Recherche appliquée

Toutes tuées en fin d'étude pour l'analyse de leurs organes, 2 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des traitements radioactifs ciblés contre le cancer de la prostate. Elles subissent une greffe tumorale, une castration chirurgicale, parfois une irradiation du corps entier qui supprime un temps leurs défenses immunitaires, un transport de cinq à six heures entre deux établissements et jusqu'à six séances d'imagerie sous anesthésie. Certaines sont immunodéficientes, et la tumeur peut provoquer nécroses et amaigrissement. Le porteur affirme qu'on ne peut se passer d'un "organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes", pour des souris castrées et parfois irradiées.

Objectifs

Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. Dans ce contexte, l’objectif de nos projets est le développement de nouvelles thérapies ciblées couplées à des radioéléments. Cette dernière repose sur le principe suivant : « attacher » une molécule radioactive à une molécule biologique qui joue le rôle de transporteur et va reconnaitre spécifiquement une protéine surexprimée par les cellules tumorales prostatiques. Pour la thérapie, on utilise des molécules radioactives puissantes sur une distance très courtes (de l’ordre du millimètre ou micromètre), détruisant ainsi les cellules tumorales à proximité immédiate de l’endroit où elle est transportée, tout en limitant la toxicité sur les tissus sains environnant la tumeur. Dans ce projet, l’objectif principal est d’évaluer l’activité antitumorale de nouveaux traitements ciblés. Dans le cas où aucune donnée de toxicité ne serait disponible, une étude de la toxicité de ces thérapies ciblées pourra être réalisée au préalable dans le cadre de ce projet. Ce projet est un projet multisite entre deux Etablissements Utilisateurs différents (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Le développement de la radiothérapie interne vectorisée est actuellement en plein essor. En effet, cette thérapie cible de façon spécifique la tumeur de chaque patient, et permet un traitement personnalisé. Notre projet permettra ainsi d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés de radiothérapie interne vectorisée.

Procédures

Une induction tumorale : sous anesthésie (

Impact sur les animaux

- Certaines souris seront immunodéficientes et pourraient développer des pathologies du fait de leur manque de défenses immunitaires si elles n’étaient pas hébergées dans des conditions sanitaires protégées. - L’irradiation corps entier chez certains animaux va éliminer les défenses immunitaires sur une courte période et fragiliser l’animal qui pourrait développer des infections s’il n’était pas maintenu dans des conditions sanitaires protégées. - L’implantation sous cutanée de cellules tumorales ou des fragments de tumeurs va mener à une masse sous cutanée qui pourrait, si elle est menée trop loin, gêner l’animal dans ses mouvements et impacter son état général. De plus, des nécroses peuvent apparaitre. Il est aussi possible, selon le modèle tumoral, que la progression tumorale entraîne une cachexie (amaigrissement et fatigue) constatée par une perte de poids. - La contention des souris pour manipulation lors de la mesure de la taille des tumeurs et de la mise sous anesthésie pourrait provoquer un léger stress. - lors de la répartition en groupes homogènes selon les critères de volume tumoral et de poids corporel, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress de 1 à 2 jours. - Afin d’observer des effets de composé sur l’évolution de la tumeur, les animaux recevront des traitements de composés intraveineux qui pourront induire un stress léger. - Les produits administrés pour la thérapie peuvent provoquer une perte de poids transitoire.

Devenir

Différentes analyses complémentaires réalisées sur les organes prélevés post-mortem sont nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques de nos études. La totalité des animaux seront donc euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

Pour étudier le devenir d’une molécule dans l’organisme et évaluer l’efficacité d’un traitement anticancéreux, il n’est pas possible de se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes ; les modèles animaux sont ainsi indispensables. Des études préliminaires réalisées in vitro nous permettrons néanmoins de valider que la molécule étudiée atteint bien sa cible.

Réduction

Une sélection des composés avec la meilleure activité sera réalisée in vitro en amont de toute utilisation in vivo et permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaire à son strict minimum. Les effectifs d’animaux dans les groupes expérimentaux ont été adaptés pour chaque type d’étude afin de mener à des résultats scientifiquement pertinents tout en réduisant au maximum les effectifs des groupes. Enfin, la bonne connaissance de la pousse tumorale pour chaque modèle permet d’implanter uniquement le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des groupes porteurs de tumeurs de tailles homogènes.

Raffinement

La chirurgie pour la greffe de fragments tumoraux et la castration sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse sur lit chauffant afin de réduire l’inconfort potentiel et permettre ainsi le raffinement de l’étude. La chirurgie est réalisée de façon aseptique et les animaux reçoivent une couverture analgésique. Une surveillance post opératoire et des soins post opératoires adaptés sont appliqués si nécessaires.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle de choix en pharmacologie car son génome est connu et ses principales fonctions physiologiques (fonction rénale, hépatique) sont comparables à l’Homme. D’autre part, les souris sont compatibles avec nos systèmes d’imagerie utilisés pour la caractérisation des molécules utilisées pour cibler et visualiser les tumeurs chez l’homme. Du point de vue scientifique, la souris porteuse de tumeur reste le modèle de choix dans les études d’évaluation de l’efficacité des nouvelles thérapies contre le cancer. Les animaux pourront être utilisés pour l’induction tumorale à un âge minimum de 5 semaines (jeune adulte), et pourront ensuite être traités à partir de l’âge de 7 semaines (adulte), les modèles de tumeur de prostate humaine nécessitant au moins 2 semaines post implantation pour commencer à pousser. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de traiter des animaux possédant les fonctions physiologiques correspondant au stade adulte.

787 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une injection unique leur fait pousser une tumeur, puis des séances d'impulsions électriques d'environ huit secondes lui sont appliquées jusqu'à deux fois par semaine pendant quatre semaines, sous anesthésie générale, les substances à évaluer étant administrées jusqu'à sept fois par semaine. L'objectif est d'améliorer un traitement déjà employé en clinique contre les cancers de la tête et du cou, l'électrochimiothérapie, qui reste peu efficace sur les tumeurs volumineuses. Le porteur écrit que les méthodes in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d'appréhender la complexité du comportement cellulaire dans les tumeurs, et conclut que ses perspectives thérapeutiques justifient la "nécessité" du recours à l'animal.

Objectifs

Ce projet vise à améliorer un traitement existant du cancer de la tête et du cou, appelé électrochimiothérapie. Ce traitement combine l'application d'impulsions électriques sur la tumeur, qui ouvrent temporairement les cellules cancéreuses, avec l'administration de médicaments. Cette ouverture facilite l'entrée des médicaments dans les cellules tumorales et rend ainsi le traitement plus efficace. Ce traitement donne de bons résultats pour les petites tumeurs, mais reste insuffisant pour les tumeurs plus volumineuses, et les médicaments actuellement utilisés peuvent provoquer des effets secondaires importants. Ce projet vise donc à tester des nouvelles substances, notamment des molécules naturellement présentes dans l'organisme, en association avec les impulsions électriques, afin de rendre le traitement plus efficace tout en réduisant ses effets indésirables.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter plusieurs bénéfices concrets pour les patients. On attend une meilleure réduction de la taille des tumeurs, notamment pour les tumeurs volumineuses qui répondent actuellement peu au traitement. L'utilisation de substances d'origine naturelle, mieux tolérées que les médicaments chimiothérapeutiques classiques, devrait également permettre de réduire les effets secondaires. Enfin, cette nouvelle approche pourrait être combinée avec d'autres traitements déjà utilisés en clinique afin d'en renforcer l'efficacité globale, ouvrant ainsi la voie à des options thérapeutiques mieux tolérées et plus efficaces pour les patients atteints de ce type de cancer.

Procédures

Les souris recevront d'abord une injection unique (durée: 30 secondes à 1 minute/ souris maximum) pour faire croître une petite tumeur expérimentale. Une fois la tumeur développée, des séances d’environ 8 secondes d'impulsions électriques seront appliquées sur celle-ci au maximum 2 fois par semaine, pendant quatre semaines, sous anesthésie générale, entre 1 à 180 minutes après l’administration du traitement ou du véhicule (durée: 30 secondes à 1 minute/ souris maximum). En absence de l’électroporation, les traitements à évaluer seront administrés au maximum 7 fois par semaine (durée: 30 secondes à 1 minute/ souris maximum), pendant quatre semaines. Enfin, un prélèvement sanguin unique sera effectué (durée: 2 minutes maximal), sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir un stress passager et un léger inconfort lors des manipulations nécessaires aux traitements, ces effets étant de très courte durée (30 secondes à 1 minute). Une légère fatigue temporaire après l'anesthésie est également attendue. Si la tumeur atteint une taille importante, des douleurs locales, une réduction de la mobilité et une perte de poids modérées pourront apparaître. Selon les traitements reçus, une perte de poids transitoire légère, de la fatigue, une réduction de l'activité modérées pourront également être observés, pendant une durée de quelques jours à deux semaines.

Devenir

À l'issue de l'expérience, tous les animaux seront euthanasiés pour analyse sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement cellulaire dans les tumeurs dans toute sa complexité, en particulier le système immunitaire impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…). Pour étudier le développement tumoral, réaliser les tests métaboliques et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables. Seul un animal vivant peut permettre d’étudier dans sa globalité la réponse immunitaire aux traitements proposés. Notre projet offre des perspectives thérapeutiques qui justifient la nécessité du modèle animal pour valider les expériences in vivo avant leur application chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables, grâce à plusieurs mesures : l'utilisation d'une lignée cellulaire avec un taux de prise tumorale très élevé, limitant les échecs d'implantation; une sélection précise des doses, basée sur la littérature existante et nos résultats préliminaires; un suivi non invasif de la tumeur par imagerie, évitant des euthanasies intermédiaires; ainsi qu'une collecte de nombreux prélèvements sur chaque animal en fin d'expérience, limitant le besoin de groupes supplémentaires. Le nombre d'animaux a par ailleurs été calculé spécifiquement pour chaque expérience selon des méthodes statistiques reconnues, et, pour deux expériences clés jugées particulièrement importantes pour la validité des résultats, l'expérience sera répétée trois fois afin d'en assurer la reproductibilité. Le nombre total d'animaux requis pour l'ensemble du projet est de 787.

Raffinement

Les souris disposeront d'un temps d'acclimatation à leur nouvel environnement avant le début des expériences, incluant un temps de familiarisation avec les chercheurs. Des méthodes limitant le stress lié à la manipulation seront appliquées, par exemple en évitant de saisir les animaux par la queue. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter tout changement de comportement, ainsi que tout signe de développement tumoral ou d'inconfort. Dès l'apparition de tels signes, la fréquence de surveillance sera renforcée, et une analgésie sera mise en place si nécessaire pour soulager l'animal. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués, afin de limiter autant que possible la durée et l'intensité de toute souffrance éventuelle.

Choix des espèces

L'espèce choisie est la souris, car elle est facile à manipuler et à héberger, avec un cycle de vie court, et la tumeur expérimentale s'y développe de façon simple, rapide et fiable. Les souris utilisées partagent toutes le même fond génétique, ce qui garantit que la tumeur ne sera pas rejetée par leur système immunitaire et permet d'obtenir des résultats reproductibles. Ce modèle est par ailleurs largement utilisé et reconnu depuis de nombreuses années dans les études précliniques sur ce type de cancer, les résultats obtenus chez la souris s'étant montrés transposables à l'humain ; notre partenaire utilise d'ailleurs ce modèle depuis plusieurs années et dispose déjà de premiers résultats avec celui-ci. Les souris seront âgées de 7 à 10 semaines, un âge correspondant au stade de jeune adulte, nécessaire pour que la tumeur puisse être greffée et que le système immunitaire soit pleinement mature.

Jusqu'à un animal sur dix meurt d'un œdème malin ou d'une hémorragie sous-arachnoïdienne dans les 72 heures qui suivent la pose d'un filament dans la carotide. 210 rongeurs vont être utilisés, 126 souris et 84 rats, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour mettre au point une imagerie par IRM et scanner X qui suivrait l'inflammation cérébrale après un accident vasculaire cérébral. Selon les groupes, la lésion est provoquée par ce filament, par l'injection stéréotaxique d'un peptide vasoconstricteur ou par celle de lipopolysaccharide, chaque animal subissant une chirurgie d'une heure au plus, parfois deux à deux semaines d'intervalle. Un sous-groupe est génétiquement altéré et présente, écrit le porteur, une anxiété augmentée et des crises épileptiques spontanées chez certains individus, alors qu'il affirme par ailleurs que la douleur concerne uniquement la cicatrice, les dommages au parenchyme cérébral n'en engendrant pas.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) constitue la première cause de handicap acquis chez l’adulte, la deuxième cause de démence et la troisième cause de mortalité : c’est donc un enjeu majeur de santé publique. L’AVC induit une réaction inflammatoire qui contribue de manière importante aux lésions cérébrales. Le suivi par imagerie in vivo de cette réaction inflammatoire permettrait de mieux comprendre sa dynamique spatio-temporelle et d’évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à la moduler. Pour cela, nous proposons de développer une approche en imagerie cellulaire et moléculaire in-vivo. L’objectif de l’imagerie cellulaire est de pouvoir suivre des cellules d’intérêt dans le cerveau : soit des cellules ayant des propriétés thérapeutiques visant à moduler l’inflammation (telles que les cellules souches issues du tissu adipeux) soit des cellules du système immunitaire (telles que les macrophages). L’imagerie moléculaire vise à suivre l’expression de récepteurs impliqués dans la réponse inflammatoire à un AVC, telles que les molécules d’adhésion qui permettent l’entrée de cellules immunitaires dans le cerveau. Les modalités d’imagerie utilisées pour ces développement méthodologiques seront les mêmes que celles qui peuvent être utilisées chez l’humain : imagerie par résonance magnétique (IRM) et scanner X. Le développement de telles techniques d’imagerie ouvrirait la voie à un suivi non-invasif des cellules et des récepteurs de l’inflammation, qui pourrait être répété dans le temps. Le but à plus long terme est de transférer ces méthodes chez l’humain, pour une meilleure prise en charge des patients présentant un AVC.

Bénéfices attendus

L’accident vasculaire cérébral est une maladie invalidante chez l’adulte. Ce projet permettra de mieux comprendre la réaction inflammatoire associée ainsi que le devenir des cellules thérapeutiques, dans des modèles rongeurs (rats et souris) plus simples à mettre en oeuvre et à standardiser que le modèle classique qui procède via une occlusion artérielle mécanique avec un filament. Ces aspects inexplorés du modèle animal permettront ensuite de définir des biomarqueurs d’imagerie utiles pour évaluer les approches thérapeutiques visant à moduler l’inflammation. Ces biomarqueurs seront à terme utilisables chez l’humain puisque le transfert en clinique des techniques d’imagerie utilisées dans ce projet est à l’étude.

Procédures

L’infusion locale du LPS (solution de lipopolysaccharide, molécule d’origine bactérienne provoquant une inflammation) induisant la neuroinflammation ou du peptide vasoconstricteur spécifique (rétrécissant le diamètre des vaisseaux sanguins) mimant l’ischémie cérébrale nécessite une injection stéréotaxique. Le modèle d’AVC transitoire nécessite l’introduction d’un filament par la carotide. Ces chirurgies, permettant de réaliser ces différents modèles d'AVC, sont réalisées sous anesthésie générale et dure au maximum une heure. Chaque animal subit une seule chirurgie de durée maximale d'une heure. Certains animaux recevront les cellules thérapeutiques par voie intracérébrale et subiront pour cela une deuxième chirurgie sous anesthésie générale deux semaines après la réalisation du modèle. Cette seconde chirurgie dure au maximum une heure.

Impact sur les animaux

Suite à cette chirurgie permettant de réaliser ces différents modèles, une perte de poids minime (

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de pouvoir prélever le cerveau et réaliser des analyses post-mortem (imagerie ex vivo, microscopie).

Remplacement

Les agents de contraste seront d’abord testés dans des modèles in-vitro : les cellules thérapeutiques sont marquées avec les nanoparticules par incubation puis placée dans un tube Eppendorf et imagées en IRM et en imagerie X. Cela permettra de réaliser une première sélection des agents de contraste d’intérêt. Néanmoins le contraste va dépendre également du microenvironnement (inflammatoire) et de la métabolisation des agents de contraste in-vivo : il nous apparaît donc indispensable de tester les cellules marquées avec les meilleurs agents de contraste (4 au maximum) chez l’animal vivant. Les cerveaux des animaux des cinq procédures seront prélevés pour l’imagerie post-mortem à l’aide de techniques innovantes basées sur les rayons X (scanner spectral à comptage de photon, imagerie de contraste de phase, de champ sombre et du k-edge avec le rayonnement synchrotron). Ces imageries ex-vivo viendront apporter des informations précieuses avant le développement in-vivo de ces nouvelles approches. Par ailleurs, les images issues de ces expérimentations seront mises en ligne à disposition de la communauté de manière anonyme sur une plateforme collaborative, afin de pouvoir être exploitées plus largement.

Réduction

L’avantage de l’imagerie in-vivo est qu’elle permet des études sur l’animal vivant plutôt que d’avoir à sacrifier les animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet d’augmenter la puissance statistique des résultats tout en limitant le nombre d’animaux. Le nombre minimal et suffisant d'animaux a été estimé par une étude bibliographique de la variabilité du modèle. Des groupes expérimentaux de 6 animaux (3 mâles et 3 femelles) seront typiquement utilisés pour ce projet à caractère exploratoire. Si certaines conditions expérimentales ne fournissent pas un signal suffisant pour être détecté (problème de sensibilité), alors l’inclusion sera stoppée. Enfin, lors des prélèvements finaux, d'autres tissus que les cerveaux pourront être prélevés et conservés en concertation avec nos collaborateurs au moment de la mise en place du projet afin de limiter, optimiser et valoriser au mieux les prélèvements et le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

Le modèle animal d’inflammation cérébrale focale provoquée par l’injection intracérébrale de lipopolysaccharide (LPS) est utilisé car il est moins invalidant pour les animaux que le modèle d’AVC et il est bien approprié pour les études d’imagerie. Il crée une lésion cortico-striatale qui occasionne des troubles sensori-moteurs mineurs et transitoires du côté contralatéral à la lésion (faiblesse des pattes, perte de sensibilité des vibrisses). Néanmoins les animaux continuent de s’alimenter normalement (récupération du poids pré-opératoire dans les 3 jours qui suivent la chirurgie, pas de perte de poids en comparaison avec les animaux sains à plus long terme) et à avoir une activité normale. Dans un second temps, nous allons évaluer si les modèles d’injection intracérébrale de peptide vasoconstricteur et de LPS peuvent nous fournir des informations pertinentes du point de vue de l’imagerie et donc se substituer aux modèles d’AVC, car ils ont l’avantage de limiter le handicap et la mortalité des animaux. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale (isoflurane) avec un traitement anti-douleur adapté (buprénorphine), une thermorégulation continue, et une hydratation sous-cutanée. Une grille dédiée au codage des expressions faciales spécifique à un modèle animal (souris ou rat) permet d’identifier les signes de la souffrance post-opératoire afin de la traiter. La salle d’évaluation neurofonctionnelle a été installée dans un endroit dédié et calme avec une lumière rouge afin de ne pas agresser les yeux des animaux albinos. En soins post-opératoires, nourriture et boisson sous forme gélifiée sont mises à disposition de l'animal pour faciliter leur hydratation, en plus de la nourriture et boisson habituelles. Les groupes sociaux sont conservés (isolement limité au réveil complet de l’animal, sauf en cas d’agressivité constatée). L’évaluation de l’état des animaux est réalisé une heure après la chirurgie et pendant une semaine suivant la chirurgie. Un score de l’état de l’animal est déterminé à l’aide d’une grille de score inspirée des études de raffinement de la procédure post-opératoire d’une chirurgie stéréotaxique, qui permet une évaluation de l’état de l’animal et l’identification des points limites. [MODIFICATION juin 2026. La manipulation et la surveillance des animaux génétiquement altérés sera renforçée.]

Choix des espèces

Les rats sont utilisés car l’imagerie cérébrale de cette espèce a une meilleure résolution en comparaison avec celui de la souris, en raison de la plus grosse taille de cerveau. Nous allons travailler avec des rats Sprague Dawley chez qui le modèle de LPS est bien maîtrisé par notre équipe. Les souris sont utilisées en raison en raison du coût des certaines particules d'oxyde de fer (marquées à la rhodamine fluorescente) et du coût des anticorps (pour la fonctionnalisation des particules d’oxyde de Fer). Les souris utilisées pour cette étude seront des souris C57Bl6 car notre équipe a une expérience extensive de l’utilisation de cette souche pour la recherche translationnelle sur les AVC. Des souris Swiss pourront être utilisées afin de faciliter la pose d'un cathéter veineux. Les animaux auront entre 6 et 8 semaines (jeunes adultes) : la maturité cérébrale sera atteinte et le poids sera suffisant pour la mise en place d’un cathéter veineux caudal pour l’injection des agents de contraste. Rats : 250-300 g à T0 et souris : 25-30 g à T0.

Tester des molécules fournies par des clients occupe 2 700 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le tétrachlorure de carbone leur est injecté deux fois par semaine pendant huit semaines au maximum, seize injections, pour abîmer leur foie jusqu'à la fibrose, et les composés à évaluer sont ensuite administrés une à deux fois par jour pendant quatre semaines. Le porteur indique que les souris peuvent présenter un poil ébouriffé, une position prostrée, une mobilité réduite dans les heures suivant l'injection et une perte de poids, et que les mises à jeun de trois heures avant les prises de sang constituent une source de stress supplémentaire. Toutes sont mises à mort pour récupérer tissus et sang, marquages histologiques et analyses d'expression génique devant mesurer l'efficacité des composés de ses clients.

Objectifs

La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) qui se caractérise par l’accumulation de graisse dans les cellules du foie, touche un quart de la population française et environ 20% de la population générale. La stéatose hépatique non alcoolique est retrouvée préférentiellement chez les patients en surpoids. L’administration répétée d'un composé chimique défini induit une toxicité hépatique qui entraîne la fibrose. L’objectif de ce projet est de modéliser une atteinte hépatique chronique chez le rongeur afin d’évaluer les mécanismes de la fibrose et d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices scientifiques de ce projet attendus sont une meilleure compréhension de la fibrose hépatique. La fibrose hépatique est un problème de santé majeur pour lequel il n’existe aucun traitement autorisé à ce jour, ce projet vise à valider de nouvelles molécules données par nos clients capables de prévenir ou de ralentir la cirrhose ou la fibrose hépatique.

Procédures

L’injection du composé chimique induisant une fibrose hépatique, dure environ 30 secondes sur animal vigile et est réalisé 2 fois par semaines pendant maximum 8 semaines (16 injections). Les composés à tester seront administrés une à deux fois par jour par toutes les voies possibles pendant 4 semaines maximum. L’administration dure environ 30 secondes sur animal vigile et 1 min sur animal anesthésié. 3 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (2 en cours de projet et un prélèvement terminal) afin de suivre les paramètres biologiques ou l’exposition des composés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements visant à quantifier les paramètres biologiques une mise à jeun (retrait de l’aliment) d’une durée de 3h peut être réalisée.

Impact sur les animaux

Les animaux sont susceptibles de présenter des effets indésirables liés à l’administration du composé chimique, comme le poil ébouriffé ou encore une position prostrée, mobilité réduite pendant les heures qui suivent l’injection, ou encore une perte de poids. Un stress de l’animal peut être provoqué par les manipulations répétées (pesées, administrations de traitements). Les prélèvements sanguins peuvent créer des oedèmes au niveau du site de prélèvement. Les traitements pouvant se faire par injections répétées, il peut y avoir des effets indésirables comme des œdèmes. Les mises à jeun de 3h lors des prélèvements de sang peuvent être une source de stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les tissus et le sang dans le but d’évaluer l’efficacité des composés grâce à des marquages histologiques, des analyses d’expression de gènes ou protéines dans le sang et les tissus cibles.

Remplacement

La fibrose n’est pas une maladie d’un seul type cellulaire mais le résultat d’une interaction complexe entre plusieurs types cellulaires. Il n'existe pas de technique in vitro ou in silico fiables pour avoir des résultats probants mimant la pathologie dans son intégrité, l'utilisation de l'animal est donc nécessaire.

Réduction

Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux exprimés par les chercheurs. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles.

Raffinement

Lors de l’injection du composé chimique, celui-ci sera systématiquement dilué dans de l'huile neutre pour diminuer son effet corrosif. Les animaux seront pesés deux fois par semaine, en cas d’apparition de perte de poids ou signes cliniques, nous réaliserons une observation clinique approfondie en scorant différents paramètres (perte de poids, locomotion, aspect général). En cas de déshydratation, une injection de soluté de réhydratation sera réalisée. Dans les cas d’atteinte des points limites, l’animal est mis à mort. Les points limites sont définis de manière conservatrice afin d’éviter toute souffrance excessive. Les prélèvements intermédiaires et terminaux seront réalisés sous couverture anesthésique et analgésique adaptée.

Choix des espèces

Les animaux et la souche sélectionnée sont largement utilisés et caractérisés par la communauté scientifique afin d’étudier la progression des désordres hépatiques telle que la fibrose hépatique. Les animaux seront utilisés entre 6 et 10 semaines car à cet âge ils sont considérés comme jeune adulte, et ont un système immunitaire et tissulaire mature pour répondre à ce composé chimique.

Vingt-et-une injections sous-cutanées en trois semaines, une chirurgie crânienne d'environ cinq heures sous anesthésie générale, puis douze séances de test avec imagerie cérébrale de vingt à cent quarante minutes sur six semaines : 64 rats subissent ce protocole dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le produit administré appartient à la famille du cannabis, et il s'agit de voir comment une exposition répétée à l'adolescence modifie les connexions cérébrales et la mémoire à l'âge adulte. Le porteur qualifie ces administrations de procédures "bien tolérées" et prévoit une douleur post-opératoire de 24 à 48 heures. Tous les rats sont mis à mort à la fin, la chirurgie et le traitement cannabinoïde excluant selon lui qu'ils servent ensuite à autre chose, et les tests de mémoire qui occupent six semaines du protocole ne sont jamais nommés.

Objectifs

Ce projet vise à mettre en place et à valider une technique d’imagerie cérébrale chez le rat en mouvement libre, afin d’étudier comment une exposition répétée à des substances psychoactives (de la même famille que le cannabis) pendant l’adolescence modifie les connections entre différentes régions du cerveau et les capacités de mémorisation. Les animaux utilisés bénéficieront d’une intervention chirurgicale (réalisée sous anesthésie complète et avec traitement de la douleur) permettant l’accès à l’imagerie cérébrale, ainsi que d’administrations de substances apparentées aux cannabinoïdes, procédures considérées comme bien tolérées.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment une exposition aux cannabinoïdes à l’adolescence modifie durablement les circuits cérébraux liés à la mémoire. Ces connaissances pourront contribuer à identifier des marqueurs biologiques de vulnérabilité et à informer les politiques de prévention.

Procédures

Les interventions sur les animaux comprennent : • Injections sous-cutanées répétées (21 injections sur 3 semaines, environ 5 secondes chacune) • Une intervention chirurgicale sous anesthésie générale et traitement antidouleur (environ 5h), permettant l’imagerie cérébrale • 2 injections sous-cutanées post-chirurgicales (5 secondes chacune) • Sessions d’habituation (5 jours, 10 à 20 minutes par session) • 12 sessions de test comportemental avec imagerie cérébrale (20 à 140 minutes par session sur 6 semaines)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : • Douleur post-opératoire modérée (24 à 48h), prise en charge par analgésie • Douleurs brèves lors des injections sous-cutanées (quelques secondes) • Léger stress lors des séances d’imagerie cérébrale en état d’éveil (bruit modéré, changement d’environnement) • Modifications transitoires de la locomotion et de l’état général liées au traitement

Devenir

Les animaux seront mis à mort car pas de réutilisation possible dû à la chirurgie et au traitement cannabinoïde.

Remplacement

Aucun modèle in vitro ou informatique ne permet d’étudier simultanément le comportement complexe, la dynamique cérébrale en mouvement libre et de manière longitudinale sur plusieurs semaines. Le recours à l’animal est indispensable.

Réduction

Cette étude pilote utilise le nombre minimal d’animaux nécessaire. Les sessions longitudinales répétées évitent de multiplier les animaux. Les animaux serviront pour plusieurs types d’expériences (imagerie et comportement).

Raffinement

La chirurgie est réalisée sous analgésie et anesthésie complètes, avec suivi post-opératoire. Une grille de score et une liste de points limites permettent d’assurer le bien-être animal et d’interrompre l’expérience ou de procéder à la mise à mort dès qu’un point limite est atteint. Des analgésiques sont utilisés pour prévenir la douleur. Des séances d’habituation à l’imagerie et au comportement sont réalisées. Les souris [rats] sont élevés en groupes sociaux avec enrichissement du milieu.

Choix des espèces

Le rat a été choisi car il est adapté à l’implantation chronique d’un dispositif d’imagerie cérébrale, offre un volume cérébral suffisant pour l’imagerie des structures d’intérêt, et montre une robustesse comportementale pour les tests de mémoire. L’effet du traitement cannabinoïde a déjà été documenté chez cette espèce. Le traitement est administré au stade adolescent (en raison de la sensibilité accrue du cerveau en développement) et les enregistrements sont réalisés au stade adulte (cerveau mature, ossature crânienne plus résistante).

Neuf séances d'imagerie de quarante minutes chacune, sous anesthésie par injection intrapéritonéale, étalées sur huit semaines : 180 souris porteuses d'un glioblastome vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. S'y ajoutent une chirurgie d'induction de la tumeur, des injections d'agent de contraste dans la veine de la queue, et pour une partie d'entre elles une craniotomie avec extraction de la tumeur. Le résumé prévoit un affaiblissement transitoire, une perte de poids au fil des séances, un risque d'hypothermie et une embolie gazeuse pouvant tuer l'animal, et pour la lignée transgénique l'apparition d'un comportement épileptique après induction. Les effectifs concernés par la craniotomie, par l'excision et par la mise à mort hebdomadaire ne sont jamais chiffrés, le résumé s'en tenant à "un petit nombre d'animaux" et à "un petit groupe".

Objectifs

Le cancer du cerveau, et en particulier le glioblastome multiforme (GBM), représente un des cancers au pronostic le plus faible. Aujourd’hui, son pronostic est largement lié à la réussite de la chirurgie, qui est rendue difficile par la présence de multiples vaisseaux afférents à la tumeur et au risque d’hémorragie. Ce projet vise à étudier la vascularisation du GBM afin de proposer des outils pour la chirurgie, grâce à une technique d’imagerie faiblement invasive et peu chère qui pourrait être utilisée de manière longitudinale, et en particulier pendant la chirurgie. À terme, cela pourrait permettre d’augmenter drastiquement la survie des patients atteints de GBM. Ce projet repose sur une technique récente basée sur l’échographie : l’imagerie de microscopie de localisation ultrasonore (ULM) ou superrésolution. Cette permet d’imager avec une précision sans précédent les vaisseaux sanguins, ainsi que de mesurer le flux précisément à chaque endroit. L’objectif de ce projet est - De mieux comprendre le développement vasculaire du GBM - De proposer des biomarqueurs permettant d’identifier les vaisseaux tumoraux - D’identifier l’effet de la récidive tumorale sur la vascularisation post-chirurgie Le but à long terme est de pouvoir mieux comprendre la maladie, et proposer des outils permettant aux chirurgiens d’optimiser l’extraction de la tumeur, afin d’augmenter le taux de survie des patients.

Bénéfices attendus

Le GBM est une tumeur du cerveau difficile à traiter, notamment parce qu’il est souvent difficile de distinguer la tumeur des tissus sains pendant l’opération. Ce projet vise à développer une nouvelle méthode d’imagerie par ultrasons permettant aux chirurgiens de mieux comprendre et identifier la tumeur, en particulier en termes de ses vaisseaux sanguins. Cette technique pourrait aider à retirer la tumeur de façon plus précise, tout en limitant les risques d’hémorragie et de récidive. À terme, elle pourrait améliorer la prise en charge des patients et augmenter leurs chances de guérison.

Procédures

Les procédures réalisées dans ce projet impliquent des manipulations limitées et sont effectuées sous anesthésie. Une chirurgie d’induction sera réalisée pour chacun des deux modèles utilisés, sous anesthésie générale gazeuse et avec injection d’analgésique, une fois par animal. Pour les acquisitions hebdomadaires d’imagerie, l’anesthésie sera réalisée par injection intrapéritonéale, et durera environ 40min. Il s’agira de 9 séances maximum par animal sur 8 semaines, avec deux séances uniquement réalisées le même jour pour un petit groupe (pré et post-excision tumorale). Une injection intraveineuse continue sera réalisée au niveau de la queue de l’animal anesthésié. Il s’agit d’un agent de contraste utilisé en imagerie. Ces injections peuvent entraîner une gêne légère et transitoire liée à la manipulation et à l’injection. Dans le cas du modèle transgénique, une craniotomie puis l’extraction tumorale sera réalisée une fois par animal sur un petit nombre d'animaux, également sous anesthésie générale gazeuse avec analgésique. Des analgésiques et du glucose seront administrés par injections dans les jours suivant l’excision de la tumeur.

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables peuvent survenir au cours de ce projet. Le transport pour faire venir les animaux, le changement d’environnement et les manipulations répétées peuvent être source de stress pour les animaux, pouvant se traduire par des modifications de comportement. Les séances d’imagerie ainsi que les chirurgies nécessitent une anesthésie générale. Bien que maîtrisée, cette anesthésie peut entraîner : • un affaiblissement transitoire, • une perte de poids au fil des séances, • un risque de déshydratation, • ainsi qu’un risque d’hypothermie, en particulier lors d’anesthésies prolongées. Les chirurgies, ainsi que les injections intraveineuses répétées au niveau de la queue peuvent également entraîner : • des lésions locales, • un risque infectieux, • une hémorragie, • et une gêne pouvant affecter la mobilité de l’animal. Un risque exceptionnel mais grave d’embolie gazeuse existe en cas d’injection accidentelle d’air dans la circulation sanguine, pouvant entraîner la mort de l’animal. Le glioblastome étant une tumeur agressive, il peut induire : • une douleur liée au développement tumoral, • une altération de l’état général (perte de poids, diminution de l’activité), • et des modifications du comportement (isolement, agressivité, diminution de la prise alimentaire ou hydrique). Enfin, dans le cas des souris transgéniques, un phénotype dommageable apparait après induction, avec la mise en place d’un comportement épileptique

Devenir

La plupart des animaux seront réutilisés chaque semaine pour imagerie, la procédure d’imagerie étant peu sévère et l’anesthésie limitée à 40min. Pour le modèle syngénique, un petit nombre d’animaux sera mis à mort à l’issue de la séance d’imagerie chaque semaine à partir de la semaine 4 après induction pour prélèvement et analyse histologique. Pour le second modèle, un petit groupe d’animaux sera mis à mort chaque semaine après l’imagerie prélèvement du cerveau à partir de la semaine 4 après induction, à l’exception du groupe de mise au point et du groupe pour lequel la tumeur sera excisée, qui seront mis à mort après l’imagerie de la semaine 9 après induction. Aucun animal ne sera gardé en vie.

Remplacement

Dans le cadre du développement de ces techniques d’imagerie, des méthodes alternatives à l’expérimentation animale sont utilisées autant que possible. Des modèles in vitro sont notamment mis en œuvre, tels que des gels (agar ou gélatine) dont les propriétés (rigidité, organisation interne) peuvent être contrôlées. Ces modèles permettent de tester et d’optimiser les techniques d’imagerie dans des conditions maîtrisées. Des simulations numériques peuvent également être utilisées dans certains cas. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire la complexité d’une tumeur dans un organisme vivant. En particulier, elles ne permettent pas de représenter fidèlement : • l’organisation et le fonctionnement des vaisseaux sanguins, • les interactions entre la tumeur et les tissus environnants, • ni l’évolution dynamique de la tumeur dans le temps. Or, ces éléments sont essentiels pour répondre aux objectifs du projet, qui visent à caractériser les tumeurs dans des conditions proches de la réalité physiologique.

Réduction

Le projet est conçu de manière à utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques. Nos protocoles d’imagerie ont été optimisés de manière exhaustive sur des modèles in-vitro afin de s’assurer de leur efficacité et limiter le nombre d’animaux utilisés inutilement. L’imagerie ultrasonore utilisée est peu invasive, ce qui permet de réaliser des mesures répétées chez les mêmes animaux au cours du temps. Cette approche longitudinale (une séance d’imagerie par semaine) permet de suivre l’évolution des tumeurs sans multiplier les groupes expérimentaux, et donc de réduire significativement le nombre total d’animaux, même si des animaux seront mis à mort à chaque stade tumoral pour référence histologique. Enfin, le nombre d’animaux prévu est volontairement estimé de manière prudente. Toutefois, une adaptation en cours d’étude sera mise en place : si les résultats obtenus sont suffisants avant d’atteindre l’effectif initialement prévu, les expériences seront arrêtées de manière anticipée, permettant de réduire encore le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Des mesures de raffinement sont mises en œuvre afin de réduire la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les animaux sont acclimatés à leur environnement, manipulés de manière douce (tunnels, prise à la main) et hébergés en groupe dans des cages enrichies. Les souris développant des tumeurs font l’objet d’une surveillance régulière, avec des points limites définis entraînant l’arrêt de l’expérimentation si nécessaire. Les procédures sont réalisées sous anesthésie, avec maintien de la température corporelle et surveillance des paramètres physiologiques. Après les anesthésies les animaux bénéficient d’un réveil encadré en environnement chauffé et sont remis avec leurs congénères après récupération complète. Une évaluation régulière de l’animal est réalisée : administration de substances à effet analgésique si nécessaire, et mise à mort anticipée en cas de douleur ou détresse persistante ou importante. Une évaluation accrue est mise en place pour les animaux au phénotype dommageable après l’induction de ce phénotype, avec évaluation spécifique des conséquences de ce phénotype et points limites pour l’administration d’antalgiques ou la mise à mort précoce.

Choix des espèces

L’étude nécessite un modèle in vivo, car les caractéristiques des tumeurs (vascularisation et interactions avec les tissus environnants) ne peuvent être reproduites en dehors d’un organisme vivant. La souris est choisie comme modèle expérimental car elle permet : • la mise en œuvre de modèles tumoraux pertinents, incluant des tumeurs apparaissant dans un environnement physiologique, • la possibilité d’études longitudinales, • et l’utilisation de modèles génétiques bien caractérisés. Les modèles choisis sont particulièrement adaptés à l’étude du microenvironnement tumoral, qui est central dans ce projet. Par ailleurs, le laboratoire dispose d’une expertise solide sur l’imagerie du rongeur, et en particulier l’imagerie cérébrale. Les souris seront accueillies à l’âge adulte afin de limiter l’impact du développement cérébral sur le développement vasculaire observé.