Recherche appliquée

1340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des régimes carencés ou enrichis en gras et sucre pendant seize semaines, des injections répétées, des gavages, et 90 d'entre elles une chirurgie d'accès aux ganglions et au tissu adipeux, avant prélèvement des organes. Le porteur répertorie une gêne à l'administration, des variations de poids et une douleur modérée liée à la chirurgie soulagée par antalgiques. Il affirme que les expériences in vivo sont "absolument essentielles" faute de système in vitro assez complexe.

Objectifs

Ce projet s'intéresse au rôle du microenvironnement immunitaire des organes périphériques comme le foie et l’intestin en conditions physiologiques et au cours de l’inflammation. L’inflammation s'accompagne de modifications des cellules immunitaires au voisinage du site d’inflammation et même jusqu’aux organes plus centraux producteurs de nouvelles cellules effectrices. Pour comprendre la régulation cellulaire et moléculaire de la réponse des cellules immunitaires dans l’intestin et le foie lors de stimuli inflammatoires, les souris sont mises dans des contextes de régimes alimentaire inflammatoires (MCD) et un régime gras et sucré (High-fat High glucose Diet, HFHG). Globalement, les désordres tissulaires engendrés par ces stimulations vont modifier le comportement des cellules immunitaires en agissant à différents niveaux (métabolisme, survie, prolifération, activation...). Ainsi, les cellules immunitaires seront étudiées pour leur propriété de prolifération, différenciation, de motilité et de circulation au niveau des organes primaires du système immunitaire (thymus et moelle osseuse), des organes lymphoïdes secondaires (ganglions, rate, plaques de Peyer) ainsi qu’au niveau des organes périphériques (poumons, l’intestin, le foie et le tissu adipeux). L’étude de la réponse immunitaire des différentes populations impliquées dans l’inflammation tissulaire, permettra de cibler les processus cellulaires et moléculaires mis en place par le système immunitaire en parallèle des modifications globales corporelles et systémiques (infiltration tissulaire, réponse systémique pathophysiologique avec l’analyse des caractéristiques hématologiques, biochimiques, cytologiques et histologiques). L’étape suivante consistera en l’analyse de molécules permettant de moduler la réponse inflammatoire et d’évaluer leur potentiel thérapeutique et leur mode d’action sur les cellules immunitaires et la répercussion sur l’état inflammatoire tissulaire.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en place lors d’inflammation tissulaire au cours de pathologies de type stéatose non alcoolique. A court terme, ce projet scientifique permettra de comprendre ce qui régit l’accumulation de certaines populations immunitaires dans le foie et l’intestin à la suite des inflammations causées par des régimes alimentaires spécifiques. Cela devrait renseigner sur les mécanismes moléculaires mis en jeu dans les tissus en inflammation pour réparer ou amplifier la stéato-hépatite et l’implication des modifications métaboliques associées comme l’insulinorésistance. Le rôle des différentes populations immunitaires sur l’évolution de la pathologie du foie et la perméabilité intestinale associée est encore mal compris. Cependant, des études indiquent que ces populations immunitaires seraient cruciales pour lutter contre une mise en place de modifications irréversibles, comme la fibrose. De plus, nous étudierons si ces processus relancent une hématopoïèse et quels en sont les mécanismes moléculaires associés. A long terme, ces données moléculaires sur l’inflammation pourraient représenter une source importante de moyens thérapeutiques avec des actions supplémentaires pour lutter contre l’évolution de la pathologie de type stéato-hépatite. Le nombre de cas est en constante progression au vu de l’augmentation mondiale de l’obésité qui y est associée.

Procédures

Les interventions sont: Un régime riche en gras et en sucre donné sur une période de 16 semaines à un grand nombre des souris en parallèle de leur contrôle sous régime alimentaire « normal ». Des injections intra-péritonéales (ip) (quelques secondes) tous les 5 jours pendant un maximum de 8 semaines. Des injections ip (quelques secondes) réalisées quotidiennement pendant 7 jours sur d’autres lots de souris. Une seule injection en ip (quelques secondes) sera réalisée soit 10H ou 24H avant la mise à mort. Un gavage de 2 minutes en 1 seule fois par animal sera suivi d’un dosage sanguin de quelques secondes sur une cinétique de 1, 3 et 5 heures pour certains animaux ou de 5, 15, 30, 60, 90, et 120 min pour les autres (quelques gouttes sur bandelettes). 90 animaux subiront une procédure chirurgicale (avec un maximum de 10min) permettant d’accéder aux ganglions et tissu adipeux. Des antalgiques sont administrés en pré et post opératoire et la chirurgie se fait sous anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

Nous avons répertorié 4 points de nuisances qui sont les suivants : 1- Une gêne légère liée à l’administration et/ou les prélèvements effectués. 2- Une perte de poids légère à modérée à la suite du régime alimentaire déficient en Methionine et choline (MCD). 3- Une prise de poids légère à modérée à la suite du régime alimentaire enrichi en gras et en sucre (High-fat High glucose Diet, HFHG). 4- Une douleur modérée liée à la chirurgie et améliorée par la prise d’antalgiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils sont tous utilisés pour prélèvement de leurs organes et l’isolement des populations immunitaires dans les différents tissus.

Remplacement

La réponse des populations immunes à des signaux inflammatoires tissulaires, donc provenant du dialogue entre divers sous-types cellulaires dans différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossible à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro assez complexe n’existe pour obtenir ces résultats. Pour les études dans une seconde étape, toutes les simulations d’activation cellulaire par des cytokines seront entreprises en culture afin d’éviter l’utilisation d’animaux dans le cas de questions mécanistiques.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires, notre étude ne prendra en compte que des points de temps bien précis pour la cinétique car les effets du régime sont déjà décrits dans la littérature et nous avons aussi le recul nécessaire avec notre précédent projets sur les mêmes régimes alimentaires. Par exemple, nous savons que l’insulinorésistance et la résistance au glucose ne sont à tester qu’à partir de la 12ème semaine de régime pour des souris sauvages. Les mécanismes cellulaires et leurs modulations ne seront analysés qu’aux stades précis de la cinétique correspondant aux points de temps avec des différences significatives des populations immunitaires détectées lors de la première procédure du projet. De plus, la compilation de données de la littérature et de données déjà générées au laboratoire (sur animal non manipulé), ainsi que des expériences de culture cellulaire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Enfin, le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. De plus, nous aurons des résultats des procédures qui s’enchainent qui permettront d’éliminer des hypothèses concernant l’implications de certaines populations et/ou molécules. Ainsi, le nombre d’analyse à faire sera réduit par rapport à ce qui a été anticipé en prenant en compte toutes les lignées utilisées à la procédure précédente sans tenir compte de la significativité des résultats. Pour les tests statistiques, nous avons évalué nos nombres finaux à analyser selon les comparaisons à faire entre les variables et selon un niveau de risque fixé à 0.01 et une puissance fixée à 0.66. Quand cela était nécessaire, nous avons appliqué un possible effet cage et donc pondéré par le facteur correspondant. Seulement dans les conditions adéquates (point de cinétique précis) où l'augmentation du taux circulant des cellules immunes est validé, une étude du blocage des molécules de circulation se fera par l’injection des anticorps bloquants. Nous vérifierons ainsi en étudiant le tissu cible si les populations bloquées avaient plutôt un effet pro-inflammatoire ou réparateur. Appliquer les bloquants uniquement dans le cas d’une circulation statistiquement signifiante permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste.

Raffinement

Les animaux sont manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences car ils sont souvent pesés et cela limite leurs stress de suivre cette habitude d’interactions. Une fiche d’observation tout au long des régimes permettra de vérifier leur état (pelage, poids, respiration, mobilité…) et des scores seront tenus afin de vérifier que le traitement n’induit pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis (perte de poids rapide, modification aspect pelage/alopécie, déshydratation, changement de consistance/couleur des selles) et le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de - diminuer la dose et/ou d’administrer un analgésique selon la gravité des changements de comportement. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures. Pour la plupart des procédures, les animaux sont mis à mort très peu de temps après le geste invasif. Quand les animaux sont conservés en vie, un suivi quotidien s’assurera de leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress selon la grille de score précédemment décrite dans ce paragraphe.

Choix des espèces

La souris de laboratoire, mammifère modèle, comporte tous les composants moléculaires et cellulaires clés du système immunitaire : l’analyse des nombreux lignages qui contribuent à la structure et aux fonctions complexes du système immunitaire des souris est précieuse pour appréhender la structure et les fonctions du système immunitaire humain. De plus, il existe un grand nombre de lignées de souris mutantes et transgéniques, qui permettent des études mécanistiques approfondies. Le recours à ces souris génétiquement modifiées va nous permettre d’identifier et de caractériser les processus sous-tendant la stéato-hépatite. Le détail du nombre d'animaux par procédure est mentionné dans le protocole. Toutes les souris seront analysées à l’âge adulte et les régimes débutés chez le jeune adulte âgé de 6 semaines. Cette date a été retenue comme la plus significative pour observer la mise en place et le suivi de la stéatose chez la souris. C’est le stade le plus précoce auquel les souris ont un poids assez stable et assez important pour en perdre suite au régime . De plus, comme le régime se pratique sur au moins 16 semaines, les souris doivent être prises à un stade qui évite qu’elles ne soient trop vieilles après le régime et que l’on ne soit pas sur l’interprétation d’un facteur vieillissement.

280 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par voie nasale avec des variants du SARS-CoV-2, puis soumis à une prise de sang intracardiaque terminale sous anesthésie pour produire des sérums et prélever des organes. Le porteur indique n'attendre qu'une perte de poids transitoire et aucun autre symptôme, et présente la production de mini-organes comme un moyen de réduire à terme le recours aux animaux. Il affirme que le hamster est "le modèle animal le plus sensible" à l'ensemble des variants.

Objectifs

Le virus SARS-CoV-2 continue d'évoluer pour échapper aux réponses des anticorps neutralisants et s’adapter à de nouveaux hôtes. Il est important de comprendre et détecter la réponse immunitaire spécifique aux différents variants pour mieux suivre une éventuelle circulation des variants SARS-CoV-2 dans les populations animales. La proximité d’espèces sauvages partageant les mêmes espaces que l’Homme et la détection de matériel génétique du SARS-CoV-2 et ses variants dans les eaux usées incitent à poursuivre les recherches sur le rôle que ces espèces pourraient jouer en tant que réservoir secondaire des variants du SARS-CoV-2, avec un risque d’émergence d’un nouveau variant pour l’Homme. Il apparait donc nécessaire de développer de nouveaux outils de diagnostic permettant d’appréhender plus rapidement le risque pour l’Homme. Le hamster est le modèle animal le plus sensible à l’ensemble des variants et peut facilement être utilisé pour produire des matériaux de référence comme du sérum et des organes spécifiquement infectés par ces variants. Ces matériaux de référence issus de sérums/organes d’animaux infectés ou non-infectés permettront de développer un panel de méthodes de diagnostic. Par ailleurs les organes collectés permettront de mettre au point des méthodes de recherche d'anticorps intra-tissulaires pour chaque variant lorsque l’obtention de sérum ne sera pas possible. Ils permettront également de mettre au point des cultures de mini-organes en vue de constituer une réserve d’organes limitant ainsi l’utilisation d’animaux par la suite. Dès l’identification d’un nouveau variant d’intérêt par les pouvoirs publics (en fonction du nombre de personnes infectées), nous envisageons d’infecter 6 hamsters avec ce variant. Une prise de sang terminale sera effectuée en fin de procédure pour collecter du sérum, et après mise à mort, les organes/tissus infectés (cœur, rate, poumons, feces, écouvillonnages salivaire et rectal et intestins) seront collectés. Un groupe de 2 hamsters non infectés sera également utilisé afin de fournir un matériel de référence négatif. En se basant sur la fréquence d’apparition annuelle de variant, et en prenant en compte les variants actuellement disponibles au laboratoire, on estime que 35 variants maximum seront testés au cours des 5 années du projet, soit un total de 280 hamsters (35 x 8).

Bénéfices attendus

L’approche expérimentale utilisée pour ce projet permettra de développer et valider des outils de détection sérologiques adaptés à chaque variant et aux investigations dans la faune sauvage potentiellement réservoir du virus SARS-CoV-2 ou de ses variants (microprélèvements, organe/tissus d’intérêt…). La collecte des différents organes/tissus permettra de rechercher les marqueurs d’une infection passée (anticorps) pour chaque variant et de valider de nouvelles matrices lorsque l’obtention de sérum ne sera pas possible dans les conditions du terrain. Le travail innovant sur les mini-organes permettra l’étude in-vitro des mécanismes d’infection d’un variant sur une espèce sensible, limitant ainsi l’utilisation d’animaux de laboratoire. Dans un second temps, ce travail pourra être étendu aux espèces de la faune sauvage afin d’obtenir des réserves de mini-organes permettant de tester la réceptivité/sensibilité de ces espèces vis-à-vis des nouveaux variants. Dans cette optique et sur le long terme, cela permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés. Ces modèles pourront ensuite être utilisés dans d’autres études ou pour tester d’autres agents pathogènes.

Procédures

Les hamsters seront infectés une seule fois par voie intra-nasale (40μl - animaux anesthésiés - durée = 15 secondes environ) Une prise de sang intracardiaque sous anesthésie profonde (+ traitement anti-douleur) est effectuée sur tous les hamsters (durée 3 minutes)

Impact sur les animaux

Une possible perte de poids, progressive et s’étalant sur une période allant de J+1 à J+6 post-infection, est potentiellement attendue chez les hamsters infectés avec du SARS-CoV2. A partir de J+7 post-infection, les animaux commencent à reprendre du poids. Hormis cette possible perte de poids, il n’y a eu, et ce quel que soit le variant isolé depuis l'apparition de la Covid-19, aucun autre symptôme clinique durant la période d’infection et aucun décès lié à cette infection.

Devenir

Mise à mort pour collecte de sérums et tissus

Remplacement

A l'heure actuelle, seul le modèle hamster naturellement sensible au virus SARS-CoV-2 et à ses variants nous permettra d’obtenir d’une part des informations sur les mécanismes d’infection par les différents variants et d’autre part de collecter des échantillons pour développer des outils sérologiques et cellulaires adaptés à leur détection ou à leur étude dans d’autres espèces animales.

Réduction

35 variants seront testés au cours des 5 années du projet, soit un total de 280 hamsters (35 x 8). Le nombre de hamsters pour chaque variant testé a été déterminé de façon à obtenir les volumes de sérum et la quantité de tissus nécessaires pour pouvoir mener à bien le développement et la validation des différentes techniques qui permettront une meilleure compréhension de la réponse immunitaire induite suite à l’infection par chaque variant. Aucune analyse statistique n’est réalisée. La collecte des organes permettra de disposer de matériel qui pourra être utilisé pour le développement notamment de mini organes qui à moyen terme permettra des études in vitro, réduisant ainsi l’utilisation d’animaux de laboratoire.

Raffinement

Les hamsters seront hébergés en cage de 2 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Des points limites précis et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis.

Choix des espèces

Les études scientifiques menées sur le SARS-CoV-2 ont maintenant largement démontré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une forte sensibilité au virus (atteintes respiratoires, perte de poids) ainsi qu'une forte réceptivité (multiplication du virus dans les poumons). Le hamster est donc un modèle d’infection de choix. Nos précédentes expérimentations nous ont permis de caractériser la réceptivité et la sensibilité des hamsters adultes vis à vis des souches SARS-CoV-2 utilisées au laboratoire. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 8 semaines à réception.

560 souris au système immunitaire partiellement humanisé vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales de côlon ou de mélanome, des injections de traitements et un suivi de la tumeur au pied à coulisse, avant prélèvement des tumeurs. Le porteur indique que la pousse tumorale peut entraîner perte de poids et douleurs au niveau de la tumeur. Il affirme que l'évaluation de thérapies immunitaires est "davantage pertinente dans un organisme entier".

Objectifs

Stimuler le système immunitaire est une stratégie ayant déjà été appliquée en clinique, mais une stimulation plus ciblée serait davantage efficace dans la lutte contre les cellules tumorales. Une substance secrétée par les cellules du système immunitaire (cytokine) a subi des modification structurale afin d'augmenter son efficacité de stimulation du système immunitaire. Une série de trois variants de cette cytokine présentant une activité biologique modifiée a ainsi été obtenue. L’étude de ces molécules constitue l’objectif principal de ce projet. Nous voulons montrer ici que ces variants de la cytokine seront efficaces contre les cellules tumorales de cancer du côlon et de mélanome et que cette efficacité sera potentialisée en combinaison avec une immunothérapie. Nous utiliserons pour cela un modèle de souris possédant une partie de son système immunitaire identique au système immunitaire humain afin de se rapprocher au plus près de la réalité clinique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. En effet, il existe aujourd’hui peu de stratégies thérapeutiques pour les cancers résistants. L’étude de nouvelles thérapeutiques va permettre de développer en phase préclinique de nouveaux traitements qui permettront au mieux de guérir les patients atteints de ces cancers, ou au moins de ralentir la progression tumorale.

Procédures

Contention et injections de cellules tumorales en sous cutanée (quelques secondes, 1 fois) - injection de traitements en intra-veineuse sur animaux vigiles (quelques dizaines de secondes, 1 ou 2 fois par semaine selon le traitement) - pesée et mesures des tumeurs (quelques dizaines de secondes, 3 fois par semaine).

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir des injections sous cutanée qui vont générer du stress à la contention et une douleur courte à l’injection. Lors du traitement, les animaux vont subir un stress à la contention et une douleur courte lors de l’injection en intra-veineuse. La pousse tumorale peut engendrer de la perte de poids et des douleurs au niveau de la tumeur. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress lors de la contention et éventuellement de la douleur au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.

Devenir

Les animaux sentinelles pour prévelements des tumeurs afin de faire de l'immunophénotypage, et tous les animaux en fin d’étude pour prélèvements des tumeurs pour analyses.

Remplacement

Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur et de son environnement direct (structure cellulaire, rigidité etc). Une fois les tests in vitro réalisés pour étudier l'effet de molécules potentiellement anticancéreuses en clinique, il est nécessaire par la suite d'étudier leur comportement au sein de l'organisme vivant en présence de ces interactions et de ces paramètres précédemment cités. Pour ces raisons, l’évaluation de thérapies impliquant le système immunitaire est davantage pertinente dans un organisme entier.

Réduction

Les modèles seront faits séquentiellement et une évaluation de l’efficacité des composés sera effectuée après la réalisation des expériences sur le premier modèle, ce qui donnera lieu à une décision d'arrêter ou de continuer l'étude pour les modèles suivants. Les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. Pour la comparaison des poids et des volumes tumoraux, nous utiliserons un test statistique validé et fiable. Celui-ci nous a permis de déterminer qu'il nous faudra 10 animaux par groupe en suivi de l'éfficacité et de la survie. Nous utiliserons 4 souris sentinelles supplémentaires par groupe pour des analyses de chaque tumeur traitée.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x)manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Les expérimentateurs sont expérimentés et sont à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. L’état général des souris sera aussi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation. Par ailleurs, le personnel animalier inspecte quotidiennement les animaux et renseignent une grille de suivi basé sur des critères comportementaux (activité, isolement…), physiques (poils hérissés, dos vouté…) qui permettent de détecter rapidement une souffrance ou l’atteinte d’un point limite. Les animaux seront hébergés sur une litière en cellulose en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour se cacher).

Choix des espèces

Nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire complet, et de modèles tumoraux murins. La souris avec un système immunitaire complet est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. De plus, cette souche a été génétiquement modifiée pour répondre à notre question scientifique. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

1038 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, des injections de composés radioactifs et des prélèvements de sang, pour étudier la réponse immunitaire induite par la radiothérapie interne vectorisée. Le porteur affirme que cette radiothérapie n'induit aucune nuisance car utilisée à dose réduite, et fixe le volume tumoral toléré à 1500 mm3. Il conclut qu'il n'existe "pas de méthodes alternatives à ces expériences de preuve de concept in vivo".

Objectifs

Les mécanismes associant la radiothérapie et la réponse immunitaire dirigée contre les tumeurs restent à explorer. La radiothérapie conventionnelle utilisant des rayons X (RTE) est dédiée aux tumeurs localisées, la radiothérapie interne vectorisée (RIV) permet elle d'irradier spécifiquement les tumeurs métastatiques. Nous proposons d’étudier l’immunité induite par la RIV et la RTE. Dans ce projet, 4 approches complémentaires seront utilisées pour évaluer cette réponse immunitaire en fonction de la présence ou de l’absence de gènes d’intérêt dans les souris. Au maximum 1038 souris pourront être utilisées pour ces 4 études sur une durée de 5 ans. Le nombre d’animaux sera réduit au minimum tout en ayant un nombre suffisant pour obtenir un résultat statistiquement significatif. Toutes les expériences sont menées par du personnel formé et compétent. Ces études découlent de premiers résultats in vitro et in vivo réalisés au sein du laboratoire. Les animaux sont surveillés quotidiennement et pesés 2 fois par semaine. Dès qu’un animal présentera l'un des points limites définis dans le cadre de nos expériences, il sera pris en charge immédiatement.

Bénéfices attendus

La radiothérapie interne vectorisée (RIV) peut induire des molécules présentant un fort potentiel thérapeutique. Ces nouveaux agents pourraient constituer une avancée majeure pour la prise en charge des patients atteints de cancer et pour le maintien de leur qualité de vie.

Procédures

- Les greffes sous-cutanées seront effectuées avec un temps de contention réduit au maximum (

Impact sur les animaux

Les nuisances d’un traitement par VECs, administrées par voie intraveineuse ou par voie intratumorale, n’est pas supérieur à celle induite par une greffe de tumeur. Dans ce projet, la RIV n’induit pas de nuisance puisqu’elle est utilisée à la moitié ou au quart de la MTA (maximal tolerated activity). Nous avons démontré dans des études antérieures qu’il n’y a pas de perte de poids, une numération sanguine constante et au-dessus des seuils pendant toute la durée de l’expérience et aucun changement de comportement observable.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés soit parce qu'ils ont atteint un des points limites définis pour chaque procédure, soit pour prélèvements post-mortem à l'issue des expérimentations. En cours d'étude, tout animal démontrant une souffrance irréversible ou inacceptable sera immédiatement euthanasié.

Remplacement

Il s’agit ici d’évaluer l’impact d’une réponse immunitaire associée à la RIV et son impact sur le développement tumoral. Il n’existe pas de méthodes alternatives à ces expériences de preuve de concept in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique et fixé à 8 souris par groupe. Enfin, les expériences intègrent les impératifs éthiques, les modalités d’hébergement, d’enrichissement du milieu, de prévention de toute douleur, détresse, et/ou inconfort chez l’animal. En outre, le principe des 3R est respecté puisque nous utiliserons des mâles et des femelles (pas de tri dans la colonie). Enfin, une technique d’imagerie SPECT/CT sera mise en place pour visualiser et suivre dans le temps la biodistribution des VECs de manière non-invasive (pas d’animaux supplémentaires).

Raffinement

Concernant les greffes, le temps de contention sera réduit au maximum (20g) par méthode submandibulaire pendant la durée de l’expérience (espacé d’au moins 8 jours) par du personnel formé et compétent (procédure

Choix des espèces

La souris immunocompétente constitue un modèle expérimental de référence pour ce type d’expérience sur la réponse immunitaire. L’étude débutera quand les souris auront entre 6 et 8 semaines. En effet, à ce stade le système immunitaire sera mature.

1962 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans l'œil et, pour 606 d'entre elles, quatre lésions au laser de la rétine sur un œil, avant récupération des yeux après mise à mort. Le porteur classe l'injection intravitréenne en gravité modérée par précaution et affirme que les lésions laser sont indolores et compensées par le cerveau en moins d'une semaine. Il conclut qu'aucune alternative in silico ou in vitro ne donne accès aux "grandes fonctions physiologiques des mammifères", et prévoit d'arrêter si un vecteur atteint 80 % de neutralisation du VEGF.

Objectifs

Les maladies de la rétine sont des troubles neurologiques majeurs pour lesquels aucun traitement efficace n’existe, et ce malgré les découvertes mettant à jour certains mécanismes liés à leur progression. Pour la Dégénérescence Maculaire Liée à l'Age (DMLA) seuls existent des traitements palliatifs visant à réduire la prolifération de nouveaux vaisseaux immatures dans la rétine avec des anticorps administrés en Injection Intravitréenne (IVT) et qui sont dirigés contre un facteur de croissance des vaisseaux sangins : le VEGF. Ces nouveaux vaisseaux immatures ne sont pas étanches et laissent passer un liquide qui crée un œdème rétinien responsable de la perte de la vision. Ces traitements ne sont que palliatifs et ne ciblent en aucun cas les mécanismes à l’origine du développement de la pathologie. L’approche visant à bloquer en amont la fabrication du VEGF (avant sa synthèse) via des petits bouts d’ARN interférents (siARN) prend donc tout son sens. En effet dans la cellule, des petits bouts d’ARN quittent le noyau (ARN messagers) pour initier la fabrication du VEGF. Les siARN dirigés contre le VEGF entrent dans les cellules et viennent neutraliser les ARN messagers bloquant ainsi la fabrication du VEGF. Depuis plusieurs années notre société et ses partenaires ont mis en place un consortium permettant le développement de vecteurs (V) améliorant la délivrance de siARN dans le Système Nerveux Central (SNC) dont la rétine. Ces vecteurs se présentent sous la forme d’anticorps modifiés et ciblent les récepteurs impliqués dans le transport au travers des barrières biologiques, par exemple pour passer du sang vers le cerveau ou la rétine, ou pour rentrer directement dans les cellules. A ces vecteurs nous venons y accrocher des molécules thérapeutiques comme des siARN dirigés contre le VEGF. Issus du savoir-faire de notre société, nos candidats médicaments sont couplés à nos vecteurs (V-siARN) et transformés dans le but d’améliorer le transport vers la rétine pour augmenter le pouvoir d’action du traitement.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de ce projet est donc de combattre plus efficacement les rétinopathies à prolifération vasculaire (la DMLA mais aussi la rétinopathie diabétique) au moyen de vecteurs combinées à des brins d’ARN interférents pour bloquer les messagers cellulaires responsable de la synthèse du VEGF et donc lutter contre la pousse de nouveaux vaisseaux dans la rétine. La valeur ajoutée consiste à tester de nombreux de siARN dirigés contre le VEGF et à améliorer leur délivrance grâce à notre technologie (nos Vecteurs). Cette première phase expérimentale nous permettra de sélectionner les meilleurs couples siARN-Vecteurs pour passer, dans une deuxième étape, aux tests d'efficacité sur des modèles animaux pathologiques. Les bénéfices attendus pour de futures applications chez l'homme sont multiples par rapport à l'utilisation d'anticorps actuellement administrés en IVT. En effet notre technologie autorise nos vecteurs à se lier qu’à un seul type de récepteur sur les membranes des cellules de la rétine, ce qui nous permet de cibler précisément les cellules à l'origine de la surproduction pathologique de VEGF. D'autre part, il est connu que l'utilisation de siARN permet de rallonger significativement l'efficacité d'un traitement dans le temps par rapport aux simple anticorps classiques dirigés contre le VEGF, ce qui en théorie permettrai aux patients d'espacer la fréquence (mensuelle) des injections qu'ils reçoivent ; administration IVT qui reste un geste chirurgical particulièrement anxiogène et porteur de potentielles complications.

Procédures

Les animaux anesthésiés seront soumis à des administrations dans l’œil (IVT) (1440 animaux, durée de l’acte : 5 min par œil) et à 4 lésions laser de la rétine sur un seul œil (606 animaux, durée 30 min environ). Ils seront ensuite hébergés de 4 jours jusqu'à 3 mois maximum (4, 7, 14 jours, 1 et 3 mois pour un petit sous-groupe seulement) avant leur mise à mort pour récupération des yeux. Dans la partie concernant la mise en place du modèle pathologique de pousse de nouveaux vaisseaux immatures induit par lésion laser un groupe restreint d'animaux (30) subira 4 contrôles en imagerie rétinienne des lésions (le jour de la lésion, puis à, 4, 7 et 14 jours, durée 30 min) sous anesthésie générale. Lors de ces contrôles les animaux recevront à chaque fois une injection d’un traceur vasculaire fluorescent (1 min) pour la visualisation des vaisseaux rétiniens. En point final tous les animaux seront mis à mort dans nos expériences.

Impact sur les animaux

La procédure d'administration IVT est considérée comme légère chez l'homme mais pour plus de sureté nous la classons en modérée. Seule une désinfection du pourtour de l’œil est requise avant de commencer. Pour éviter de stresser les animaux, cette procédure sera effectuée sous anesthésie générale avec des antidouleurs. Avec une très faible fréquence, les nuisances pouvant être rencontrées dans ce type d’administration seront surveillées attentivement tous les jours (infections notamment). Pour éviter ce type de complication une pommade antibiotique sera systématiquement déposée sur la cornée. Concernant nos composés, nos données issues de projets précédents avec les mêmes molécules ne montrent pas de réaction du système immunitaire, ni de toxicité apparente. L'autre aspect susceptible d'affecter les animaux concerne les lésions rétiniennes par laser. Ces dernières, indolores, aboutissent à des déficits visuels qui correspondent à des tâches noires dans le champs visuel (< 15° d'angle visuel, ce qui correspond à peu près à des cercles de 10 cm de diamètre à un mètre de distance de l’œil). Au nombre de 4 par animal (en haut, en bas, à gauche et à droite), ces lésions couvrent au total moins de 10% du champ visuel des animaux et ceci sur un seul œil. De plus il est connu que des mécanismes corticaux au niveau des aires visuelles du cerveau compensent une partie de cette perte en moins d'une semaine (la lésion dans la rétine est toujours présente mais l’animal ne voit plus ces tâches sombres : mécanisme de remplissage perceptif). De fait, ces lésions n’affecteront que très peu la fonction première de cette voie sensorielle et donc le bien-être des animaux mais nous nous contenterons d'effectuer ces lésions sur un seul œil pour plus de sureté.

Devenir

Dans la procédure 1, un groupe de 720 animaux est inclus pour étudier le potentiel de nos vecteurs couplés au siARN. Si les analyses montrent qu'un couple de nos Vecteur/si ARN atteint plus de 80% de neutralisation des ARN messagers du VEGF-A alors le reste des animaux ne sera pas utilisé. Sinon le reste des animaux inclus sera mis à mort car il est nécessaire pour les analyses de les perfuser pour enlever le sang et nous récupérons les deux yeux pour analyse. Etant donné que nous commandons les animaux pour chaque expérience individuellement, les animaux inclus dans le projet et non utilisés ne seront pas à replacer. Dans la procédure 2 tous les animaux seront mis à mort car ils doivent être perfusés avant récupération des yeux pour analyse.

Remplacement

Toutes études de mesures physiologiques, de tests de molécules thérapeutiques, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l’heure actuelle aucune alternative (in silico ou in vitro) qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions physiologiques des mammifToutes études de mesures physiologiques, de tests de molécules thérapeutiques, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l’heure actuelle aucune alternative (in silico ou in vitro) qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille, de petite taille, facile d'utilisation, facile à reproduire et disposant d'une large panoplie de modèles génétiquement modifiés est idéale pour la mise en place de premières approches visant à développer de nouveaux médicaments. L’évaluation de l’efficacité de nos vecteurs couplés à une molécule thérapeutique ne peut être réalisé que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des molécules développées. A noter que la présélection des siARN qui vont être testés passe par une phase de sélection in sillico sur des bases de données informatiques ce qui permet d'éviter d'avoir recours aux animaux et ces derniers sont ensuite testés in vitro sur des cellules en culture avant de passer chez l’animal pour en mesurer l’efficacité.ères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille, de petite taille, facile d'utilisation, facile à reproduire et disposant d'une large panoplie de modèles génétiquement modifiés est idéale pour la mise en place de premières approches visant à développer de nouveaux médicaments. L’évaluation de l’efficacité de nos vecteurs couplés à une molécule thérapeutique ne peut être réalisé que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des molécules développées. A noter que la présélection des siARN qui vont être testés passe par une phase de sélection in sillico sur des bases de données informatiques ce qui permet d'éviter d'avoir recours aux animaux et ces derniers sont ensuite testés in vitro sur des cellules en culture avant de passer chez l’animal pour en mesurer l’efficacité.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été réduit au minimum requis pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Pour réduire d'avantage le nombre d'animaux nous avons opté pour des injections IVT bilatérales chez l’animal sain pour la sélection des différents siARN couplés à nos vecteurs car le geste, bien que classifié ici comme modéré, est à considérer comme une procédure légère sans composante douloureuse, ni impact au niveau de la vision. Le fait d'injecter les deux yeux dans cette phase de sélection nous permet donc de réduire le nombre d’animaux de moitié. Le nombre total d'animaux dans cette procédure fait l'hypothèse de l’échec des précédents V-siRNA testés. Si un des composés atteint plus de 80% de neutralisation du VEGF (observation systématiquement quantifiée dans chaque expérience) alors notre objectif sera atteint et le reste des animaux inclus dans le projet ne sera pas utilisé.

Raffinement

Les animaux seront soumis à un protocole anesthésique et analgésique rigoureux. Dans ce projet nous avons remplacé notre précèdent anesthésique par un de nouvelle génération car il permet un réveil plus rapide des animaux et n'entraine pas d'augmentation de la pression intra-oculaire (problématique pour l'IVT). Une couverture analgésique générale et locale permet d'éviter toute souffrance pendant l'expérimentation. Etant donné le court laps de temps d’exposition de nos V-siRNA dans l’œil (en moyenne 14 j et jusqu'à 3 mois pour un petit sous-groupe), ce type d’action n’est pas à même d’entrainer l’apparition de problèmes dommageables chez les animaux (observation effectuée dans nos précédentes études). Pour des questions de raffinement et de bien-être animal les groupes de lésions rétiniennes au laser passeront de 4 à 8 individus : en effet un seul œil sera lésé pour affecter le moins possible leur vision. De fait, ces lésions n’affecteront que très peu la fonction première de cette voie sensorielle et donc le bien-être des animaux. Enfin Le fait de choisir une administration IVT pour combattre les pathologies rétiniennes permet d’utiliser des doses largement revues à la baisse par rapport à une injection intra-veineuse avec une diminution des risques toxiques et immunitaires associés ainsi qu'une distribution dans tout le corps qui n’est pas voulue. Pour éviter toute souffrance animale, nous avons mis en place une grille d'évaluation de la condition des animaux avec toute une série de points limites et les actions y étant associées. Enfin les souris seront hébergées par 4 sous un cycle lumière-obscurité de 12 heures à 21°C (portoirs ventilés) et dans des cages avec un environnement enrichi (alternance entre dômes de plexiglas et dômes en papier, accompagné de nids en coton, de la frisure de papier craft et nous mettrons également à l’intérieur des cages quelques croquettes).

Choix des espèces

Dans ce projet nous avons choisi des souris saines adultes et pigmentées pour 3 raisons : En ophtalmologie il est indispensable d’utiliser des espèces pigmentées (non albinos) car elles ne sont pas dépourvues d’un type de photorécepteur dans la rétine. De plus leur utilisation est indispensable car nos Vecteurs ont été développés pour cibler la version « souris » du récepteur auquel ils se lient. Certains de nos Vecteurs ciblent également la version humaine de ce même récepteur d'où le choix d'une deuxième espèce, des souris adultes, pigmentées et humanisées pour le récepteur ciblé par nos vecteurs et ceci pour évaluer le potentiel de transfert de nos avancées chez l'homme. Enfin nous utiliserons ici uniquement des souris mâles et adultes car il a été prouvé que le modèle de lésion de la rétine que nous allons utiliser est beaucoup plus variable chez les jeunes individus et chez les femelles.

2500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris immunodéprimée reçoit une transplantation de cellules pancréatiques humaines sous la capsule rénale et un prélèvement sanguin hebdomadaire à la queue, pour évaluer la fonction du greffon avant transplantation chez le patient. Le porteur indique n'avoir noté aucune incidence sur le bien-être des souris lors du projet précédent et traiter la douleur chirurgicale, toutes les souris étant tuées pour récupérer le rein porteur du greffon. Il affirme travailler à une technique in vitro de remplacement mais la juge encore trop peu robuste pour fournir des résultats exploitables.

Objectifs

Lors de la transplantation des îlots de Langerhans chez le patient, la fonction primaire du greffon apparait comme le principal facteur pronostic de succés et son amélioration représente l'un des principaux enjeux dans le domaine. Aprés l'isolement de ces cellules, même aprés avoir obtenu une préparation d'îlots quantitativement importante, il est difficile de prédire la fonction après transplantation. L'évaluation pré-greffe (in vitro) consiste en un comptage, une viabilité, la pureté et la capacité à secréter de l'insuline. Malheureusemment, ces techniques ne corrèlent pas avec la fonction greffée chez le patient. Le modèle de souris xénogreffée montre, quant à lui, une bonne corrélation de fonction. L'objectif général du projet est donc, d'étudier les cellules pancréatiques humaines transplantées chez le patient, en transplantant une fraction chez la souris immunodéprimée, afin d'en évaluer la fonction. Cela se fait notamment par dosage spécifique du Peptide-C humain circulant dans le plasma de la souris.

Bénéfices attendus

La transplantation des cellules pancréatiques nous permettra : - D'une part, d'étudier la fonction des cellules pancréatiques humaines provenant de donneurs de phénotype différent (age, taille, poids, habitus...) et - D'autre part, de prédire la fonction du greffon cellulaire transplanté chez le patient recevant les cellules issues du meme donneur.

Procédures

Les animaux subiront un seul acte chirurgical à savoir la transplantation de cellules humaines sous la capsule rénale, traité par les anti-douleur adéquats (durée 15 minutes). Aussi, un prélevement sanguin hebdomadaire au niveau de la queue permettra de doser les hormones plasmatiques.

Impact sur les animaux

Ce projet etant un renouvellement d'un projet précédent, nous n'avons noté aucune incidence néfaste au bien etre des animaux transplantés. Les eventuelles douleurs notamment dues à la chirurgie sont palliées par un traitement anti-douleur adéquat. De la même manière, un traitement anti-douleur local (xylocaine) sera effectuée au niveau de la queue pour la prise de sang hebdomadaire.

Devenir

Nous envisageons la mise a mort de tous les animaux car en fin de protocole, nous récupérons le rein proteur du greffon pour étude immunohistochimique ou étude dynamique ex-vivo.

Remplacement

L'étude de fonction des ilots transplantés ne peut se faire sans faire avoir recours à l'animal car il n'xiste pas de technique in vitro performante qui permet de maintenir les cellules pancréatiques vivantes sur le long terme. Nous travaillons sur la mise en place d'une technique in vitro d'étude des cellules appelée périfusion en vue de remplacer l'animal, mais les données ne sont actuellement pas suffisemment robustes pour obtenir des résultats quantifiables et statistiquement exploitables. De plus, du fait de l'extreme hétérogénéité des donneurs d'organe, il n'existe pas de modèle d'étude ex vivo, organe-sur-puce, ou autre modele biostatistique qui permettent d'obtenir des résultats satisfaisants à l'heure actuelle. Aussi, l'usage de l'animal est necessaire pour 1) reproduire l'acte de la transplantation, 2) étudier les cellules humaines dans un organisme entier, et 3) maintenir les cellules vivantes pendant plusieurs semaines.

Réduction

Nous utiliserons le juste nombre d'animaux (n=5 animaux par pancréas traités) afin d'obtenir des résultats probants et statistiquement satisfaisants.

Raffinement

Les animaux seront hébergés et traités avec soin (nourriture et eau en illimité, visite quotidienne, cycle jour/nuit régulier). Les animaux recevant une chirugie seront surveiller pluriquotidiennement les 3 premiers jours après chirurgie puis quotidiennement. L'acte chirugicale se fera sous anesthésie et traitement de la douleur (pré et post opératoire - buprénorphine 0,05mg/kg) renouvelé selon le besoin. De plus, la chirurgie et les prélèvement sont réalisées par du personnel formé et sensible aux régles d’éthique expérimentale et qui manipule les animaux quotidiennement afin de les faire coopérer.

Choix des espèces

Les outils génétiques permettent de générer des animaux mutants immunodéficients disponibles facilement. De plus, nous disposons de tous les outils (anticorps, kits de dosages, animalerie) pour mener une étude facilité sur cet animal. Les souris Swiss Nude constituent un bon compromis puisque leur déficience d'immunité permet une bonne implantation des cellules humaines. Nous utiliserons des animaux adultes pour un geste chirurgical aisé.

496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après trois mois d'un régime induisant surpoids et troubles métaboliques, elles subissent un test au glucose puis une chirurgie reproduisant un accident vasculaire cérébral, suivie de tests comportementaux non précisés à sept et vingt et un jours. Le porteur indique que le modèle provoque douleur peropératoire, perte sensorimotrice, perte de poids et déshydratation, les souris étant tuées pour prélever les tissus. Il affirme que l'étude de l'ischémie cérébrale dans ce contexte métabolique ne peut s'envisager que dans un "organisme entier" et présente les retombées cliniques comme applicables à l'humain.

Objectifs

Les maladies cardiaques sont l'une des principales causes de problèmes de santé et de décès chez les personnes âgées, en raison des problèmes de santé associés (vieillissement de leurs artères et troubles métaboliques). Ce projet de recherche se concentre sur l'accident vasculaire cérébral, maladie de plus en plus fréquente chez les personnes de plus de 60 ans. Aujourd’hui aucune thérapie ne permet une bonne prise en charge de la maladie. Chez ces patients, les comorbidités, telles que l’hyperglycémie et l’hyperlipidémie sont des facteurs de risque bien identifiés, aggravant les conséquences de la maladie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre et caractériser le rôle des comorbidités liées à l’âge dans la modulation de la réponse des mécanismes de réparation après la survenue d’un accident vasculaire cérébral. Nous utiliserons un modèle classiquement utilisé et qui est proche de l’accident vasculaire cérébral chez l’Homme. Par ailleurs, la prise en compte des problèmes de santé associés à l'âge est nécessaire pour déterminer l’impact de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cette étude, qui sera menée sur 2 établissements utilisateurs, permettra de mieux comprendre les caractéristiques de l'accident vasculaire cérébral dans le contexte de vieillissement et ses problèmes de santé associés dans l’optique d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des comorbidités dans les conséquences de l'accident vasculaire cérébral. Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités).

Procédures

Après 3 mois d’administration d’un régime riche en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (une injection de glucose intrapéritonéale et mesure de la glycémie). Cette première intervention sera réalisée dans un des 2 établissements utilisateur (EU1 et EU2). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral en utilisant un modèle in vivo (chirurgie de 10 min) au sein de l'EU2. Les effets du régime sur la réponse après AVC seront analysés à J7 et J21 après la mise en place du modèle d’AVC à l’aide de tests de comportement.

Impact sur les animaux

L’âge (animaux âgés de plus de 6 mois) et le changement de l’alimentation induit une prise de poids (animaux de 35 – 60g). L’injection intrapéritonéale de glucose et la mesure de la glycémie sont également une nuisance pour l’animal. Le modèle d’AVC induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues. Les tests comportementaux peuvent également être une source de stress pour les animaux.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire les analyses histologiques, protéiques et génomiques

Remplacement

Notre projet a démarré par des études in vitro rapportant les effets d’un modèle de stress métabolique sur les fonctions de cellules endothéliales de vaisseaux cérébraux, notre but est maintenant d’étudier l’ischémie cérébrale dans ce contexte de stress métabolique (comorbidités), qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant en accord avec notre expérience sur ces modèles et un calcul de puissance. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront une analgésie en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 48h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score. Enfin, le bien-être animal sera aussi amélioré par l’enrichissement du milieu. Les cages seront pourvues de coton, bâtonnets de bois, igloo. Les souris sont placées dans une pièce au calme. Une chambre de réveil thermostatée sera utilisée en post-chirurgie. Le transport des animaux sera effectué en conditions ventilé et suivi de température.

Choix des espèces

Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle souris pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral (AVC) et pour lequel les outils sont nombreux pour le suivi de cette étude et ultérieurement pour le suivi de cette pathologie (anticorps, imagerie, modèles génétiquement modifiés). L’AVC étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte. Le choix du modèle sera réalisé en utilisant des animaux âgés d’au moins 6 mois, âge permettant de mimer la physiologie du vaisseau à l’âge adulte. Pour prendre en compte les comorbidités liées au vieillissement, les animaux seront préparés par la mise en place d’un régime conduisant à des comorbidités en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’AVC. Les souris C57BL/6J utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime.