étude de la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer. Ces études chez l’animal vigile sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements potentiels. De plus, l'utilisation d'animaux transgéniques (modèle Alzheimer) justifie également le choix de cette espèce. La maladie d'Alzheimer étant une maladie se déclarant chez l'adulte voire la personne âgée, les animaux seront utilisés et sacrifiés à l'âge adulte (6 mois). De plus, la caractérisation du modèle de souris transgéniques a déjà été effectuée dans notre laboratoire et nous avons montré que : -les déficits comportementaux commencent à partir de 3 mois -les modifications biochimiques (augmentation de la charge amyloïde, de la phosphorylation de la protéine tau, principaux marqueurs de la maladie d’Alzheimer) et histologiques (formation des plaques amyloïdes) sont visibles à l’âge de 6 mois

48 souris rendues obèses par un régime gras vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant 26 pesées, 12 injections dans l'abdomen, 39 injections sous la peau, cinq prises de sang et deux séjours de 96 heures en cage de mesure. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, et les souris sont hébergées seules pendant toute l'étude, ce que le porteur reconnaît comme une nuisance pour une espèce sociale. Un jeûne de quatre heures précède chaque prise de sang, et l'obésité elle-même réduit leur capacité de mouvement. L'étude est menée pour un client, à un stade précoce du développement d'un candidat médicament anti-obésité, avec la perspective déclarée d'une mise sur le marché.

Objectifs

Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament de notre client et vise à tester son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse, en administration seule ou combinée avec un autre composé anti-obésité déjà autorisé sur le marché. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament sur l'appétit, les dépense énergétiques et, en conséquence, sur le poids corporel du modèle d'obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieures molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (26 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule ou du candidat médicament par voie intrapéritonéale (12 administration; durée de la mesure : 1 minute); 3) Administrations de véhicule ou de sémaglutide par voie sous-cutanée (39 administrations; durée de la mesure : 1 minute); 4) Analyse non invasive de composition corporelle (5 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 5) Prélèvements sanguins (5 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 6) Mesures de dépenses énergétiques (2 sessions de mesures de 96h); 7) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).

Impact sur les animaux

De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements intrapéritonéaux et sous-cutanés, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs aiguës et de stress. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non obèse a été réduit à 8 animaux, contre 10 pour les groupes expérimentaux constitués de souris obèses, compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genres.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie intrapéritonéale et sous-cutané seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J nourris avec une alimentation enrichie en graisses (45% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 20 semaines (28 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 14 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.

Anesthésiées pour recevoir un virus par injection derrière l'œil, puis une heure durant pour une IRM, 1 920 souris porteuses de la mutation de Huntington vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont transportées entre trois établissements, dont un en Belgique, et toutes sont tuées pour prélever leur cerveau. Le projet teste deux approches censées restaurer un transport de molécules défaillant dans les neurones, validées jusqu'ici sur des cellules. Sept tests comportementaux sont annoncés, un par jour, sans que le RNT précise lesquels, alors que deux d'entre eux sont décrits comme des stress modérés, un jeûne de 24 heures et un isolement de 48 heures.

Objectifs

Ce projet a pour but de tester in vivo 2 approches thérapeutiques qui ont été validées in vitro contre la maladie de Huntington. Ces approches thérapeutiques sont développées dans le but de restaurer un manque de transport de molécules dans les neurones. Ce projet se déroule dans 3 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le but du projet est de tester 2 nouvelles approches therapeutiques permettant de retarder la progression de la maladie, ou d’empêcher l’apparition des symptômes. Nous avons récemment mis en place un outil nous permettant de tester cette approche sur des cellules et de valider son effet bénéfique. Ces résultats prometteurs nécessitent désormais une validation sur des animaux en vue de proposer des thérapies aux patients atteints par cette maladie.

Procédures

Les animaux de ce projet vont développer en vieillissant la maladie de Huntington caractérisée par des symptômes neurologiques et moteurs légers qui ne sont observés que lors de certains tests comportementaux conçus à cet effet. L'élevage des animaux utilisés dans ce projet pourra être réalisé dans 2 établissements utilisateurs. À l'âge d'un mois, les animaux seront transportés dans le troisième établissement utilisateur pour y être manipulés comme suit: 1) les animaux seront anesthésiés deux fois, une fois pendant 5 minutes le temps d'injecter le virus qui sert à apporter la molécule d'intérêt dans le cerveau des animaux (durée de l'injection 30 secondes), et une autre fois pendant 1h le temps de l'acquisition des images IRM; 2) 7 tests comportementaux seront réalisés avec ces animaux (1 test par jour, répartis sur une durée de 1 à 2 semaines en fonction du nombre d'animaux testés).

Impact sur les animaux

Les modèles de souris utilisés dans cette étude sont des modèles largement utilisés dont le phénotype devient dommageable avec l’âge, par l’expression de symptomes modérés. Ces symptômes neurologiques et moteurs associés au modèle ne sont observés que lors de tests comportementaux fins conçus à cet effet. Avec l’âge, les symptômes neurologiques (anxiété, dépression, désinhibition) et moteurs (perte d’équilibre, manque de précision dans les mouvements) sont de plus en plus visibles lors des tests comportementaux mais ne deviennent pas handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte de poids excessive. Nous ne nous attendons pas à observer de points limites ni de mort prématurée chez ces animaux dus au phénotype. Nous pouvons identifier plusieurs effets indésirables sur les animaux lors de l’expérimentation : 1) un stress léger pendant leur transport dans établissement utilisateur à l'autre; 2) un stress léger lors de la manipulation pour les injections rétro-orbitales pendant lesquelles les animaux seront anesthésiés une seule fois pendant 5 minutes le temps d'injecter le virus (durée de l'injection = 30 secondes); 3) un stress modéré lors du test de l'alimentation supprimée par la nouveauté, impliquant une mise à jeun de 24h; 4) un stress modéré lors du test d’actimétrie impliquant un isolement prolongé de 48h; 5) un stress modéré pendant leur transport en Belgique; 6) un stress léger pour les expériences d'IRM pendant lesquelles les souris seront anesthésiées pendant 1h avec un anesthésique volatile.

Devenir

La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux en vue des études histologiques et biochimiques qui nous permettrons de comprendre les mécanismes des approches thérapeutiques évaluées dans ce projet.

Remplacement

Le projet traitant de réseaux neuronaux complets, il nous est impossible de remplacer le modèle animal vivant par des cultures cellulaires ou des simulations informatiques. Nos résultats in vitro nous ont déjà permis de valider les constructions virales et donc de réduire les nombre d'animaux testés in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’un test statistique d’estimation de la taille d’échantillon optimale grâce aux variances déterminées dans des études préliminaires de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. Nous prévoyons une analyse du comportement des animaux, suivi d’analyses post-mortem des cerveaux. Puisque nous avons observé que les résultats comportementaux pouvaient varier en fonction du sexe dans le modèle souris, tous les groupes seront composés de 50% d‘animaux mâles et 50% d’animaux femelles afin de pallier de potentielles disparités dans les résultats. Dans l’éventualité où aucune différence significative n’est observée entre mâles et femelles, les animaux des deux sexes seront regroupés au sein d’un même groupe de traitement afin d’augmenter la puissance des tests statistiques.

Raffinement

Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages équipées d’une litière stérile et des matériaux permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. Tous deux seront changés toutes les semaines. Les cages seront équipées d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, changés également toutes les semaines. Le transport des animaux sera effectué en cages occultées avec leurs nids et des croquettes mouillées dans la cage. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. Nous laisserons aux souris au moins une semaine d'acclimatation avant de commencer les expériences. Lors des injections de virus, les animaux seront anesthésiés une seule fois pendant 5 minutes le temps d'injecter le virus (durée de l'injection = 30 secondes). Dans la littérature, aucun signe de douleur lié directement à ce type d'injection n'a pu être observé. Bien que la procédure est peu invasive et très rapide (5 min), des points limites suffisamment précoces et adaptés ainsi que des critères d'arrêt des souffrances seront mis en place. Pour limiter leur stress lors du test d'alimentation supprimée par la nouveauté, la nourriture sera remise à volonté dans les cages dès que chaque animal aura terminé le test. Pour éviter que le test de mesure d'activité n’impacte le reste des expérimentations, il sera réalisé en dernier, avant le sacrifice des animaux. Durant toute la procédure d'imagerie IRM, les souris seront anesthésiées pendant 1h et leur température corporelle sera maintenue à 36.5°C. Les souris seront envoyées avec un transporteur agréé avec un délai de livraison de maximum 24h après leur enlèvement. L’état de santé des animaux sera surveillé régulièrement par des mesures de poids jusqu'a leur mise à mort. Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.

Choix des espèces

Compte tenu de la similarité de l'anatomie du cerveau avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de la maladie de Huntington. Les modèles souris choisis permettent de comprendre le rôle de la protéine responsable de cette maladie et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les maladies neurodégénératives se développent dans la majorité des cas à l’âge adulte chez l’Homme. Le but du projet est de tester 2 nouvelles approches thérapeutiques permettant de retarder la progression de la maladie, ou d’empêcher l’apparition des symptômes. Les animaux seront utilisés à l’âge de 10-12 mois car c’est à partir de 6-8 mois qu’ils commencent à développer des troubles moteurs et de mémoire observables en étude de comportement.

Un substitut osseux en poudre, développé pour être réhydraté par le chirurgien avec le liquide de son choix, va être testé sur 133 rats dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat subit une chirurgie du crâne d'au plus vingt minutes, pendant laquelle un ou deux trous sont percés dans les os pariétaux puis comblés avec le matériau. Les animaux sont gardés trois, sept ou huit semaines, avec un risque de douleurs postopératoires et de gêne au site d'implantation, avant d'être tués pour récupérer les échantillons. Présentée comme une démonstration d'efficacité, l'étude vise à moyen terme, selon le porteur, "la mise sur le marché d'un produit innovant".

Objectifs

Le traitement de la fragilisation osseuse liée au vieillissement, ainsi que des maladies et des traumatismes touchant le tissu osseux, est un enjeu sociétal majeur et nécessite dans la plupart des cas une intervention chirurgicale pour régénérer le tissu osseux lésé. Plusieurs procédés permettent de restituer l’intégrité osseuse mais l’utilisation d’os venant du patient lui-même reste le traitement de référence dans la majorité des cas (autogreffe). Les substituts osseux synthétiques sont développés et utilisés en clinique depuis plusieurs décennies. Leurs propriétés sont améliorées, tant au niveau de la facilité d’utilisation que de l’efficacité en terme de régénération osseuse. A l’heure actuelle, les solutions synthétiques proposées se limitent à des formes solides (granules ou blocs) ou à des « pâtes » prêtes à l’usage ou à hydrater à des ratios stricts. Nous avons récemment développé une formulation sous forme de poudre sèche composée de granules de calcium, constituants de l’os, et d’un polymère formant un gel une fois hydraté. Cette formulation permet au clinicien de réhydrater cette dernière par le liquide de son choix (sérum physiologique, sang, moelle osseuse mais également antibiotiques ou autres molécules). Ces réhydratations/mélanges sont possibles dans des quantités modulables afin d’obtenir une pâte dont les propriétés de manipulation sont supérieures à celles des produits présents sur le marché. Ces mélanges apportent des cellules du patient dans le matériau, visant ainsi à améliorer les propriétés de notre produit . L’objectif de ce travail est donc de démontrer l’efficacité de ce produit sous forme de poudre à réhydrater avec des ratios/solution de réhydratation sélectionnés suite à des essais préalables. Nous nous questionnerons aussi sur l’impact de l’espacement des granules dans la préparation ainsi que des propriétés de surfaces des biomatériaux sur la régénération osseuse.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de déterminer l’efficacité des granules contenus dans notre produit dans le cadre de la régénération osseuse. Nous étudierons leur répartition dans le défaut grâce à la présence d’un gel pour les maintenir à distance . Elle nous permettra aussi d’évaluer l’efficacité des différents produits présents sur le site opératoire en combinaison avec notre produit. Cette étude pourra nous apporter de nouvelles connaissances sur les phénomènes impliqués dans la régénération osseuse chez l’Homme lors de l’utilisation de cellules du patient combinées à un substitut. A moyen terme, la mise sur le marché d’un produit innovant est envisagée.

Procédures

Les rats seront chacun soumis à une unique procédure chirurgicale consistant à la réalisation et d’un ou deux défauts osseux (en calvaria). Ces défauts seront comblés avec nos substituts osseux afin d’observer les propriétés de régénération osseuse. Cette chirurgie n’excédera pas 20 minutes, durant lesquelles les animaux seront endormis. Suite à celle-ci les animaux seront surveillés et leur bien-être sera assuré jusqu’à leur euthanasie après 3, 7 ou 8 semaines.

Impact sur les animaux

Au vu des précédentes études menées au laboratoire avec les composants de notre matériau, peu de souffrances sont attendues lors des manipulations prévues grâce aux anti-douleurs injectés aux animaux. Il est possible que des douleurs post-opératoires adviennent, comme des difficultés de récupération suite à l’anesthésie, une gêne fonctionnelle ou des douleurs au site d’implantation. Pour éviter cela, les animaux seront médicamentés les jours suivants l’opération

Devenir

La mise à mort des animaux est nécessaire afin de récupérer et analyser les échantillons.

Remplacement

A l’heure actuelle, l’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des biomatériaux en terme de capacité à promouvoir la formation d’os. De plus, afin de développer des techniques et protocoles chirurgicaux chez le gros animal avant d’aller en clinique chez l’homme, la démonstration d’une preuve de concept sur le petit animal est nécessaire pour sélectionner la ou les meilleures formulations

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les composants présents dans le biomatériau utilisé ont été sélectionnés en amont et déjà testé s pour leur biocompatibilité et bioactivité in vitro. De même les mélanges sélectionnés pour cette étude ont été étudiés et choisi s préalablement pour leurs propriétés texturales. Pour la première procédure les défauts osseux seront réalisés sur chaque os pariétal qui compose la calvaria de rat, soit 2 défauts par animaux, réduisant de fait le nombre d’animaux tout en préservant la puissance statistique. Par ailleurs une approche statistique nous a aidé à calculer le nombre d’implants nécessaires à l’obtention de résultats significatifs afin de constituer des groupes avec un nombre d’animaux nécessaires et suffisants à l’obtention de résultats significatifs et à la valorisation des résultats de cette étude.

Raffinement

Afin de raffiner la méthodologie, les procédures de manipulation et de surveillance régulière sont élaborées avec l’objectif d’éliminer toute forme de souffrance animale. Les animaux seront anesthésiés et recevront une analgésie adaptée en prémédication et jusqu’à 48 heures après la chirurgie. La surveillance régulière des animaux permettra d’évaluer des points limites selon une grille d’évaluation détaillée . Selon les points limites identifiés, les animaux pourront recevoir une analgésie adaptée ou seront retirés de l’étude. Chaque étape de l’étude tiendra compte du bien-être de l’animal, de son arrivée dans l’animalerie spécialisée à son sacrifice en fin d’étude. Les animaux seront hébergés en groupe sociaux de 3 individus par cage avec enrichissement sous forme de frisottis et recevront une nourriture standard et de l’eau à volonté. Nous raffinerons les conditions d'hébergement des animaux par un enrichissement des milieux dans chaque cage. Les animaux seront observés de manière quotidienne par les animaliers de l’unité expérimentale pour s’assurer du bien-être des animaux.

Choix des espèces

Un des modèles les plus pertinents utilisés pour étudier la régénération osseuse est le défaut critique de calvaria chez le rongeur. Le modèle de régénération osseuse chez le rongeur est bien décrit dans la littérature. Le choix du rat permet de travailler sur des proportions convenables d’os à régénérer et les outils d’analyses chez animaux sont très développés : scanner du petit animal, outils de chirurgie adaptés. Les animaux inclus dans cette étude seront des rats d’environ 8 semaines au début de la procédure. Ceci permet d’avoir des animaux matures sans maladies associées au vieillissement tout en limitant les biais liés à la croissance de l’animal.

Réformées de l'élevage plutôt qu'élevées pour l'expérimentation, quatorze brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune passe trois heures sous anesthésie générale pendant que des chirurgiens entaillent cinq de ses disques intervertébraux lombaires et y posent trois types de biomatériaux à tester, avec radiographies et IRM du rachis. Quatre sont tuées au bout d'un mois, dix au bout de six mois après deux passages supplémentaires sous anesthésie pour l'imagerie, afin de prélever leurs soixante-dix disques lombaires pour analyse histologique et tests mécaniques. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternative à l'utilisation de l'animal" pour cette évaluation préclinique, une étude préliminaire sur des disques prélevés après la mort ayant déjà confirmé la faisabilité de la pose de l'implant.

Objectifs

La lombalgie est un problème de santé publique majeur, ayant des conséquences socio-professionnelles et économiques considérables. Il est estimé qu’environ 80 à 90% de la population mondiale souffrira de lombalgie à un moment donné au cours de la vie. Entre 8 et 20% des lombalgies chroniques sont associées à une hernie discale (HD), survenant lorsque le disque intervertébral (DIV) ne joue plus son rôle essentiel d’amortisseur dans la biomécanique de la colonne vertébrale. En effet, le DIV est composé de deux tissus, le noyau pulpeux NP en son centre, et l’anneau fibreux (AF) en périphérie. Avec le temps, des microfissures et des déchirures de l’AF peuvent amener le NP à faire saillie dans le canal rachidien : il s’agit d’une hernie discale, ayant pour conséquence une compression de la moelle épinière et/ou de racines nerveuses à l’origine de douleurs d’intensité variable. Lorsque les traitements antalgiques ne suffisent pas pour garantir le confort du patient, il est possible de pratiquer une intervention chirurgicale afin de retirer la partie herniée du NP exerçant une compression sur les structures nerveuses adjacentes. Toutefois, les lésions de l’AF persistent : le risque de récidive de HD est élevé et le DIV entre dans un processus dégénératif accéléré pouvant rapidement conduire à la perte totale de ses compétences biomécaniques. Dans ce projet, nous proposons d’évaluer une nouvelle stratégie de médecine réparatrice reposant sur la réparation de la déchirure de l’AF par comblement à l’aide d’un biomatériau électro-tissé. Ce biomatériau présente une structure fibreuse mimant celle de l’AF et servira de tuteur à sa colonisation cellulaire et sa réparation. Avant de pouvoir envisager des études cliniques chez l’Homme, nous souhaitons évaluer son efficacité à moyen terme dans un modèle ovin de réparation discale à l’aide de radiographies, d’imageries par résonance magnétique (IRM), d’analyses histologiques et d’une évaluation biomécanique des DIV ainsi réparés. 14 brebis seront utilisées afin d’évaluer 3 types d’implants différents en deux temps : une première phase d’une durée de 1 mois concernant 4 animaux et une seconde phase d’une durée de 6 mois concernant 10 animaux.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à développer une nouvelle approche de médecine régénératrice pour traiter les patients atteints de hernie discale. L'objectif n'est pas seulement de combler le défaut de l'anneau fibreux (AF) et d'atténuer la douleur, mais aussi de stimuler la réparation de l'AF, restaurant ainsi le disque intervertébral (DIV) dans son état fonctionnel. À court terme (première phase de 1 mois), ce projet vise à évaluer la sécurité, la stabilité et les premiers signes de réparation de l’AF après mise en place des implants dans la déchirure de l’AF (3 types d’implants différents seront utilisés). À moyen terme (deuxième phase de 6 mois), il vise à évaluer l’efficacité de ces mêmes implants dans un modèle ovin de lésion de l’AF. Enfin, à long terme, nous espérons mettre en place une étude clinique chez l'Homme, en nous appuyant sur les résultats prometteurs obtenus dans notre étude animale préclinique. Cette étape ouvrirait la voie à un nouveau paradigme thérapeutique pour le traitement de la hernie discale.

Procédures

4 brebis seront manipulées 3 fois sur une période de 1 mois (une fois pour le prélèvement sanguin, une fois pour la chirurgie et une fois pour l‘euthanasie) et 10 brebis seront manipulées à 5 reprises sur une période de 6 mois (une fois pour les prélèvements sanguins, une fois pour la chirurgie, deux fois pour l’imagerie seule et une fois pour l’euthanasie). L’ensemble des procédures à l’exception de la prise de sang sera réalisé sous anesthésie générale : - à J-1 (n=14, animaux vigiles, durée de la manipulation = 2 minutes) : prise de sang, - à J0 (n=14, durée de l’anesthésie = 3h) : radiographies et IRM du rachis lombaire, randomisation des DIV lombaires (5 conditions expérimentales), réalisation des défauts de l’AF dans les DIV concernés et mise en place des 3 différents biomatériaux évalués, - à 1 et 3 mois (n=10, durée de l’anesthésie = 1h) : radiographies et IRM du rachis lombaire, - à 1 (n=4) ou 6 (n=10) mois : euthanasie des animaux, radiographies et IRM du rachis lombaire (les DIV étant des tissus non vascularisés, leur aspect à l’IRM reste inchangé pendant plusieurs heures après la survenue de la mort), prélèvement de la totalité des DIV du rachis lombaire. Par ailleurs, les animaux seront soumis à un examen clinique quotidien pendant toute la durée de l’expérimentation, sur leur site d’hébergement (pas de déplacement prévu pour les animaux). L’examen clinique se fait dans un premier temps à distance (temps mis à profit pour que les animaux s’habituent à la présence humaine) puis de manière rapprochée et individuelle (quelques minutes par animal, sans douleur).

Impact sur les animaux

La chirurgie, réalisée sous anesthésie générale, entraîne un risque réduit de douleur ou de lésion neurologique. La technique chirurgicale choisie est peu invasive, supprimant la manipulation des muscles ou des nerfs dorsaux. Le risque de douleur postopératoire ou de lésion nerveuse est ainsi significativement réduit. La procédure sera réalisée par des chirurgiens du rachis expérimentés dans ce type d'intervention sur ce modèle animal. Des douleurs modérées et transitoires peuvent être ressenties par les animaux dans les jours suivant l'opération, et l’administration d’anti-douleur est prévue si nécessaire. Le risque infectieux associé à cette chirurgie est très faible car elle sera réalisée en salle d'opération dans des conditions stériles et dans un temps réduit. L'implant utilisé sera stérile. Pour minimiser le stress sur les animaux, tous les examens d'imagerie médicale programmés pendant la période de suivi de 6 mois seront réalisés sous anesthésie générale. Les animaux seront sédatés dans leur enclos et puis transportés vers les salles d'imagerie seulement après que la sédation a pris effet.

Devenir

L’euthanasie des brebis aura lieu à la fin du premier mois (n=4) ou du sixième mois (n=10), c’est-à-dire à la fin de la procédure. Cette euthanasie est indispensable afin de pouvoir réaliser les analyses histologiques et immunohistochimiques ainsi que les tests mécaniques sur l’ensemble des DIV lombaires des brebis concernées par l’expérimentation (70 DIV au total). Ces résultats permettront de caractériser la tolérance des biomatériaux par le DIV ovin, tant au niveau de ses propriété biomécaniques qu’au niveau cellulaire et moléculaire (informations non disponibles par d’autres techniques, notamment d’imagerie médicale).

Remplacement

Ce projet correspond à une étude préclinique d’évaluation de l’innocuité et de l’efficacité d’un nouveau dispositif médical in vivo, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de l’animal. Toutefois, nous avons choisi de faire appel à des animaux de production réformés plutôt qu’à des animaux élevés spécifiquement pour l’expérimentation animale. Une étude préliminaire réalisée sur des DIV isolés (DIV prélevés sur des animaux après leur mort) a d’ores et déjà confirmé la faisabilité de l’installation d’un implant. Une phase d’étude chez l’animal vivant est incontournable pour vérifier que l’implant est correctement colonisé par des cellules à long terme.

Réduction

Une étude statistique préliminaire nous a permis de calculer le nombre de DIV lombaires à inclure dans notre étude : 70 DIV au total. L’animal étant son propre témoin (5 DIV lombaires par animal répartis au hasard parmi les 5 conditions expérimentales), nous réduisons le nombre total d’animaux utilisés à 14 (5x14=70) tout en garantissant la validité des analyses statistiques qui seront réalisées après obtention des résultats. De plus, la réduction du nombre d’animaux est également assurée par la mise en place de procédures raffinées (anesthésie, suivi et soin des animaux, prise en charge de la douleur, alimentation et enrichissement) limitant les pertes animales et l’atteinte de points critiques en cours de protocole. La méthode de suivi choisie (par imagerie médicale et ne faisant appel qu’à une euthanasie terminale) limite également le nombre d’animaux utilisés (par comparaison avec des procédures où des animaux seraient euthanasiés à chaque temps de suivi). Enfin, la première phase de la procédure décrite dans ce projet, concernant 4 animaux, sera réalisée dans un premier temps : les résultats obtenus seront analysés et la seconde phase, concernant 10 animaux, ne sera effectuée que s’ils sont favorables aux dispositifs médicaux étudiés. Nous réduisons ainsi le nombre total d’individus utilisés à 14 (4 animaux à 1 mois et 10 à 6 mois).

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les animaux sont stabulés en groupe (espèce grégaire) dans des conditions similaires à leur hébergement en élevage. Ils ont accès librement et à volonté au foin et à l’eau. L’alimentation est complétée par des granulés et par des pierres à lécher (apport en minéraux). Les animaux bénéficient d’un suivi individuel quotidien pendant toute la durée de l’expérimentation : examen clinique et évaluation de la douleur/inconfort selon une grille adaptée à l’espèce ovine (intégration dans le troupeau, comportement à l’approche de l’opérateur, appétit et rumination, vigilance, posture - debout, couchée-, port de tête à l’arrêt et en déplacement, aspect et posture au niveau du dos et des membres pelviens, confort global). Procédure expérimentale : L’ensemble des manipulations est réalisé sous anesthésie générale afin de limiter le stress des animaux. La technique chirurgicale choisie pour ce protocole limite le risque de lésion nerveuse et de douleur chirurgicale par comparaison à d’autres (absence d’ouverture de la cavité abdominale, absence d’exposition de la moelle épinière ou des racines nerveuses). La chirurgie est effectuée par un chirurgien expérimenté qui maitrise les gestes, ce qui permet de réduire le temps d’intervention et le risque infectieux. Par ailleurs, les implants utilisés sont stériles et l’intervention est réalisée dans un bloc chirurgical en conditions stériles. La gestion de la douleur pendant et après la chirurgie est assurée par un vétérinaire qualifié qui suit les règles en vigueur afin d’assurer un confort optimal pour l’animal. Des anti-douleurs seront administrés pendant la chirurgie ainsi que les 5 jours suivants. Un examen clinique sera fait quotidiennement par un vétérinaire pour déceler toute complication post-opératoire.

Choix des espèces

L’espèce ovine est un modèle animal de défaut de l’AF couramment utilisé. Les similitudes avec l’Homme concernent la biomécanique du disque, la physiopathologie de la dégénérescence du DIV et de la hernie discale, les anomalies détectées à l’IRM au niveau des DIV atteints et l’évolution clinique. Ainsi, la brebis est un modèle classiquement utilisé en médecine régénératrice du DIV. Par ailleurs, la taille des animaux facilite la réalisation des techniques chirurgicales (taille relativement proche de celle de l’Homme) et leur hébergement en stabulation est aisé (contrairement aux porcs par exemple). Nous avons choisi d’utiliser des brebis adultes (maturité squelettique) âgées de 1 à 3 ans chez lesquelles il est peu probable que des lésions de dégénérescence discale soient déjà présentes (contrairement à des brebis plus âgées).