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Psoriasis et dysbiose vaginale, sont ils des déclencheurs des spondyloarthrites ?
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
1 490 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la majorité tuée à l'issue et 560 mâles susceptibles d'être réutilisés dans d'autres projets. Porteuses d'un déficit immunitaire, elles reçoivent des injections destinées à déclencher une arthrite qui se traduit par un gonflement des articulations, une baisse d'activité et une perte de poids pouvant être importante. Le porteur décrit aussi l'induction d'une inflammation cutanée de type psoriasis et d'une infection vaginale, croisées pour tester l'apparition de spondyloarthrites. Les femelles sont mises à mort pour examen des tissus articulaires, tandis que les mâles en excès sont tués au sevrage ou orientés vers d'autres protocoles.
Objectifs
Les spondyloarthrites sont des rhumatismes inflammatoires fréquents (0,3% de la population française) touchant les articulations, les tendons mais aussi d’autres organes (inflammation des yeux, de la peau et du tube digestif). Les spondyloarthrites entrainent une altération de la qualité de vie. Les raisons du déclenchement de cette maladie sont à ce jour mal comprises. Il y a parfois l’association d’une susceptibilité génétique et d’un environnement déclencheur comme une infection, parfois l'influence de la flore intestinale est suspectée, parfois la présence de lésions de psoriasis sur la peau, mais la relation de cause à effet reste non prouvée. 2% de la population française est touchée par le psoriasis, maladie inflammatoire chronique de la peau. 30% de ces patients développeront au cours de leur vie un rhumatisme psoriasique, en moyenne 10 ans après le début du psoriasis. Comparativement au psoriasis isolé, le rhumatisme psoriasique, comme toutes les autres spondyloarthrites, entraîne un surcoût important pour le système de santé, notamment du fait des traitements biologiques utilisés au long cours pour contrôler cette maladie. Notre premier objectif est d’étudier sur modèle animal la transition entre psoriasis local et le rhumatisme psoriasique. La dysbiose vaginale, est une perturbation de l'équilibre de la flore vaginale. C’est la maladie génitale la plus fréquente au monde chez les femmes en âge d'être sexuellement actives, avec une fréquence de 23 à 29 %. Elle est associée à une susceptibilité aux infections sexuellement transmissibles et à un risque accru de maladie inflammatoire. Nous suspectons une plus grande susceptibilité aux spondyloarthrites chez les femmes atteintes de dysbiose vaginale. Notre second objectif est d’établir une relation causale entre une dysbiose vaginale et la survenue d’une spondyloarthrites, dans notre modèle de souris. Le troisième objectif est d’élever les souris avec un déficit immunitaire les rendant susceptibles aux spondyloarthrites afin de pouvoir mener ces études.
Bénéfices attendus
Entre les premières lésions de psoriasis et le déclenchement du rhumatisme psoriasique, il y a l’opportunité de traiter par des médicaments afin d’éviter la survenue de ce dernier. Notre recherche, une fois le modèle de cette transition établie permettra d’identifier les types de traitements susceptibles de bloquer ou retarder cette transition, voire de tester des médicaments. De même, si nous arrivons à démontrer le lien entre dysbiose vaginale et spondyloarthrites, nous pourrons identifier les types de traitements susceptibles de bloquer ou retarder cette transition puis tester des médicaments.
Procédures
Les diamètres des chevilles et poignets des souris seront mesurées toutes les semaines, parfois deux fois par semaine. Suivant le protocole pour induire la maladie, elles auront une injection intrapéritonéale d’hormone pour synchroniser leurs chaleurs, et quelques jours plus tard un dépôt intravaginal, pour induire la maladie. Ce sera fait sous anesthésie générale courte (de 3 à 15 minutes) et couplé à une prise de sang. Elles pourront avoir jusqu’à 5 autres prises de sang. Il y aura aussi jusqu'à sept écouvillonnages vaginaux. Dans l’autre protocole, elles subiront jusqu’à 5 injections sous cutanées (éventuellement répété une fois après plus d’un mois) pour induire la maladie. Elles auront des prises de sang (maximum 6) sous anesthésie générale courte (de 3 à 15 minutes). Selon l’avancée de nos connaissances, elles pourront avoir des injections de traitements en intrapéritonéal, dont les fréquences pourront varier de 1 par jour pendant 4 semaines à 1 par semaine pendant 20 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront des contentions pour les peser et mesurer le diamètre de leurs poignets et de leurs chevilles, une à deux fois par semaine. Le stress de ces mesures disparait après 2 à quatre mesures. Ils subiront des courtes anesthésies (3-15 min) pour l’injection qui déclenche la maladie et les prises de sang. Ils pourront aussi subir des injections (ip) jusqu’à une par jour, pour favoriser le déclenchement (synchronisation du cycle oestrale), induire un traitement, une atténuation des symptômes, ou de façon inattendue une exacerbation de ceux-ci. Il y aura une irritation et une inflammation locale après induction du psoriasis. Cette irritation sera inférieure à celle qui déclenche une réaction de grattage nuisible. L’infection vaginale déclenchera une inflammation de l’utérus (décrite en post mortem dans la littérature sans qu’il soit fait mention d’altération de l’état général). L’arthrite que nous cherchons à induire se traduit par un gonflement des articulations (chevilles et poignets), une baisse de l’activité (détectable par actimétrie continue sur une journée, il ne s’agit pas d’une prostration), une rougeur transitoire des oreilles, une possible conjonctivite. La perte de poids peut être importante quand la maladie est installée.
Devenir
Les femelles de la procédure d’élevage sont gardés en vie soit comme reproducteurs soit pour servir dans les expériences. A la fin des expériences, nous avons besoin de faire des examens sur les tissus articulaires des animaux donc ils sont mis à mort, tant pour les malades que pour les contrôles. Il y aura un excès d’animaux mâles (610-50, nos expériences se feront quasi-exclusivement sur des femelles). La majorité sera mise à mort au sevrage, mais la totalité de ces 560 animaux mâles pourront être potentiellement réutilisés dans d'autres projets. Il faudra que les conditions sanitaires de cette réutilisation permettent de les utiliser sans que leur déficit immunitaire les handicape.
Remplacement
Actuellement, il n’existe aucun modèle in vitro capable de mimer les spondylarthrites ou de comprendre son mécanisme, son déclenchement cellulaire ou moléculaire. Le développement de cette maladie complexe et donc son étude nécessitent l’intervention d’un système immunitaire complet en plus d'un tissus cartilagineux, voire d'une articulation, et des autres organes dont nous voulons démontrer l’implication (peau ou utérus). Nous faisons des expériences en complément de celles décrites ici ; in vivo : mesures d’activités enzymatiques, calibrage des inoculum bactériens ; ex vivo : mise en culture des cellules immunitaires, cytométrie sur les cellules immunitaires, analyses sanguines, histologie, PCR…
Réduction
Les effectifs des expériences ont été calculés afin de réduire le nombre d’animaux. Dans les expériences longues durée, nous tenons compte du taux de réussite habituel d’induction de la maladie, et de la variabilité de la grosseur des articulations. Nous synchronisons les chaleurs des femelles par une injection d’hormone afin d’augmenter les chances d’induction de la maladie. D’autres expériences seront faites sur des temps plus court pour explorer les mécanismes mis en jeu, elles se feront sur des effectifs très réduits car nous voulons alors détecter des effets tout ou rien et non des variations sur le diamètre des articulations Enfin, nous mettrons en commun les animaux contrôles sur la première expérience entre les procédures 1 et 2 et nous répéterons cela chaque fois que ce sera possible.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions sanitaires très strictes (air filtré, nourriture et eau stériles) qui font que leur déficit immunitaire n’est pas un handicap. L'enrichissement sera conforme aux préconisations de la structure de bien-être animal de l’établissement. Le geste technique de mesure des diamètres est toujours réalisé par la même personne afin que les souris soient habituées à cette manipulation qui est contraignante pour elles en termes de durée de contention et afin de réduire cette durée de contention. Les prises de sang seront faites sous anesthésie générale. Un analgésique sera administré après. Les anesthésies générales seront de courte durée (3 à 15 minutes) afin que la perturbation du rythme de vie soit de moins de 24h (l’équivalent d’un examen sous anesthésie générale en ambulatoire chez l’homme). Nous avons une grille d’évaluation des souffrances subies par les animaux. Les critères intermédiaires entrainent des mesures d’aide : ainsi en cas de perte de poids de 10%, pour un individu ou pour tout le groupe si plus de 4 en sont à ce stade, une alimentation riche et humide leur sera donnée dans la cage en plus des croquettes sèches habituelles. Les critères terminaux de cette grille correspondent à une mise à mort pour éviter des souffrances inutiles et ces critères sont atteints avant que la détérioration de l’état général ou la perte de poids n’atteignent un stade sévère.
Choix des espèces
Nous élevons une lignée de souris avec un déficit immunitaire qui les rend susceptibles à des maladies auto-immunes. Ces souris sont un bon modèle de spondylarthrite car elles vérifient assez bien ou très bien les trois critères d’un modèle animal de maladie humaine : - Elles développent des symptômes qui sont très proches de la maladie humaine. - La mutation génétique à l’origine de leur auto-immunité n’est pas décrite chez l’homme (donc ce modèle n’est pas parfait), mais la perturbation des cellules immunitaires qui en découle est retrouvée dans la maladie humaine. - Une des biothérapies efficaces en clinique est aussi efficace sur les spondyloarthrites classiques induites chez ces souris. Nous avons donc un grand espoir que pour les variantes de spondyloarthrites que nous voulons induire chez ces souris, leurs réponses aux médicaments seront prédictives de ce qui sera efficace dans l’espèce humaine. L’âge des souris au début des expériences est compris entre 5 et 10 semaines pour 1) avoir des animaux adultes ; et 2) ne pas avoir des animaux vieillissant en fin d’expérience. Pour l’élevage nous aurons des animaux de leur naissance à la réforme (à 6-8 mois).
Évaluation de l’impact des anticorps neutralisants sur le transfert de gène médié par l’AAV chez le primate non-humain.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
10 macaques à longue queue, tous des femelles, vont être utilisés, tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections intraveineuses de vecteurs de thérapie génique et subissent de nombreux prélèvements sanguins sous anesthésie répétée, avant d'être tués un mois plus tard pour prélèvement des tissus. Le porteur affirme que le macaque apporte les meilleures connaissances transposables à l'humain et qualifie le recours à cette espèce d'"indispensable", la complexité des réactions immunitaires excluant selon lui les méthodes in vitro. Il décrit les gestes comme peu ou pas invasifs, tout en pratiquant euthanasie et prélèvements terminaux.
Objectifs
Les vecteurs dérivés du virus adéno-associé (vecteurs AAV) sont actuellement les candidats-médicaments les plus utilisés dans cadre de traitement des maladies génétiques, par leur capacité à pénétrer dans un organe/tissus et y faire exprimer un gène thérapeutique. Ces vecteurs sont efficaces et bien tolérés. Cependant, leur utilisation en thérapie génique peut être limitée soit (i) en raison d’une immunité pré existante à l’AAV due à l'exposition naturelle de l'homme à certains virus AAV, (ii) de leur efficacité thérapeutique limitée dans certains organes et (iii) du risque d’une concentration importante dans des organes non ciblés. Ces problèmes sont, à ce jour, les principaux défis à relever pour accroître l'efficacité et la sécurité des vecteurs AAV. Afin de surmonter ces limites, plusieurs travaux ont été menée par notre laboratoire et ont aboutis aux résultats suivants : (i) Identification d’un nouveau vecteur AAV thérapeutique qui cible spécifiquement les muscles, tout en préservant le foie et le cœur, chez des primates non humains. (ii) Développement d’une nouvelle stratégie de thérapie génique pour la maladie de stockage du glycogène de type III (accumulation du glycogène, réserve de sucre, dans les organes tels que le muscle et le foie notamment) par utilisation d’un nouveau vecteur AAV thérapeutique dans un modèle de souris. (iii) Démonstration de l'efficacité d’une enzyme (endopeptidase), capable par son action spécifique, de diminuer l’immunité préexistante chez des primates non humains, et donc d’augmenter l’efficacité de l’AAV thérapeutique. Les objectifs de l’étude que nous envisageons de réaliser chez le primate non humain sont : (i) Valider l’efficacité du nouveau vecteur AAV thérapeutique ciblant les muscles (ii) Étudier l’efficacité, la sécurité et la toxicité du nouveau vecteur AAV thérapeutique pour la maladie de stockage du glycogène de type III chez cette espèce (iii) Démontrer qu’un traitement par l’enzyme endopeptidase couplé à un traitement par une méthode permettant de diminuer le taux d’anticorps dû à l’immunité (méthode dite méthode de déplétion des anticorps par administration d’un AAV, nommé « AAV à capside vide » ne pouvant donc pas transférer de gène), permettrait d’obtenir un transfert de gène efficace.
Bénéfices attendus
Les objectifs de l’étude que nous envisageons de réaliser chez le primate non humain sont : (i) Valider l’efficacité du nouveau vecteur AAV thérapeutique ciblant les muscles. Ce qui permettrait d'éviter une accumulation du vecteur dans d'autres organe, notamment foie et coeur (ii) Étudier l’efficacité et la sécurité du nouveau vecteur AAV thérapeutique pour la maladie de stockage du glycogène de type III chez cette espèce (iii) Démontrer qu’un traitement par l’enzyme endopeptidase couplé à un traitement par une méthode permettant de diminuer le taux d’anticorps dû à l’immunité (méthode dite méthode de déplétion des anticorps par administration d’un AAV, nommé « AAV à capside vide » ne pouvant donc pas transférer de gène). Ce traitement combiné permettrait de diminuer, voire d’annuler 1-soit une pré immunité, ainsi un plus grand nombre de patients pourront bénéficier de de la thérapie génique AAV 2-soit une réponse immune suite à l'administration du vecteur AAV thérapeutique, permettant ainsi la possibilité d'une deuxième injection thérapeutique
Procédures
Les animaux de cette étude seront soumis aux interventions suivantes : - Dans le mois avant l’injection, les 10 animaux auront 2 prélèvements sanguins (J-30 et J-8), sous anesthésie de courte durée (15-20 min) afin de répartir les macaques dans 3 groupes en fonction du niveau de leur immunité préexistante. - Pour le groupe 1 (n=2) : le jour de l’injection (J0) : une prise de sang et une injection par voie intraveineuse lente du vecteur AAV thérapeutique testé précédé ou non par une injection de « l’AAV à capside vide » par voie intraveineuse en fonction de leur immunité préexistante à l’AAV. Le tout sous anesthésie (maximum 3 heures) - Pour le groupe 2 (n=4) : Le jour de l’injection (J0) : une prise de sang et une injection par voie intraveineuse lente du vecteur AAV thérapeutique testé, précédé ou non par une injection de « l’AAV à capside vide » par voie intraveineuse en fonction du niveau de l’immunité préexistante à l’AAV. Le tout sous anesthésie (maximum 3 heures). - Pour le groupe 3 (n=4) : La veille de l’injection (J-1) : un traitement immunosuppresseur et antihistaminique par voie intraveineuse. Le jour de l’injection (J0) : une injection par voie intraveineuse lente du vecteur AAV thérapeutique testé, précédé par une injection de « l’AAV à capside vide » ou d’une solution saline (contrôle) par voie intraveineuse. Le tout sous anesthésie (maximum 3 heures). Le nombre de prises de sang sous anesthésie (entre 15 et 30 min) seront les suivants : à J0 : n= 8 et entre 1 et 30 jours post-injection : n = 5 - A 30 jours post-injection (J30) : un prélèvement sanguin, avant euthanasie par injection intraveineuse d’une dose létale d’anesthésique.
Impact sur les animaux
Tous les gestes réalisés sur ces animaux seront non ou peu invasifs : (i) administration lente des produits par voie intraveineuse, et (ii) prélèvements sanguins par ponction veineuse. Aucune douleur ni aucun stress physique ou thermique n'est anticipé pendant la procédure ou en post-injection. Dans le but de réduire au maximum le stress des animaux lié à la contention, toutes les manipulations, à l'exception des observations biquotidiennes, seront effectuées sous anesthésie, ainsi qu’une induction de cette dernière par injection intramusculaire sur des primates préalablement isolés dans des cages individuelles. Un jeûne d'une durée maximale de 12 heures, sera mis en place pour tous les animaux avant leur anesthésie, dans le but de prévenir les régurgitations et les fausses routes pendant la procédure. Cependant, il est important de noter que ces injections n'auront aucun impact sur leur consommation alimentaire et hydrique. Les primates seront réintégrés dans leur cage ou volière une fois pleinement réveillés de leur anesthésie afin de réduire au maximum tout stress environnemental. Malgré tout, un suivi rapproché des paramètres cliniques (observations quotidiennes et examens cliniques) et des paramètres sanguins (hématologie et chimie clinique) des animaux sera mis en place afin de pouvoir détecter toute potentielle anomalie non phénotypique en post-injection.
Devenir
Les 10 animaux concernés par cette procédure seront suivis pendant 1 mois après l’injection du vecteur testé puis euthanasiés pour prélèvements de tissus post-mortem. L’euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir des prélèvements de tissus sur lesquels s’appuieront des analyses de biodistribution et d’expression du transgène, ainsi que des analyses histopathologiques et immunohistochimiques
Remplacement
Les études réalisées chez le Primate Non Humain (macaque fascicularis) apportent les meilleures connaissances transposables à l’homme en termes de toxicité, d’efficacité et d’immunogénicité de l’AAV. La complexité des réactions en jeu ne permet pas le recours à des méthodes substitutives, telles que les études in vitro isolées et justifie notre recours à des animaux. Les résultats obtenus sont transposables en terme de biodistribution et tolérance et permettent d'envisager de futurs essais cliniques chez l'homme (Primate Humain).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans cette étude (n=10) a été déterminé sur la base d’études précédentes en thérapie génique. Ce nombre est réduit à son minimum tout en assurant une exploitation possible des résultats. En effet, la constitution de 3 groupes différents permettra de (i) Valider l’efficacité du nouveau vecteur AAV thérapeutique ciblant les muscles (ii) Étudier l’efficacité, l’innocuité la sécurité et la toxicité du nouveau vecteur AAV thérapeutique pour la maladie de stockage du glycogène de type III chez le primate non humain (iii) Evaluer la synergie et l’efficacité d’un traitement par l’enzyme endopeptidase combinée à un traitement par une méthode permettant de diminuer le taux d’anticorps dû à l’immunité (méthode dite méthode de déplétion des anticorps par administration d’un AAV, nommé « AAV à capside vide » ne pouvant donc pas transférer de gène).
Raffinement
L’état général et l’alimentation des animaux seront surveillés quotidiennement tout le long du projet (techniciens animaliers et vétérinaire). Des protocoles anesthésiques seront mis en place selon la procédure à réaliser. Les administrations expérimentales (injections par voie intraveineuse d’antihistaminique, d’immunosuppression et des vecteurs) se dérouleront sous anesthésie générale. Les prélèvements sanguins seront effectués sous protocole anesthésique permettant d'obtenir une anesthésie de courte durée (environ 10 min). Ces actes étant peu ou pas douloureux, le protocole analgésique ne sera pas basé sur des opioïdes mais par contre sur les effets analgésiques des molécules anesthésique utilisées. Pour favoriser les échanges sociaux entre animaux et favoriser leur bien-être, les macaques seront hébergés en cage en post-injection, et en volières dès que possible pour favoriser les déplacements verticaux.
Choix des espèces
La capacité des vecteurs AAV à pénétrer dans un organe/tissu et y faire exprimer un gène thérapeutique est espèce dépendante. Les objectifs principaux de ce projet étant : (i) Valider l’efficacité du nouveau vecteur AAV thérapeutique ciblant les muscles (ii) Étudier l’efficacité, l’innocuité la sécurité et la toxicité du nouveau vecteur AAV thérapeutique pour la maladie de stockage du glycogène de type III chez le primate non humain (iii) Evaluer la synergie et l’efficacité d’un traitement I par l’enzyme endopeptidase combinée à un traitement par une méthode permettant de diminuer le taux d’anticorps dû à l’immunité (méthode dite méthode de déplétion des anticorps par administration d’un AAV, nommé « AAV à capside vide » ne pouvant donc pas transférer de gène), Il est donc indispensable de choisir l’espèce en conséquence. Un vecteur peut être efficace chez le rongeur mais pas chez l'homme. Le macaque fascicularis représente l’espèce animale de choix dans le modèle préclinique de par sa morphologie, sa physiologie, sa proximité phylogénétique et sa similitude avec le système immunitaire de l’homme. 10 singes (Macaca fascicularis) femelles (2-3 ans, 2.5-4.5 kg) seront inclus dans l’étude. Par conséquent, les animaux utilisés dans cette étude sont de jeunes adultes ayant leur système immunitaire mature, indispensable pour notre étude.
Rôle de la toxicité cellulaire dans le remodelage cardiaque après l’infarctus du myocarde chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
9 830 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit un infarctus du myocarde provoqué chirurgicalement, suivi d'échocardiographies sous anesthésie, de prélèvements sanguins par voie sous-mandibulaire sur animal vigile et d'injections répétées, dont certaines par voie rétro-orbitaire. Le porteur affirme que ces modèles murins sont une étape "indispensable" et un préalable absolu à la validation de stratégies thérapeutiques, les modèles in vitro ne pouvant selon lui recréer l'ensemble des interactions cellulaires. Les souris sont mises à mort pour analyses histologiques du cœur.
Objectifs
L’incidence de l’insuffisance cardiaque consécutive à un infarctus du myocarde est en augmentation constante, et la mortalité à court et moyen terme reste élevée, ce qui constitue un enjeu médical et sociétal majeur. Notre projet a pour but de comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent le rôle délétère de certaines cellules de l’immunité, après un infarctus du myocarde chez la souris. Nous utiliserons des modèles de déplétion cellulaires pour étudier la contribution de ces populations. L’utilisation de modèles de souris génétiquement modifiées nous permettra d’analyser spécifiquement le rôle de ces cellules et de certaines protéines associées. Ces animaux subiront un infarctus du myocarde induit chirurgicalement accompagné d'injection d'anticorps, de cellules ou de molécules pharmacologiques. Nous analyserons la fonction cardiaque des souris par échocardiographie et étudierons également le remodelage cardiaque et la réponse inflammatoire post-infarctus. Ce projet est constitué de 4 procédures impliquant au total 9830 souris sur une durée de 5 ans.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre, à court terme, une meilleure compréhension des mécanismes du remodelage cardiaque après infarctus. En particulier, l’identification des mécanismes moléculaires activés au sein de ces cellules est essentielle pour le développement à plus long terme de stratégies thérapeutiques innovantes visant à limiter les dommages tissulaires après un infarctus du myocarde et par conséquent, limiter le développement de l’insuffisance cardiaque et réduire la mortalité post-infarctus.
Procédures
Ce projet comporte une partie d'élevage de souris déficientes pour certains gènes d'intérêt. Lors du sevrage, ces animaux subiront une biopsie de queue ou d'oreille pour génotypage. Une partie des animaux va subir une procédure chirurgicale de 30 min au cours de laquelle un infarctus du myocarde est réalisé. Quatre injections sous-cutanées d’analgésiques (durée inférieure à 30 secondes pour chaque injection) sont prévues, dont une en préopératoire. A différents temps après l’opération, une échocardiographie non-invasive indolore sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse, d’une durée maximale de 15 minutes. Une partie des animaux va subir une injection intrapéritonéale d'une durée maximale de 30 seconde ainsi qu'un prélèvement sanguin hebdomadaire par voie sub-mandibulaire en étant vigile, d'une durée maximale d'une minute (4 prélèvements maximum); une autre partie des animaux va subir des injections intrapéritonéales pour traitement d'une durée maximale de 30 secondes (au maximum une par jour pendant 7 jours soit 7 injections au total) ; une dernière partie des animaux va subir une injection intraveineuse par voie rétro-orbitaire, d'une durée maximale de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension et contention des animaux, potentielle douleur au point d'injection, stress lié à l'anesthésie. Effets de la chirurgie : douleur post-opératoire, mobilité transitoirement réduite suite à l'anesthésie (8 heures). Bien que l'infarctus induise une perte de fonction cardiaque, il n’altère cependant pas la mobilité des souris dans leur cage ni leur comportement.
Devenir
Les animaux issus de la procédure 1 seront utilisés pour constituer les groupes expérimentaux des autres procédure ou au sein de la procédure 1 pour contribuer au maintien de l'élevage des lignées de souris s'ils sont d'un génotype d'intérêt, ils seront mis à mort sinon. Les animaux en fin de procédure 2, 3, et 4 seront utilisés pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur.
Remplacement
Nous avons évalué nos hypothèses in vitro avant de les étudier dans nos modèles murins. Ces derniers sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes survenant au cours de l’infarctus du myocarde. En effet, ces événements sont des phénomènes complexes impliquant un grand nombre de types cellulaires, ce que des modèles in vitro ne pourraient pas permettre de recréer dans leur entièreté. Nous voulons, in vivo, comprendre les différentes interactions cellulaires, mais également tissulaires qui sont mises en jeu au cours des phénomènes de réparation tissulaire consécutifs à une atteinte cardiaque. Ces modèles murins pré-cliniques sont également un préalable absolument nécessaire et indispensable pour la validation des stratégies thérapeutiques afin de les mettre en application chez des patients présentant un infarctus du myocarde.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste. En utilisant des calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux, nous obtenons une taille d’échantillon de 15 souris par groupe. En tenant compte des aléas inhérents à la procédure chirurgicale, nous estimons une taille de groupe à 20 animaux. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal. En ce qui concerne l'élevage, nous aurons une stratégie de croisement des animaux permettant d'optimiser la génération des animaux en fonction des groupes nécessaires pour les expériences et pour la gestion des lignées, à l'aide des tableaux de croisement.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Par ailleurs, il y aura un enrichissement complémentaire dans certains cas particuliers. Lors des procédures expérimentales, la souffrance animale sera réduite au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées, et par, l’établissement et l'application de points limites stricts et spécifiques au projet. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière et renforcée par les expérimentateurs confirmés et par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Les grilles de score de suivi des points limites seront remplies sous contrôle de la personne responsable de la mise en oeuvre du projet.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. De plus, c’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées déficientes pour l’expression des protéines que nous souhaitons étudier. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications vasculaires dans un espace de temps raisonnable. Grace à ces modèles souris, nous pourrons obtenir rapidement des résultats très importants pour notre projet, ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce qui prendrait beaucoup plus de temps à se reproduire et où le nombre de naissance serait nettement moins important. Nous utiliserons des souris adultes non sénescentes, âgées de 10 semaines minium et chez lesquelles le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité. En dessous de cet âge, la variabilité est accrue dans le remodelage et la survie est fortement réduite à la suite d’un infarctus du myocarde.
Evaluation sur modèle ovin d’un dispositif permettant la réalisation de pose de prothèses artérielles sans arrêt circulatoire et sans sutures
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
16 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, quatre d'entre elles étant opérées puis tuées sans réveil. Elles subissent une ou plusieurs chirurgies avec incision d'environ douze centimètres au niveau de la carotide ou de l'artère iliaque, et jusqu'à cinq anesthésies générales, pour valider un instrument censé poser des prothèses artérielles sans arrêt circulatoire ni suture. Le porteur indique que la taille des artères de la brebis est proche de celle de l'humain, ce qui justifie selon lui de tester le dispositif sur cette espèce. Les artères et la prothèse sont prélevées après la mise à mort, présentée comme "indispensable" pour confirmer les données d'imagerie.
Objectifs
Ce projet a pour objectif la validation d'un instrument chirurgical innovant dans le cadre de la réalisation d’un pontage artérielle (technique chirurgicale consistant à créer une dérivation afin de court-circuiter une artère endommagée), qui est employé pour la prise en charge de certaines pathologies vasculaires. Ce projet sera constitué d'une étude pilote (phase réalisée en aigue) et d'une étude de validation du dispositif (sur 3 mois de suivi).
Bénéfices attendus
A l’issue de cette étude, le dispositif innovant sur lequel porte ce projet pourrait permettre de réaliser des pontages artériels sans arrêt circulatoire et sans suture. Ces pontages seront utilisés dans le traitement de certaines pathologies vasculaires. Le dispositif d’intérêt pourrait permettre de faciliter le geste technique chirurgical et de limiter la morbidité associée à la chirurgie et, ainsi, d’améliorer la prise en charge de ces pathologies vasculaires.
Procédures
Les animaux de l'étude pilote (n=4) auront une anesthésie générale, ceux de l'étude de l'efficacité (n=12) auront 5 anesthésies générales au total. Tous les animaux auront une procédure chirugicale (incision d'environ 12cm) au niveau de la carotide droite ou de l'iliaque droite, les animaux de l'étude pilote auront les 2 (durée de la chirurgie évaluée à 1h30 maximum). Les animaux de l'étude d'efficacité auront chacun 4 sessions d'imagerie médicale (contrôles échographiques et scanographiques) effectuées 7 jours, 1 mois, 2 mois et 3 mois après l'intervention chirurgicale (durée de 45 min à chaque fois).
Impact sur les animaux
Isolation de l'animal pour la prémédication ce qui peut etre source de stress. Mise en place d'un cathéter veineux en jugulaire. Intubation, mise sous respiration mécanique et anesthésie générale gazeuse. Le projet nécessite de réaliser juqu'à 5 anesthésies générales par animal. Incision (environ 12cm) au niveau de l'encolure ou de la région iliaque droite. Scanner au temps basal, à J7, M1, M2 et M3.
Devenir
Tous les animaux (n=16) du projet seront mis à mort à la fin de la procédure pilote ou des 3 mois de suivi de la procédure d'efficacité. Le prélèvement des artères et de la prothèse est indispensable afin de pouvoir confirmer les données d'imagerie par des analyses histologiques.
Remplacement
Le dispositif a été testé au préalable sur bancs d’essai (simulateur). Cet instrument doit encore être éprouvé in vivo afin de vérifier la possibilité de mise en œuvre technique. A l’état actuel des connaissances scientifiques, la complexité du système cardiovasculaire impose de tester le dispositif sur modèle animal. Les tailles des artères de la brebis sont proches de celles de l'humain, ce modèle permet donc de tester le dispositif dans sa version finale, identique à celle qui pourra être utilisée chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au maximum en veillant toutefois à obtenir un nombre suffisant de dispositifs implantés pour réaliser une évaluation de l'efficacité. La réalisation d’une étude pilote sur 4 animaux permettra de valider au préalable une faisabilité technique et de déterminer la zone d'implantation la plus adaptée (carotide ou aorte) pour l'étude d'efficacité. Si l’étude de faisabilité ne donne pas de résultats satisfaisants, l’étude d'efficacité ne sera pas entreprise et seuls 4 animaux seront utilisés in fine.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales ainsi que l’environnement d’hébergement ont été optimisés. Les animaux arriveront par groupe de 2 à 6 et seront hébergés ensemble dans un box avec de la fibre de bois au sol et des objets d'enrichissement (jouets, ballots de foins), une période d'acclimatation de 5jours sera respectée avant toute procédure. Les gestes interventionnels seront toujours réalisés sous anesthésie générale, par du personnel formé, permettant un temps interventionnel réduit au maximun, afin de prévenir la souffrance et l’angoisse des animaux. Le bien-être des animaux sera contrôlé en veillant aux conditions d'hébergement et au comportement des animaux. Des observations quotidiennes seront réalisées par une personne compétente basées sur l'apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (bruits...). Ces contrôles permettent de repérer tout animal malade ou blessé pour prendre des mesures appropriées. Tout constat d'un mal-être est remonté au responsable du bien-être des animaux pour examen approfondis, traitements adaptés et/ou consultation du vétérinaire référent. Les contrôles effectués au temps basal puis 7jours, 1, 2 et 3 mois après l'intervention chirurgicale se feront par imagerie médicale (échographie et scanner) qui est une approche non invasive, qui n’est pas source de douleur. L’utilisation de la contention physique douce, possible chez la brebis (réalisée notamment pour la tonte des animaux), pour la mise en place de la voie veineuse jugulaire externe est préférable à l’administration d’une prémédication intramusculaire source de douleur et de stress. La mise en place d’un tissu sur les yeux lors de la contention douce de l'animal réduit les stimuli externes et donc le stress de l'animal. Une fois la voie veineuse périphérique mise en place, l’anesthésie générale est induite en quelques secondes et sera maintenue par halogénés.
Choix des espèces
La brebis est un animal proche de l’Homme d’un point de vue physiologique et anatomique (taille, structure et forme des organes, etc.). Les dispositifs médicaux de la clinique humaine peuvent directement être utilisés chez l’ovin. L'utilisation d'équipements d'imagerie médicale destinés à l'Homme permet d'avoir une qualité d'imagerie équivalente à celle obtenue chez l’humain. D’autre part, contrairement au Porc, la Brebis possède une stabilité dans le diamètre des vaisseaux qui n’augmente pas de manière significative à partir d’un certain âge. Cette caractéristique permet au dispositif de rester en place tout au long de la période suivi post-chirurgical dans le cadre de l’étude d'efficacité. Cette étude pourra également servir de référence si une autre étude avec un suivi sur du long-terme (1an) est nécessaire. En effet, ceci serait impossible chez le Porc qui atteindrait un poids d'environ 300kg. Les animaux seront des Brebis adultes (de 5 à 8 ans). En effet, la taille des artères doit être suffisante pour pouvoir mettre en place le dispositif et surtout leur diametre ne doit plus varier pendant le temps de suivi.
Élevage et maintien de modèles murins pour l’étude de la maladie de Huntington à phénotype dommageable (1/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
2 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Élevées pour reproduire la maladie de Huntington, elles portent une mutation qui provoque en vieillissant des symptômes neurologiques et moteurs que le porteur décrit comme visibles uniquement lors de tests comportementaux dédiés, sans les détailler. Maintenues sous forme hétérozygote, elles sont mises à mort à la fin de leur vie reproductive, vers huit mois, et leur cerveau est prélevé. Le porteur indique qu'aucune méthode alternative ne reproduit la complexité d'un organisme vivant et revendique la nécessité de générer ces animaux pour plusieurs projets.
Objectifs
Il s’agit d’un projet d’élevage et de maintien dans 2 établissements utilisateur de differents modèles de souris génétiquement altérés avec des mutations qui entrainent l'apparition de la maladie de Huntington comme dommage. Le but de ce projet est donc de générer les animaux nécessaires pour étudier cette maladie. L'utilisation de ces animaux est essentielle pour mener à bien plusieurs projets de recherche, qui vont nous permettre de répondre à des questions majeures sur les mécanismes de mise en place de la maladie de Huntington et aboutissant sur des innovations thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L'élevage et le maintien de ces lignées de souris ont pour but de générer le nombre d'animaux nécessaires à plusieurs projets de recherche tout en surveillant l'apparition de phénotypes dommageables et en assurant le bien être animal. Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs des projets visant à mieux comprendre les mécanismes de mise en place de la maladie de Huntington et aboutir à des innovations thérapeutiques permettant de retarder la progression de la maladie, ou d’empêcher l’apparition des symptômes.
Procédures
Les animaux de ce projet seront mis en reproduction et/ou maintenus en vie jusqu'à la fin de leur vie reproductive. Ces animaux vont développer en vieillissant la maladie de Huntington caractérisé par de symptômes neurologiques et moteurs légers qui ne sont observés que lors de certains tests comportementaux conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte d'autonomie ni de perte de poids excessive.
Impact sur les animaux
Les animaux de ce projet ont un phénotype qui peut devenir dommageable avec l’âge. Pour la prise en charge de ce phénotype, les animaux seront toujours maintenus sous forme hétérozygote, qui se caractérise par l’expression de symptômes légers. Les symptômes neurologiques et moteurs associés aux modèles ne sont observés que lors de certains tests comportementaux conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte d'autonomie ni de perte de poids excessive. Nous ne nous attendons donc pas à observer des altérations significatives de la qualité de vie des animaux, ni de morts prématurées dû au phénotype. Nous pouvons identifier 3 nuisances légères potentielles: 1) un stress léger pendant leur transport d'un établissement à l'autre; 2) un stress léger lors de la manipulation par l'expérimentateur pendant la mise en place des croisements; 3) un stress pour les mâles reproducteurs lors de leur isolement pour les mettre en croisement jusqu'à la fin de leur vie reproductive.
Devenir
Étant donné qu'il s'agit d'élevage d'organismes génétiquement modifiés, l'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de leur vie reproductive.
Remplacement
Nous avons précédemment démontré que les modèles murins actuelles reproduisent plusieurs des principales caractéristiques pathologiques de la maladie de Huntington in vitro et in vivo, ce qui nous a permis de répondre à des questions majeures sur les mécanismes moléculaires de la maladie et d'aboutir à des innovations thérapeutiques dans les dernières années. Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs de nos projets de recherche et reproduire la complexité d’un organisme vivant. De plus, nous avons développé de nouveaux modèles murins afin de pouvoir étudier le rôle de la protéine responsable de la maladie de Huntington en conditions physiologiques et pathologiques.
Réduction
Nous allons générer 2880 animaux pendant les 5 années du projet pour le maintien de 3 lignées différentes. Le nombre d'animaux a été determiné de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisé tout en gardant suffisamment d'individus pour ne pas compromettre la validité des expériences et nous permettre d’obtenir des conclusions scientifiquement solides pour l’ensemble des projets de recherche. L'ensemble du schéma d'élevage et de maintien des animaux proposé est en accord avec les recommandations des organismes compétents en matière d'élevage de souris. De plus, nous prélèverons le cerveau de tous les animaux générés à la fin de leur vie reproductive. Ainsi, nous pourrons les utiliser afin de mettre au point de futures expériences sans devoir générer d'autres animaux, dans un principe de réduction du nombre d’animaux utilisés pour nos projets.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages équipées d’une litière stérile et d’un enrichissement prévu par l'animalerie permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. Tous deux seront changés toutes les semaines. Les cages seront équipées d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, changés également toutes les semaines. Le transport des animaux sera effectué en cages occultées avec enrichissement et des croquettes mouillées dans la cage. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. Pour reduire au maximum leur stress lors de la manipulation pendant la mise en place des croisements, un seul manipulateur (zootechnicien ou utilisateur) réalisera ce geste. L’état de santé des animaux sera surveillé régulièrement par des mesures de leur poids jusqu'à leur mise à mort. En particulier pour les mâles reproducteurs isolés, nous surveillerons plus attentivement l'apparition de signes de stress (comme l'alopécie) et, si nécessaire, ils seront remplacés avant la fin de leur vie reproductive pour minimiser leur stress. L’état de santé des animaux sera surveillé pendant toute la durée de l’étude. Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de la maladie de Huntington. Pour cela, nous utilisons des souris issues de la transgénèse classique. Les modèles murins permettent de comprendre le rôle de la huntingtine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les mâles et femelles reproducteurs hétérozygotes seront maintenus en vie jusqu’à l'âge de 8 mois, quand leur fertilité diminue de manière considérable. À ce stade, les symptômes neurologiques et moteurs associés aux modèles ne sont observés que lors de tests comportementaux conçus à cet effet mais ne deviennent pas handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte de poids excessive.
Approche thérapeutique de la leucodystrophie métachromatique par encapsulation de cellules et implantation sous durale, preuve de faisabilité́ et tolérance chez le primate non humain
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
15 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue pour études histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation sous anesthésie, trois IRM et jusqu'à neuf ponctions de sang et neuf ponctions de liquide céphalo-rachidien, pour tester la faisabilité d'une thérapie de la leucodystrophie métachromatique. Le porteur reconnaît des risques anesthésiques, des douleurs post-opératoires et des fuites de liquide provoquant maux de tête et vomissements. Il présente l'étape chez le primate comme "indispensable" et "requise" par l'agence du médicament avant un essai chez l'humain, l'efficacité n'ayant été montrée que chez la souris.
Objectifs
La leucodystrophie métachromatique (MLD) est une maladie neurodégénérative héréditaire conduisant à une perte de myéline (gaine qui isole la fibre nerveuse) qui s’accompagne de signes cliniques très sévères cognitifs et moteurs chez le jeune enfant avec une dégradation très rapide dans les 6 mois suivant les premiers symptômes et un décès des patients dans les deux ans au maximum. De nos jours la majorité des patients atteints de MLD sont diagnostiqués lorsque leurs symptômes sont déjà bien installés (patients symptomatiques). Les traitements actuels, présentent de bons résultats pour les enfants traités avant l’apparition des symptômes mais restent inefficaces une fois les symptômes présents. L’enjeu pour cette maladie est donc de trouver des traitements pouvant agir sur les patients symptomatiques. Une composante particulière de la MLD est la neuro-inflammation que développent les patients et qui est présente aussi dans le modèle souris de la pathologie. Dans ce contexte, nous proposons de mener le projet de recherche qui a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle thérapie pour le traitement de la pathologie. L’efficacité de la thérapie a été évaluée préalablement dans le modèle murin de la pathologie et les résultats préliminaires démontrent des résultats très encourageant. L’objectif ici est de démontrer la faisabilité et la tolérance de notre approche chez le primate non humain (PNH).
Bénéfices attendus
À l’heure actuelle il n’existe aucun traitement pour les patients atteints de leucodystrophie métachromatique (MLD) ayant des symptômes déjà bien installés (patients symptomatiques). Ce projet a pour but d'identifier une nouvelle voie thérapeutique pour ces patients. Le projet sera mené sur un modèle animal extrêmement proche de l’être humain afin de pouvoir proposer pour les différentes pathologies d’intérêt, un traitement et sa mise en place. A terme l’objectif est de pouvoir mettre en place un essai clinique chez l’Homme dans les prochaines années.
Procédures
- 3 examens par Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 2h), sous anesthésie générale repartis dans le projet ( un pré op, un immédiatement après la chirurgie et un avant la necropsie - Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie sera pratiquée sur les animaux (durée environ 1h30). - 9 prélèvements sanguins maximum et 9 prélèvements de Liquide céphalo rachidien (LCR) (durée du geste maximum 30min pour les 2 gestes, respectivement 10 min et 15 min max) réalisés sous anesthésie générale et analgésie. Dans ce projet, une même anesthésie générale permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + prélèvements de Liquide céphalo rachidien + IRM selon les temps d’intérêt de l'étude, ou chirurgie + IRM). des administrations IM en vigile pour induire l'anesthésie et la pose de cathéter à chaque IRM
Impact sur les animaux
L’animal sera confronté à une chirurgie sous anesthésie générale générant un risque anesthésique et infectieux, et de potentielles douleurs post-opératoires. Sur le protocole, plusieurs prélèvements de sang et de LCR seront réalisés amenant un risque de fuite de LCR (maux de tête, vomissements, signes neurologiques ) et la formation possibles d’hématomes au niveau des sites de ponctions. Enfin, l’animal sera soumis à un stress lié à la contention en cage pour la réalisation des injections (anesthésie, analgésie, antibiotique,…) même s’il est réalisé par des personnes formées et auxquelles les PNH sont habitués.
Devenir
A la fin du projet, l'ensemble des animaux (n=15) sera euthanasié pour permettre les etudes histologiques et de biodistribution composant l'etude preclinique permettant de supporter une étude de Toxicologie et la soumission aux agences reglementaires.
Remplacement
Toutes les études possibles sur des cellules ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des constructions et des implants. Une preuve de concept a été établie dans le modèle souris de la pathologie. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude d’efficacité et de tolérance chez le gros animal (primate non humain). Ces étapes sont requises par l’Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé pour toute demande d’autorisation d’étude clinique chez l’Homme.
Réduction
Il y a 15 animaux maximum prévus sur ce projet, correspondant au minimum requis pour la validation de l’efficacité des différentes approches avec des lots d’animaux. Une première étude de faisabilité sur 4 animaux suivi d’une étude de toxicité sur 11 PNH maximum, repartis en lot de 2 à 3 individus selon les demandes de nos partenaires et des agences réglementaires. L'étude concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié sans analyse statistique.
Raffinement
Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, les procédures sont réalisées par du personnel formé et experimenté. Le nombre d'anesthesies est minimisé en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et conforme aux recommandation en terme de Bien être animal validé par le vétérinaire), ponction lombaire) au sein de la même anesthesie. Les animaux sont hebergés en groupe et recevront un enrichissement adapté. Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthesie. Un analgésique sera utilisé pour éviter tout inconfort. La procédure chirurgicale est raffinée avec un protocole d’anesthésie et d’analgésie approprié, un suivi et un maintien des paramètres physiologiques de l’animal. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si necessaire. Des points limites ont été définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Enfin, en termes de raffinement nous avons travaillé sur la taille de notre puce à implanter qui est 10 à 15 fois plus petite que celle de notre étude précédente qui avait été utilisée chez la souris et donc parfaitement adaptée à l’implantation prévue dans ce projet. Tout ce projet sera réalisé en conditions de Bonnes Pratiques de Laboratoire (BPL) pour bénéficier du meilleur suivi qualité et permettre la valorisation de ces expériences auprès des agences réglementaires françaises et internationales en vue d’un essai clinique de phase I/II chez l’homme.
Choix des espèces
La capacité des implants a secréter de manière efficace de la protéine d'interet qui soit mobilisable par les systèmes nerveux centraux et périphériques est dépendante de l’organisme dans lequel on réalise l’implantation. Ainsi à finalité clinique, l’implantation chez le primate non humain est une étape indispensable en vue de la préparation d’un dossier d’essai clinique afin d’obtenir les donner de faisabilité et de tolerance dans un organisme entier qui soit en plus comparable à l’homme d’un point de vue physiologique et immunitaire notamment. Les animaux utilisés sont des macaques adultes (2-8 ans) (2 à 10 Kg) ayant un cerveau complètement développé́, de plus compte tenu des patients ciblés par nos approches, ils auront une taille similaire à nos patients pédiatriques.
Évaluation de l’innocuité d’une nouvelle molécule, administrée par voie intranasale, chez la souris saine
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
160 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une à trois administrations intranasales d'une molécule sous anesthésie, pour évaluer sa tolérance avant des essais d'activité contre une bactérie et le virus de la grippe. Le porteur indique n'attendre aucun effet secondaire, la molécule s'étant montrée non toxique en culture cellulaire, mais prévoit un suivi du poids et de la température. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne renseigne sur la tolérance d'un "organisme entier", d'où le recours aux souris pour cette étape préalable.
Objectifs
Chaque année, dans le monde, le nombre de cas de grippe est d’environ 1 milliard et le nombre de décès liés à la grippe est estimé entre 290 000 et 600 000. L’émergence d’une pandémie, comme celle de COVID-19, met fortement en évidence l’impact sanitaire, social et économique d’une infection virale incontrôlée. Ainsi, chaque pays est également confronté à des défis de sécurité. Même si la vaccination est la stratégie la plus efficace contre les virus, la courte durée de l’immunité induite par le vaccin, associée à la dérive antigénique intrinsèque des virus, affecte négativement cette protection. En parallèle, l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) alerte aussi sur les maladies résistantes aux médicaments, qui pourraient être responsables de 10 millions de décès chaque année d’ici à 2050. Parmi ces maladies, celles ayant pour origine des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques présentent un risque critique, avec une menace particulière dans les hôpitaux, les maisons de retraite, etc. Une liste de bactéries a été publiée et comporte notamment Pseudomonas aeruginosa dont certaines souches sont devenues multi-résistantes aux antibiotiques. Ces souches peuvent entraîner des infections sévères, telles que des pneumonies qui peuvent conduire au décès des patients. De nouvelles molécules antivirales et antibactériennes sont donc à développer de toute urgence. Le projet actuel a pour objectif d’évaluer in vivo l'innocuité d’une molécule que nous appelerons M, pour déterminer les doses auxquelles elle pourra être utilisée ensuite dans une autre demande d'autorisation de projet pour évaluer ses activités antibactérienne et antivirale, dans le contexte d’une infection par P. aeruginosa ou par le virus de la grippe, chez la souris. En effet, cette molécule a déjà montré une activité antivirale et antibactérienne in vitro, sans toxicité aux doses utilisées.
Bénéfices attendus
Notre projet consiste à évaluer l'innocuité d’une nouvelle molécule M prometteuse chez la souris saine. Cette molécule M possède une activité in vitro contre P. aeruginosa et contre le virus de la grippe, à des doses non cytotoxiques. Les expériences montrent que cette molécule ne semble pas favoriser la résistance et propose une solution de traitement avec une administration par voie nasale, ce qui permet d’interagir directement avec la muqueuse nasale et pulmonaire. Les expériences permettront de déterminer la dose la plus appropriée à utiliser pour démontrer son activité antivirale et antibactérienne in vivo. Ceci concernera une autre demande puisque les expériences devront être réalisées dans une animalerie A2 qui permet d'utiliser des micro-organismes de classe de risque 2, c'est-à-dire des pathogènes pouvant provoquer une maladie chez l'homme et pour lesquels une prophylaxie ou/et des traitements sont efficaces. Cette nouvelle molécule permettrait ainsi d’apporter une nouvelle stratégie pour lutter contre Pseudomonas aeruginosa et contre le virus de la grippe.
Procédures
Dans une première expérience, les souris recevront 1 seule administration intranasale de la molécule M ou de solution contrôle, sous anesthésie générale induite par voie intrapéritonéale. Dans une seconde expérience, les souris recevront 2 ou 3 administrations intranasales de la molécule M ou de solution contrôle, sous anesthésie générale induite par voie gazeuse. La durée d’une administration intranasale, anesthésie comprise, dure environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les contentions engendrent du stress pour l'animal et l'injection intrapéritonéale pour l'anesthésie générale peut entraîner une légère douleur au niveau du site de l'injection. L’administration de la molécule M ne devrait pas provoquer d’effets secondaires car les tests en culture cellulaire ne montrent pas de cytotoxicité aux doses efficaces, mais les souris feront l’objet d’un suivi bi-quotidien et nous mesurerons notamment la température corporelle et le poids et nous observerons attentivement leur comportement.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à la fin de chaque plan expérimental afin de prélever des organes et d’analyser les différents paramètres de la tolérance.
Remplacement
Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d’un organisme entier. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que la molécule a déjà démontré in vitro son efficacité antibactérienne et antivirale à des doses non cytotoxiques en culture cellulaire.
Réduction
Chaque procédure a été conçue pour utiliser le minimum de souris, en utilisant les tests statistiques adaptés. De plus, les expérimentations sont également conduites en recherchant un éventuel « effet sexe ». Ainsi, un total de 160 souris est donc nécessaire pour ce projet.
Raffinement
Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée de façon pluriquotidienne par les animaliers et les expérimentateurs, afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. Les souris seront habituées aux manipulations les jours précédant l’expérimentation, en les sortant de la cage et en associant la manipulation à un renforcement positif en donnant une récompense alimentaire (bout de biscuit, pomme, etc.). De plus, l'administration intranasale sera effectuée sous anesthésie générale suivie d’une analgésie éventuelle (paracétamol 200 mg/kg). Afin d’identifier la souffrance et la douleur, nous avons établi une grille permettant d’évaluer différents paramètres et de prendre en considération différents points limites.
Choix des espèces
Lors de ce projet, nous utiliserons la même souche de souris qui sera ensuite utilisée pour étudier l’inflammation et les réponses immunitaires. De plus, la souris, de par sa petite taille, permet une logistique aisée, et constitue un bon support pour tester les nouvelles approches thérapeutiques dans les modèles précliniques. Ainsi, cette souche de souris limite de ce fait le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (entre 8 semaines et 12 semaines) pour avoir un système immunitaire mature mais non vieillissant en vue des doses à utiliser dans un contexte infectieux pour tester l'activité antivirale et antibactérienne de la molécule M. De plus, les expériences seront conduites en utilisant des souris mâles et de femelles afin de rechercher un éventuel « effet sexe ».
Etude du profil pharmacocinétique de formulations à libération prolongée du médicament X administrées par voie sous-cutanée chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection sous-cutanée d'une formulation à libération prolongée puis onze prélèvements sanguins à la veine de la queue, pour comparer le profil pharmacocinétique de six formulations d'un "laboratoire pharmaceutique client". Le porteur reconnaît que les prélèvements répétés stressent les animaux et peuvent léser leur queue. Il présente le recours à l'animal entier comme "nécessaire et obligatoire d'un point de vue réglementaire" et retient le rat plutôt que la souris pour son volume sanguin plus élevé.
Objectifs
Le laboratoire pharmaceutique client a développé des matrices de type gel qui peuvent être complexées avec des composés thérapeutiques et être administrées par voie sous-cutanée afin d'induire une libération prolongée du composé complexé. Ce type de formulation (ou galénique) permet ainsi, en théorie, de réduire très sensiblement la fréquence d'administration de médicaments dont la voie d'administration est sous-cutanée. Néanmoins, il est nécessaire de tester, pour chaque composé à complexer, sa stabilité à moyen long terme dans la matrice afin que ce dernier conserve son efficacité. Par ailleurs, la durée de libération va également dépendre étroitement de la composition du gel. Le présent projet vise ainsi à explorer le profil pharmacocinétique de 6 formulations à libération prolongée du médicament X administrées par voie sous-cutanée chez le rat, dans le but d'optimiser son développement. Les données obtenues seront comparées aux profils pharmacocinétiques obtenus après administration d'une galénique classique du composé X par voie intraveineuse et sous-cutanée. La formulation permettant la meilleure stabilité du compose X et de ses paramètres pharmacocinétiques sera conservée pour la suite du développement, notamment dans un cadre clinique.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de catégoriser les formulations à libération prolongées du médicament X de notre client en fonction de leur paramètres pharmacocinétiques et de prioriser les meilleures formulations pour la suite du développement préclinique et clinique. La formulation à libération choisie prolongée devrait à terme permettre de réduire considérablement la fréquence d'administration du composé X qui est déjà utilisé en clinique humaine sous sa forme galénique classique.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Pesée (1min ; 2 fois). Habituation aux boîtes de contention (5min ; 2 fois). Anesthésie gazeuse (5min ; 1 fois). Administration sous-cutanée du composé d'intérêt (1min ; 1 fois). Prélèvements sanguins (5min ; 11 fois).
Impact sur les animaux
La répétition des prélèvements sanguins via la veine de la queue est de nature à induire un stress aux animaux. Par ailleurs, ces prélèvements répétés pourraient s'avérer générateurs de lésions problématiques au niveau de la queue. Afin de limiter le stress, les animaux seront manipulés de façon quotidienne par les expérimentateurs et habitués aux systèmes de contention utilisés au cours des prélèvement. Afin de se prémunir de lésions potentielles au niveau du site de prélèvement sanguin, ceux-ci seront pratiqués à l'aide de microperfuseurs à ailettes, ces derniers autorisant un prélèvement sanguin en n'insérant que le premier millimètre de l'aiguille dans la veine. Une attention particulière sera portée à la queue des animaux. Si un hématome venait à apparaitre, les prélèvements suivants seraient pratiqués sur le côté opposé de la queue. Par ailleurs, le volume de sang prélevé pour chaque point est limité au volume minimum possible pour la réalisation des analyses pharmacocinétiques (PK) ultérieures.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Après euthanasie, certains organes seront prélevés (coeur, poumons, cerveau...) afin d'étudier une accumulation éventuelle à leur niveau du composé X ou d'éléments constituants de la matrice de libération prolongée.
Remplacement
Le présent projet vise à déterminer les paramètres pharmacocinétiques de formulations à libération prolongée d'un médicament X. Le recours à l’animal entier reste une étape nécessaire et obligatoire d'un point de vue règlementaire pour ce type d'étude. Le choix du modèle rat a été préféré à la souris du fait des capacités accrues de prélèvements sanguins sur ce modèle (volémie plus importante).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure d'obtenir des données significatives sur les paramètres pharmacocinétiques étudiés. Le nombre d'animaux par groupe a été choisis selon les recommandations d'un ouvrage de référence. Le nombre de 6 animaux par groupe a été choisi en tenant compte d'une possibilité de variabilité plus importante de la biodisponibilité des drogues progressivement libérées par la matrice en sous-cutanée par rapport à une administration classique (libération immédiate).
Raffinement
Le modèle animal qui sera utilisé est parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études pharmacocinétiques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Notamment, les volumes des prélèvements sanguins en série seront limités au strict nécessaire pour l'élaboration des dosages. Par ailleurs, les prélèvements seront réalisés par ponction de la veine de la queue à l'aide de microperfuseurs à ailettes, ces derniers autorisant un prélèvement sanguin en n'insérant que le premier millimètre de l'aiguille dans la veine. Les animaux seront hébergés avec un enrichissement du milieu de vie qui sera assuré par l'ajout de petites briquettes en bois et de tubes cartons spécifiques pour rat. Enfin, un suivi journalier des animaux permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis (administration d'analgésiques; cf annexes).
Choix des espèces
Le rat a été préféré à la souris compte tenu du nombre de prélèvements et des volumes sanguins nécessaires à l'étude. La même étude sur la souris aurait nécessité de limiter drastiquement le nombre de prélèvements par animal, ce qui aurait eu pour conséquence d'augmenter considérablement les effectifs de l'étude. Par ailleurs à ce stade, les études sur animaux non rongeurs n'ont pas été envisagées par soucis de Remplacement (Règle des 3Rs). Il nous apparait que les études sur les mammifères non murins devraient être limitées aux études règlementaires sur des molécules actives déjà sélectionnés. Or dans le cas présent il s'agit d'une étude de sélection de formulations, permettant d'optimiser la recherche et développement du client et de limiter le développement ultérieur aux formulations présentant les meilleurs propriétés pharmacocinétiques. Les animaux utilisés seront des rats adultes (300 g à réception/350g env. au démarrage des expérimentation). Ce stade de développement a été choisis: - en se basant sur le recommendations d'un ouvrage de référence. - en considérant le nombre de prélèvements et les volumes sanguins nécessaires à la bioanalyse.
Développement de stratégies pharmacologiques pour limiter la sévérité des Accidents Vasculaires Cérébraux survenant en contexte de Maladie Rénale Chronique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système urogénital
Rats : 920
3 180 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour la plus grande partie d'entre eux. Ils subissent une chirurgie provoquant un arrêt transitoire de la circulation cérébrale, équivalent d'un AVC, ou l'ablation de cinq sixièmes de la masse rénale, une maladie rénale pouvant aussi être induite par un régime enrichi en adénine. Le porteur reconnaît que ces interventions provoquent "indubitablement" douleur, altération de l'état général et stress. Il affirme que la communication entre rein et cerveau est "impossible à modéliser autrement que [par] l'animal", le bénéfice pour les patients restant présenté comme une possibilité.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de caractériser les atteintes cérébrales au cours d'une maladie rénale chronique, et après un Accident Vasculaire Cérébral survenant dans un contexte de Maladie Rénale Chronique, particulièrement sur la dysfonction de la barrière-hémato-encéphalique (barrière biologique séparant la circulation sanguine du système nerveux) et de neuroinflammation (inflammation au niveau cérébral), dans différents modèles murins. En complément, nous développerons une approche pharmacologique afin d’identifier des voies impliquées et proposer des cibles thérapeutiques innovantes dans ce contexte.
Bénéfices attendus
La possibilité d'améliorer la prise en charge et le pronostic neurologique des patients atteint d'une maladie rénale chronique présentera un bénéfice en santé humaine.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie (acte chirurgical d'environ 30 minutes) visant à induire un arrêt de la circulation cérébrale transitoire (équivalent à un accident vasculaire cérébrale) ou une néphrectomie (retrait de 5/6 de la masse rénale totale). Les animaux seront soumis à une administration d'un candidat médicament. Les imageries (jusqu'à 4 par animal) seront espacées d'au moins 24h pour une durée maximale de 30minutes. Enfin une quantité de sang des animaux sera prélevée à la fin de l'étude.
Impact sur les animaux
L'ablation de 5/6e de la masse rénale totale, l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne et l'induction d'une maladie rénale par un régime riche en adénine provoquent indubitablement une douleur, une altération de l'état général et un stress de l'animal : douleur provoquée par la procédure chirgurgicale - une alétration de l'état général : une perte de poids, une déshydratation - hémorragie per-opératoire (rare). L'imagerie et l'injection de traceurs nécessiteront une anesthésie et pourront engendrer un stress. Les tests comportementaux pourront induire un stress par des manipulations quotidiennes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort au terme de la procédure.Les organes seront prélevés pour réaliser des analyses histologique et biochimique
Remplacement
Partant de nos résultats observés chez le rat et la souris. Nous étudions une communication entre des organes qui sont le rein et le cerveaux et qu'il est impossible de modéliserautrement que pour l'animal. De plus, pour caractériser les atteintes neurologiques fonctionnelles lors d'une maladie rénale chronique, nous réalisons des évaluation neuro-comportementales des animaux, qui n'est pas modélisable in vitro ou in silico.
Réduction
Comme évalué dans des expériences précédentes notamment concernant les études neurocomportementales, des lots de 9 animaux sont nécessaires afin d’obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences significatives entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre et ainsi obtenir un échantillon de taille suffisante pour l’étude de nos résultats. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants pour s’affranchir d’une variabilité liée au lot.
Raffinement
Pour assurer le bien-être des animaux pendant et après la chirurgie, tous les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et s'accompagneront d'une prise en charge peri-opératoire de la douleur (injection d'analgésique avant, pendant et après la chirurgie). Après chirurgie de la nourriture humidifiée sera mise à disposition des animaux à volonté pour anticiper des difficultés de mobilité de l'animal. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne, par du personnel qualifié et formé, de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée quotidienne pendant toute la durée du protocole. Les critères d’arrêt sont la prostration, la présence de plaies ne cicatrisant pas, ou la perte de 20% du poids initial.
Choix des espèces
Les modèles de MRC proposé ont été développé et validé chez le rongeur. De plus, ces espèces permettent également le recours à des techniques validées d’évaluation neurocomportementale, d’imagerie cérébrale, et d’immuno-histochimie cérébrale, permettant de répondre à nos hypothèses. Tous les rats sont livrés à l'âge de 5 semaines. Une période d'acclimatation d'une semaine est respectée avant le début des procédures. Les rats sont donc soumis aux procédures à l'âge de 6 semaines. Toutes les souris sont livrés à l'âge de 7 semaines. Une période d'acclimatation de 2-3 semaines est respectée avant le début des procédures. Les animaux sont donc soumis aux procédures à l'âge de 9-10 semaines. Des animaux jeunes sont utilisés pour éviter l'accumulation de tissu adipeux autour du pédicule rénal, qui peut géner l'interruption de la circulation.
Identification des neuroadaptations suite à l’administration de drogues d’abus chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des structures cérébrales, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 280 et modéré pour 320. Elles reçoivent des injections répétées de cocaïne, d'héroïne ou de THC, une chirurgie de délivrance de nicotine ou une exposition à des vapeurs d'alcool, pour chercher des adaptations moléculaires communes à cinq drogues. Le porteur indique que les injections répétées provoquent un stress et que les animaux peuvent développer des symptômes d'addiction. Il affirme que ces effets ne peuvent pas être étudiés sur des modèles cellulaires et "nécessite[nt] l'analyse d'organismes vivants et entiers", et souligne que la souris partage 99 % de son génome avec l'humain.
Objectifs
Ce projet de recherche s’intéresse aux troubles liées à l’usage de substances psychoactives et particulièrement à la toxicomanie et vise à identifier les mécanismes moléculaires et épigénétiques ( c’est-à-dire l’étude des changement dans le contrôle de l’expression des gènes n’impliquant pas de changement dans la séquence d’ADN ) impliqués et participant au développement de ces troubles cérébraux. Bien que chaque substance psychoactive ait des profils pharmacologiques et des cibles distincts dans le cerveau, leur symptomatologie commune reflète l'hypothèse générale selon laquelle elles recrutent des mécanismes physiopathologiques convergents. Les processus et adaptations moléculaires communs de ces diverses drogues d'abus restent très peu étudiés. L’objectif de ce projet est de combiner des études post mortem sur l'homme et des études sur les rongeurs, afin de caractériser de façon moléculaire les tissus cérébraux et d’identifier les adaptations spécifiquement associées à l’exposition à 5 drogues d’abus : alcool, cocaïne, THC, héroïne et nicotine. Les études portées chez la souris consisteront à réaliser une administration de chaque drogue d'abus séparément, permettant alors de décomposer leur contribution respective aux effets moléculaires précédemment observés chez les polytoxicomanes humains.
Bénéfices attendus
Les études sur les souris devraient nous permettre d'identifier les adaptations épigénétiques épigénétiques ( c’est-à-dire l’étude des changement dans le contrôle de l’expression des gènes n’impliquant pas de changement dans la séquence d’ADN ) spécifiquement associées à l'exposition aux quatre principales drogues d'abus, et les comparer à ceux parallèlement observer chez des patients polytoxicomanes. Afin de caractériser les adaptations moléculaires la polytoxicomanie dans le cerveau.
Procédures
les aniLes animaux seront soit soumis à des injections de cocaïne (10 injections), d’héroïne (11 injections) et de THC (10 injections), à une chirurgie permettant la délivrance de la nicotine (durant 6 jours), ou seront exposés à des vapeurs d’alcool (durant 9 jours). Durée maximale des injections est de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront présenter un état de stress en lien avec les injections répétées avec une douleur considérée comme légère, et des risques de nuisance dues aux actes chirurgicaux vec une douleur considérée comme modérée. De plus, les animaux pourront présenter des symptômes d’addiction, entrainant une douleur considérée comme légère.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérience afin de réaliser le prélèvement des structures cérébrales d’intérêt.
Remplacement
"Remplacer" : les effets moléculaires des drogues d’abus, sur le cerveau et d’autres tissus de l’organisme, ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires, qui par nature ne récapitulent ni la complexité de l’organisation cérébrale en réseaux complexes de structures interconnectées, ni les communications inter- tissulaires. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes vivants et entiers.
Réduction
"Réduire" : Les animaux utilisés étant consanguins, la variabilité phénotypique est limitée, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant potentiellement en évidence un effet statistiquement significatif. Ainsi, au regard des données de la littérature et de la variabilité interindividuelle attendue, les groupes expérimentaux destinés à caractériser les comportements liés aux effets de récompense seront constitués de 20 souris chacun (par sexe) identifié comme étant le minimum d’animaux nécessaires pour un résultat statistiquement significatif fiables et robustes.
Raffinement
"Raffiner" : nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les propriétés des drogues d’abus. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux, et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger et des papiers absorbants pour faire un nid. De plus, lors de la réalisation de procédures chirurgicales, les animaux seront sous anesthésie générale et recevront un traitement antidouleur (anesthésique local autour du site de chirurgie et traitement par un anti- inflammatoire non stéroïdien), et la température corporelle de l’animal sera maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté jusqu’au complet réveil de l’animal Enfin, des points limites seront déterminés après les procédures chirurgicales et après les injections répétées afin d’apporter un suivi individuel à chaque animal permettant de limiter ou arrêter la souffrance de l’animal. Pour cela nous utiliserons une grille d’évaluation jusqu’à leur mise à mort incluant des signes d’apparence (inactif, moins actif, ataxique, pelage hirsute, regard morne, animaux blottis, isolé, paupières mi-closes, absence de toilettage) et des signes lors de la manipulation (agressif, réticent à se déplacer, vocalisations, hyperactif, perte de poids corporel). Avant de commencer les expérimentations les animaux seront pris en mains afin d’être habitués aux manipulateurs.
Choix des espèces
La souris est aujourd’hui utilisée comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies de son génome (99 % identique à celui de l'humain) et permet de contrôler l’administration de drogues ce qui n’est pas possible chez l’humain. De plus ces études complèteront des études antérieures et parallèles effectuées chez la souris. Pour ce projet, des animaux adultes, âgés de 8 semaines au début de l’expérience, seront utilisés puisque l’étude repose sur l’exploration de comportements complexes qui nécessitent des systèmes neurobiologiques matures.
Comportement, cognition sociale et utilisation du parcours chez les poulets élevés en plein-air
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
400 poulets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sans être tués à l'issue mais renvoyés vers le système d'élevage de chair en plein air jusqu'à l'abattage. Élevés en poulailler biologique, ils sont équipés de ponchos d'identification, pesés à plusieurs reprises et soumis à des tests comportementaux après transport dans une autre salle. Le porteur décrit un stress léger et passager lié à la contention, aux ponchos et aux déplacements. Il indique qu'aucune méthode in vitro n'étudie ces comportements et présente le projet comme visant à améliorer le "bien-être" des volailles élevées en plein air, dont l'usage reste tourné vers la production de viande.
Objectifs
Le projet consiste à étudier la relation entre les capacités cognitives du poulet domestique élevé dans un système d’élevage plein-air et l’utilisation qu’il a de son enclos extérieur (appelé aussi parcours). Chez le poulet, la cognition (appelée aussi capacité cognitive) correspond aux capacités du poulet à être en interaction avec son environnement. C'est à dire de sa capacité à percevoir son environnement, sa capacité de concentration, sa capacité à acquérir et à assimiler de nouvelles connaissances ou sa capacité à s'adapter et à interagir avec les autres. Cette étude est d’une part guidée par le fait que, dans les élevages commerciaux, les éleveurs sont souvent confrontés à une grosse variabilité de l’utilisation du parcours extérieur par les animaux. Et d’autre part, des études précédentes ont montré que les animaux peuvent être classés selon leur niveau d’exploration du parcours, en prenant en compte le nombre de visites au parcours (animaux plus ou moins explorateurs). Ces différences dans l’exploration peuvent être liées à des différences au niveau comportemental et cognitif. Alors que la plupart des recherches sur la variation de l'utilisation du parcours sont basées sur une approche inter-lots et sont principalement concentrées sur les facteurs externes (par exemple, la saison et la présence d’arbres sur le parcours) et internes (par exemple, le sexe et la génétique), moins d'attention a été accordée à la façon dont, au sein d'un même lot et au niveau individuel, les oiseaux perçoivent et traitent les informations provenant de leur environnement physique et social. En d'autres termes, il existe peu d'informations sur la façon dont l'utilisation du parcours est liée aux capacités cognitives des poulets. De plus, ces recherches ne prennent pas en compte les influences sociales que les poulets ont les uns sur les autres. Afin, donc, de mieux comprendre la relation entre comportement, cognition sociale et utilisation du parcours et d’avoir plus d’informations sur la façon dont l'utilisation du parcours est liée aux capacités cognitives des poulets , les objectifs de ce projet sont de 1) comprendre si et comment la variation interindividuelle de l'utilisation du parcours est liée à la dynamique sociale des individus et 2) approfondir l'étude de la cognition sociale au niveau individuel, en se focalisant sur comment les oiseaux les plus et les moins explorateurs du parcours interprètent les informations sociales.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le cadre d’études cherchant à améliorer le bien-être des volailles élevées dans des systèmes de production biologique et de plein air. Bien que ces systèmes permettent un degré élevé d'expression du comportement naturel des animaux (recherche de nourriture, bain de poussière, activité exploratoire), les éleveurs sont souvent confrontés à une grande variabilité de l’utilisation du parcours extérieur par les poulets. A court terme, ce projet permettra d'acquérir plus de connaissances sur la manière dont un poulet perçoit son environnement et ses congénères, c'est à dire sur sa capacité à percevoir, à assimiler de nouvelles connaissances, à s'adapter et à interagir avec ses congénères. En reliant toutes ces informations (recueillies lors de tests comportementaux) avec l'utilisation naturelle qu'il a de son parcours, ce projet, permettra, à plus long terme de proposer des améliorations en élevage afin de mieux répondre aux besoins des animaux : environnement d'élevage et aménagement du parcours extérieur plus adaptés.
Procédures
A 1 semaine d’âge, les 400 poussins du projet seront équipés de petits ponchos afin de les repérer individuellement. Cette intervention durera environ 10 secondes par animal. A 5 semaines, ces petits ponchos seront retirés et les 400 poulets du projet seront équipés de ponchos de taille plus grande. Cette intervention durera environ 15 secondes par animal. Les 400 poulets du projet seront pesés individuellement à 4 reprises entre leur arrivée à 1 jour et la fin du projet à 15 semaines, afin de connaitre et comparer leur performance de croissance. La durée d’une pesée est inférieure à 10 secondes par poulet. Enfin, les poulets seront exposés à des tests de comportement, et seront pour cela, déplacés dans une nouvelle salle, à l’aide de caisses de transport : sur les 400 poulets du projet, 140 seront déplacés 2 fois (pour un temps total des tests réalisés estimé à 40 minutes), 140 seront déplacés 4 fois (pour un temps total des tests réalisés estimé à 40 minutes), 60 seront déplacés 5 fois (pour un temps total des tests réalisés estimé à 70 minutes) et 60 seront déplacés 7 fois (pour un temps total des tests réalisés estimé à 70 minutes). Le déplacement en salle de test (moins de 5 minutes / transport) pourra entrainer un léger stress transitoire pour les poulets.
Impact sur les animaux
Les effets négatifs sur les animaux sont notamment liés à la contention lors de la mise en place des ponchos (à 1 et 5 semaines), et au stress léger et passager que cela peut engendrer pour l'animal. Le poncho peut également entrainer une gêne passagère pour l’animal, le temps de son habituation. Les tests comportementaux peuvent entrainer un stress passager pour animal, au moment où il est installé dans un nouvel environnement et au moment du test en lui-même. Les tests comportementaux peuvent entrainer un stress passager pour animal, au moment du transport, au moment où il est installé dans un nouvel environnement et au moment du test en lui-même. Enfin, la contention liée aux pesées peut entrainer un stress léger et passager.
Devenir
En fin de procédure, tous les animaux retourneront dans le système d'élevage classique d'un poulet de chair élevé en plein air selon le cahier des charges de l'agriculture biologique.
Remplacement
Il n’existe à ce jour, aucune méthode in vitro ou in silico pour étudier les réponses des poulets face aux stimuli auxquels ils sont exposés. Ainsi, le recours aux animaux vivants dans les études de comportement et cognition animale reste nécessaire, afin d’évaluer la complexité des réponses des individus face aux contraintes environnementales et aux interactions sociales auxquelles ils sont soumis. Il est également important de se placer en condition d’élevage pour pouvoir suivre le comportement naturel d’exploration des animaux sur le parcours extérieur.
Réduction
Dans notre projet, nous étudierons deux lots de 200 poulets chacun (soit 400 poulets au total). En étudiant deux lots de manière successive, cela nous permettra de prendre en compte les modifications de comportement sur le parcours liées à la saison et ainsi de vérifier la consistance des résultats obtenus. Il est également important d’avoir des groupes suffisamment représentatifs pour rendre compte de la variabilité existante au sein de la population et obtenir des données suffisamment précises pour identifier des individus avec des comportements explorateurs extrêmes (les plus et les moins explorateurs). Aussi, les 200 poulets seront divisés en deux groupes de 100 poulets chacun pour les tests cognitifs et comportementaux. Le design expérimental et les statistiques utilisés sont en accord avec la littérature existante pour l’étude de la cognition animale et nous permettront de tester un grand nombre d’individus tout en simulant ce qui pourrait se passer dans un élevage traditionnel.
Raffinement
Les animaux sont élevés en groupe, selon la règlementation d’un élevage avicole biologique classique avec accès à un parcours plein air, favorisant l'expression des comportements naturels des poulets. Ils seront hébergés dans des conditions optimales d’alimentation et de soins. Les animaux auront à disposition dans les bâtiments des perchoirs, balançoires, ficelles et pierres à piquer en tant qu’enrichissement du milieu. Le diamètre des ponchos sera adapté à la taille et à la morphologie de l’animal et n’aura pas de conséquence sur la liberté des mouvements des animaux. Le poncho ne sera pas mis en place dès l'arrivée des poussins à 1 jour d'âge ; il sera mis en place à 7 jours d'âge afin de leur permettre, au préalable, de s’habituer à leur environnement d’élevage. La contention liée à la mise en place du poncho sera réalisée dans le calme par des personnes expérimentées. Les tests comportementaux seront réalisés dans une salle chauffée. Lors des périodes d'attente (avant ou après un test), les poulets seront installés, en groupe avec des congénères, dans un enclos paillé avec accès à l’eau et à l’aliment. Des points limites adaptés sont déterminés et une évaluation du bien-être des poulets sera complétée quotidiennement par le personnel animalier pour permettre de détecter précocement toute altération de leur état de santé ou de leur comportement. Pour chaque paramètre d’atteinte au bien-être, des actions seront prises sans délai et dans le respect de la grille de décisions mise en place en amont du projet.
Choix des espèces
Ce projet étudie le comportement du poulet de chair élevé dans un élevage en plein air, dans le but d’évaluer la variabilité d’utilisation de l’enclos extérieur. Il est ainsi nécessaire d’utiliser l’espèce animale chez laquelle ce mode d’élevage est employée et chez laquelle notre problématique est rencontrée, afin d’être dans des conditions proches de ce système d’élevage et obtenir des réponses satisfaisantes et fiables. Les poussins arriveront dans notre élevage à 1 jour d’âge et seront étudiés sur la période de 7 à 100 jours d’âge. En effet, nous étudierons la cognition et le comportement des poulets dès 7 jours et nous la suivrons jusqu’à leur âge d’abattage classique afin de suivre l’évolution ou la stabilité au cours du temps.
Etude de l’efficacité d’un traitement capable de ralentir la dégénérescence rétinienne chez la souris.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
852 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 240 d'entre elles et modéré pour 612. Porteuses d'une mutation provoquant une dégénérescence de la rétine, elles reçoivent des injections répétées et des examens ophtalmologiques sous anesthésie, pour tester un composé censé ralentir cette dégénérescence. Le porteur indique que l'un des modèles présente un retard de croissance, des difficultés à se mouvoir et une mort prématurée. Il précise avoir mené des études préalables sur cellules mais affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit une rétine, l'efficacité clinique du composé restant à établir.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique d’un composé dans le traitement de la dégénérescence rétinienne et des atteintes rénales et neurologiques associées, due à la mutation d’un gène, dans des modèles murins porteurs de cette mutation.
Bénéfices attendus
L’ensemble des résultats de ce projet devrait permettre de valider l’efficacité in vivo d’un composé chimique pour traiter la dégénérescence rétinienne ainsi que les atteintes systémiques provenant de mutations génétiques connues et représentant une cible thérapeutique majeure pour la dystrophie rétinienne chez l’enfant. Ce composé a déjà montré des résultats prometteurs in vitro in vivo pour une autre maladie similaire.
Procédures
Les animaux de ce projet seront soumis à un génotypage et une identification (6 secondes) à l’âge de 3-5 jours afin de permettre leur bonne répartition dans les groupes expérimentaux. Les animaux seront soumis à entre 4 et 8 injections (environ 5-10 seconde/injection) tous les 3 jours pour une durée allant de 12 à 24 jours. Les animaux seront soumis à une évaluation de l’état des yeux par un examen ophtalmologique réalisé de façon hebdomadaire pendant 1 à 3 semaines, donc entre 1 et 3 examen(s) par animal, sous anesthésie générale et sur un tapis chauffant (environ 15min/examen).
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable n’est attendu suite aux injections du composé ou des diluants. Une cataracte peut être observée par suite des examens ophtalmologiques, mais sans effet indésirable sévère sur les animaux et elle est transitoire, elle disparait quelques heures après les enregistrements. L’un des modèles murins étudiés présente un retard de croissance, une difficulté à se mouvoir, et une mort prématurée.
Devenir
A l’issue du protocole thérapeutique, les animaux seront mis à mort afin de collecter les organes post-mortem pour analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Les recherches préliminaires in vitro ayant permis l’identification de la molécule thérapeutique qui fait l’objet de cette étude ont été menées sur des lignées de cellules afin de limiter le recours à l’expérimentation animale. Néanmoins, compte tenu de l’absence de modèle cellulaire permettant l’étude d’une rétine, il n’a pas été possible de substituer des approches cellulaires aux modèles murins impliqués dans ce projet à visée thérapeutique. Par ailleurs, nous souhaitons également évaluer le potentiel thérapeutique de la molécule au niveau systémique, ce qui fait nécessairement intervenir l’usage de modèles animaux, seuls à même de reproduire la complexité du métabolisme et de l’organisation des divers organes potentiellement atteints.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum permettant d’atteindre des résultats statistiquement significatifs en utilisant un test approprié pour comparer les groupes d’animaux deux à deux. Les croisements permettant de générer les animaux sont optimisés pour obtenir les animaux nécessaires à l’étude. Par ailleurs, un seul groupe d’animaux contrôles sera utilisé comme référence pour les 2 doses de composé.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Les souris avec une atteinte sévère et généralisée seront surveillées et pesées tous les 3 jours par les personnes en charge du projet. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, nous ajouterons dans la cage du coton, des maisonnettes en carton ou des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort. Afin de prévenir une déshydratation et une malnutrition des souris avec l'atteinte sévère et généralisée, nous ajouterons dans leur cage un complément alimentaire hydraté. Les examens ophtalmologiques seront réalisés sous anesthésie générale après injection d’un mélange de produits anesthésiques adaptés sur une surface chauffante.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, l’oeil est un organe facilement accessible et l’organisation structurale de la rétine d’une souris est très proche de celle de l’homme. La validation thérapeutique du composé sera initiée à 6 jours de vie (avant l’ouverture des yeux et le début de la dégénérescence rétinienne) et sera poursuivie jusqu’à un stade suffisamment évolué de la maladie pour différencier les souris contrôles des souris porteuses de la maladie, mais suffisamment précoce pour observer un effet thérapeutique, soit 18, 21 ou 30 jours pour les modèles présentant une atteinte rétinienne isolée progressive ou précoce. Pour le modèle présentant une atteinte généralisée, le traitement sera poursuivi jusqu’à 30 jours qui correspond au stade de survie le plus avancé observé chez ces souris, afin d’évaluer l’effet du composé sur la viabilité de ces souris.