Recherche appliquée

3 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de peptides déclenchant des symptômes migraineux et une hypersensibilité à la lumière, mesurée par un test de boîte claire et obscure, et peuvent subir jusqu'à 34 prélèvements sanguins en 28 jours. Le porteur veut cribler des molécules contre la photophobie migraineuse pour développer des traitements chez l'homme. Il affirme que la migraine reste difficile à modéliser in vitro.

Objectifs

La migraine est une maladie neurovasculaire qui affecte plus de 12% des adultes. Elle se caractérise par d’intenses céphalées, résultantes d’une hyperexcitabilité neuronale. Ce phénomène de suractivation neuronale est lié à des facteurs génétiques complexes associés à des facteurs environnementaux, et s’accompagne fréquemment d’une hypersensibilité au bruit et à la lumière (photophobie). Plusieurs neuropeptides ont été mis en évidence comme ayant un rôle crucial dans le déclenchement des migraines. Les taux dans le sang de certains peptides se voient nettement augmentés lors de migraines. Dans notre laboratoire, nous utilisons ces peptides pour modéliser la migraine chez la souris et l’évaluation de l’état migraineux est suivi par la mesure de l’hypersensibilité à la lumière dans un dispositif de boite claire et obscure. Le test est basé sur la possibilité laissée à l’animal de choisir de rester dans un compartiment peu éclairé par rapport au second compartiment fortement éclairé. Ainsi un traitement induisant une hypersensibilité à la lumière ou photophobie, ici l’utilisation des peptides CGRP, PACAP38 ou VIP chez la souris, causera une diminution de l’exploration du compartiment lumineux. Ainsi dans ce projet, nous allons utiliser ce modèle comme un outil d’évaluation des nouvelles molécules thérapeutiques dans le traitement de la migraine.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de mettre en évidence des molécules qui seraient capables d’agir sur la photophobie induite chez des souris et ainsi de développer des traitements contre les céphalées migraineuses chez l’Homme.

Procédures

Dans ce projet, un animal subira au maximum 3 tests comportementaux (d’une durée de 20 à 30 min chacun). De plus les animaux subiront un maximum de 6 injections de peptides et bien entendu le traitement avec la molécule à étudier (le schéma de traitement sera fixé en fonction des données pharmacologiques disponible sur cette molécule). En cas une injection intraveineuse, elle dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Pour le reste des administrations (Per-Os, IP, SC, IN et IM), la durée est de moins de 30 seconds en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. En parallèle des tests de comportement, des prélèvements de sang peuvent avoir lieu en cours d’expérience. Selon les tests et la voie d'administration choisie, les animaux pourront subir de 1 à 34 prélèvements sanguins sur la période de 28 jours en ne dépassant pas les recommandations. Les prélèvements de sang durent 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle, une baisse de l’activité locomotrice peut être attendue à la suite du traitement avec le peptide inducteur des symptômes migraineux. Les souris traitées avec les peptides peuvent présenter une sensibilité à une forte lumière une fois la deuxième injection de peptide réalisée. De plus les administrations peuvent induire une douleur localisée et passagère.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est sacrifiée pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.

Remplacement

La migraine est un trouble neurovasculaire complexe, dont l’origine et les mécanismes ne sont que partiellement appréhendés. Il implique diverses structures cérébrales, nombreux vaisseaux sanguins intracrâniens et nerfs sensoriels. Cette synergie reste difficile à modéliser in vitro. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet font l’objet, autant que possible, d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses biochimiques ou histologiques. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle et d'une éventuelle différence inter-individuelle à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués de 12 animaux. Toutefois l’effectif pourra être amené à n = 20 par groupe. Des analyses statistiques finales seront réalisées.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial pendant les expérimentations. Ainsi, plusieurs mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion d’une phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) à l’arrivée des animaux, avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux seront hébergés en cohorte pour respecter leurs besoins sociaux. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres par un enrichissement important du milieu. L’enrichissement comporte un tunnel en carton accroché à la grille de la cage afin d’en augmenter le volume utile, une maisonnette en carton afin de permettre aux animaux de se cacher et de la frisure pouvant servir de matériel de nidification, de jeu et de matériel à grignoter. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement est suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Les souris traitées avec les peptides peuvent présenter une sensibilité à une forte lumière une fois la deuxième injection de peptide réalisée. L’éclairage de la salle de comportement est atténué. Les animaux sont anesthésiés pour les traitements par voie intraveineuse et pour les prélèvements sanguins. De plus nous avons établis des points limites afin de soustraire l’animal à un mal-être ou une douleur qui n’est pas en relation avec les signes attendus du projet. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre Structure du Bien-Être Animal (SBEA) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines).

800 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un régime contenant de la charcuterie pendant dix-huit jours puis passent jusqu'à 48 heures seuls en cage à métabolisme, source de stress, pour recueillir urines et fèces. À l'issue, le porteur indique que 150 rats seront adoptés, environ 250 réutilisés en formation et le reste tué. Il affirme qu'aucune étude in vitro ne permet d'évaluer l'effet des nitrites sur l'"organisme entier".

Objectifs

Les études épidémiologiques réalisées chez l’Homme montrent une association entre la consommation de charcuteries et le développement du cancer colorectal. Les additifs nitrés (nitrites et nitrates) sont utilisés dans les charcuteries pour limiter le développement de bactéries pathogènes mais aussi pour retarder la date limite de consommation. Les charcuteries contiennent également du fer héminique, constituant important des muscles ou viandes. Les études épidémiologiques et celles réalisées chez le rat montrent que ces additifs nitrés et le fer héminique pourraient être responsables de cet effet néfaste, car pendant la digestion, ils favorisent la formation de composés toxiques. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de la diminution ou du retrait des additifs nitrés dans les charcuteries sur la formation des composés toxiques. Les doses de nitrites et nitrates seront choisies pour évaluer l’effet d’une diminution importante de l’utilisation de ces additifs dans les charcuteries les plus consommées en France. Les charcuteries représentatives des 20 charcuteries les plus consommées seront produites avec quatre doses d’additifs nitrés : la dose actuellement utilisée dans la production des charcuteries, deux doses plus faibles et une charcuterie sans additif. En plus d’un groupe sans charcuterie, l’effet du retrait ou de la diminution des additifs nitrés sera testé en ajoutant ces différentes charcuteries à la ration des rats. Dans ce projet, 800 rats seront nourris avec un régime contenant ou non de la charcuterie pendant 18 jours. Leurs urines et leurs fèces seront récupérées. Ces échantillons permettront des mesures des produits toxiques formés pendant la digestion de ces charcuteries contenant un gradient d’additifs nitrés.

Bénéfices attendus

L’objectif est d’identifier une dose d’additifs nitré la plus basse possible afin de préconiser des doses faibles voire nulle d’additifs dans les charcuteries. Ainsi cela aurait comme bénéfice de proposer un levier de prévention du risque du cancer colorectal associé à la consommation de charcuterie.

Procédures

Pour les prélèvements des fèces et urines de 24 h, tous les rats seront hébergés en cage individuelle spécifique pendant maximum 48h en continu. Les rats seront en habituation pendant 3h dans ces mêmes cages la veille. Les prélèvements sont en fait des recueils dans des réceptacles sous la cage à métabolisme. Nous recueillons toute la production de 24h en fèces et en urine séparément, 2 fois, au bout de 24 et 48h à J17 et J18. Les rats ne sont pas manipulés.

Impact sur les animaux

Le projet comporte un passage en cage spécifique pendant 48h (après 3h d’habituation) ce qui peut générer du stress chez le rat (rat isolé). Nous sommes très attentifs au suivi des animaux pendant cette période (ouverture d’une fiche de suivi sanitaire scoré avec 9 points de contrôle en 2.5 jours). Pour compléter, nous réaliserons une mesure de la consommation alimentaire et d’eau de boisson le deuxième jour et une mesure de poids corporel.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux rentreront dans un processus de don après une période de 7 jours d'adaptation à une alimentation conventionnel, afin que - 150 rats maximum soient adoptés via une association d'adoption d'animaux. - qu’environ 250 rats soient réutilisés lors de formation. - Le reste des animaux sera euthanasié.

Remplacement

Aucune étude in vitro ne permet d'évaluer les répercussions des doses de nitrites dans les charcuteries d'un organisme entier, sur la physiologie, sur le métabolisme et sur les formations des composés toxiques au niveau de la lumière colique. Seule une approche in vivo permet de prendre en compte la complexité de l’écosystème colique.

Réduction

Dans l'objectif de réduire au strict minimum l'utilisation d'animaux de laboratoire, pour ces études nutritionnelles, sur la base un test statistique, le nombre d'animaux a été limité au maximum (n=8 animaux/lot) et la durée de l’étude au maximum (18 jours). Notre expérience, nos publications et une analyse statistique montrent que ce nombre de 8 animaux par lot est nécessaire pour observer un effet sur les indicateurs précoces du cancer colorectal.

Raffinement

L’environnement des rats sera enrichi avec une niche. Les cages utilisées seront transparentes pour maintenir un contact visuel et le suivi sanitaire sera plus fréquent. Pour les interventions potentiellement stressantes (hébergement individuelle pendant 48h), les rats seront habitués au préalable. Les interventions des opérateurs seront minimales hors observation sanitaire, de manière à les maintenir dans un lieu d’hébergement le plus calme possible.

Choix des espèces

Le rat Fisher est un bon modèle pour étudier la modulation de la cancérogenèse colorectale associée à la consommation d’un régime riche en charcuteries et pour étudier le rôle des nitrites et du fer héminique. Les mâles sont privilégiés pour analyser le développement des pathologies à l’âge adulte afin d’éviter les effets hormonaux liés aux cycles de la femelle (observés sur la cancérogenèse). Les études se feront sur des rats adultes. Ils seront âgés de 5 à 6 semaines à leur arrivée et leurs organes seront matures en particulier ceux de l'appareil digestif et l’écosystème colique L'ensemble des études précédentes du laboratoire ont été menées sur des rats adultes du même âge dont la fonction digestive est totalement fonctionnelle. Afin de rester en accord avec ces études précédentes, il est important de rester au même stade de développement.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques, des traitements et une radiothérapie qui peut provoquer diarrhées et saignements digestifs, avant d'être tuées pour des prélèvements d'organes. Le porteur décrit une évaluation de médicaments avant passage chez l'homme, bénéfices situés au long terme. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution et que l'animal constitue un passage "indispensable".

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux médicaments dans des modèles murins pertinents de leucémie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de démontrer que les traitements testés sont actifs dans un modèle de cancers du sang et aussi d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage chez l'homme. Ainsi, à long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouvelles thérapeutiques pour traiter ce type de cancers.

Procédures

Greffe de cellules tumorales (durée de l'injection inférieur à 1 min). Application / Administrations des traitements (moins de 2min pour les injections et environ 5 min pour la radiothérapie). En cas de prélèvement de sang (moins de 2min) ceux-ci seront réalisés sous anesthésie et limités à 1 par semaine et à un volume inférieur à 10 %. Un suivi par imagerie pourra être réalisé sous anesthésie comme par exemple par Bioluminescence (durée moyenne < 10 min) ou encore par IRM (durée moyenne = 30 min).

Impact sur les animaux

Stress lié à l’anesthésie par agent chimique en inhalation et/ou injection lors des administrations / imageries. Stress lié à la contention pour l'implantation de cellules tumorales dans la veine caudale et lors des suivis clinique. Le développement de tumeurs chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères (ex: présence d'une tumeur associé ou non à de la perte de poids). Traitements par différentes voies d'administration (douleur équivalente à la piqure d’une aiguille) - De même, l’utilisation de traitements novateurs pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Les effets de la radiothérapie, notamment sur les aspects digestifs (diarhée, saignement).

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal. Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués le développement de la tumeur ou encore par le produit / modèle chez les animaux.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur ces cancers. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage indispensable pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’une nouvelle thérapeutique. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : classiquement 10 par groupe en fonction de l’effet thérapeutique attendu. L’analyse statistique sera par la comparaison des groupes d'animaux en fonction du traitement réalisé.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • des conditions d'hébergements garantissant la non-contamination des animaux immunodéficients

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes (à partir de 3 semaines). Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris immunodéprimées reçoivent une greffe de mélanome humain, une résection de la tumeur et des traitements, avec un suivi par imagerie, avant le prélèvement des organes. Le porteur indique vouloir caractériser une protéine limitant l'invasion métastatique, retombée pour les patients formulée au conditionnel. Il affirme que seul le modèle animal reproduit la complexité de la métastase du mélanome.

Objectifs

Le laboratoire a identifié une protéine comme régulateur des métastases de mélanome, cause principale des décès liés à cette maladie. Plus précisément, cette protéine diminue les capacités invasive et migratoire des cellules, diminuant le potentiel métastatique de la tumeur. Ce projet cherche donc à caractériser les effets de notre protéine sur la migration, l’invasion et les métastases de mélanomes, permettant à terme d’améliorer la prise en charge thérapeutique de cette maladie.

Bénéfices attendus

Le mélanome métastatique est particulièrement létal : à ce jour, le taux de survie à 5 ans de cette maladie est de 22,5%. L’objectif est de mieux comprendre le rôle de notre protéine dans les mécanismes de migration et d’invasion métastatique du mélanome. Des résultats préliminaires montrent que notre protéine inhibe les capacités migratoires et invasives du mélanome métastatique. Ainsi, promouvoir l’expression et/ou l’activité de cette protéine dans la tumeur pourrait être bénéfique pour améliorer la survie des patients.

Procédures

Lors de l’implantation tumorale nous réalisons une anesthésie en intrapéritonéale (2 secondes) puis nous procédons à l’implantation des cellules tumorales en sous cutanée (20 secondes). Lors de la résection tumorale nous procédons à une analgésie en sous-cutanée (2 secondes) 30 minutes avant l’anesthésie qui elle est en intrapéritonéale (2 secondes), puis nous réalisons la résection tumorale (3 minutes). La suture de la peau est réalisée à la fin de l’implantation avec du fil de suture (2 minutes). Les traitements sont réalisés par voie intrapéritonéales (2 secondes). . Un suivi par imagerie pourra être réalisé sous anesthésie comme par exemple par Bioluminescence (durée moyenne

Impact sur les animaux

Stress lié à l’anesthésie par agent chimique en inhalation et/ou injection lors des administrations / imageries. Stress lié à la contention pour l'implantation de cellules tumorales et lors des suivis clinique. Le développement de tumeurs chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères (ex: présence d'une tumeur associé ou non à de la perte de poids). Traitements par différentes voies d'administration (douleur équivalente à la piqure d’une aiguille) - De même, l’utilisation de traitements novateurs pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères.

Devenir

En fin de procédure les organes seront prélevés afin de réaliser des analyses immunohistologiques

Remplacement

La migration et l’invasion peuvent être étudiées via des modèles in vitro, mais celles-ci ne peuvent récapituler aussi fidèlement les métastases du mélanome observées in vivo. L’environnement tumorale, notamment vasculaire et immunitaire étant absent, aucun modèle cellulaire ne permet de reproduire la complexité de la métastase du mélanome, et seul le modèle animal permet de conduire ce projet. La souris est un animal très adapté à ce travail avec une littérature validant ce choix.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochable. Pour ces études les tests statistiques non seront utilisés en cohérence avec le nombre de groupes analysés et d'animaux. Au total 520 souris maximum seront nécessaires pour cette étude.

Raffinement

Afin de raffiner les conditions de vie des souris, un suivi adapté des animaux sera instauré afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux et bénéficieront d’un enrichissement adapté. Des soins pré-, per- et postopératoires adéquats seront réalisés. Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale et des traitements analgésiques sont systématiquement utilisés pour prévenir toute douleur.

Choix des espèces

Nous utiliserons un modèle immunodéprimé (NSG) permettant le développement de mélanomes humains. L’utilisation de ce modèle va nous aider à mieux appréhender la croissance tumorale et surtout avoir un modèle animal très proche de ceux rencontrés chez les patients. Les cellules utilisées nous permettent de contrôler la croissance tumorale par bioluminescence et de mieux visualiser les métastases. Nous utiliserons des souris de 8 à 10 semaines pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs semaines, donc l’implantation sur des jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés.

2 979 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un modèle transgénique de trisomie 21 présente des malformations cardiovasculaires et une fréquence anormale d'hydrocéphalie, et les souris subissent tatouage et coupe de la queue, chirurgies cérébrales avec implants optiques, restriction alimentaire de six jours et tests cognitifs. La plupart sont tuées pour prélever le cerveau, tandis que le porteur indique garder les surplus d'élevage porteurs du génotype pour d'autres projets. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative aux modèles souris et prête aux procédures un caractère de "stricte nécessité".

Objectifs

Le syndrome de Down (SD) est causé par une modification du chromosome 21 humain. Il entraîne des caractéristiques physiques et neurologiques spécifiques, y compris des problèmes intellectuels. Les personnes atteintes de SD ont des difficultés avec des fonctions cérébrales importantes pour mener une vie autonome, comme l'attention et la mémoire. Ces fonctions dépendent d'une partie du cerveau appelée le cortex préfrontal. Les personnes atteintes de SD rencontrent des difficultés dans leurs interactions sociales et ont du mal à filtrer les informations, en particulier au niveau de certaines cellules cérébrales. On pense que l’excès d'inhibition du cortex préfrontal est un mécanisme important à l'origine des problèmes intellectuels chez les personnes atteintes de trisomie. Cependant, on ne sait pas encore quel rôle jouent les différents types de cellules cérébrales dans ces difficultés. Ce projet vise à comprendre comment les modifications des circuits cérébraux chez les personnes atteintes de trisomie du chromosome 21 influent sur leurs capacités cognitives. Pour ce faire, nous utiliserons des modèles murins de la trisomie.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait nous permettre de mieux comprendre les mécanismes physiologiques et moléculaires impliqués dans le dysfonctionnement des circuits corticaux qui sous-tendent les déficits cognitifs connus. En particulier, ce projet fournira des informations précieuses sur les cibles moléculaires potentielles pour les thérapeutiques pharmacologiques visant à améliorer les performances cognitives des personnes atteintes du syndrome de Down.

Procédures

Ce projet nécessitera d’élever nos animaux pour réaliser nos procédures expérimentales, afin de piloter de manière raisonnée cet élevage et ne pas produire plus d’animaux que nécessaire certains mâles pourraient êre isolés de manière temporaire. Dans le cadre de l’élevage il y aura la réalisation d’un tatouage et d’un prélèvement de l’extrémité terminale de la queue à l’âge de 10 jours. Les deux actes ne sont réalisés qu’une seule fois et dureront moins de 2 minutes par animal au total. Nous allons enregistrer l'activité électrique neuronale dans la region préfrontale du cerveau en utilisant des souris transgéniques. Pour cela, les animaux subiront une chirurgie sous anesthesie générale qui prendra environ 30-40 minutes par animal. Ensuite, nous implanterons du matériel optique pour stimuler le cerveau avec de la lumière (30 minutes d'intervention pendant la même anesthésie). Nous enregistrerons l'activité des neurones chez des animaux qui seront éveillés et libres de leurs mouvements, ce qui nécessitera 1 à 3 heures d'intervention. Nous allons également stimuler le cerveau de ces animaux pendant qu'ils effectuent des tâches cognitives. Cette étape impliquera à nouveau une chirurgue et une implantation de fibres optiques pour la stimulation. Certaines de ces expériences nécessiteront des injections de substances pharmacologiques dans la cavité abdominale des souris et une restriction alimentaire pendant 6 jours pour les motiver à effectuer certaines tâches comportementales. Enfin, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de permettre les différents prélèvements et analyses nécessaire. Toutes les opérations chirurgicales (durée 30-40 min) seront effectuées sur des animaux complètement endormis et soumis à un traitement analgésique avant, pendant et après l'intervention.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour le génotypage et au moment du tatouage au niveau de la pulpe digitale. Les systèmes cardiovasculaire et gastro-intestinal des embryons de notre modèle de souris de la trisomie 21, présentent des malformations ce qui complique leur survie. Les malformations du système cardiovasculaire sont similaires à celles observées chez les patients atteints du syndrome de Down. Ces souris présentent aussi des déficiences intellectuelles observées dans les tests de mémoire de court et de long terme. Des observations préliminaires indiquent une fréquence anormalement élevée d'hydrocéphalie. Nous allons surveiller et documenter l'incidence des hydrocéphalies afin de déterminer si cela est dû à un accouplement particulier avec des lignées de souris congéniques ou si cela fait partie du phénotype. Concernant la chirurgie des implants les nuisances comprennent douleur post opératoire, risque potentiel d’infection et de perte de l’implant. Stress et isolement pour les tests comportementaux et contraintes avec la restriction alimentaire. Dans le cas où il serait nécessaire d’isoler un animal, s’agissant d’animaux grégaires, il pourrait ressentir un stress.

Devenir

Les animaux reproducteurs seront euthanasiés à 18 mois maximum. Les animaux non porteurs des génotypes d’intérêt seront euthanasiés. Une partie des animaux sera euthanasiée afin de prélever leur cerveau pour analyse post-mortem. Les animaux produits dans notre procédure d’élevage non utilisés dans ce projet et porteurs d’un génotype d’intérêt seront utilisés dans des projets scientifiques dédiés de notre équipe, donc en utilisation continue.

Remplacement

Les questions traitées dans cette étude n’ont pas encore trouvé de réponse dans les recherches menées par la communauté scientifique internationale et, à notre connaissance, a l’heure actuelle nous sommes la seule équipe à y travailler. Il n’existe pas de méthode alternative autre que le recours aux modèles souris de la trisomie et aux croisements avec des souris exprimant des rapporteurs fluorescents, pour atteindre les objectifs du projet: analyses des caractéristiques physiologiques ainsi que moléculaires des circuits neuronaux inhibiteurs génétiquement identifiés dans le contexte de la trisomie. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information (comportement, neuropathologie produisant des déficiences cognitives et neurodegeneration chez l'Homme).

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (n = 2979) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal : les animaux seront implantés d’un côté à la fois pour l'électrophysiologie et la photométrie par fibre, et d’un autre pour l'électrophysiologie et l'optogénétique afin de maximiser les mesures longitudinales multiples sur un même animal. Notre maitrise du geste chirurgical limite les pertes d’animaux en post-opératoire. Toutefois, les avantages de l'utilisation d'animaux pour de nombreuses techniques sera mis en balance avec les effets négatifs sur leur bien-être, en tenant compte de l'expérience cumulée au cours de la vie de l'animal. En outre, notre expertise dans l'entraînement des souris aux tâches cognitives réduira également la variabilité et, dans une large mesure, les nombres globaux nécessaires pour obtenir une signification statistique dans les cohortes. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et il est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille de chaque groupe sera déterminée par l'utilisation de tests statistiques appropriés, y compris le calcul de puissance. La taille réelle de l'échantillon, et donc la signification statistique, dépend de la variabilité de la lecture biologique. Il est donc nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Des tests paramétriques et non-paramétriques sont utilisés en fonction de la distribution normale ou non-normale des données. Il est également important de noter que le projet comporte un plan de partage de données. Les données expérimentales seront disponibles en libre accès sur une plateforme en ligne ce qui permettra à d’autres équipes de profiter de ces données, leur évitant ainsi de reproduire ces expériences, et réduira donc le nombre d’animaux utilisés à terme.

Raffinement

Les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les procédures expérimentales sont les plus appropriées pour minimiser toute douleur, souffrance, anxiété/détresse ou dommage que les animaux pourraient subir. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. La préférence pour les procédures non invasives par rapport aux procédures invasives est prise en considération et, lorsque des interventions invasives sont nécessaires, les directives appropriées en matière d'anesthésie/analgésie seront approuvés par le comité d’ethique et le Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. Les animaux auront à manger et à boire à volonté. Des croquettes adaptées à la gestation/allaitement seront mise à disposition pour les animaux en accouplement. Toutes les expériences seront réalisées sur des souris âgées de moins de 120 jours après la naissance pour garantir qu’elles s n’arrivent pas aux phases critiques du phénotype Un suivi de poids sera réalisé de manière hebdomadaire afin de détecter l’apparition de formes marquées du phénotype. Pour les animaux fragilisés par le phénotype des croquettes seront disponibles en fond de cage, de l’hydrogel, ou des biberons d’accès facilité (tétine plus longue). Nous serons attentifs et tracerons tous les signes d’hydrocéphalie dès la naissance des petits. Nous définirons des points limites qui, s'ils sont atteints, nous conduiront immédiatement à l'euthanasie de l'animal afin de réduire les souffrances inutiles.

Choix des espèces

Les propriétés de base des microcircuits neuronaux chez la souris sont similaires à celles d’autres mammifères. Actuellement, seuls les modèles murins nous permettent de visualiser les types d’interneurones que nous étudions. Les approches expérimentales multiples réalisées chez la souris permettent une analyse complète allant du comportement jusqu’à l’activité d’un seul neurone. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. De plus, chez la souris, la période de gestation est courte et les portées sont importantes, permettant de produire suffisamment d’animaux pour plusieurs expériences à partir de peu de fondateurs. Le développement du cerveau est très bien caractérisé, ce qui facilite les études anatomiques et fonctionnelles. Nous maîtrisons suffisamment les techniques proposées dans ce projet pour réduire le nombre d’animaux nécessaires aux expériences. Des animaux adultes seront utilisés pour toutes les procédures (mâles et femelles). L'élevage nécessite d'avoir des animaux reproducteurs adultes. Toutes les procédures qui nécessitent des interventions chirurgicales qui ne peuvent être pratiquées que sur des animaux adultes. En outre, toutes les expériences seront réalisées chez des souris adultes, lorsque les circuits corticaux ont atteint un stade de maturation final.

14 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des tirs de laser femtoseconde dans le cristallin sous anesthésie générale et locale, un motif dans l'œil droit pouvant selon le porteur diminuer "de manière très modérée" l'acuité visuelle, avant d'être tués pour l'analyse histologique des tissus oculaires. Le porteur affirme que le traitement "reste sans douleur" et s'appuie sur une étude antérieure menée sur neuf lapins. Il indique qu'il n'existe aucun modèle in vitro ou ex vivo du cristallin permettant un suivi sur plusieurs semaines, le projet servant une startup à établir une preuve de concept contre la presbytie.

Objectifs

La presbytie, qui survient systématiquement après 45 ans, concerne 1,8 milliard de personnes, dont 826 millions ne sont pas ou sont mal corrigés. Il est documenté qu'elle est causée par une rigidification du noyau du cristallin empêchant les muscles accrochés à sa périphérie de modifier l’épaisseur et la courbure nécessaires à l'accommodation. Le cristallin est composé de cellules contenant des protéines appelées cristallines, qui sont solubles et le rendent transparent en homogénéisant son indice de réfraction. En vieillissant, les agrégats de cristallines (création de ponts disulfures principalement), deviennent insolubles et rigidifie le noyau. L’hypothèse principale est qu’il est nécessaire de « ramollir » le noyau du cristallin en désagrégeant les protéines cristallines. Une des techniques les plus appropriées pourrait être le laser femtoseconde. Ce dernier permet d’envoyer de très courte impulsion d’énergie photonique avec précision dans le tissu sans dégagement d’énergie thermique. Après une étude de safety menée en 2021 sur 9 lapins ayant montré que la création de patterns (= motifs 2D ou 3D) au laser femtoseconde dans le cristallin d'un lapin n'entraine pas d'effets délétères à court, moyen et long terme sur les tissus opthamologiques de l'animal ; la startup a effectué de nombreux tests ex vivo sur cristallin de cochon. Ces tests avaient pour objectif d'effectuer une gamme de marquage au laser femtoseconde (distance entre les points de tir laser, puissance...) afin d'en étudier les interactions laser-matière. Ils ont alors pu observer des paramètres permettant d'obtenir des tirs lasers qui restaient transparents dans le cristallin. 1/ confirmer ou infirmer IN VIVO la correspondance entre les paramètres laser et types d’interaction laser matière observés en EX VIVO (bulles de coalescence, bulle de cavitation, marquage sans apparition de bulles, pas de marquage apparent) 2/ confirmer ou infirmer l’évolution des différents types d’interactions sur plusieurs semaines (résorption des bulles, atténuation ou disparition totale des marquages…) 3/ identifier les paramètres qui permettent d’obtenir un marquage maintenant la transparence ou permettant de la récupérer en IN VIVO afin d’en évaluer les effets biomécaniques (assouplissement), dioptriques ou autres. Données d’entrée à des études ultérieures. 4/Caractériser In situ les impacts laser des différentes interactions lasers (tissulaires et protéiques) 3 semaines après le traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à la stratup d'obtenir des connaissances sur l'interaction laser-matière sur le long terme (impossible à obtenir en ex-vivo ou in-vitro) confirmant ou infirmant les résultats qu'ils obtenus en ex vivo et leur permettant ensuite d'aller plus en avant sur des études d'efficacités de leur traitement.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tirs de laser femtoseconde dans le cristallin. 6 lapins auront 2 phases de tirs lasers. et 4 lapins n'en auront qu'un seul. Les animaux seront sous anesthésie générale et locale. Rapellons que ce traitement laser très focalisé reste sans douleur pour l'animal et que des tests précédents ont montrés qu'à cette puissance, il n'y a pas d'effets délétères pour la cornée et la rétine des animaux.

Impact sur les animaux

Les nuanciers créés dans l'oeil gauche de l'animal sont de très petite taille (environ 2mm²) et ne devraient pas avoir d'impact sur la vision de l'animal. Le pattern qui sera créé dans l'oeil droit de l'animal pourrait diminuer l'acuité visuelle de manière très modérée. Les puissances lasers qui seront utilisées durant cette étude sont inférieures à celles utilisées durant l'étude de 2021, par conséquent aucun effet délétère pour la cornée ou la rétine n'est attendu.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car nous devons analyser en histologie les tissus oculaires de ces animaux afin de pouvoir conclure.

Remplacement

A ce jour, il n'existe aucun modèle in vitro ou ex vivo de conservation du cristallin satisfaisant et permettant un suivi de l'organe sur plusieurs semaines. De plus, il n'existe aucun modèle de cristallin permettant de simuler l'interaction avec le système immunitaire pour ce genre d'intervention chirurgicale.

Réduction

Il a été jugé que le nombre minimum, mais suffisant d’animaux était de 3 lapins par groupe pour prendre en compte les différences interindividuelles pour ce type d'intervention chirurgicale pour la première phase et de 4 lapins par groupe pour la deuxième phase afin de pouvoir effectuer toutes las analyses histologiques dont certaines nécessite un globe oculaire entier.

Raffinement

Les animaux arriveront au moins une semaine (7 jours) avant toute manipulation. Tout est mis en œuvre pour LIMITER AU MAXIMUM LE STRESS ET LA DOULEUR DE L’ANIMAL (sédation pendant les observations). Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérer grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie). Par ailleurs, les lapins sont hébergés en cage règlementaire pouvant communiquer entre elles ; dans un environnement enrichi (jouet kong et autres jeux). Enfin, l'eau et la nourriture (granules et foin) sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux. Une précédente étude menée par notre laboratoire a démontrer qu'à cette fluence de laser le tir laser dans le cristallin n'induit aucun dommage à la rétine et la cornée du lapin. Cette précédente étude a par ailleurs permis de tester et d'optimiser le système de tir laser et son docking. Ce dernier sera d'autant plus optimisé puisqu'il sera testé sur des têtes de lapins de boucheries et des yeux de lapins énucléés ex vivo et modifié au besoin courant la fin de l'année 2023 et le début 2024. Toutes les techniques d'imagerie de suivi in vivo se font sans contact avec l'oeil et sans docking.

Choix des espèces

D'un point de vue éthique et pratique, les lapins sont les seuls animaux communément utilisés en expérimentation animale et présentant une anatomie oculaire (cristallin et cornée) proche de l'homme. Pour que le traitement du cristallin soit représentatif de ce qu’il puisse être chez l’homme dans le futur, la chambre antérieure de l’œil de l’animal ne doit pas être trop petite. C’est pour cela que nous optons pour des lapins âgésd’environ 3 mois (12 semaines).