Recherche appliquée

224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur mammaire humaine triple négative, une injection intratumorale de nanoparticules puis des séances d'irradiation sous anesthésie, avec transfert entre deux établissements. Le porteur indique que l'injection intratumorale est douloureuse, que la tumeur peut se nécroser et que les contentions répétées stressent les souris, toutes tuées pour prélever les tumeurs. Il affirme que "la règle de remplacement ne peut être appliquée" et renvoie les essais chez l'humain à un éventuel futur conditionné par une efficacité démontrée chez la souris.

Objectifs

Le cancer du sein est le plus fréquent des cancers chez la femme et le cancer du sein triple négatif parmi les plus agressifs, avec souvent des échecs aux thérapeutiques classiques du cancer. Le pronostic de ce type de cancer est mauvais et la recherche continue activement pour trouver des nouvelles thérapeutiques. Chez ces patientes, il est important de disposer de médicaments améliorant la survie et leur qualité de vie. Une thérapeutique innovante d’irradiation sélective à basse dose grâce aux rayons X a vu le jour. Elle permet de déclencher un processus de mort cellulaire en cascade grâce à des nanoparticules. Les nanoparticules sont spécifiquement conçues pour agir à la fois comme produit de contraste et agent thérapeutique. Un modèle animal murin pour le cancer du sein triple négatif sera utilisé afin d’investiguer 2 nanoparticules innovantes, pour évaluer l'efficacité thérapeutique après irradiation. Le projet est mené entre 2 établissements utilisateurs .Une injection intra tumorale de la nanoparticule sera réalisée dans des conditions de concentration du produit et de dose d’irradiation restreints, suite de précédentes études. Le développement et l’optimisation doit impérativement se faire chez l’animal pour pouvoir assurer la translation des résultats à terme chez l’être humain. La règle de remplacement ne peut être appliquée.

Bénéfices attendus

Chez les patientes atteintes d’un cancer du sein triple négatif , plusieurs stratégies de traitement existent telles que la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie et l'immunothérapie, mais les résultats sont souvent insuffisants. Au stade localement avancé ou métastatique, le besoin médical, en première ligne (chez les patientes n’ayant pas précédemment reçu de chimiothérapie en situation métastatique), est actuellement mal couvert par les alternatives disponibles. De plus, même si dans certains cas la survie à cinq ans après traitement peut être encourageante, les conditions de vie des patientes se dégradent du fait des effets secondaires des thérapies. De nouveaux traitements spécifiques, moins toxiques, plus puissants et surtout des approches thérapeutiques combinatoires constituées de différentes modalités et donc complémentaires les unes des autres représentent une approche extrêmement prometteuse pour améliorer la survie et la qualité de vie des patients atteints de cancer. L'objectif de ce projet est de tester l'efficacité thérapeutique de cette nouvelle thérapie et de prouver que l'approche combinatoire offre un bénéfice maximal avec un profil de toxicité acceptable pour les animaux, ce qui justifierait les bases d'études cliniques chez l’homme. A court terme, une efficacité antitumorale démontrée au stade pré clinique dans cette méthode de traitement innovante, permettrait éventuellement d’envisager de futurs essais chez l’homme.

Procédures

EU 1 Anesthésie locale (1x, 30sec): identification des souris _Contention 3x/semaine 25sec- mesure de la taille/pied à coulisse EU 1 et 2 _ EU 2Injection intratumorale sous cutanée 1x 100µL 30sec_Procedure 1 : Injection intratumorale de nanoparticule (1injection, 30sec)_Irradiation : 1x/sem ou 4x/sem_ Anesthésie générale selon schéma expérimental d'irradiation: soit 1 anesthesie/jour soit 4anesthesies/4j._Procedure 2 : selon précédents résultats, choix schéma irradiation et nanoparticule (en 1x /sem ou en 4x/sem) en variant dose et concentration._Anesthésie générale selon schéma expérimental d'irradiation: soit 1 anesthesie/jour soit 4anesthesies/4j.

Impact sur les animaux

Dans de très rares cas, un phénomène de gêne à la mobilité peut être observé après injection des cellules cancéreuses. Dans de rares cas, une nécrose de la tumeur peut apparaitre . Douleur lors de l'injection intratumorale du traitement ( douleur inférieure à celle procurée par un traitement anesthésique + contention) . Les contentions multiples (lors des mesures au pied à coulisse, des anesthésies, des pesées) de l’animal peuvent générer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, car les tumeurs seront prélevées pour des analyses histologiques.

Remplacement

Une présélection des nanoparticules sera effectuée grâce à des expériences in vitro pour exclure les combinaisons de traitement inefficaces et éviter ainsi des expériences animales inutiles. Pour confirmer l'efficacité in vivo et assurer la possible translation chez l'humain à terme, le modèle murin est nécessaire car les expériences in vitro ne peuvent pas reproduire entièrement le l'environnement complexe de la tumeur

Réduction

La conception des expériences et les procédures par étapes conditionnelles permettent de réduire le nombre d'animaux calculés à l'aide d'un test statistique . De plus, nous testons uniquement 2 nanoparticules sur 4 intialement produites ; ce choix a été basé sur l’ensemble des résultats obtenus par nos précédentes expériences in vitro et celles de nos collaborateurs

Raffinement

Une anesthésie locale est prévue pour l’identification des souris. Une anesthésie générale est prévue lors des sessions d'irradiation avec l’imagerie. De la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présenteraient des difficultés à se déplacer. Les animaux seront hébergés par groupe de 5. Une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant l’entrée des animaux en protocole . Surveillance des points limites, et des souffrances possibles, via une grille de scoring établie avec la SBEA. Mesures de raffinement prévues pour le transfert entre les EU ( 5 maximum par cage pour le transport, trajet court,alimentation, abreuvement, aération des cages)

Choix des espèces

Le modèlede cancer du sein triple négatif par greffe de lignées cellulaires humaines de sein immortalisées est un des modèle le plus utilisé pour les études visant à étudier l’efficacité des thérapeutiques anticancéreuses. Les souris immunodéprimées permettent de greffer des tumeurs humaines, ce qui permet de tester la réponse des tumeurs d'origine humaine. Les greffes de tumeurs humaines représentent des modèles cliniquement pertinents de cancer humain, qui simulent de nombreuses caractéristiques du cancer, notamment un microenvironnement tumoral distinct avec des structures vasculaires mal organisées et des régions de cellules hypoxiques, ce qui affecte négativement la sensibilité des cellules cancéreuses aux radiations. Greffe chez des athymic nude femelles à l’âge de 6-7 semaines, ce stade permet d’optimiser la prise de la greffe

8 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque lapin subit une chirurgie d'environ deux heures au cours de laquelle son urètre est sectionné puis reconstruit avec de la veine de cordon ombilical humain, suivie d'endoscopies sous sédation à deux et six semaines avant la mise à mort pour analyse. Le porteur indique que l'intervention peut provoquer douleur, rétention urinaire et atteinte de la fonction sexuelle. Il justifie le recours au lapin par le calibre de son urètre proche de celui de l'humain et affirme que le fonctionnement du système urinaire et immunitaire exclut une méthode alternative.

Objectifs

Les sténoses urétrales correspondent à un segment rétréci de l’urètre, canal qui permet l’évacuation de l’urine vers l’extérieur. C'est une maladie fréquente (229-627 patients sur 100 000). Elles se manifestent principalement par des difficultés à vidanger la vessie entièrement et engendre des infections urinaires et peut même être responsable d’insuffisance rénale. Pour corriger la sténose de l’urètre, il faut reconstruire l’urètre par chirurgie. Seul un prélèvement de la muqueuse buccale utilisé pour reconstruire l’urètre permet de corriger la sténose à ce jour. Mais cette technique demande souvent plusieurs interventions chirurgicales et le prélèvement de la muqueuse buccale est douloureux et cause des complications. Le cordon ombilical est composé d’une veine et de deux artères. Ces vaisseaux, qui ont entre autre été utilisés pour la régénération nerveuse, pourraient aussi être utilisés pour reconstruire l’urètre rétréci. L’objectif de ce projet est donc de remplacer la muqueuse buccale par un greffon provenant d’une veine ombilicale pour reconstruire l’urètre. Un précédent projet a montré qu’il était possible de greffer de la veine ombilicale sur un urètre incisé. Ici il sera testé une greffe d’un lambeau de tronçon ou d’un tronçon complet de l’urètre ce qui représente un vrai challenge en médecine. Pour cela, des lapins seront opérés, leur urètre coupé puis reconstruit. La cicatrisation sera suivie par endoscopie.

Bénéfices attendus

Actuellement, pour réparer la sténose de l’urètre, il faut la plupart du temps deux interventions chirurgicales espacées de 3 mois. De plus, le fait de prélever de la muqueuse buccale n’est pas sans problème (douleurs, saignements, difficultés alimentaires, troubles de la salivation et du goût, difficulté à articuler). Si la veine de cordon ombilical permet de reconstruire l’urètre de façon tubulaire, cette reconstruction pourra être réalisée en une seule chirurgie, sans prélèvement au niveau de la bouche. Cette technique pourra être utilisée dans d’autres maladies.

Procédures

La chirurgie sous anesthésie générale et antidouleur va s’étendre sur environ 2 heures pendant lesquelles l’animal, après préparation (tonte, désinfection, mise en place du monitoring) va subir une incision d’environ 2-3 cm. Son urètre sera externalisé, sectionné puis réparé avec de la veine de cordon ombilical. L’incision de la peau sera suturée. 2 semaines plus tard l’animal aura une endoscopie de l’urètre pour observer la cicatrisation sous sédation (15 min) et l’introduction d’une bougie calibrée pour vérifier que le diamètre de l’urètre ne diminue pas. Les lapins seront sortis de leur cage pour être pesés 2 fois par semaine. 6 semaines plus tard l’animal sera sédaté pour une nouvelle endoscopie (15 minutes) et sera mis à mort (5 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances/effets indésirables sur l’animal sont principalement : * nuisances liées à la chirurgie : - douleur possible au niveau de la zone chirurgicale - rétention urinaire post-opératoire possible - atteinte de sa fonction sexuelle * nuisances liées au suivi : - gêne liée à la présence du mini-drain - endoscopies prévues à 3 et 6 semaines (contention, anesthésie) - pesée deux fois par semaine (stress).

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever l’urètre et d’effectuer des analyses histologiques pour vérifier la cicatrisation.

Remplacement

D’après les travaux antérieurs, les vaisseaux issus de cordons ombilicaux humains sont tolérés chez le lapin et le rat. Il reste donc à étudier la cicatrisation dans le cadre de la reconstruction de l’urètre. Bien que la technique ait été validée sur cadavres d’autres projets en amont, le projet nécessite le système urinaire et le système immunitaire fonctionnels et ne peut donc pas être réalisé avec des méthodes alternatives à l’expérimentation animale.

Réduction

Des études préliminaires sur cadavres issus d’autres projets ont déjà permis de valider la procédure chirurgicale sans utiliser de lapins vivants dédiés à cet objectif. La procédure sera réalisée séquentiellement en débutant d’abord par la chirurgie qui engendra le moins de risque de difficulté (remplacement d’un lambeau d’urètre). Si tout se passe bien, le deuxième type de chirurgie (remplacement d’une section d’urètre) sera effectuée. Dans cette première étape, aucune statistique ne sera effectuée. Un effectif maximal de 4 animaux par groupe est prévu dans l’objectif d’obtenir 3 procédures réussies. Par ailleurs, le nombre d’animaux a été réduit grâce à l’utilisation de l’endoscopie, ce qui permettra d’évaluer la qualité de la prise de la greffe dans le temps chez le même lapin.

Raffinement

La technique chirurgicale a été élaborée et sera effectuée par des chirurgiens d’un service d’urologie. L’animal recevra une combinaison de deux anesthésiques locaux (rapide et longue action) durant l’intervention et au moment de la fermeture pour lutter contre la douleur lors de l’intervention et au réveil. Ainsi l’animal ne sentira aucune douleur pendant le réveil, ce qui réduira son stress post chirurgie. A réception, l’hébergement par deux sera testé. Si les animaux sont incompatibles, ils bénéficieront de temps dans un espace de « jeux » plus grand que leur cage comportant cabane, tunnel, hamac... L’état des animaux est évalué par l’observation de leur état physique (ouverture des yeux, orientation des oreilles) et la quantité d’aliment consommée.

Choix des espèces

Le lapin est l’animal le plus petit permettant de réaliser la reconstruction de l’urètre. L’intérêt de l’urètre du lapin est son calibre proche de celui de l’homme, un trajet droit, la survenue d’érections qui permettra de tester l’élasticité du tissu. D’un point de vue technique, la chirurgie est facile à réaliser dans de bonnes conditions chez le lapin. Une endoscopie de contrôle est facile à réaliser. Les lapins seront choisis par l’éleveur en fonction de leur taille. Nous demanderons des animaux adultes de grande taille afin que l’urètre soit le plus long possible.

6500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue et jusqu'à 100 réutilisés pour de la formation ou d'autres études. Un tiers subit une neurochirurgie crânienne d'environ une heure, puis les rats reçoivent des stimulations sonores et des injections de candidats médicaments jusqu'à deux fois par jour pendant 28 jours, avec des prélèvements sanguins répétés. Le porteur indique que les rats sont hébergés seuls après l'implantation, ce qui les isole socialement, et que les molécules testées peuvent provoquer perte de tonus, somnolence ou excitation. Il affirme que ces mécanismes complexes ne peuvent être reproduits par des modèles cellulaires ou informatiques et qu'une preuve d'innocuité chez l'animal est "indispensable" avant toute mise sur le marché.

Objectifs

Les maladies neurologiques et psychiatriques représentent un enjeu majeur de santé publique et touchent de plus en plus de personnes du fait de la croissance et du vieillissement de la population mondiale. Développer de nouvelles thérapies ciblant ces maladies est un axe majeur actuellement. L’objectif aujourd’hui est d’identifier des méthodologies précliniques précoces capables de sélectionner des composés sur la base de leur efficacité potentielle chez l’homme. Les méthodes se basent sur des biomarqueurs utilisables à la fois chez l’animal et chez l’homme. Parmis eux, les activités oscillatoires de base et les potentiels évoqués sont particulièrement intéressants. Dans ce projet, les activités oscillatoires spontanées et évoquées chez des animaux contrôles et des animaux reproduisant des symptômes de pathologies humaines seront étudiées.

Bénéfices attendus

Afin d'optimiser le développement de nouveaux médicaments et ainsi fournir aux patients des traitements efficaces, la priorité est donnée à la découverte et l'utilisation de marqueurs d'évaluation d'efficacité quantifiables, fiables et facilement transposables enter les études précliniques et cliniques. Les activités électriques cérébrales sont largement conservées à travers les mammifères permettant ainsi une transposition fiable entre l'humain et le rongeur. Dans ce projet nous utiliserons des rats.Nous chercherons à mettre en évidence de nouveaux marqueurs biologiques sur ces animaux. Ces marqueurs biologiques translationnels permettront de tester de nouveaux candidats médicament.

Procédures

1/3 des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores (2 heures maximum en pulse de stimulation, non continu) qui seront réalisées sur l’animal vigile une à deux fois par semaine. Lors des tests pharmacologiques en courte durée (injections aigues durant quelques minutes), un protocole de stimulation sonore sera appliqué avant et après l’administration d’un candidat médicament. Une période de repos de 2 jours minimum sera respectée entre 2 sessions (en fonction du delais possible d'admission des candidats médicaments). Lors des tests pharmacologiques en administration de longue durée (chronique), les injections pourront être réalisées jusqu’à deux fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours. Des prélèvements sanguins (d'une durée de quelques minutes) pourront être faits au cours de la procédue expérimentale en fonction du plan expérimental établi. Le volume de prélèvement dépendra de la fréquence de prélèvement : le volume prélevé pourra aller jusqu’à 7.5% de volume sanguin circulant avec une période de récupération d’une semaine (pour un rat de 300g, 1.2 ml), et jusqu’à 10% avec 2 semaines de récupération (pour un rat de 300g, 2 mL). Les prélèvements seront effectués de manière à ne pas dépasser le volume de sang maximm autorisé (1.2 ml sur 1 semaine) pouvant etre fait en prelèvement retro-orbitaire, ou caudal (en fin d'EEG par exemple, ou 200 µl de sang sont prélévés, répatable (si besoin de prelevement à différents temps pour la pharmacocinétique, avec une limite de 3 prélèvements maximum par jour), avec en moyenne 2 EEG par semaine)

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, une diminution de l'activité locomotrice et une deshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaitre dans les heures suivant l'intervention chirurgicale. Lors de la stimulation cérébrale, malgré l'intensité faible utilisée, une réaction comportementale (freezing, sursaut, clignement d'yeux) pourra être induite dans de rares cas. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tous tests de composés sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l'inverse une excitation dûe au fait des mécanismes d'action des molécules testées. Les animaux sont hébergés en cage individuelle (portoir ventilé) après l'implantation des dispositifs d'enregistrement ce qui engendre un isolement social.

Devenir

Il sera nécessaire de vérifier l’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus de tous les animaux engagés dans ce projet. Si toutefois cette vérification n'est pas nécessaire (demandé dans le plan expérimental), les animaux pourront être réutilisés (pour de la formation ou pour un autre plan d'étude) si : - le nombre d'injection maximum n'a pas été atteint - le bien être de l'animal le permet.

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle adresse des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou computationnel). Pour toute demande de mise sur le marché, et quel que soit le pays de vente ciblé, il est indispensable pour les industries pharmaceutiques de prouver l’innocuité et l’efficacité d’une molécule. Avant de réaliser des essais cliniques, des tests in vitro et in vivo sont nécessaires. Les mécanismes d’apparition, puis de mise en place des troubles neurologiques, sont encore peu connus et nécessitent des explorations supplémentaires. Cette étude nécessite donc l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être récapitulés par des modèles plus simples (ex. culture de neurones).

Réduction

Dans ce projet, chaque animal est son propore contrôle et chaque animal recoit toutes les conditions pharmacologiques dans un ordre aléatoire (= plan d'étude croisée), ce qui permet de reduire le nombre de groupe d'animaux (évite d'avoir un groupe d'animaux contrôle). Le nombnre d'animaux nécessaire pour avoir des réultats significatifs est calculé avant d'établir le plan expérimental en utilisant des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Dès réception, les animaux s'acclimatent 1 semaine à leur environnement. Une injection de morphinique sera faite avant la procédure chirurgicale et sera renouvelée 6 à 8 h après afin de prévenir toute douleur liée à la phase de chirurgie. Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale volatile. L'état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et définissant les points limites adaptés. Cela permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles avec enrichissement. Il sera proposé aux animaux, 1 fois par semaine pendant 30 minutes, un temps de regroupement et de sociabilisation au sein d'une enceinte contenant différents enrichissements.

Choix des espèces

Dans ce projet nous utiliserons des rats. Ces animaux présentent des similarités anatomiques et fonctionnelles avec le cerveau humain et notamment au niveau des activités électriques cérébrales spontanées et induites et ils peuvent être utilisés pour le développement de nouveaux médicaments. Les animaux sont manipulés au minimum à l’age de 8 semaines puisque nous souhaitons évaluer les modifications électrophysiologiques chez des animaux adultes, car les circuits, à cet âge là sont matures.

Les souris utilisées portent une modification génétique qui provoque un syndrome de Leigh : perte de poids et retard de croissance vers quatre semaines, difficultés croissantes à se déplacer, puis détresse respiratoire peu avant la mort, vers sept ou huit semaines. 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Dès le sevrage, à 21 jours, elles reçoivent dans leur nourriture deux molécules qui freinent le système immunitaire, et passent un test de coordination sur rotarod à 40 jours, après un entraînement à 30 jours. Le traitement dure jusqu'à la mise à mort, décidée par une grille de score : une perte de poids de plus de 20 %, une détresse respiratoire ou une mobilité fortement réduite suffit à atteindre le seuil de 3 points. Le porteur mesure l'efficacité au retard d'apparition des signes cliniques, et garde donc les souris en vie jusqu'à ce que leur état franchisse ce seuil.

Objectifs

Il n'existe aucun traitement disponible pour la plupart des maladies mitochondriales, maladies génétique du métabolisme entraînant un handicap grave et une mort prématurée. Le syndrome de Leigh en est une des formes plus graves. Il est causé par des mutations dans de nombreux gènes différents affectant la fonction des mitochondries, les centrales énergétiques de nos cellules. Cliniquement, cette maladie affecte généralement le cerveau et les muscles. Une étude récente a rapporté un effet positif de deux médicaments agissant sur l'inhibition du système immunitaire chez un modèle de souris développant un syndrome de Leigh suite à l'inactivation d'un gène mitochondrial particulier. Le but de notre projet est de tester ces deux molécules sur un deuxième modèle de souris du syndrome de Leigh, impliquant un autre gène, afin de déterminer si ces deux traitements peuvent être généralisable à tous les patients atteints par cette maladie.

Bénéfices attendus

Le projet vise à étudier l'implication du système immunitaire en tant que mécanisme principal à l'origine du syndrome de Leigh et la possibilté d'approches thérapeutiques le ciblant . Si les résultats sont solides et montrent des améliorations significatives, cela devrait permettre le développement de traitements cliniques pour le syndrome de Leigh et potentiellement pour d’autres maladies mitochondriales.

Procédures

Traitement pharmacologique: administration de deux molécules thérapeutiques dans la nourriture, de l'âge de 21 jours jusqu'à la mise à mort de l'animal basée sur l'observation de signes cliniques. Basé sur une publication sur un modèle similaire, le traitement pourrait s'étendre sur 6 mois. Test de coordination motrice: les souris seront placées sur une machine (rotarod) permettant de vérifier leur capacité à coordonner les mouvements de leurs pattes. Il y aura une phase d'entrainement à l'âge de 30 jours, puis une phase de mesure à 40 jours. Basé sur des publications scientifiques, les souris restent en moyenne 10 minutes sur le rotarod, par mesure. Trois mesures seront effectuées, espacées de 15 minutes de récupération.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées sur ce projet ont un phénotype dommageable qui commence par une perte de poids et un retard de croissance (vers 4 semaines), puis des difficultés progressives à se mouvoir, et enfin des difficultés respiratoires peu avant le décès (à 7-8 semaines). Les traitements pharmacologiques en question ont été déjà appliqués dans des études scientifiques publiés qui ne semblent pas attribuer effets indésirables spécifiques.

Devenir

Tous les animaux prévus sur ce projet seront mis à mort en fin de protocole expérimental en vue de prélèvements post-mortem

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle en absence d’autre modèles cellulaires qui permettent d’étudier la réponse du système nerveux à des immunotraitements in vivo. De plus, les modèles physiopathologiques par définition étudient les conséquences pathologiques de la mutation sur l’ensemble de l’organisme. Les lignées cellulaires tels que les cellules de peau de patients atteints par le syndrome de Leigh ne peuvent pas reproduire les mécanismes complexes d'adaptation physiologique systémiques liés à ces dysfonctionnements des mitochondries.

Réduction

Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique et les effectifs ont été calculés à l'aide d'un logiciel. Ainsi nous allons utiliser les mêmes souris pour les analyses cliniques, pathologiques et moléculaires.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la structure de bien-être animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). En raison du phénotype dommageable des souris, nous ajoutons de la nourriture directement dans les cages, et utilisons des biberons avec tétine longue, pour permettre aux animaux de s'alimenter plus facilement. Pour limiter l’inconfort lié aux procédures, les manipulations seront réalisées par des personnes compétentes et expérimentées. Le bien-être des animaux fera l’objet d’un contrôle quotidien par le personnel de l'établissement utilisateur et du laboratoire. De plus, dans le cadre du protocole expérimental, à partir du début du traitement à lâge de 3 semaines, le poids corporel, la température rectale, la consommation alimentaire, l’état clinique seront évalués en aveugle au moins trois fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). Une pesée supplémentaire sera effectuée le dimanche à partir de l’âge de 6 semaines. Un score sera attribué aux signes cliniques selon la grille de points suivante: Perte de poids 20% = 3 points; Détresse respiratoire = 3 points; Diminution de la mobilité: légère = 1 point; modérée = 2 points; sévère = 3 points. Dès que les souris obtiendront un score de 3 points, elles seront sacrifiées (point limite).

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de ses gènes est très similaire à celle de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le cas présent, cela permettra de tester l'efficacité de molécules thérapeutiques sur le syndrome de Leigh à l'échelle d'un organisme par des observations concrètes sur la survie et l'évolution pondérale. Le début du traitement commencera dès le sevrage des animaux à 21 jours car les molécules testées étant dans la nourriture, il faut que les souris puissent se nourrir seules. Le traitement continuera jusqu'au moment de la décision d'euthanasier les souris, basée sur notre grille de score, car le critère principal d'efficacité du traitement pharmacologique est la survenue plus tardive des signes cliniques pathologiques.

743 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des tumeurs leur sont implantées dans le flanc ou les poumons, suivies de traitements par virus oncolytique et d'injections intrapéritonéales répétées jusqu'à 36 fois, les tumeurs pulmonaires pouvant gêner la respiration. Fortement immunodéprimées, ces souris humanisées sont plus sensibles aux infections, ce que le porteur décrit comme un phénotype dommageable. Il veut induire des structures lymphoïdes dans les tumeurs pour améliorer le pronostic des patients et affirme qu'aucune alternative, pas même les organoïdes, ne remplace le modèle animal.

Objectifs

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) représentent une cible nouvelle dont le contrôle de la formation est devenu un enjeu en immunothérapie. En effet, les TLS sont à l’origine du développement de réponses immunitaires adaptatives favorables chez les patients atteints de cancers. Il a, récemment, été montré que certaines molécules pouvaient être à l’origine de leur induction. Notre projet vise à évaluer la capacité de ces molécules, exprimées par un virus capable d’infecter la tumeur (virus dit oncolytique), à induire la formation de TLS dans les tumeurs, dans des modèles de souris présentant un système immunitaire humain afin de se rapprocher au mieux de la physiopathologie humaine.

Bénéfices attendus

Notre projet a pour objectif de manipuler les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) à visée thérapeutique afin de les induire chez des patients atteint d’un cancer présentant peu ou pas de TLS, et d’augmenter ainsi leur pronostic vital. Pour répondre à cette problématique, il nous est impossible d’avoir recours à d’autres alternatives que les modèles animaux. En plus de nous permettre d’établir une nouvelle stratégie thérapeutique des cancers, les résultats issus de ce projet nous permettront d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes fondamentaux et les molécules intervenant dans la formation de TLS. Si un effet probant est observé, le projet pourra se poursuivre vers un développement clinique.

Procédures

Des tumeurs seront implantées dans le flanc ou dans les poumons des souris par injection de cellules tumorales en sous-cutané ou intraveineuse, respectivement. L’intervention n’aura lieu qu’une fois, durera moins d’une minute et sera réalisée sur souris vigile. L’administration du traitement par voie intra-tumorale ou par voie intraveineuse sera aussi réalisée sur souris vigile, à une seule reprise, et ne durera pas plus d’une minute. L’administration du traitement par instillation intranasale se fera cette fois-ci sur souris anesthésiées et tenues à la verticale. L’opération durera environ 5 min par souris et sera répétée un jour sur deux pendant six jours. Le suivi de la croissance tumorale sous-cutanée se fera pas mesure du volume tumoral au pied à coulisse, 2 fois par semaine, sur souris vigile, et ne durera que quelques secondes. Les injections intrapéritonéales d’un inhibiteur de point contrôle immunitaire seront réalisées 3 fois par semaines en alternant de côté, sur souris vigiles et ne dureront pas plus d’une minute. Les souris seront systématiquement manipulées sous un poste de sécurité microbiologique (PSM) en raison de leur forte immunodéficience (sensibilité élevée aux infections).

Impact sur les animaux

La douleur potentielle liée aux actes d’injections des cellules tumorales et des virus oncolytiques se limitera à l'introduction de l'aiguille au site d'injection et aura lieu au maximum à 2 reprises par animal et par procédure. Il en est de même pour l’injection intrapéritonéale de l’inhibiteur de point de contrôle immunitaire qui aura lieu au maximum 36 fois par animal. La contention des animaux peut procurer un stress ponctuel (quelques minutes). La croissance des tumeurs sous-cutanées pourra générer une gêne physique et des difficultés à la mobilité. La croissance des tumeurs pulmonaires pourra occasionner une gêne respiratoire. Les tumeurs métastasées sont rarement observées. Cependant, si elles surviennent, elles pourraient entraîner de la douleur, perturber le fonctionnement des organes, causer des complications physiologiques, altérer l'alimentation et la nutrition, ainsi qu'impacter la qualité de vie des animaux concernés. Les anesthésies peuvent être associées à des risques d'hypothermie, d'hypoventilation ou encore d'arrêt cardio-respiratoires. Les souris utilisées ont un phénotype dommageable en raison de leur forte immunodépression, elles sont donc plus sujettes aux infections et peuvent être plus sensibles à certains traitements que des souris immunocompétentes.

Devenir

Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées afin de prélever les tumeurs et d’analyser l’infiltrat immunitaire du microenvironnement tumoral après chaque procédure.

Remplacement

Nos travaux portent sur l’induction de structures lymphoïdes tertiaires au sein de tumeurs. Ce mécanisme fait intervenir plusieurs paramètres dynamiques et complexes (système immunitaire, systèmes vasculaire et lymphatique) qui ne peuvent pas être modélisés ailleurs que dans des modèles in vivo, pas même dans des modèles d’organoïdes. De plus, dans ce projet nous souhaitons valider de nouveaux virus oncolytiques candidats. Il est donc primordial d’utiliser des modèles in vivo afin d’appréhender leurs interactions potentielles avec l’organisme hôte.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Différents prélèvements seront faits sur les animaux destinés à être euthanasiés, afin d’évaluer la pharmacologie des virus et des substances anti-tumorales utilisés et de réduire ainsi le nombre d’animaux nécessaire. Du fait de la variabilité de la croissance tumorale entre les animaux, particulièrement élevée dans les modèles de souris humanisées, nous utiliserons 12 souris par groupe traité et nous réduirons le nombre de souris à 10 dans le groupe non traité. Nous répéterons jusqu’à trois fois les expériences car la reproductibilité des résultats est une question centrale dans les bonnes pratiques des laboratoires. Tous les groupes expérimentaux seront réalisés simultanément pour réduire le nombre d’animaux contrôles dans le projet. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Nous utiliserons au maximum 743 animaux dans ce projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés (6 souris maximum par cage) et ne seront expérimentées qu'après une semaine minimum de stabulation. Notre structure a un programme d'enrichissement (placement de nids végétaux et de tunnels en carton dans les cages) lors d'expérimentations supérieures à 15 jours. La stabulation sera conventionnelle et conforme à la réglementation (litière normale, cages ventilées individuellement, 6 animaux maximum par cage de type-IIL, éclairage alterné jour et nuit 12h-12h de 6h-18h), et celles-ci recevront un régime alimentaire classique (nourriture libitum et eau par abreuvage automatique). Compte tenu de leur caractère immunodéficient, les souris seront maintenues dans un environnement stérile (cages individuellement ventilées, change sous hotte, aliment/litière irradiée, autoclavage, etc.). Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs et animaliers pendant la durée de chaque expérience. Les animaux seront pesés deux fois par semaine et leur état de santé sera reporté sur une grille de suivi individuel. La présence de points limite définis permettra de stopper les expériences en cas d’atteinte de ceux-ci. Les actes d’instillation intranasale seront réalisés sous anesthésie.

Choix des espèces

Les souris humanisées représentent le seul modèle d’étude préclinique d’une réponse immunitaire de cellules humaines, in vivo. De plus, les propriétés oncolytiques des virus de la vaccine sont nettement supérieurs dans les cellules cancéreuses humaines que dans les cellules cancéreuses murines. Un tel modèle permet d’apprécier à la fois les propriétés oncolytiques directes des virus oncolytiques sur des tumeurs humaines, la capacité d’un armement avec des molécules humaines à stimuler les défenses immunitaires anti-tumorales humaines et, d’appréhender la pharmacocinétique des virus face à un système immunitaire humain afin de mieux extrapoler les effets thérapeutiques du traitement à l’homme. Les souris humanisées seront reçues à l'âge de 22 semaines, puis mises en stabulation pendant une semaine minimum avant de débuter l'expérimentation. La tranche d’âge des souris a été choisi car à ce stade de développement, les souris sont sevrées, ont atteint une taille adulte. Les expériences, visant en partie à mesurer la survie des animaux en réponse à un traitement, dureront au maximum 3 mois ou jusqu’à l’apparition de signes de souffrance, dans le respect de la règle des 3R.

210 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque groupe de six est infecté par un variant du SARS-CoV-2 par voie intranasale sous anesthésie, puis mis à mort à 21 jours par ponction cardiaque terminale pour prélever le sérum, avec une perte de poids attendue les premiers jours. Le porteur veut produire des sérums de référence associés à un variant connu, impossibles à obtenir chez l'humain, et prévoit 35 variants sur cinq ans. Sur le remplacement, il affirme qu'en l'absence de sérums humains exploitables il est nécessaire de passer par le hamster, présenté comme le modèle de choix pour le COVID-19.

Objectifs

Le SARS-CoV-2 continue d'évoluer et d'échapper aux réponses des anticorps produits suite à la vaccination ou à une infection passée. Il devient de plus en plus important de comprendre les relations antigéniques entre les variants et de pouvoir tester les échappements possibles des nouveaux variants aux vaccins et aux anticorps utilisés pour le traitement des malades. Or, Il est actuellement impossible d’avoir des sérums humains pour lesquels le variant à l’origine de la production des anticorps serait connu et ce, du fait des campagnes de vaccination et surtout des vagues successives de variants qui ont touchées à plusieurs reprises la population. En conséquence, et en l’absence de solution de substitution, il est nécessaire de passer par le modèle animal qui est le hamster pour le COVID-19. Malgré le facteur limitant associé à la petite taille des animaux qui limite les volumes de sang collectés, ce projet permettra de produire des quantités de sérum suffisantes pour répondre aux besoins de la communauté scientifique. Par ailleurs, la collecte d’autres organes permettra d’obtenir du matériel nécessaire à la mise au point de nouvelles méthodes diagnostic. Ainsi, dès l’identification d’un nouveau variant d’intérêt par les pouvoirs publics (en fonction du nombre de personnes infectées), un groupe de 6 hamsters sera infecté avec ce variant par voie intra-nasale, puis les animaux seront mis à mort après 21 jours. Une prise de sang terminale sera effectuée pour collecter du sérum utilisé pour la caractérisation antigénique de chaque variant. Cela consiste à évaluer pour chaque nouveau variant la protection conférée par les anticorps produits après une infection par les anciens variants. En se basant sur la fréquence d’apparition annuelle de variant, et en prenant en compte les variants actuellement disponibles au laboratoire, on estime que 35 variants seront testés au cours des 5 années du projet.

Bénéfices attendus

La caractérisation des sérums issus de chaque infection par un nouveau variant va permettre de comprendre les relations antigéniques entre ces variants et de pouvoir tester les échappements possibles des nouveaux variants aux vaccins et aux anticorps monoclonaux.

Procédures

Les hamsters seront infectés une seule fois par voie intra-nasale (40μl - animaux anesthésiés - durée = 15 secondes environ). Durant l'anesthésie, les hamsters seront identifiés à l'aide d'une puce implantée sous la peau, entre les omoplates (5 secondes). Une prise de sang intracardiaque sous anesthésie profonde (+ traitement anti-douleur) est effectuée sur tous les hamsters (durée 3 minutes).

Impact sur les animaux

Une perte de poids, progressive et s’étalant sur une période allant jusqu'à 6 jours après l'infection, est attendue chez les hamsters infectés avec du SARS-CoV2. Hormis cette perte de poids, il n’y a pas de symptômes cliniques attendus durant la période d’infection. L’infection n’aboutit jamais à des décès non désirés. 7 jours après l'infection, les animaux commencent à reprendre du poids.

Devenir

Mise à mort pour ponction totale de sang et collecte d'organes.

Remplacement

Il est actuellement impossible d’avoir des sérums humains pour lesquels le variant à l’origine de la production des anticorps serait connu du fait des campagnes de vaccination et surtout des vagues successives de variants qui ont touchées à plusieurs reprises la population. En conséquence, et en l’absence de solution de substitution, il est nécessaire de passer par le modèle animal qui est le hamster pour le COVID-19. Les sérums produits seront issus d’une infection unique des hamsters par un variant bien identifié.

Réduction

35 variants seront testés au cours des 5 années du projet, soit un total de 210 hamsters (35 x 6). Le nombre de hamsters pour chaque variant testé a été déterminé de façon à obtenir les volumes nécessaires de sérum pour pouvoir mener à bien les techniques qui permettront la caractérisation antigénique pour chaque variant. Aucune analyse statistique n’est réalisée. Par ailleurs, une collecte d’autres organes sera effectuée sur l’ensemble de ces hamsters afin de disposer de matériel de référence qui sera utilisé dans le cadre d'un autre projet.

Raffinement

Les hamsters seront hébergés en cage de 2 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Des points limites précis et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis.

Choix des espèces

Les études scientifiques menées sur le SARS-CoV-2 ont maintenant largement démontré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une forte sensibilité au virus (atteintes respiratoires, perte de poids) ainsi qu'une forte réceptivité (multiplication du virus dans les poumons). Le hamster est donc un modèle d’infection de choix. De précédentes expérimentations ont permis de caractériser la réceptivité et la sensibilité des hamsters adultes vis-à-vis des souches SARS-CoV-2 utilisées au laboratoire. Des hamsters adultes de 6 semaines à réception seront utilisés

18 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'administration intracrânienne, un isolement de 24 heures, un examen d'imagerie sous anesthésie et quatre prélèvements sanguins, dont trois sur animal vigile sans analgésique pour ne pas fausser les dosages, afin de suivre un médicament radiomarqué injecté dans le cerveau. Le porteur indique avoir mené en amont des analyses in silico, in vitro et sur organe artificiel, mais affirme qu'elles ne reproduisent pas la distribution réelle dans un organisme vivant. L'étude ne comporte que 18 animaux, répartis en une phase pilote de deux rats et une phase principale conditionnée à ses résultats.

Objectifs

L’objectif de notre projet est d’étudier la distribution dans l’organisme entier d’un médicament pour traiter les patients souffrant de certaines pathologies neurologiques. L’objectif est de vérifier la bonne libération du médicament marqué par radioactivité après l’avoir administré directement dans le cerveau grâce à un suivi par imagerie .

Bénéfices attendus

Ce médicament testé est conçu grâce à de nouvelles technologies qui devraient permettre d’accroître sa sécurité d’utilisation (moins d’effets secondaires) et d’améliorer son efficacité dans le traitement de certaines pathologies neurologiques .

Procédures

Les 18 animaux subiront tout d’abord une procédure chirurgicale pour permettre une administration intracrânienne d'un composé (20 minutes environ). Suite à cela, ils seront placés durant 24 heures maximum (durée totale de l’étude) en cage individuelle. ils auront un examen d'imagerie durant 15 min maximum sous anesthésie générale .Un prélèvement sanguin effectué en 1 minute environ sera réalisé sur ces 18 animaux dans la veine de la queue à 3 reprises, puis un dernier prélèvement juste avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale pourra induire une souffrance des animaux. L’hébergement en cage individuelle des rats opérés, nécessaire après la procédure chirurgicale et pour le suivi par imagerie durant 24h maximum, pourrait conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes. Les 3 prélèvements sanguins s’effectueront sur animal vigile sans aucune médication, analgésique ou anti-inflammatoire pour ne pas perturber l’activité des animaux et les dosages réalisés. L’anesthésie générale est susceptible de causer une hypothermie.

Devenir

Tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort à la fin du suivi par imagerie à la fin de la procédure expérimentale (24H maximum).

Remplacement

Les alternatives non animales ne peuvent être envisagées dans le cadre de ce projet, car la détection et la mesure du médicament radiomarqué, dans le cerveau et d'autres organes d'intérêt nécessitent un suivi temporel sur un animal vivant avec toute la complexité du système biologique dans son ensemble (organes, sang, environnement et microenvironnement, …). Avant la planification de ce projet, des alternatives non animales et des méthodes de remplacement partielles ont également été utilisées. Des analyses in silico avec des simulations pharmacocinétiques ont été utilisées pour prédire la formulation et la biodistribution du médicament. Des analyses in vitro sur des échantillons de tissus isolées ont été également réalisées pour analyser la distribution du médicament et son mécanisme d’action. Pour l’imagerie, une simulation avec un organe artificiel a été utilisé en amont pour vérifier la faisabilité et la pertinence du protocole au vue des quantités très faibles du médicament administré. Ces approches de remplacement ont permis d’avoir une évaluation préliminaire précieuse. Cependant, l'utilisation d'organes artificiels, d’échantillons tissulaires et cellulaires ou de modèles informatiques ne permettent pas de reproduire fidèlement les conditions réelles de distribution dans un organisme vivant.

Réduction

Nous utilisons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation du projet qui nous permettront néanmoins d’obtenir des résultats représentatifs Pour la Phase 1 de faisabilité de notre étude, nous allons tester notre méthodologie sur 2 animaux, un rat mâle et un rat femelle. Pour déterminer le nombre de points temporels nécessaires et optimaux pour les examens, afin de suivre le passage du médicament radiomarqué de manière séquentielle : une analyse de régression est envisagée. La phase 2 ne sera réalisée que si, et seulement si la phase 1 et concluante. Pour la Phase 2 : Le nombre d’animaux a été calculé en envisageant un niveau de signification α à 0,05 et une puissance de 0,80. Pour comparer la biodistribution entre deux sites d'injection (ICV vs. IPC), un test t de Student est envisagé. Pour analyser la dosimétrie, un test de variance (ANOVA) est utilisé pour comparer la captation du médicament entre les différents organes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles avec un enrichissement (papier kraft), ils auront un accès non restreint à de la nourriture et de l’eau. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant la chirurgie qui sera réalisée dans des conditions d’asepsie strictes (analgésie pré-opératoire, anesthésie générale, maintien de la température corporelle, désinfection et anesthésie locale du site d’incision) ainsi qu’après (analgésie post-opératoire). Durant les examens, les animaux seront placés sur un lit chauffé avec une surveillance permanente de leur respiration et rythme cardiaque par un expérimentateur qualifié qui pourra intervenir si nécessaire. Les prélèvements sanguins seront effectués par du personnel ayant les compétences requises et une observation régulière des animaux sera effectuée après réalisation de chaque prélèvement. Si un animal présente des signes de souffrance ou détresse qui ne peuvent être soulagés, il sera immédiatement euthanasié dans des conditions éthiques.

Choix des espèces

Le choix du rat comme espéce utlisé est un choix technique imposé par la résolution spatiale de notre appareil d'imagerie afin de mieux visualiser la biodistribution du radiotraceur de façon objective dans le carveau et les autres organes . Les animaux seront des rats âgés de 3 mois à leur arrivée au laboratoire, les expérimentations déburteront 1 semaine après leur arrivée. Cela correspond à des rats adultes pour être dans des conditions identiques à celles souhaitées chez l’Homme .

2 400 animaux non-humains vont être utilisés, 960 souris et 1 440 rats, en majorité tués et pour partie réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nouveau-nés sont placés en atmosphère enrichie en oxygène pour provoquer une atteinte des vaisseaux de la rétine, puis reçoivent des gouttes ou des injections répétées, avec anesthésies et examens d'imagerie jusqu'à leur mise à mort. Le porteur teste des traitements contre les rétinopathies vasculaires et indique réutiliser les mères gestantes dans d'autres procédures après avis vétérinaire. Sur le remplacement, il affirme avoir besoin d'un œil perfusé en développement, que seul l'animal vivant fournirait.

Objectifs

Les pathologies de la rétine ou rétinopathies sont liées en grande partie à des anomalies de la vascularisation rétinienne. Parmi elles, on retrouve la rétinopathie du prématuré. Cette maladie liée à un mauvais développement du système vasculaire qui touche 30% des prématurés de moins de 31 semaines est la principale cause de cécité infantile dans le monde avec 30000 cas de malvoyance. Le but de ce projet est de mettre en place de nouvelles approches thérapeutiques et de trouver de nouveaux traitements en utilisant un modèle qui va mimer cette atteinte vasculaire chez le rongeur après une exposition à une atmosphère enrichie en oxygène. Plus généralement, lorsque le flux sanguin est altéré et que les vaisseaux perdent leur intégrité fonctionnelle, un mécanisme compensateur de réparation se met en place, avec la formation de nouveaux capillaires à partir des vaisseaux préexistants. Ce phénomène est appelé néovascularisation. Ces nouveaux capillaires sont souvent perméables et se développent de façon anarchique. Ils ne peuvent alors plus assurer correctement le transport du sang et aggravent de ce fait les dommages causés à la rétine. C’est le cas de nombreuses maladies comme la forme humide de dégénérescence maculaire liée à l’âge, première cause de handicap visuel chez les personnes de plus de 50 ans et la rétinopathie diabétique, première cause de cécité acquise dans les pays occidentaux chez l’adulte entre l’âge de 25 et 74 ans. Ce projet s’inscrit donc avec ce modèle de rétinopathie, développé dans les années 1950, dans un cadre plus large que la seule rétinopathie du prématuré. Il est largement utilisé depuis pour l’étude de l’angiogenèse et de la néovascularisation pathologique au niveau de la rétine. Il permet de ce fait de tester l’efficacité de thérapies luttant contre la grande famille des rétinopathies vasculaires. Sur la durée du projet, 10 études par espèce sont prévues en plus des études de formation du personnel aux bons gestes techniques, avec à chaque fois au moins un nouveau traitement ou une nouvelle formulation à tester. Chaque étude nécessite un nombre d’animaux minimum afin de pouvoir comparer les différentes conditions expérimentales et évaluer de l’efficacité du traitement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont l’identification et la sélection de nouveaux traitements pouvant améliorer la prise en charge de la rétinopathie du prématuré bien sûr mais aussi toutes les maladies incluant une composante vasculaire telles que dégénérescence maculaire liée à l’âge ou rétinopathie diabétique par exemple.

Procédures

Dès la naissance (rats) ou 7 jours après (souris), les animaux seront placés dans des chambres permettant le contrôle du taux d’oxygène durant une durée définie (14 jours pour les rats, 5 jours pour les souris). La durée des traitements variera en fonction de la formulation et du mode d’administration. Les administrations de gouttes se font généralement quotidiennement à raison de 2 à 3 administrations par jour, tout au long de la durée de l’étude c’est à dire jusqu’à la mise à mort de l’animal soit classiquement 17 ou 20 jours après le début de l’étude suivant l’espèce. Pour les administrations systémiques, le schéma d’administration est proche de celui de l’administration de gouttes. Généralement, le nombre d’administrations quotidiennes est un peu plus faible avec 1 ou 2 injections par jour tout au long de la durée de l’étude c’est à dire jusqu’à la mise à mort de l’animal soit classiquement 17 ou 20 jours après le début de l’étude suivant l’espèce. Pour les autres voies d’administration qui nécessitent une anesthésie de l’animal, les traitements ne sont plus quotidiens mais hebdomadaires avec seulement 1 à 2 injections par semaine pendant les 17 ou 20 jours de l’étude. La manipulation des animaux durant ces administrations ne durera que quelques secondes. Les examens (observation à la lampe à fente, angiographie, tomographie…) seront généralement hebdomadaires et de dureront pas plus de 5 minutes. Des anesthésies seront pratiquées autant que nécessaire afin de permettre si besoin l’administration ou l’examen des animaux. Tous les examens réalisés ces procédures sont des examens pratiqués chez l’homme en ambulatoire, en cabinet d’ophtalmologie ou chez l'animal en clinique vétérinaire. Chez l’homme, toutes les procédures qui ont nécessité une anesthésie générale, se font la plupart du temps sous anesthésie locale. Les autres examens (lampe à fente…) sont totalement indolores ou sous anesthésie locale et ne durent que cinq minutes tout au plus. Chez l’animal, l’anesthésie générale est réalisée afin d’immobiliser l’animal, de faciliter la procédure et de réduire un stress éventuel.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont pour l'essentiel liés aux conditions expérimentales d’hébergement, à leur manipulation et à l’administration des produits. La pathologie recherchée - néovascularisation et perméabilité vasculaire rétinienne - n'induit pas de douleur chez l'animal. La croissance des nouveau-nés et des mères exposés à l'hyperoxie (ou alternance de cycles hypoxie/normoxie) n’est que faiblement impactée. Les travaux publiés ne montrent pas d'effet de la modification du taux d'oxygène sur le comportement des animaux. La manipulation des nourrissons peut introduire du stress chez les petits comme chez la mère. Les risques sont qu'un animal soit rejeté de la portée par la mère, ne soit plus alimenté ou mangé par la mère. Pour ne pas induire de stress chez les mères déclenchant ces comportements, les manipulations des animaux seront donc limitées au maximum et seront réalisées par un personnel formé. Les risques liés aux administrations de produits sont l’apparition de signes d'inflammations, de nécroses, de saignements au site d'injection. Les animaux présentant les symptômes, ou exclus volontairement par la mère avec un risque pour leur survie, et si une adoption par une autre femelle n’est pas possible, ils seront sortis de l’étude.

Devenir

A l'issue de chaque étude, les animaux qui auront participé à l’ensemble de la procédure expérimentale seront mis à mort afin de permettre l'analyse des tissus. Pour les études concernant l'évaluation de l’efficacité de traitement, les animaux n’ayant pas suivi la totalité de la procédure, à savoir les mères gestantes pourront être réutilisées dans d’autres procédures expérimentales compatibles après l’avis du vétérinaire si nécessaire.

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents (très vascularisés ou très innervés pour certains, totalement avasculaires ou faiblement innervés pour d’autres). Il est soumis à d'importantes variations environnementales (température et humidité ambiantes), mécaniques (mouvements des globes, des paupières) et physicochimiques (osmolarité...), ainsi qu'à de nombreuses interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. Dans le cadre de notre projet, nous avons besoin d’un œil perfusé en cours de développement. C'est pour cela que nous utiliserons des animaux vivants dans nos procédures expérimentales.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement et du nombre de naissances par portée. Il tient aussi compte du nombre d'études estimées, des variations du métabolisme et de la robustesse des mesures. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Les animaux, une femelle par cage avec ses nourrissons, sont maintenus dans un environnement enrichi, (bouts de bois, coton pour le nid sur toute la période de l’étude) avec un accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Le change des cages s’effectue par un personnel sensibilisé à la manipulation des portées tout comme le suivi sanitaire quotidien pour minimiser au maximum le stress de la mère afin qu'elle subvienne aux besoins de ses nourrissons. Les examens qui nécessitent un immobilisme complet de l'animal pour la prise de photo, sont réalisés sous anesthésie pour le confort de l’animal. Il en ira de même pour les procédures plus invasives afin de supprimer la douleur provoquée pendant et après l’intervention. L'ensemble des examens envisagés n'engendre pas de douleur pour l'animal, ils sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

Le modèle est connu et utilisé dans de nombreuses publications scientifiques, depuis les années cinquantes pour étudier le développement de la vascularisation de la rétine et ses pathologies. Les espèces choisies sont le rat et la souris. Ce sont les espèces références pour ce modèle. Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. Le principe du modèle est d'agir sur le développement vasculaire de la rétine de nouveau-nés. Les animaux seront donc inclus dans l'étude quelques jours après leur naissance, avec leur mère pour subvenir à leurs besoins.