Recherche appliquée

313 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation reproduisant le syndrome NARP, avec un déficit de poids d'environ 20 %, un défaut cardiaque et musculaire, et subissent des prélèvements de sang et d'urine ainsi que des tests de force, d'équilibre et d'endurance, des IRM et des échocardiographies sous anesthésie, de un à six mois. Le porteur indique qu'aucune caractérisation détaillée de cette lignée n'a été faite auparavant et que l'objectif est d'identifier des déficits mesurables avant de tester des candidats médicaments. Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires restent incomplets pour un phénomène impliquant l'"organisme tout entier", et présente le recours à la souris comme une "nécessité".

Objectifs

Le syndrome NARP (Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire) est une pathologie rare qui affecte majoritairement les fonctions cardiaques, musculaires, et neurologiques et pour laquelle il n'y a toujours pas de traitement. Au laboratoire nous avons identifié des candidats médicaments efficaces sur les cellules de patients atteints du syndrome NARP. Afin de pouvoir proposer le traitement à des patients il nous faut prouver leur efficité dans un animal entier (ici le modèle murin). Avant, il est nécessaire d'identifier des déficits clairs dans le modèle souris du syndrome de Barth. Ce projet vise donc à caractériser finement le modèle souris du Syndrome NARP d'un point de vue cardiaque, musculaire, comportementale etc.... Ceci permettra ensuite de tester si les candidats médicaments efficaces en cellules de patients sont capables de diminuer les défauts mis en évidence dans l'étape de caractérisation du modèle murin. Si tel est le cas, on aura la preuve de leur efficacité dans un animal entier. L'objectif ultime étant de proposer les candidats médicaments efficaces dans les cellules de patients et le modèle murin du syndrome NARP à des patients atteints du syndrome NARP.

Bénéfices attendus

Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome NARP, dans nos animaleries afin d'identifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. Seront analysés, le comportement, le poids, la fertilité, les portées, les avortements spontanés, la mortalité périnatale, l'acidose, la force musculaire, l'endurance, la coordination, les fonctions cardiaques, les fonctions mitochondriales sur tissus et des dosages sanguins et urinaires.

Procédures

Prélèvements sanguins et urinaires aux âges de 1 mois, 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excédera pas 10 minutes. Tests comportementaux (force musculaire, motricité, équilibre et endurance) aux âges de 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes. IRMs et echocardiographies aux âges de 2, 4 et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 30 minutes et les souris subiront des anesthésies.

Impact sur les animaux

Des nuisances liées aux souris présentant un phénotype dommageable peuvent être attendues. Comme d'autres modèles murins similaires (avec des déficits mitochondriaux) nous pouvons attendre, à l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents, un défaut cardiaque et un défaut musculaire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse par IRM et échocardographie nécesite une anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données IRM ou échocardiographiques. Le suivi des performances sur tapis de course, rotarod ou grip test teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de caractériser à différents niveaux le modèle murin.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome NARP, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également avant de procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes cités. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 20-25 pourcents d’animaux en plus, soit 10 souris par groupe.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 1 fois par semaine. Si l'animal perd entre 10 et 15 pourcents par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 25 pourcents l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Nous raffinons nos expérimentations en utilisant les animaux de chaque groupe pour recueillir plusieurs types de données. Sur chaque animal, l’ensemble des organes et tissus pouvant être recueillis sont prélevés afin d’anticiper les expérimentations futures. Pour toutes les procédures, les animaux seront observés quotidiennement, et les points limites seront évalués en détail: Plaie/Traumatisme, Comportement/Mouvement, Aspect général, Evolution pondérale. Un score sera attribué, qui déterminera les traitements/observations à suivre: Score 0-2 = aucune douleur => pas de traitement. Score 3-5 = Observation plus importante et gel diet et croquettes humides au fond de la cage. Score 6-7=douleur légère à modérée=>Nettoyer d'éventuelles plaies et injection en sous cutanée d'un anti douleur et euthanasie si pas d'amélioration sous 24H. Score 8-9 = euthanasie de l'animal pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. Les animaux seront transférés dans différentes animaleries selon les analyses. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquate et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des cages de transport adaptées contenant copeaux, cotons et nourritures. Les souris contrôles seront toujours séparées des souris modèle de la maladie. Les transferts seront effectués une semaine avant les analyses pour laisser un temps d'acclimatation dans la nouvelle animalerie.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. Les animaux seront suivis de leur naissance (mortalités, suivi des portées, génotypage, avortements spontanés) à l'âge de 2 ans. Les animaux seront caractérisés dès l'âge de 10 jours pour un suivi de poids hebdomadaire, aux âges de 2, 4 et 6 mois pour des tests d'endurance, de force musculaire, de coordination et de fonction cardiaque et aux âges de 1, 2 ,4 et 6 mois pour des dosages sanguins et urinaires, et des prélèvements d'organes.

159 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections intrapéritonéales, un traitement oral quotidien pendant 93 jours et deux prises de sang, après administration d'un composé oncogène et d'un produit chimique reproduisant une rectocolite hémorragique, avec perte de poids et diarrhées pouvant contenir du sang. Le porteur teste une molécule déjà passée en essai clinique de phase 2 pour réduire le risque de cancer colorectal, la mise sur le marché restant l'objectif affiché. Sur le remplacement, il affirme que seul le modèle murin convient, une tumeur liée à l'inflammation ne pouvant selon lui être reproduite sur cellules en culture.

Objectifs

La Rectocolite hémorragique est une maladie inflammatoire chronique de l'intestin affectant 1 personne sur 1000 dans le monde. Elle se manifeste généralement par poussées plus ou moins sévères caractérisées par des diarrhées, des douleurs abdominales et un amaigrissement pouvant amener à des complications comme une péritonite. Sur le long terme, les patients sont exposés à un risque plus élevé de cancer colorectal. Des traitements existent et permettent de réduire cette inflammation mais ne fonctionnent pas chez un grand nombre de patients. Notre molécule a montré une efficacité anti-inflammatoire dans le modèle murin de colite et chez le patient atteint de rectocolite hémorragique lors d'un essai clinique de phase 2. Dans l’objectif d’une autorisation de mise sur le marché de cette molécule en tant que médicament, nous voulons étudier la possibilité de diminuer le risque d’apparition de cancer colorectal chez les patients atteints de rectocolite hémorragique traités par notre molécule.

Bénéfices attendus

La mise sur le marché de ce composé permettra d'améliorer la prise en charge des patients pour qui les traitements actuels ne fonctionnent pas et de limiter leur risque de développer un cancer colorectal.

Procédures

Les animaux recevront une injection par voie intrapéritonéale au début de l'étude puis une deuxième au jour 21, ce geste dure environ une dizaine de secondes. Nous administrerons également aux animaux un traitement par voie orale de façon quotidienne sur une durée de 93 jours. Cette procédure est non douloureuse et réalisée avec une contrainte de très courte durée (10 secondes en moyenne). Deux prises de sang seront realisées, une avant le début de l'expérience et une seconde après 62 jours, d’une durée de 5 secondes en moyenne afin d'analyser différents paramètres biologiques. Ces gestes seront réalisés par du personnel qualifié et expérimenté.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus chez les animaux résultent de l’administration d’un composé oncogène induisant l’apparition de tumeurs cancéreuses et de la prise du produit chimique qui mime une rectocolite hémorragique chez l’homme. Ce produit chimique induit une altération de l’épithélium du colon qui provoque une perte de poids de l’ordre de 5% à 10% chez les souris malgré une alimentation et une hydratation normale et des diarrhées qui peuvent ou non contenir du sang.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude pour pouvoir réaliser des prélèvements de tissus et évaluer l’efficacité du traitement.

Remplacement

Nous voulons étudier la prévention de l’apparition de tumeurs associée à une rectocolite hémorragique et pour cela seule l’utilisation d’un modèle murin est adaptée car il n’est pas possible de reproduire le développement d’une tumeur suite à une inflammation sur des cellules en culture.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en se garantissant l’obtention de résultats statistiquement représentatifs. Le nombre de souris pour chaque groupe est fixé à partir des résultats précédemment obtenus dans un modèle de colite murine et d’après les résultats obtenus par des équipes travaillant sur le modèle.

Raffinement

La surveillance des animaux se fera régulièrement avec une évaluation du stress et de la douleur. L'administration répétée des composés par voie orale sera réalisée par du personnel entrainé à un geste précis et rapide. Ceci afin de limiter le stress de l'animal. L'hébergement des souris sera enrichi par l'ajout dans les cages de cabane en carton et de cotons, favorisant par exemple la construction de nids. Un fond musical est également assuré dans les locaux afin de diminuer le stress des animaux. Lors des périodes de récupération des animaux, de la pâtée alimentaire sera également distribuée dans les cages pour favoriser l’hydratation des souris.

Choix des espèces

Le modèle murin de cancer colorectal associé à une colite est très documenté et permet de reproduire les symptômes, les mécanismes immunitaires de la rectocolite hémorragique ainsi que le développement de tumeurs observés chez le patient. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 9 semaines car c’est l’âge optimal pour une induction de la colite qui ne soit ni trop importante ni trop mineure pour observer des effets de la molécule.

180 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont exposés au xénon dans une boîte d'inhalation pendant quatre heures et porteurs d'une pompe implantée chirurgicalement dans le dos pour délivrer un médicament, afin de tester si le xénon aide les traitements à franchir la barrière hémato-encéphalique. Le porteur indique que l'implantation de la pompe peut provoquer une infection et une réaction inflammatoire locales. Il reconnaît qu'une partie du projet repose sur des cultures cellulaires in vitro, mais affirme que la complexité anatomique impose un recours aux "systèmes intégrés", les rats étant tués pour prélever leurs organes.

Objectifs

La barrière hématoencéphalique (BHE) est une interface essentielle qui sépare le sang du système nerveux central (SNC), empêchant ainsi les substances indésirables d'atteindre le cerveau. Cette barrière constitue un obstacle majeur pour l'acheminement de médicaments ciblant le cerveau. Dans le cadre de ce projet, nous explorons l'utilisation du xénon pour moduler la perméabilité de la BHE, permettant ainsi l'entrée de médicaments dans le cerveau. Le xénon présente de nombreuses propriétés intéressantes pour diverses applications : 1) il est chimiquement inerte et soluble dans la plupart des fluides biologiques ; 2) in vitro, il peut être facilement introduit et retiré des échantillons cellulaires ; 3) in vivo, il est actuellement utilisé comme agent anesthésiant à l'hôpital. Les protéines membranaires ABC (ATP Binding Cassette), jouent un rôle clé dans les phénomènes généraux de pharmacocinétique et de pharmacologie clinique, qui concernent de nombreux médicaments, grâce à leur capacité de reconnaissance multi-spécifique. La BHE présente une perméabilité restreinte et sélective en raison de l'expression de ces protéines ABC et de la présence de jonctions serrées dans les espaces inter-endothéliaux, permettant ainsi de contrôler la composition du milieu interstitiel cérébral. Bien que nous sachions maintenant que le xénon franchit rapidement la BHE, il est intéressant d'évaluer la possibilité d'utiliser sa dynamique aide au passage des médicaments dans le cerveau. Si tel est le cas, obtenir des informations sur la perméabilité de la BHE serait utile pour de nombreuses applications médicales, telles que la détermination de doses pour l'administration de médicaments au cerveau.

Bénéfices attendus

L'étude vise à étudier la capacité du Xénon à favoriser le passage de composés à travers la BHE. Les résultats de cette étude sont porteurs d'applications pharmaceutiques potentielles, qui bénéficieront en fin de compte aux patients. La démonstration d'une augmentation des concentrations cérébrales de médicaments tels que des agents anticancéreux (vérapamil), des antiépileptiques (acide valproïque, clobazam, stiripentol, bumétadine) et/ou des agents anti-infectieux (tenofovir, zidovudine, lamivudine, lopinavir) grâce à l'utilisation du xénon pourrait ouvrir la voie à son utilisation chez l'homme. Cela est d'autant plus prometteur que le xénon est déjà utilisé en clinique humaine. Les bénéfices attendus de cette étude comprennent : 1- Amélioration de la délivrance de médicaments au cerveau : En évaluant l'impact du xénon sur la barrière hémato-encéphalique (BHE), l'étude cherche à déterminer la meilleure combinaison de xénon et d'oxygène-Air qui favorise le passage des composés à travers la BHE. Cela pourrait conduire à une meilleure diffusion des médicaments thérapeutiques dans le cerveau potentialisant ainsi les traitements actuels. 2- Potentiel d'optimisation des traitements existants : Si l'utilisation du xénon permet d'augmenter les concentrations cérébrales des médicaments mentionnés (anticancéreux, antiépileptiques, anti-infectieux), cela pourrait améliorer l'efficacité de ces traitements chez les patients atteints de ces affections. 3- Utilisation potentielle du xénon chez l'homme : Si les résultats expérimentaux démontrent l'effet bénéfique du xénon sur la perméabilité de la BHE et l'augmentation des concentrations cérébrales des médicaments, cela pourrait justifier l'utilisation du xénon chez les patients humains. Étant donné que le xénon est déjà utilisé en clinique humaine, cela faciliterait son adoption et son application dans le contexte médical. En résumé, l'étude vise à démontrer les avantages potentiels de l'utilisation du xénon pour améliorer la délivrance de médicaments au cerveau, ce qui pourrait conduire à des traitements plus efficaces pour les patients atteints de cancer, d'épilepsie et d'infections par exemple. Ces résultats ouvriraient également la voie à l'utilisation clinique du xénon chez les humains, en capitalisant sur sa sécurité et son utilisation déjà établies dans le domaine médical.

Procédures

Les rats seront placés dans une boite d’inhalation permettant l’exposition au xénon. Les médicaments seront administrés au moyen d’une pompe Alzet placée au dos de l’animal. L’animal sera libre de ses mouvements dans la cage d’inhalation. La durée de traitement est de 4h. A la fin de chaque traitement les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d’organes.

Impact sur les animaux

Ces considérations seront prises en compte lors de l'étude : Stress lié à la manipulation des animaux et au placement dans la cage : 1- Problème d'infection suite à la chirurgie 2- Réaction inflammatoire : L'implantation des pompes peut provoquer une réaction inflammatoire locale.

Devenir

Les rats seront euthanasiés à la fin de chaque expérimentation pour des prélèvements d’organes.

Remplacement

Le projet que nous souhaitons mener repose sur diverses approches expérimentales complémentaires. La validation de l’utilisation du xénon comme marqueur de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique sera réalisée à l’aide de modèles in vitro de cellules en culture. Ces modèles in vitro constituent un axe important du projet et leur étude apporteront des éléments précieux qui permettront de réduire au maximum l’utilisation d’animaux. Toutefois, l’un des objectifs importants du projet est de tester si l’administration du xénon par inhalation permet une meilleure biodisponibilité cérébrale des molécules thérapeutiques. La complexité anatomique des voies de communication entre le compartiment systémique et le cerveau est telle qu’elles ne sont pas modélisable in vitro. Nous devrons donc avoir recours à des systèmes intégrés afin de tester et valider nos hypothèses.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux (180 au total) nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude.

Raffinement

• Les animaux sont hébergés en groupe, dans un environnement enrichi. • L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux hébergés permettent de garantir leur bien-être. L’état de santé des animaux sera surveillé (état général) tout au long de l’expérience • Stress des animaux liés à leur mise en cage :Les animaux seront progressivement familiarisés avec la boîte d'inhalation en étant exposés à celle-ci pendant des sessions d'entraînement quotidienne sur une période de 15 jours avant le début des expérimentations. Au cours de ces sessions d'entraînement, les rats seront placés dans la boîte d'inhalation pendant des périodes croissantes, commençant par des durées plus courtes et augmentant progressivement jusqu'à atteindre la durée maximale de 4 heures prévue pour l'expérience. Cette approche graduelle visera à réduire l'anxiété et le stress liés à l'exposition à la boîte d'inhalation et aux manipulations associées. • Infection/inflammation du fait de la chirurgie pour l’implantation des pompes : Les animaux seront suivis quotidiennement suite à l’implantation des pompes t. En cas de signe d’infection/inflammation, le vétérinaire sera contacté pour savoir quelles mesures prendre.

Choix des espèces

L’étude de l’efficacité du xénon pour moduler la perméabilité de la BHE nécessite un modèle élaboré comme le rat couramment utilisé en pharmacologie. De plus celui-ci est préféré à la souris car sa plus grande taille rend les expérience plus sensible (la quantité de signal étant plus grande). Cette espèce sera aussi utilisée dans les études futures de toxicologie. Les rats adultes seront utilisés dans ce protocole. Cette première étude adresse les agents thérapeutiques pour une application dans un premier temps chez l’adulte. En conséquence, Il est nécessaire d’utiliser des animaux bien matures sur le plan du développement neuronal. En fonction des résultats nous envisagerons les animaux juvéniles.

616 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules de cancer du foie puis une chimiothérapie combinée à un anticorps deux fois par semaine pendant six semaines, pour tester si cette association ralentit la croissance tumorale. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer une ulcération cutanée et que la chimiothérapie entraîne perte d'appétit et de poids. Il affirme avoir mené des études in vitro et sur tissus de patients, mais juge nécessaire une validation sur "animal entier" avant le passage chez l'humain.

Objectifs

Le cancer du foie est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à une combinaison de chimiothérapie, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement chimiothérapeutique standards entraine une augmentation de l’expression de la protéine ciblée par notre anticorps. Cela suggère qu’une combinaison entre notre anticorps et le traitement de référence pourrait améliorer l’efficacité du traitement du cancer du foie. L’objectif de notre projet est tout d’abord d’identifier la dose adéquate de chimiothérapie à utiliser puis d’évaluer l’efficacité de la combinaison entre le traitement de référence et notre anticorps sur la progression tumorale.

Bénéfices attendus

Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologie du foie.

Procédures

Une partie des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses du foie. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Les animaux recevront un traitement par chimiothérapie et anticorps 2 fois par semaine pendant 6 semaines par injection intrapéritonéale. Cette injection est réalisée sur animaux vigiles et prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont très limités. Pour les souris injectées sous la peau, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée. De même, les injections répétées intrapéritonéales peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Le traitement par chimiothérapie peut entrainer une perte de poids de la souris (perte d’appétit, fatigue).

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum. Il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement.

7 750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines, génétiquement modifiées, reproduisent des maladies neurologiques rares et développent troubles moteurs, dégradation de l'état général et perte de poids, tandis que des candidats médicaments leur sont administrés jusqu'à treize semaines, avec pose de mini-pompes sous la peau et prélèvements sanguins répétés. Le porteur fixe un point limite à 20 % de perte de poids, seuil qui déclenche la mise à mort des animaux qui se dégradent. Il affirme que seul l'animal possède un répertoire comportemental et neurophysiologique intégré permettant de tester l'efficacité des composés.

Objectifs

En France, le nombre de personnes atteintes de maladies rares est estimé actuellement à 3.5 millions. Une maladie est dite rare lorsqu’elle affecte moins d’une personne sur 2000. Plus de 7000 maladies rares, dont environ 800 neurologiques, sont décrites, et de nouvelles sont identifiées chaque semaine. Les maladies rares sont généralement sévères, chroniques, handicapantes. L’atteinte peut être visible dès la naissance ou l’enfance, comme par exemple l’amyotrophie spinale infantile. Cependant, plus de 50% des maladies rares apparaissent à l’âge adulte, comme la maladie de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique ou les ataxies spinocérébelleuses. La moitié des personnes atteintes présentent des déficits moteurs, sensitifs ou intellectuels et dans 9 % des cas, une perte totale d’autonomie. C’est dans ce contexte que notre équipe tente aujourd’hui d’identifier des composés issus de notre recherche capable de ralentir ou d’arrêter la progression de ces maladies, afin de proposer aux patients des traitements adaptés et personnalisés. Dans le cadre de la recherche de nouveaux médicaments, les composés, après avoir été sélectionnés grâce à des tests in vitro, sont testés in vivo chez la souris saine ou génétiquement modifiée afin d’évaluer leur effet dans le traitement des maladies rares neurologiques, et destinés à être administrés chez l’homme par différentes voies de traitement. La souris présente une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et apporte ainsi une forte valeur translationnelle. En effet, 90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris saine, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque l’homologie homme/souris n’est pas possible, le remplacement total ou partiel dans le génome du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées génétiquement modifiées. Nous avons également recours à des souris génétiquement modifiées répondant en tant que modèle de physiopathologie humaine récapitulant une partie des caractéristiques pathologiques observées chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la stratégie de recherche en neurosciences. Les bénéfices attendus de ce projet sont d’identifier et de sélectionner des candidats médicaments et de déterminer leur efficacité sur une cible donnée dans le cadre de maladies rares neurologiques.

Procédures

• Administration des médicaments vétérinaires analgésiques (contention d’une durée maximale de 30s) • Administration de composés testables, de référence ou véhicule (selon la voie d'administration) : animal vigile en simple contention d’une durée maximale de 30s – 1 fois par semaine pendant 13 semaines maximum ou sous anesthesie générale gazeuse et couverture analgésique (durée maximale de 25 minutes – 1 seule fois en début d’expérience) ou encore avec mise en place d’une mini-pompe pour l’administration continue de composé implantée sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésique (durée maximale de 10 min – 1 fois par mois si nécessité de changer la mini-pompe) • Prélèvement de sang sur animal vigile (1 fois toutes les 3 semaines pendant 30 semaines maximum) : Contention d’une durée maximale de 2min ; Piqûre de la veine marginale de la patte d’une durée maximale de quelques secondes ; Prélèvement de sang d’une durée maximale de 15 secondes

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress ou douleur peut provenir lors : -Des injections d’analgésiques et/ou d’anesthésiques. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress. -de l’administration de composés testés réalisée dans la première procédure chez la souris vigile avec une contention de 30s et une injection d’environ 10s qui peuvent également générer du stress. -Ou, dans la seconde procédure de la phase chirurgicale nécessaire à l’administration du composé testé (d’une durée d’environ 20 minutes) et du suivi post-opératoire. -Des prélèvements de sang au niveau de la veine marginale de la patte. La contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress. -D’une perte de poids limitée à 20% du poids de l’animal. -Des signes cliniques observables associés à l’injection des composés (troubles du comportement, altération de l’état général). -De signes cliniques liés à l’expression des altérations génétiques : les souris génétiquement modifiées miment les pathologies humaines et sont susceptibles de développer ainsi des signes cliniques évolutifs tels que des troubles moteurs (incoordination motrice), une altération de l’état général, des dermatites, de la perte de poids.

Devenir

Toutes les souris sont soit euthanasiées en cours d’étude si des points limites éthiques sont atteints, soit euthanasiées en fin d’études afin de réaliser des prélèvements de fluides et/ou de tissus qui permettront d’effectuer des analyses biochimiques.

Remplacement

La recherche de nouveaux médicaments dans le domaine des maladies neurologiques rares repose sur une première étape d’identification de molécules efficaces sur leur cible au moyen de tests in vitro (cultures de neurones primaires, IPS…) et in silico. Toutefois l’efficacité thérapeutique d’une molécule ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal. Il est donc nécessaire que les molécules les plus abouties dans leur développement soient administrées in vivo. Plus spécifiquement pour ce projet, seul l’animal (sains et génétiquement modifié) possède de façon intégrée un répertoire comportemental et des caractéristiques neurophysiologiques permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments pour le traitement de maladies neurologiques rares.

Réduction

Dans un premier temps, une caractérisation des composés de référence est réalisée afin de déterminer la dose pharmacologiquement pertinente, choix basé sur les données de la littérature et les brevets issus de la concurrence (3 animaux par groupe suffisent à avoir une réponse reproductible). Les effets toxiques potentiels des traitements pharmacologiques seront évités en administrant aux doses définies dans la littérature ou après détermination de la première dose toxique par l’équipe de toxicologie. A l’issue des premiers résultats obtenus, nous pouvons tester à la dose identifiée les candidats médicaments avec un faible effectif (3 à 5 animaux par groupe suffisent à avoir une réponse reproductible). Ce premier filtre vivo permet de discriminer les composés afin de sélectionner uniquement les candidats pharmacologiquement intéressants. Ils seront ensuite évalués à différentes doses et différents temps post-administration à l’aide d’une approche descriptive (pas de tests statistiques). Les meilleurs candidats seront testés dans des études nécessitant plus d’animaux (pharmacocinétique / pharmacodynamie, …), une modélisation non linéaire et une approche statistique multi-critères est effectué en collaboration avec le service statistique dédié. Au cas par cas, en fonction du projet de recherche concerné et des questions posées, une consultation statistique sera programmée pour réajuster le nombre d’animaux nécessaire ainsi que pour travailler sur le design expérimental le plus adapté. La technique de prélèvement de sang dite par microsampling, peu invasive et rapide, permet de prélever des échantillons de sang plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux, tout en respectant les limites de volémies physiologiques. Lors des prélèvements effectués à la fin des études, un maximum de tissus et de fluides seront collectés sur un même animal. Chaque tissu, cérébral ou périphérique, sera séparé en plusieurs échantillons permettant ainsi la multiplication des analyses biochimiques et/histologiques potentiellement réalisables. Ce process nous permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés par projet de recherche.

Raffinement

Les injections intracérébrales seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse et avec analgésie pré, péri et post-opératoire. Seules les souris opérées pour l’implantation d’une mini-pompe (type pompe alzet) seront remises en groupe après la phase de chirurgie si les caractéristiques de la souche le permettent. Toute la phase chirurgicale, d’une durée d’environ 20 minutes, (de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal) se fera sur couverture chauffante et/ou dans des enceintes chauffées réduisant ainsi significativement le risque d’hypothermie. Les éventuelles recommandations en termes de limite d’âge ou de conditions de maintien émises par la Structure de Bien-Etre Animal seront appliquées aux souris âgées ou génétiquement modifiées qui peuvent développer des signes pathologiques avec le temps. Des prélèvements de sang à la veine marginale de la patte peuvent être mis en œuvre afin d’obtenir des informations sur des possibles biomarqueurs ou sur le profil d’exposition du composé (évitant ainsi des études de pharmacocinétique dédiées). Si des prélèvements sanguins répétés sont prévus, le volume maximal prélevé n’excèdera pas 15% de volume de sang total sur 28 jours. Tous les animaux font l’objet d’un suivi quotidien qui est accru lors des périodes post-chirurgicales, pour les souris génétiquement altérées, et/ou soumises à une étude pharmacologique chronique (procédure 2), réalisé par les expérimentateurs et le personnel assurant leur soin. Un suivi particulier sera réalisé pour les animaux faisant l’objet d’une administration de composés par voie intracérébrale. Plus précisément, un suivi post injection sera assuré dès le réveil de l’animal et par l’intermédiaire d’une analyse observationnelle basée sur des critères définis par une grille d’observation spécifique scorée. Les animaux disposeront d’enrichissement dans leurs hébergements bâtonnets de coton ‘cocoon’ et de sizzle pad pour se construire un nid ou de morceau de bois à ronger dans leur cage d’hébergement et d’un tube en plexiglass.

Choix des espèces

La souris présente une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et ainsi une forte valeur translationnelle. Les procédures d’évaluations décrites dans ce projet s’appuient sur une littérature scientifique et une expertise interne robustes. La souris est génétiquement modifiable, avec des techniques de plus en plus performantes (ex : édition du génome), et offre une large palette de modèles pertinents pour l’identification de nouveaux biomarqueurs et cibles des maladies neuropsychiatriques. Les souris seront utilisées du stade « jeune adulte sevré » au stade « animal âgé ». L’âge des souris au moment des études effectuées dépendra du modèle utilisé : Si l’étude concerne des injections de composés par voie cérébrale/orale ou périphérique, les souris utilisées sont de jeunes adultes sevrés ou adultes au moment de l’administration. Quel que soit le modèle, l’âge d’utilisation dépendra des éventuelles recommandations en termes de limite d’âge qui pourront être émises par la Structure de Bien-Etre Animal.

13 530 animaux non-humains vont être utilisés, en très grande majorité tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : 6 400 souris, 4 800 rats, 1 250 macaques à longue queue, 540 chiens et 540 cochons. Ils reçoivent des administrations répétées de candidats médicaments, des prélèvements de sang, de moelle osseuse ou de liquide cérébrospinal et, pour les non-rongeurs, la pose chirurgicale d'implants de télémétrie, dans des études de toxicité réglementaire. Le porteur indique qu'une analyse terminale des organes est le plus souvent nécessaire, seuls 10 à 15 % des non-rongeurs pouvant être réutilisés et certains proposés à l'adoption. Il justifie l'emploi de deux espèces, dont un non-rongeur, par les lignes directrices internationales et l'extrapolation à l'humain, aucune méthode ne remplaçant selon lui l'"organisme entier".

Objectifs

Un médicament n’est mis sur le marché pour les patients qu’après plusieurs années de Recherche et Développement. Les études précliniques, en amont des essais chez l’Homme, sont indispensables à l’évaluation de l’innocuité et de l’efficacité d’un candidat médicament. Celles visant à qualifier la sécurité du candidat médicament sont réalisées en accord avec la réglementation qui impose cette évaluation sur deux espèces mammifères, un rongeur (rats ou souris) et un non rongeur (chiens, mini-porcs ou primates non humains) (sauf cas particulier, par exemple pour les anticorps si une seule espèce est pertinente). L’objectif de ce projet est de réaliser des études de sécurité préclinique afin d’évaluer les potentiels effets indésirables des candidats médicaments. Pour cela, les procédures mises en œuvre concernent le suivi clinique et biologique des animaux suite à l’administration unique ou répétée du candidat testé, par des voies, la plupart du temps, identiques à celles prévues chez l’Homme, avec des prélèvements de fluides biologiques (par exemple : sang, urines) permettant de mieux caractériser les effets observés. Cela permettra d’avoir des informations essentielles (choix de dose et index thérapeutique) avant la première administration chez l’Homme ou bien de stopper le développement d’un candidat ayant un profil non satisfaisant en termes de sécurité. Ce projet fait partie des prérequis indispensables à la mise sur le marché de nouveaux médicaments et de nouvelles stratégies thérapeutiques pour l’Homme, efficaces, plus sûrs et mieux tolérés et participe aux progrès scientifiques et biomédicaux.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’apporter les éléments d’information nécessaires aux prérequis toxicologiques en évaluant la sécurité et les effets indésirables des candidats médicaments chez l’animal vivant. Les avantages attendus sont la protection de l’Homme, d’une part en stoppant le développement de composés pour lesquels la toxicité est rédhibitoire et/ou innocuité insuffisante et d’autre part en fournissant les informations essentielles avant les administrations en clinique (par exemple calcul des index thérapeutiques, caractérisations des effets secondaires attendus, biomarqueurs).

Procédures

Les animaux vigiles seront concernés par l’administration unique ou répétée (quotidienne ou hebdomadaire) du candidat médicament, possibles par différentes voies (le plus souvent intra-veineuse ou orale), au cours de l’étude sur une durée maximale de 2 mois. Des prélèvements de sang ou autres fluides biologiques, associés à une contrainte légère de quelques minutes, seront nécessaires pour évaluer différents paramètres (par exemple hématologie, biochimie, immunologie) ; leur fréquence et leur volume sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont réalisés sous anesthésie/analgésie (entre 15 et 30 minutes) quand ils sont invasifs (par exemple moëlle osseuse, liquide cérébrospinal). Des mesures comme par exemple, la température corporelle (avec puce électronique), le poids (2 fois par semaine) sont réalisées en fonction de l’objectif de l’étude. Plus rarement, une procédure chirurgicale pourra être pratiquée chez les non-rongeurs afin de mettre en place un implant vasculaire ou de télémétrie pour mesurer par exemple les ECG et la pression artérielle (durée d’intervention sous anesthésie générale-analgésie d’environ 2 heures).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables seront limités à une contrainte modérée. L’administration du composé lui-même peut provoquer une baisse d’activité, une perte de poids, des modifications de la température corporelle par exemple. Les nuisances liées à la procédure (contention, administration, prélèvements de fluides ou tissus biologiques, etc.) se traduisent par un stress, une douleur de courte durée. La mise en place d’implants vasculaires par chirurgie provoquera une contrainte de courte durée (douleur légère, baisse d’appétit par exemple).

Devenir

Ce type d’étude nécessite le plus souvent une analyse anatomo-pathologique terminale pour évaluer les atteintes sur les organes et tissus. C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas cette analyse que certains animaux non-rongeurs pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. L’estimation de ce nombre d’animaux est d’environ 10-15%. Certains de ces animaux pourront être proposés à l’adoption via des associations et des structures d’accueil spécifiques et en accord avec les autorités compétentes.

Remplacement

Le projet est réalisé sur animal vivant car il n’existe aujourd’hui aucun modèle in vitro mimant la complexité des interactions d’un organisme entier et les effets possibles d’un candidat médicament sur celui-ci. Il n’existe pas de méthode substitutive pour remplacer l’ensemble des études menées pour l’évaluation des risques en sécurité préclinique. Cependant, l’utilisation de méthodes in silico (modélisation informatique) et in vitro (par exemple organ-on-chip) mimant la structure et la fonction d’un organe (par exemple : foie, cœur, rein) permet un premier criblage des futurs candidats ou de mieux caractériser l’atteinte de telle ou telle fonction.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes sont définis sur des bases scientifiques (données bibliographiques et historiques, lignes directrices internationales et internes), et/ou avec l’apport des biostatistiques afin d'avoir un effectif minimum mais statistiquement exploitable pour pouvoir interpréter les éventuels effets adverses. Les tests statistiques utilisables sont dépendants des paramètres étudiés, et peuvent être par exemple, une analyse de variance, un test de tendance. La mise en place d’études combinant l’acquisition et l’analyse de paramètres de sécurité, pharmacodynamie et pharmacocinétique permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, l’utilisation d’animaux contrôles n’est pas systématique et est soumis à réflexion en fonction des objectifs de l’étude. Enfin, lorsque les objectifs d’étude le permettent et en accord avec le Vétérinaire clinicien, certains animaux peuvent être réutilisés, ce qui participe à diminuer le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Ce projet fait l’objet d’une démarche qualité rigoureuse avec la réalisation des études par du personnel formé et compétent, le respect des impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvements réalisés sous anesthésie-analgésie pour les plus invasifs, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique pour chaque espèce étudiée. Pour certains gestes techniques, une phase de désensibilisation/habituation est faite en amont de l’étude pour diminuer le stress de l’animal. L’administration est associée à une récompense physique (caresses, félicitations avec la voix) et/ou alimentaire. Les interventions chirurgicales sont réalisées en condition maximale d’asepsie et avec l’utilisation d’une analgésie multimodale. Le suivi clinique, au moins quotidien des animaux, permet la détection précoce de toute douleur, inconfort ou détresse et la mise en application de critères d’arrêt anticipés supervisée par le Directeur d’étude, le Vétérinaire clinicien et la Structure en charge du Bien-Etre Animal, afin que les animaux ne subissent pas plus qu’une contrainte modérée.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est défini par : -les lignes directrices internationales (ICH) définissant que les études de Toxicologie Générale doivent être conduites à la fois chez le rongeur (rat, souris, génétiquement modifiés ou non) et chez le non rongeur (chien, mini-porc ou primate non humain) -les données scientifiques telles que la cible thérapeutique visée, le véhicule envisagé et les données disponibles (pharmacocinétique, métabolisme et de toxicologie). L’espèce utilisée doit être pertinente et est essentiellement fonction de la similitude du profil métabolique et des effets biologiques attendus chez l’Homme, afin de permettre l’extrapolation des données acquises à l’espèce humaine. Le choix de l’espèce non rongeur peut dépendre également de la modalité thérapeutique (par exemple, les primates non humains pour les biologiques). Les animaux utilisés sont des animaux sevrés, juvéniles ou adultes, pour répondre aux exigences de la réglementation internationale et aux spécificités découlant des différents programmes de recherche.

270 souris, 270 rats et 270 cochons d'Inde vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette société de prestations teste pour ses clients des molécules dont elle indique ignorer la nature et les effets, administrées par des voies multiples, avec des prélèvements sanguins par ponction rétro-orbitale, sublinguale ou intracardiaque et des séjours de 24 heures en cage à métabolisme qui isolent chaque animal. Le porteur reconnaît qu'il lui est difficile d'anticiper les nuisances puisqu'il ne connaît pas les composés testés. Il conclut que l'absence de modèle in vitro rend le recours à l'animal "incontournable" et fixe six animaux par groupe d'après quinze ans d'expérience, sans test statistique.

Objectifs

Ce projet approuvé par la direction de la société permettra d’évaluer l’absorption, la distribution et le métabolisme de candidats médicaments dans l’organisme après administration afin d’obtenir des données de pharmacocinétiques et pharmacodynamie. Etant une société de prestations de service, nous testons les molécules de nos clients dont nous n’avons aucune connaissance sur le type/famille de molécule. Cependant, ces molécules seront testées dans le cadre de la recherche de pathologies rénales, urologiques, oncologiques, gastro-entérologiques…nos principales thématiques de recherche.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de récolter du matériel biologique (sang, organes, urines, fecès, salive….) afin d’avoir des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de candidats médicaments. Ces différentes données, obtenues au tout début des études pré-cliniques, permettront par la suite d’adapter les doses et la fréquence d’administration des composés dans des études plus complexes (pouvant mimer une pathologie).

Procédures

Les animaux seront traités par des molécules par différentes voies possible (per os, intrapéritonéale, intra-veineuse, sous-cutanée, intradermique, intra-vésicale…). Ces gestes sont en général rapides et durent moins d’une minute/animal. Les animaux pourront être anesthésiés pour certains gestes ou prélèvements (gazeuse : isoflurane ou fixe : xylazine/kétamine). Ces anesthésies devraient être rapides et ne pas durer plus de 1 heure (pour les administrations intra-vésicales). Des prélèvements sanguins sur animal vigil ou anesthésié au niveau des veines caudales, saphènes, de la veine abdominale, en sublinguale, submandibulaire, rétro-orbital ou intracardiaque pourront être réalisés. Ces gestes sont rapides et durent moins de 5 min. Les animaux pourront être mis dans les cages à métabolisme et seront donc isolés de leurs congénères quelque temps (24H maximum).

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. Cependant, les animaux vont être manipulés et vont recevoir des administrations de produits, pouvant engendrer un stress et une légère douleur. Les animaux pourront être mis dans des cages à métabolisme, et donc être isolés temporairement de leurs congénères (24 heures maximum), avoir des prélèvements sanguins, être anesthésiés…tout cela peut provoquer une nuisance.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés car des prélèvements de sang et d’organes seront réalisés.

Remplacement

Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent fournir du matériel biologique afin de réaliser différents tests de pharmacocinétique ou pharmacodynamie. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. En général, ces études préliminaires de pharmacocinétique et pharmacodynamie ne sont pas réalisées sur un grand nombre d’animaux car ce sont des études préliminaires aux tests pré-cliniques. Aucun test statistique n’est utilisé pour déterminer le nombre d’animaux par groupe. Cependant, de par notre expérience de plus de 15 ans, nous savons qu’un nombre de 6 animaux par groupe est suffisant pour avoir des données fiables et statistiquement significatives. Dans une même étude, il sera rare que différentes espèces soient utilisées. Nous prévoyons de réaliser 3 études par an par espèce avec 18 animaux par étude.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Différents types d’enrichissement seront ajoutés aux animaux (coton, aspen brick (bout de bois), igloo en polycarbonate, tunnel, carré de coton…). Les procédures nécessitant une anesthésie seront réalisées avec des plaques chauffantes thermorégulées afin d'éviter une hypothermie à l'animal. Les méthodes utilisées pour récolter tout ce matériel biologique (par exemple les cages métaboliques avec une phase d’acclimatation pour réduire le stress) sont peu invasives et ne devraient pas provoquer chez l’animal un grand stress, ni de souffrance particulière et ne nécessitent donc pas l’utilisation d’antalgique. Tous les gestes techniques seront réalisés par du personnel compétent et qualifié diminuant ainsi les temps de contention et la souffrance ou le stress possible. Le personnel, sensibilisé au raffinement et à l’éthique animal, pourra modifier quelques protocoles, enrichissement des cages…. en fonction des nouvelles techniques mises au point et nouvelles obligations dans le but d’améliorer les conditions des animaux de laboratoire. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids supérieure à 20%, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Si un animal présentait un signe de douleur, de mal-être, il serait isolé dans un premier temps, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Dans notre laboratoire, nous utilisons ces 3 espèces (rat, souris et cobaye) selon les modèles et aires thérapeutiques employés. Ces trois espèces seront donc utilisées pour réaliser des études de pharmacocinétique et pharmacodynamie. Les animaux utilisés seront très dépendants des demandes de nos clients et de la thématique étudiée. Nous essayerons le plus possible d’utiliser des animaux âgés de 7 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines. Cependant, l’utilisation d’animaux plus jeunes ou plus âgés sera possible.

1 320 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'adjuvant dans les coussinets plantaires, à la base de la queue et dans les flancs, injection qui peut provoquer une douleur modérée à la marche, ainsi que des injections de toxine pertussis, des gavages et des injections intrapéritonéales, pour tester la stimulation de lymphocytes T régulateurs contre les myosites auto-immunes. Le porteur euthanasie les souris pour prélever muscles et rate. Le projet, entièrement financé par une entreprise pharmaceutique, renvoie ses retombées pour les patients au conditionnel et au futur, et le porteur affirme qu'il faut recourir à la souris parce que seule l'expérimentation animale permettrait une approche intégrée.

Objectifs

Les myosites auto-immunes sont responsables d’inflammations musculaires chroniques conduisant à une altération dégénérative des muscles. Ces maladies fortement invalidantes se caractérisent par une faiblesse musculaire symétrique, des douleurs occasionnelles pouvant entrainer de la fibrose et une atrophie des muscles des membres. Leur diagnostic repose sur la clinique et des examens complémentaires. Les traitements actuels visent à induire une rémission de la maladie en utilisant de fortes doses de corticoïdes puis à maintenir cette rémission par de faibles doses de corticoïdes en combinaison avec des immunosuppresseurs. Le but étant de restaurer une masse musculaire et des fonctions motrices normales. Malheureusement ces traitements sont souvent peu efficaces et exposent les patients à des effets indésirables fréquents et parfois graves. Il est donc nécessaire de trouver de nouveaux traitements. La stimulation d’une population cellulaire du système immunitaire, appelée lymphocytes T régulateurs représente une approche thérapeutique intéressante que nous allons tester dans ce projet. Les lymphocytes T régulateurs ont un rôle bénéfique dans les myosites en inhibant les réponses immunes et inflammatoires. L'objectif de ce projet est de proposer une nouvelle approche thérapeutique dans ces maladies consistant à stimuler spécifiquement ces cellules. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour tester l’efficacité de ce traitement. L’objectif de ce projet est donc de pouvoir proposer une nouvelle approche thérapeutique des myosites réfractaires aux traitements classiques. Du fait de la complexité des mécanismes physiopathologiques impliqués dans les myosites auto-immunes, nous devons avoir recours à l'animal pour tester de nouvelles approches thérapeutiques. Il est important de rappeler ici que la plupart des avancées récentes en immunothérapie proviennent directement de données obtenues d'abord chez la souris. On voit donc l'intérêt de pouvoir tester ces approches chez la souris avant de pouvoir les appliquer à l'homme.

Bénéfices attendus

Grâce à ce travail, nous espérons avoir une meilleure connaissance du rôle des lymphocytes T régulateurs dans le contrôle des myosites auto-immunes et nous allons tester un nouveau traitement de ces maladies en stimulant ces cellules. Ce projet, entièrement financé par une entreprise pharmaceutique, pourrait se traduire par de nouvelles approches thérapeutiques chez l’homme dans le futur.

Procédures

On effectuera des immunisations des souris par voie sous-cutanée qui dureront moins de 30 secondes et des injections par voie intraveineuse de toxine pertussis qui dureront moins de 60 secondes. Dans les 2 cas, les animaux seront anesthésiés. On fera également des gavages et des injections par voie intrapéritonéale qui dureront moins de 30 secondes chacun par souris dont on fera une contention par le cou. On effectuera un suivi au moins 4 fois par semaine des souris pour mesurer le bienêtre animal et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 30 secondes par souris. Enfin, ces souris, seront euthanasiés quand 3 à 4 semaines après le début de la procédure (compter 5 à 10 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Aucun phénotype dommageable n'a été rapporté ou observé au laboratoire chez les souris génétiquement modifiées qui seront utilisées dans ce projet. Les différents traitements réalisés dans ce projet n’entraineront pas d’effet indésirable en soi. Il pourrait y avoir un stress bref lors de la contention des souris par la peau du cou et lors du gavage. Pour les injections par voie intraveineuse, les animaux seront anesthésiés. Les effets indésirables attendus dérivent surtout de l’injection par voie sous-cutanée d’un adjuvant dans les coussinets plantaires, à la base de la queue et dans les flancs. L’injection de cet adjuvant peut entrainer une gêne qui sera plus ou moins forte en fonction du lieu d’injection. A la base de la queue et dans les flancs, son injection génère une induration localisée pouvant entrainer une gêne pendant quelques jours sans provoquer de douleur. Injecté dans les coussinets plantaires, l’adjuvant peut entrainer une gêne à la marche et une douleur modérée au moment où la souris pose le pied au sol. Pour limiter ce problème, l’injection ne sera effectuée que dans un seul membre postérieur. La myosite ne devrait pas entrainer d’effet indésirable notable. En effet, dans ce modèle il est décrit que les muscles ne sont que faiblement enflammés, n’entrainant pas de paralysie ou de faiblesses musculaires majeurs. Les symptômes cliniques sont absents ou très difficiles à détecter.

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour pouvoir prélevez de nombreux tissus biologiques (muscle, rate) sur lesquels on effectuera des analyses cellulaires et immunologiques multiples.

Remplacement

Etant donnée la complexité du développement des myosites auto-immunes, seule l'expérimentation animale permettra une approche intégrée de la compréhension des mécanismes impliqués. Nous utiliserons la souris dans la mesure où c’est un modèle de référence d’étude des myosites auto-immunes et que nous avons développé au laboratoire des modèles de souris génétiquement modifiées uniques qui permettent de répondre aux questions soulevées par ce projet. Dès que possible, on effectuera un remplacement partiel de la souris par des expériences de culture cellulaire et par des analyses bio-informatiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Du fait de la variabilité de maladie interindividuelle entre souris, nous utiliserons des lots de 15 souris par groupe. Les expériences seront répétées 2 à 3 fois en fonction du type de question. Le nombre de souris par expérience et le nombre d’expériences ont été établis en tenant compte de l’expertise que nous avons développée depuis plus de 20 ans. Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Pour objectiver au maximum l’interprétation des résultats, les expériences seront faites en aveugle, c’est-à-dire que la personne qui induira la maladie ne sera pas la même que celle qui fera l’évaluation des scores de la maladie. Ainsi, les scores seront évalués à l’aveugle, sans savoir à quel groupe la souris analysée appartient. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous prélèverons les différents muscles enflammés et la rate de chaque animal afin de collecter le plus de données possibles.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont optimisées pour réduire douleur, souffrance ou stress. Les souris seront hébergées selon les conditions de la règlementation européenne avec accès ad libitum à la nourriture et à la boisson. Le change de la litière sera réalisé 1 fois toutes les 2 semaines et les biberons chaque semaine. Les souris resteront toujours en groupes sociaux (de 2 à 5 souris) en milieu enrichi. Les animaux sont vérifiés tous les jours par le personnel du service de zootechnie. L’état général des animaux (apparence physique, changement de comportement) sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en œuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Toute observation de souffrance animale (blessure, prostration, poil hérissé, modification majeure du comportement, expression faciale particulière indiquant des signes de souffrance) fera l’objet d’un avis au responsable de l'animalerie et sera suivi de l’application de ses conseils en tant qu’expert. En pratique si on trouvait un animal qui présente des signes de souffrance, nous l’euthanasierons. La dentition de chaque souris sera vérifiée régulièrement.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier les maladies inflammatoires chroniques de l’Homme et les lymphocytes T régulateurs en particulier. De nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. L’utilisation de souris génétiquement modifiées nous permet de répondre aux questions posées dans ce projet. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques in vivo et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche. Pour l’ensemble des expériences, celles-ci seront initiées chez des jeunes adultes de 8 à 10 semaines d’âge, à un moment où le système immunitaire est mature.