Recherche appliquée

60 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chirurgie stéréotaxique de deux à quatre heures pour implanter des électrodes dans le cerveau ou y injecter des vecteurs viraux, jusqu'à dix prélèvements sanguins en quarante-huit heures, ponctions de liquide céphalorachidien, imagerie de trois heures sous anesthésie, séances quotidiennes d'une à deux heures en chaise de contention, et injections d'harmaline pour provoquer des troubles moteurs. Ce travail relève d'une "activité pré-clinique de service" menée pour des clients qui font tester électrodes et molécules avant un passage éventuel chez l'humain. Le porteur justifie le recours au macaque en écrivant que "l'éthique spéciste actuelle interdit l'utilisation d'approches neurobiologiques invasives chez l'homme", et retient cette espèce pour sa proximité anatomique avec l'espèce humaine.

Objectifs

La stimulation cérébrale profonde (DBS) est une procédure neurochirurgicale pratiquée chez les personnes souffrant de troubles du mouvement notamment dans la maladie de Parkinson (MP). La stimulation interfère avec les signaux pathologiques dans le cerveau pour restaurer les fonctions motrices normales. Cette thérapie a été reconnue comme sûre et efficace pour l'amélioration des symptômes chez les patients atteints de MP tel que les tremblements, rigidité ou autres fluctuations motrices. Cette méthodologie a été une évolution technique majeure pour le traitement de la MP et l’intervention chirurgicale est maintenant explorée également pour d'autres conditions, comme l'épilepsie et la dépression. Ceci explique le développement permanent de nouvelles sondes DBS capables d'enregistrer l'activité cérébrale dans les structures cibles afin de contribuer au développement de nouvelles thérapies chez les patients atteints d’autres affections neurologiques. D’un autre côté, de nouvelles stratégies innovantes basées sur la thérapie génique pourraient également bénéficier aux patients atteints de ces affections. Cette approche utilise des virus modifiés ; ils ont perdu leur pouvoir de se multiplier mais peuvent apporter dans des cellules ou des organes malades, un gène réparé, ou des molécules qui soignent. On parle alors de vecteurs viraux ou non viraux (peptides, anticorps...) ou plus génériquement d’inocula. Pour le cerveau, la voie la plus efficace d’administration de ces vecteurs tout comme la DBS reste l’approche chirurgicale par stéréotaxie. Si la validation de nouvelles sondes DBS passent par des enregistrements des signaux, la mesure des effets des inocula se fait par des analyses biochimiques sur des prélèvements biologiques puis cellulaires après mise à mort. Les études précliniques nécessitent de valider ces outils (sondes pour la DBS ou inocula) chez le primate non humain (PNH). Le projet a donc pour objectif de valider d’une part de nouveaux vecteurs qu’ils soient porteurs d’une molécule «contrôle» ou de protéines d’intérêt à visée thérapeutique et d’autre part de nouvelles sondes DBS chez le PNH.

Bénéfices attendus

Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament ou d’un nouveau dispositif médical (électrode), indispensable avant les essais chez l’homme. Le développement de nouvelles électrodes sur les animaux visant à améliorer l’impact de la DBS dans les troubles neurologiques sont fondamentaux pour confirmer que les prototypes atteignent les niveaux de sécurité, d’efficacité et d’ergonomie attendus et pourrait permettre à terme de maximiser le temps du patient "en thérapie". Ce projet est mené obligatoirement sur l’animal. En effet, il n’est pas envisageable d’implanter un nouveau dispositif médical ou d’administrer un nouveau composé à l’homme - sain ou malade - compte tenu des risques non connus susceptibles d’apparaître. A terme, nous souhaitons démontrer l’efficacité et la tolérance d’outils de thérapie génique chez un modèle de grand animal, pour demander par la suite une autorisation d’essai clinique chez des patients atteints de formes génétiques (en particulier) des maladies neurodégénératives.

Procédures

Les animaux sont soumis aux différentes étapes décrites dans la procédure. - Prélèvements sanguins sur animal anesthésié ou vigile (10 min), fréquence max en 24/48 h = 10 prélèvements et volume max sur une semaine entre 5 à 7 ml/kg / semaine - Prélèvements LCR, sur animal anesthésié, 1 ml max sur un mois (10 min) - Imagerie (3 heures) sur animal anesthésié (2 à 3 max. selon la durée du suivi longitudinal) - Chirurgie stéréotaxique sous anesthésie pour l'implantation, l'enregistrement ou la stimulation d'électrodes intracérébrale ou l'administration d'inoculum sous imagerie par rayons X (durée 2-4 heures). - - Traitement prophylaxique par gavage (fréquence variable, max 2 fois par jour) sur animal vigile pour une durée entre une semaine et 10 jours. Ceci afin de conserver un score inférieur à 5 sur l’«Échelle d'évaluation du bien-être PNH». - Tache en chaise avec enregistrements électrophysiologiques et/ou stimulation (séances quotidiennes de 1-2h, sur jour ouvré pendant toute la durée du projet) sur animal vigile en absence ou en présence de fluctuations motrices (induites par l’harmaline, max 1 fois par semaine).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées aux différentes étapes. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible, infection au niveau des points de sutures. Pour l’aspect comportemental : stress et inconfort dus à la captivité et au conditionnement à une tache comportementale, administration systémique d’harmaline entrainant les fluctuations motrices. Pour les prélèvements (sang, LCR) : stress de la contention et de l’anesthésie, hématome, douleur possible. Pour l’imagerie : réaction imprévue à l’administration de produit de contraste, inconfort liée à l’anesthésie durant le transport. Bien que les vecteurs viraux soient réputés pour leur faible toxicité, une surveillance des paramètres biologiques et comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de les détecter. Une échelle d’évaluation du bien-être décrite en annexe 1 est applicable pour ces points limites.

Devenir

L'ensemble des animaux à la fin du projet seront euthanasiés afin de réaliser des analyses ex-vivo. Des organes pourront également être proposés à d'autres équipes de recherche.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité pré-clinique de service. Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du PNH, vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique « spéciste » actuelle interdit l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs); 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux; 3) Enfin, dans le cadre des modèles de maladies neurodégénératives, l’objectif à terme (bien que non décrit dans le présent projet) est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (moteur, cognitif) de ces affections qui en tant que telles ne peuvent être étudiées sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale, de répertoire comportemental etc.) pour étudier les manifestations comportementales et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Enfin, dans les tests pré-cliniques que nous abordons et dont le but est de se poursuivre chez l’homme, le recours exclusif au rongeur ne peut être satisfaisant. Dans bien des cas par exemple les immunothérapies testées ne peuvent interagir qu’avec des tissus provenant de PNH, ce qui impose souvent l’utilisation du modèle primate.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques ou le développement de nouveaux dispositifs médicaux (ici électrodes de stimulation/enregistrement) avec un nombre estimé de 3 études par an, comprenant 4 animaux maximum par étude, soit un total de 60 animaux maximum sur 5 ans. Bien qu’un nombre de 4 animaux soit faible pour avoir une puissance statistique élevée, il est suffisant pour effectuer des tests statistiques de comparaison. Il est également important de noter que les études de neurophysiologie ou de développement de neurotechnologies sur «gros animal» se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Les inocula auront été testés préalablement in vitro ou chez le petit animal (rongeur) par nos clients pour déterminer les doses à utiliser et s’affranchir d’éventuels effets toxiques nécessitant un apport supplémentaire d’animaux. Dans le cadre d’une étude de validation de dispositif médical (électrode), la chirurgie implantatoire peut ne concerner qu’un seul hémisphère cérébral, l’autre hémisphère pouvant être utilisée comme contrôle. Ce qui permet de réduire le nombre d’animaux de moitié. Enfin des males comme des femelles pourront indépendamment être utilisés dans nos projets.

Raffinement

Pendant la procédure, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Ceux-ci nous permettent d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des antiarythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Un défibrillateur est toujours disponible en salle d’opération pour éviter la mort précoce de l’animal durant les tests. Pendant l’hébergement, l’animal est placé dans des locaux adaptés, avec les méthodes de raffinement appropriées pour son espèce (groupe social, enrichissement adapté). Pour le transport à la plateforme d’imagerie située à 200 m de l’animalerie, une cage dédiée placée sur un chariot protégée des regards extérieurs par une housse est préparée. et l’animal sous sédation légère et dont les constantes sont toujours contrôlées, est maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillote. Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’ensemble de ces informations sont reportés dans des fiches de suivi adapté. Cette surveillance permet une intervention rapide auprès du vétérinaire et du responsable de projet pour adapter les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole chronique affecte l’état de santé au point d’atteindre l’un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités éthiques. Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adaptés au poids de l’animal, et sont réalisé sur animaux sédatés. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme le PNH a été retenu car (i) les modèles sont bien décrits et caractérisés et constituent donc une référence dans la communauté scientifique ; (ii) le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles animaux. De plus, l'anatomie cérébrale du PNH est proche de celle de l’homme en terme de taille. Il existe de plus une forte homologie entre les structures cérébrales du porc et celles de l’homme (basées sur des atlas) ce qui est indispensable dans le cadre de l'étude de la faisabilité de la procédure Enfin, ce passage par le PNH avant la clinique relève d’un principe éthique visant à protéger démontrant la faisabilité de l’approche thérapeutique de l’espèce la plus proche de l’homme. Adultes afin que de pouvoir appréhender un système nerveux central en pleine maturité (2 ans minimum). Au stade défini, la taille et les caractéristiques du cerveau des animaux sont proches de celle de l’homme ce qui permet une évaluation fiable des cibles pour la chirurgie.

Pour mettre au point des traceurs d'imagerie de la fibrose pulmonaire et tester des traitements, 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La fibrose est induite à la bléomycine, suivie d'injections de traceurs radioactifs, de jusqu'à cinq séances d'imagerie de quarante minutes sous anesthésie, d'un gavage quotidien de J8 à J28 ou d'injections intrapéritonéales quotidiennes, puis d'une ponction dans le cœur. Pendant la phase d'inflammation, les souris peuvent perdre du poids, se déshydrater, respirer difficilement et rester prostrées, sans analgésie, le porteur indiquant que les antidouleurs interféreraient avec le développement de la fibrose. Le nombre de souris par groupe a été fixé d'après l'expérience de l'équipe, le porteur précisant qu'aucune approche statistique n'a été utilisée.

Objectifs

Ce projet porte sur l’étude de la fibrose pulmonaire qui se caractérise par une modification de la structure du tissu pulmonaire qui devient plus rigide. Elle résulte de l’accumulation excessive de protéines comme le collagène et mène à des défauts de fonctionnement des poumons. Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode permettant un diagnostic précoce et le suivi de la progression de la maladie. Peu de traitements sont disponibles car les mécanismes menant à la fibrose sont peu connus. Ces traitements permettent uniquement de ralentir la progression de la maladie mais ne permettent pas de la stopper. De plus, il n’existe, à l’heure actuelle, aucun moyen de suivre l’efficacité de ces thérapies chez les patients. Ce projet est donc construit avec un triple objectif: 1/ Mettre en place de nouveaux traceurs d’imagerie pour le diagnostic précoce et le suivi de la progression non-invasif de la fibrose pulmonaire, 2/ évaluer l’action de ces traceurs pour le suivi de l’efficacité de traitements anti-fibrose et enfin 3/ évaluer les effets de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

La découverte de biomarqueurs pour la FPI en est encore à ses débuts et il n'existe pas de consensus dans ce domaine, en particulier pour l'imagerie moléculaire. L'imagerie actuelle de la FPI repose uniquement sur le scanner haute résolution et n'a que peu d'impact sur le diagnostic précoce et la survie. En outre, l'efficacité des thérapies actuellement approuvées pour la FPI dans l'ensemble de la population atteinte de FPI reste incertaine et les outils permettant de contrôler l'efficacité des thérapies font cruellement défaut. Ce projet permettra donc de développer et d’évaluer des traceurs d’imagerie qui pourraient être des biomarqueurs d'imagerie pour la FPI. Un nombre important de patients atteints de FPI doivent subir une biopsie pulmonaire pour obtenir un diagnostic définitif. Cependant, l'hétérogénéité spatiale des lésions fibrotiques dans le poumon de la FPI rend difficile l'échantillonnage précis de la zone pulmonaire malade afin d'obtenir une décision de diagnostic fiable. Le développement de sondes radiomarquées spécifiques des zones pulmonaires affectées par la FPI, telles que les sondes développées dans notre projet, pourrait aider les cliniciens à prendre des décisions thérapeutiques. En outre, ce projet fournira des outils innovants pour la détection de voies biologiques spécifiques impliquées dans la fibrose pulmonaire. Dans ce contexte, les sondes développées dans le cadre de ce projet constitueront une première étape dans le développement de thérapies personnalisées pour les patients atteints de FPI, ce qui n'est pas le cas actuellement, en identifiant les répondeurs potentiels ou les non-répondeurs aux thérapies évaluées dans ce projet. Notre projet ambitieux favorisera donc le développement de thérapies ciblées qui sont inexistantes pour le traitement de la FPI.

Procédures

Intervention subies par les animaux : - Injection de traceur radioactifs par voie IV sous anesthésie (100µl, 2 minutes, 1 à 4 injection par animal) - Prélèvement sanguins sous anesthésie (2 minutes, 4 par animal, n=30 (procédure 1 seulement)) - Imagerie in vivo sous anesthésie (40 minutes maximum, 1 à 5 imagerie par animal) - Traitement par gavage sur souris vigile (procédure 3 uniquement, 200µl, gavage quotidien de J8 à J28, 1 minute) - Traitement par injection IP sur souris vigile (procédure 4 uniquement, 100µl, quotidien de J8 à J28, 1 minute) - Prélèvement de sang terminal sans réveil par ponction intracardiaque sans thoracotomie sur animal anesthésié (1 minutes).

Impact sur les animaux

Durant la phase d’inflammation de J0 à J7 les animaux peuvent subir une perte de poids importante et présenter des signes cliniques caractéristiques tels que la déshydratation, l’augmentation de la fréquence respiratoire (associé à une difficulté respiratoire) et un comportement de prostration et d’isolement. Toute observation anormale sera répertoriée et suivie de mesures.

Devenir

A l’issue de chaque procédure la totalité des animaux seront mis à mort afin de mesurer et quantifier la fibrose pulmonaire par des méthodes ex vivo classiques (histologie, dosage de protéine) et les comparer avec nos techniques d’imagerie in vivo.

Remplacement

L’étude de la fibrose pulmonaire ainsi que l’effet d’un traitement sur celles-ci ne peut se passer d’une étude chez l’animal. En effet, les modèles cellulaires ne reflètent pas l’environnement complexe et pluricellulaire présent physiologiquement, ni la fonction pulmonaire (rigidité, stress mécanique dû à la respiration…) dans son ensemble. Néanmoins, les molécules qui seront évaluées dans ce projet auront été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Puisqu’il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent, la seule alternative reste l’utilisation d’animaux.

Réduction

Dans le cadre de cette étude, les traceurs/composés seront évalués à l'aide de techniques d'imagerie préclinique in vivo couplées à des techniques de comptage de la radioactivité ex vivo. Ces techniques étant particulièrement sensibles et spécifiques, seuls de faibles effectifs sont nécessaires pour obtenir des données fiables et précises tout en réduisant le nombre d’animaux au maximum. De plus l’imagerie in vivo permet d’évaluer les traceurs/composés à plusieurs stades de fibrose sur les mêmes animaux limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminée suivant notre experience de ce type de manipulation et aucune approche statistique n'a été utilisée. De plus, le nombre d’animaux utilisé pourra être revu à la baisse pour certaines procédures en fonction des résultats obtenus lors des procédures précédentes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages, en groupe (10 maximum par cage), suivant un cycle jour/nuit inversé avec accès illimité à l’eau et la nourriture. Les litières des cages seront supplémentées par un enrichissement de type « SIZZLE PAD ». Les gestes de ce projet (injection, imagerie, mise à mort) se dérouleront tous sous anesthésie et sur lit chauffant réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les animaux recevant de la bléomycine seront observés une fois par jour pendant la phase aigüe d’inflammation (de J0 à J7) puis trois fois par semaine de J8 à J28 pendant la phase de progression de la fibrose. Le développement de la fibrose reposant sur l'induction d'une phase d'inflammation, il n'est pas possible d'utiliser des analgésiques qui pourraient interfèrer avec le bon développement de la fibrose. En dehors des effets induits par le modèle, aucun effet indésirable n’est attendu mais des points limites adaptés ont été définis. Toute observation d’un signe de souffrance excédent les points limites sera suivie de l’arrêt immédiat du protocole et de la mise à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les modèles de choix pour l’étude de la fibrose pulmonaire. La souris est l’espèce la plus utilisée et la plus connue notamment pour le modèle à la bléomycine, permettant ainsi une extrapolation à l’homme et une comparaison à de résultats antérieurs. Les souris débuteront les études à un âge de 8 semaines, déterminé en fonction de résultats déjà publiés. Cet âge correspondant à un stade de développement adulte de l’animal.

Une partie des souris utilisées est immunodéficiente et porte une greffe de peau humaine, le méningocoque n'interagissant qu'avec des vaisseaux humains. 1 145 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffe de peau de quarante-cinq minutes sous anesthésie générale, infection par injection intraveineuse, injections intrapéritonéales d'anticorps et d'inhibiteurs, jusqu'à cinq ponctions veineuses : le porteur indique que l'infection peut provoquer une baisse d'activité, une perte de poids et une hypothermie, des points limites devant permettre de tuer les souris avant que l'infection ne le fasse. Le sang est ensuite prélevé par ponction dans le cœur sous anesthésie, l'analyse des vaisseaux et des organes exigeant leur mort à toutes.

Objectifs

La méningite et le purpura fulminans sont des infections bactériennes foudroyantes et sévères qui touchent principalement les enfants et les jeunes adultes. La mortalité approche 100% en l'absence de prise en charge médicale. En France, malgré une prise en charge adaptée, le taux de mortalité reste élevé : 3%pour les cas de méningite et 30% pour les cas de purpura fulminans qui se traduit par des plaques hémorragiques cutanées et un choc septique foudroyant. De plus, lorsque l’évolution n’est pas fatale, les séquelles sont fréquentes, graves et handicapent leur vie durant les jeunes patients atteints : amputations, troubles de la vision, perte partielle ou totale de l’audition, déficience mentale permanente, difficultés d’apprentissage, mémorielles, dépression nerveuse… Le purpura fulminans est un syndrome infectieux très sévère, qui associe une septicémie à des lésions tissulaires nécrotiques disséminées sur la peau et les organes internes. Ces infections sont complexes et impliquent plusieurs organes et systèmes physiologiques à l’échelle de l’organisme. Une étape essentielle de ces infections sévéres est l'infection des vaisseaux sanguins. La bactérie responsable de ces infections n’interagit qu’avec les vaisseaux sanguins humains, nous utiliserons donc une lignée de souris gréffées avec de la peau humaine (modèle mimant le purpura fulminans). Différents variants bactériens seront utilisés afin de déterminer l’importance de différents facteurs de virulence. Nous analyserons le rôle des cellules du système immunitaire dans ces infections. Nous chercherons également à valider in vivo les effets d’agents pharmacologiques préalablement validés in vitro .

Bénéfices attendus

Les résultats attendus sont importants, car mieux comprendre les mécanismes de la méningite cérébro-spinale et du purpura fulminans, pourra conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cela permettra à terme de diminuer voire supprimer la mortalité et les séquelles dramatiques de ces infections sévères et fulgurantes.

Procédures

Ce projet comporte 5 types d'intervention : - 1 Greffe de peau humaine, durée : 45 min. sous anesthésie générale - 2 : Infections expérimentales à méningocoque par injection intraveineuse, durée de 4h pour les souris NOD/SCID gréffées et 72h pour les souris Balb/c. une infection par animal - 3: Injection d’anticorps et d'inhibiteurs par voie intra-péritonéale (moins de 5 min) (deux injections par animal, 24 et 48h avant l'infection). Injection d’agents pharmacologiques en association ou non avec un antibiotique (moins de 5 min) (une injection par animal). - 4 : Mesure de la bactériémie chez les souris par ponction veineuse (moins de 5min). (une mesure pour les souris NOD/SCID; 5 pour les souris Balb/c)- 5 : Prélèvement de sang par ponction intracardiaque sur des souris anesthésiées avant leur mise à mort 3 min.

Impact sur les animaux

La greffe peut provoquer un stress lié à l’anesthésie. La greffe peut produire une inflammation ou une infection. L’infection peut provoquer un stress chez les souris se traduisant par une diminution de leur activité, une perte de poids ainsi qu’une potentielle hypothermie, la définition des points limites permet de mettre à mort les animaux avant la léthalité due à l'infection. L’injection d’agents pharmacologique peut produire un stress. La mesure de la bactériemie peut produire du stress lié à la manipulation et la contention.

Devenir

L'analyse de l'impact de l'infection et des traitements sur l'intégrité vasculaire et l'analyse de différents organes, nécessite la mise à mort de tous les animaux.

Remplacement

Ces infections sont complexes et impliquent plusieurs organes et systèmes physiologiques à l’échelle de l’organisme (cellules endothéliales, circulation sanguine, coagulation, système immunitaire…), c’est pourquoi notre étude nécessite le recours à un modèle animal. Il est impossible de mener une telle étude sur les modèles in vitro existants.

Réduction

Nous utiliserons pour chaque expérience le nombre minimal d'animaux permettant d'observer une différence significative en se basant sur des données publiées. Pour les comparaisons statistiques entre les groupes de souris, nous utiliserons un test adapté aux petits effectifs in vivo. Afin de réduire le nombre d’animaux dans l’étude, nous avons développé des expériences permettant l'analyse de plusieurs paramètres sur un même animal, comme par exemple les analyses sanguines et les analyses sur les greffons de peau.

Raffinement

Pour réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des souris au cours de notre étude, de l’enrichissement sera ajouté dans chaque cage d’hébergement (coton et maison en carton) afin de limiter le stress des animaux. De plus, nous réaliserons les greffes sous anesthésie générale et des analgésiques seront utilisés en période péri- et postopératoire. L’analgésie per et post-opératoire sera réalisée par injection sous-cutanée d’un antalgique 30 min. avant la chirurgie et dans les deux jours suivants. Des points limites ont été définis et leur atteinte entraînera la mise à mort anticipée de l’animal.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle d'infection à méningocoque largement décrit dans la littérature. Il permet d'obtenir une bactériémie reproductible et prolongée après infection par voie intraveineuse. Ce modèle sera utilisé pour analyser les effets de différents variants bactériens et agents pharmacologiques sur l’initiation et la progression des lésions tissulaires. Souris femelles adultes âgés de 7 à 10 semaines car il est nécessaire que ces souris présentent une surface corporelle suffisante pour greffer des fragments de peau.

Les rats reçoivent dans la vessie une instillation d'isothiocyanate d'allyle, principal composé de l'huile de moutarde, qui y provoque une inflammation sur laquelle l'établissement teste les candidats médicaments de ses clients. 1 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'instillation dure une trentaine de minutes sous anesthésie, la sensibilité abdominale est mesurée en appliquant des filaments de Von Frey pendant deux à trois minutes, et les animaux reçoivent des administrations quotidiennes de molécules dont le porteur écrit ne connaître "ni la nature ni les effets secondaires possibles". L'effectif ne repose sur aucun calcul statistique, le porteur invoquant son expérience pour fixer dix animaux par groupe et annoncer cinq études par an, soit 1 500 rats sur cinq ans.

Objectifs

L'inflammation joue un rôle important dans la plupart des pathologies de la vessie et représente une réaction de défense à une lésion physique, des substances chimiques, des micro-organismes ou d'autres agents pathogènes. Cette inflammation entraîne notamment une augmentation de la perméabilité vasculaire vésicale. Le projet proposé permettra d’évaluer l’effet de candidats médicaments sur l’œdème vésical et la douleur associée à l’inflammation. Dans la littérature, il est décrit que l’instillation intravésicale d’huile de moutarde ou de son principal constituant, l'isothiocyanate d'allyle (AITC) provoque une forte réaction inflammatoire dans les tissus de la vessie, entraînant une extravasation.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces que les molécules utilisées actuellement pour traiter les pathologies vésicales.

Procédures

Tous les animaux vont recevoir des administrations de candidats médicaments (voie, fréquence dépendant de chaque protocole expérimental mais des administrations quotidiennes per os, intrapéritonéales, sous-cutanées ou intraveineuses seront classiquement les plus utilisées). Cependant, ces gestes étant réalisé par du personnel qualifié et avec de l’expérience, ces gestes seront très rapides (1 min). Les animaux seront anesthésiés et recevront une instillation vésicale de produit irritant la vessie. Lors de cette procédure, les animaux seront placés sur des plaques chauffantes thermorégulées (classiquement instillation de 30 min). Les animaux seront placés dans un set-up de Von Frey et des filaments de différentes forces seront appliqués sur l’abdomen (au niveau de la vessie). Cette méthode est non invasive et est très rapide (environ 2-3 min par animal). Les animaux seront anesthésiés avec un anesthésique sans réveil car l’anesthésique utilisé est le seul qui n’a pas d’effet sur la contrcation de la vessie et auront des administrations de composés et des prélèvements sanguins (gestes très rapides 1-2 min).

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). De plus, ce modèle crée une inflammation vésicale donc les animaux pourront avoir les mêmes symptômes que chez l’Homme (sensation de « brûlure » lors des mictions, œdème vésical, gène pour uriner, mictions fréquentes…).

Devenir

L’anesthésique utilisé étant un anesthésique irréversible (l’animal ne peut pas se réveiller) tous les animaux de l’expérience sont mis à mort à la fin et des prélèvements de sang et des tissus seront réalisés.

Remplacement

Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peut mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience en expérimentation animale, les publications scientifiques publiées, un nombre minimum e 10 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence entre les groupes expérimentaux. Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Nous pensons réaliser 5 études par an avec un total de 1500 animaux pour 5 ans.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. De plus un enrichissement (type tunnel et aspen brick) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Toutes les procédures nécessitant une anesthésie des animaux se feront en utilisant des plaques chauffantes thermorégulées afin d’éviter toute hypothermie. Si un animal présentait un mauvais état général (prostration, perte de poids importante, pâleur, plaie…), celui-ci serait observé plus attentivement, soigné s’il avait une blessure et séparé de ces congénères si son état le nécessitait, réhydraté si besoin. L’accès à la nourriture pourra être facilité (directement dans la cage). Si après les premiers soins, son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

L’instillation intravésicale d’huile de moutarde ou de son principal constituant, l'isothiocyanate d'allyle (AITC) provoquant une forte réaction inflammatoire dans les tissus de la vessie chez le rat est très bien décrite dans la littérature. Nous utiliserons des rats âgés d’au moins 7 semaines afin d’avoir des jeunes adultes matures en accord avec la littérature.