Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Interaction cœur-poumon et effet du préconditionnement ischémique dans la greffe pulmonaire chez le porc
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
30 porcs de 50 à 70 kg vont être opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Après ouverture du thorax, les artères pulmonaires droite et gauche sont cerclées puis alternativement bloquées et rouvertes pendant six heures pour la plupart des animaux, ce qui provoque des désaturations et des fibrillations cardiaques que le porteur annonce comme attendues. L'objectif déclaré porte sur la prévention de la dysfonction du greffon après une transplantation pulmonaire chez l'humain, les organes prélevés servant aux analyses, la tête et les viscères à des formations en chirurgie viscérale et ORL. Après des travaux sur des greffons humains rejetés et des modèles d'ischémie in vitro, le porteur affirme qu'il était "incontournable" de passer sur un modèle proche de l'humain.
Objectifs
Notre étude a pour but de montrer: L'effet du préconditionnement ischémique : Étudier si de brefs cycles d'arrêt de circulation/reprise de circulation du sang dans l'artère pulmonaire avant le prélèvement des poumons peuvent limiter les dommages tissulaires et inflammatoires L'interaction cœur-poumon : Évaluer les conséquences d'un arrêt de circulation sanguine pulmonaire sur la fonction et l'intégrité tissulaire du coeur, notamment en raison de l'augmentation brutale de la post-charge induite par le clampage de l'artère pulmonaire.
Bénéfices attendus
L'objectif final est d'améliorer la prévention de la dysfonction primaire du greffon pour réduire la mortalité postopératoire chez l'humain. Cette étude vise ainsi à valider de nouvelles stratégies thérapeutiques protectrices pour le cœur et les poumons.
Procédures
Tous les animaux vont subir une induction par injection intramusculaire. Suivant les différents groupes les animaux vont subir: une anesthésie générale et une chirurgie avec thoracotomie avec cerclage des artères pulmonaires droite et gauche. La durée de cette intervention sera d'environ 1h. Pour les groupe HNF, sans HNF 6 h d'ischémie reperfusion droite et gauche en alternance. Pour le groupe préconditinnement 30 min d'ischémie reperfusion droite et gauche en alternance. Puis pour tous les animaux une mise à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux vont subir une perte de conscience lors de l’induction ils seront désorientés. Durant l’intervention ils vont être sujet a désaturation du fait des clampages successifs et des fibrillations cardiaques ventriculaires ou auriculaires.
Devenir
Tous les animaux seront mise à mort à la fin de la procédure pour un prélèvement des tissus et organes à analyser.
Remplacement
Après de nombreuses analyses sur des prélèvements humains de greffes rejetées, des analyses poussées sur de potentielles causes et des modèles in-vitro d’ischémies il était incontournable de passer sur un modèle animal proche de l’homme avec des réactions hémodynamiques très proche voir similaires.
Réduction
Pour répondre au principe de réduction nous avons liés 2 études complémentaires qui ont pour but d’améliorer la qualité du greffon en le conditionnant tel un entrainement et la survie du receveur en limitant les atteintes cardiaques du ventricule droit par des moyens pharmacologiques. De ce fait nous pouvons multiplier les organes à analyser sans augmenter le nombre d’animaux utilisés de plus les témoins permettant d’évaluer les niveaux de base des métabolites sont commun aux deux études. Nous avons ensuite utilisé les premiers résultats obtenus chez le rat pour modéliser et donc apprécier statistiquement le modèle et le calquer sur le porc qui est un modèle beaucoup plus proche de l’homme.
Raffinement
L’ensemble de l’étude sera sans réveil. Elle sera effectuée sous anesthésie générale avec une analgésie très poussée et des temps opératoires réduits à l’extrême. Les procédures chirurgicales complexes sont effectuées par des chirurgiens humain spécialiste de la greffe pulmonaire et formés à l'expérimentation animale. L’anesthésie l’analgésie et le monitoring sera suivit par des vétérinaires car ce projet est en partenariat avec une école vétérinaire. Un médecin anesthésiste réanimateur habilité a l'expérimentation animale sera aussi présent pour assurer les gestes de réanimation nécessaire durant la procédure. Après prélèvement des organes à analyser, les viscères et la tête seront récupérées pour être utiliser dans des formations en chirurgie viscérale et ORL. La carcasse sera donnée au laboratoire d’anatomie de l’école vétérinaire.
Choix des espèces
On peut considérer le modèle porcin comme un modèle de haute-fidélité pour les chirurgiens thoraciques. L'anatomie cardio-pulmonaire est extrêmement proche ainsi que l'abord chirurgical. Il permet de recréer les tempêtes hémodynamiques et inflammatoires de la greffe dans un environnement contrôlé, afin de tester des manœuvres de "pilotage" (comme le préconditionnement ou le prélèvement) avant de les appliquer en conditions réelles sur des patients. Les porcs seront des jeunes de 50 à 70 kg pour pouvoir supporter plus facilement la chirurgie tout en conservant une anatomie proche de l’homme et être facilement manipulable.
Evaluation de différentes formes galéniques implantables au niveau la zone portale chez le porc miniature comme thérapeutique du diabète de type 2 – MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Aucun ne sera réveillé de la dernière anesthésie, le porteur estimant ce réveil "potentiellement douloureux" et impossible à soulager. 20 porcs miniatures adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un implant destiné à libérer une molécule contre le diabète de type 2 leur est posé par cœlioscopie près de la veine porte, avec un suivi d'un à six mois, des anesthésies répétées, des prises de sang, un scanner, puis une tomographie par émission de positons sous une anesthésie terminale de deux heures. Le porteur liste comme effets possibles une brèche vasculaire, une compression de la veine porte et une péritonite, et écrit qu'un calcul de puissance statistique "n'est pas pertinent" pour ce type d'expérience.
Objectifs
Le diabète de type 2 est une maladie endémique qui touche plus de 25 millions de personnes dans le monde. De nouveaux traitements existent mais leur efficacité est entachée par de nombreux effets indésirables. Une solution vise à rétablir la sensibilité des récepteurs au Glucagon-like-peptide 1 (GLP-1 r) situés dans un très court segment de la veine porte. Cela peut être produit par la libération locale et prolongée d’un composé capable de restaurer la densité des récepteurs GLP-1. Ce dernier est libéré par un implant idéalement biodégradable sur plusieurs mois. Le projet vise à évaluer la conversion d’un dispositif antérieur reposant sur un implant non biodégradable cylindrique en dispositif utilisable chez le patient humain et répondant aux bonnes pratiques de fabrication en accord avec les autorités de régulation des dispositifs biomédicaux implantables (GMP - good manufacturing practices). Le but de l’expérience est d’évaluer plusieurs dispositifs implantables biodégradables susceptibles de libérer in situ, sur plusieurs mois, une dose idoine de la molécule capable de réguler la densité des récepteurs GLP1. Cette évaluation comprend également une mesure directe et indirecte de la libération de la molécule active afin de calibrer différents tests in vitro de validation des implants dans le cadre de l’utilisation clinique chez l’homme de l’implant une fois celui-ci sélectionné.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme sont ceux associé à la possibilité de lancer la phase humaine du programme. Les bénéfices à long terme sont directement associés à la mise en place d'une thérapeutique alternative au traitement du diabète de type 2. Dans tous les cas, nous visons la production d’un dispositif médical susceptible d’être produit en condition GMP et dont la mise en place soit faiblement risqué pour le patient tout en allongeant de façon significative la durée de libération de la molécule active. L’idéal étant de disposer d’un dispositif médical qui puisse fonctionner plusieurs années i.e. qui libère la molécule active durant cette période. Cela nécessite de façon connexe de disposer d’un modèle de libération in vitro. L’expérience proposée vise entre autres à caliber in vivo ce modèle in vitro
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure comprenant diverses étapes durant la durée du projet. Au cours de la première expérience, trois types de dispositifs libérant une molécule active seront placés par voie chirurgicale coelioscopique (durée max de la chirurgie proprement dite - 15 minutes) chez trois groupes d’animaux. Chacun de ces groupes sera suivi durant 1 mois avec une anesthésie au cours de la semaine 2 et 4 post implantation. Au cours de cette anesthésie, un scanner et une prise de sang (2,5 mL) seront réalisés (durée max 30 minutes). La dernière anesthésie est terminale et permettra avant l’administration de l’agent déclenchant l’euthanasie une tomographie d’émission positronique destinée à la mesure de la densité des récepteurs GLP-1 (durée anesthésie 2 heures). Au cours de la seconde expérience, un implant choisi à la suite des résultats de la première expérience sera également implanté par voie chirurgicale coelioscopique sur un groupe unique d’animaux. les animaux seront suivi durant 6 mois avec 4 prises de sang sous anesthésie légère toutes les deux semaines puis tous les mois. Comme pour les animaux de l’expérience précédente, une dernière anesthésie terminale permettra avant l’administration de l’agent déclenchant l’euthanasie une tomographie d’émission positronique destinée à la mesure de la densité des récepteurs GLP-1. Dans tous les cas, les animaux seront logés en hébergement individuel et cela pour la totalité de la durée des procédures. Cela est rendu nécessaire par l’utilisation d’un système robotisé de distribution de l’alimentation.
Impact sur les animaux
Le projet sera réalisé en s’assurant qu’aucune angoisse, douleur ou souffrance inutile ne soit ressentie lors de toute intervention sur les animaux. Les effets liés au risque septique bien que parfaitement maitrisés sont pris en compte dans la surveillance durant semaine post-chirurgicale (recherche d’un arrêt de l’ingestion, prostration, toux, vocalisation au couché, diminution de la diurèse, température rectale accrue). En dehors de ces effets, et dans le cas de la première expérience, les effets indésirables potentiels sont ceux directement liés à la présence physique de l’implant et correspondent soit une brèche vasculaire soit une compression portale. Ils peuvent survenir durant la totalité de la période expérimentale mais ne peuvent être objectivés que par l’imagerie abdominale (US 2D et Doppler respectivement). Ils seront suspectés par les signes cliniques classiques d’une péritonite (arrêt brutal de l’ingestion, prostration, douleur à la palpation abdominale). Outre ces signes, des effets plus complexes à mettre en évidence sont possibles mais ont un tableau clinique protéiforme. Ces effets peuvent également survenir durant la totalité du protocole expérimental. C’est pourquoi, en cas de baisse significative de l’ingestion qui reste le seul élément quantitatif précoce dont nous disposons, nous compléterons l’examen clinique par une mesure de l’ECG et de la pression artérielle. En fonction de l’impact sur le bien être de l’animal, une euthanasie préventive sera réalisée. Dans le cas de la seconde expérience, les effets néfastes directs liés à l’implant sont identifiés et résolus. Les nuisances relèvent de l’élevage en condition expérimentale (plaies de contact, fractures au moment des pesées hebdomadaires en dépit d’une conception idoine des structures d’animalerie) sur des animaux obèses. Celles-ci peuvent survenir tout au long de la durée expérimentale. Aucun autre effet indésirable n'est attendu en consequence de leur obésité. Pour les deux procédures, l'hébergement individuel induit des nuisances bien identifiées par la littérature. Cependant, les mesures prises au cours des experiences précédantes sur des animaux de statut identique montre qu'ils ne sont jamais agressifs ou atteint de stéréotypie. Les mesures prises visent donc essentiellement à prévenir l'anhedonie qui est également observée (chez l'homme) durant le T2D. Ces mesures sont essentiellement associée à des interactions fortes entre le soigneur et l'animal.
Devenir
Un réveil à la suite d'une longue anesthésie est potentiellement douloureux et/ou induit un mal-être sans qu'il ne soit réellement possible de contrer ces effets par un susbtitut pharmacologique. Face à ce risque, nous estimons qu'il est préférable de réaliser une euthanasie à l'issu de l'expérimentation
Remplacement
Ce projet réalisera de nouvelles recherches pour lesquelles l'information n'est pas déjà disponible dans la littérature. Bien que le remplacement par des alternatives non animales soit un atout inestimable pour la recherche, celles-ci ne peuvent pas reproduire la physiologie intégrative complexe présente chez un animal modèle, qui s’apparente étroitement à l'homme. En raison du haut niveau de complexité des systèmes étudiés, de leur intégration complexe et des conséquences multiples de leurs dérèglements, il existe trop d'inconnues pour créer des modèles fiables générés par ordinateur. Cette expérience vise d’une part à valider un modèle in vitro de libération de la substance active. Ce modèle n’existe actuellement pas du fait des particularités vasculaires de la zone d’implantation. Les questions suivantes nécessitent encore un modèle animal. Comment se comporte la libération de la molécule candidate au cours du temps et plus particulièrement une fois que l’implant est inséré dans une structure jouxtant une des plus grosses veines de l’organisme ? Encore une fois, nous avons réalisé un modèle pharmacocinétique sur la base de nos expériences antérieures et nos partenaires développent un modèle in vitro de libération à l’horizon d’un an post implantation. Néanmoins, il est impératif d’avoir des données in vivo de façon à calibrer ce modèle in vitro. Par ailleurs, l’utilisation d’un modèle animal pour le volet chirurgical reste indispensable notamment pour répondre aux questions suivantes: Quelle est la meilleure matrice biodégradable et la forme optimale de l’implant pour permettre une implantation aisée en cœlioscopie. La matrice biodégradable de l’implant peut-elle supporter la procédure d’implantation et l’outil d’implantation est-il suffisant pour réduire les contraintes physiques sur l’implant de façon à ce que ce dernier reste intact ? Ces deux questions font l’objet de modélisations physiques à l’aide de l’outil Comsol. Il reste à valider les données de stress mécanique tant sur l’implant que sur les tissus biologiques qui vont accueillir l’implant - une phase qui ne peut être réalisée que sur un modèle chirurgical.
Réduction
Ce projet a été conçu pour utiliser un nombre minimum d'animaux, tout en garantissant l'obtention de résultats scientifiquement pertinents et l'atteinte des objectifs de l'étude. Néanmoins les questions posées, le caractère exploratoire des différents modèles d’implants et le risque de survenue d’événements néfastes sont tous difficilement modélisables et par voie de conséquence un calcul de puissance statistique classique n’est pas pertinent pour le type d’expérience projeté. L'objectif de réduction se basera donc sur l'expérience acquise au cours des projets antérieurs de même nature (implantation coelioscopique d'implants non biodégradable). Par ailleurs, il est tout à fait possible que rapidement les premiers essais conduisent à identifier une incompatibilité immédiate entre la nature de l'implant et la zone à traiter. Dans ce cas, le nombre d'animaux prévu pour ce sous groupe sera immédiatement réduit.
Raffinement
Des points limites sont fixés au préalable, et un suivi des animaux est effectué de facon très régulière. Les procédures chirurgicales et d’imagerie ont été conçues et validées par un vétérinaire en incluant une valence analgésique forte. Les méthodes d’imagerie sont les plus sophistiquées possible à ce jour indépendamment de l’espèce utilisée. La méthode chirurgicale est reconnue comme celle produisant les suites post-opératoires néfastes les plus limités possibles. Les possibilités d'affiner la procédure seront continuellement explorées et mises en oeuvre dans la mesure du possible pendant la durée de vie du projet. Des revues de littérature régulières seront effectuées pendant toute la durée du projet pour s'assurer que les procédures utilisées sont aussi raffinées que possible et restent conformes aux recommandations de bonnes pratiques.
Choix des espèces
Le porc s’impose comme un modèle privilégié pour les études en nutrition et neurosciences. En contexte nutritionnel délétère, le miniporc adulte développe une obésité similaire à la pathologie humaine. De plus, le capteur GLP-1r au niveau portal est altéré par l'obèsité. Le choix du modèle porcin se justifie également par rapport à l’utilisation d’une procédure d’implantation cœlioscopique qui sera celle utilisée chez l’homme et qui ne peut être effectuée techniquement sur un animal de plus petite taille. Pour les mêmes raisons de taille, la résolution spatiale obtenue par l’utilisation du modèle porcin, du fait des limitations techniques fait qu’un modèle de grande taille est recherché. Les animaux seront des adultes bien après que leur croissance ait atteint un plateau i.e. > 3 ans. Ceci se justifie par le fait que la condition visée par notre solution thérapeutique est celle du diabète de type 2 chez l'adulte et que ce dernier se développe préférentiellemetn après 45 ans
Etudes de toxicologie, tolérance locale, pharmacocinétique et pharmacologie chez le macaque cynomolgus
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Cent-dix études réglementaires en trois ans, exigées avant tout essai clinique ou toute mise sur le marché : 2 000 macaques à longue queue vont être utilisés, 1 568 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 432 en gravité légère. Ils reçoivent des produits par voie orale ou par injection, parfois placés jusqu'à deux heures sur une chaise de contention, isolés en cage individuelle jusqu'à 72 heures pour la collecte d'urine, équipés d'un gilet portant une pompe, d'électrodes, de cathéters permanents ou d'implants de télémétrie posés sous anesthésie. La plupart sont tués pour l'examen des organes exigé par la réglementation, 150 sont réutilisés dans d'autres études, six retournent en élevage et trois sont placés. Le porteur rappelle que la réglementation réserve les primates aux pathologies humaines invalidantes ou mortelles et aux cas sans autre espèce possible, tout en couvrant par ce seul projet médicaments et dispositifs médicaux de commanditaires variés.
Objectifs
L’objectif de ce projet est la réalisation des études réglementaires de toxicologie générale ou de pharmacologie de sécurité ou de tolérance locale ou des études préliminaires (recherche de doses, dose maximale tolérée, étude de pharmacocinétique, pharmacologie et pharmacodynamie) ou des études d’immunogénicité chez le primate non humain. Ces études consistent en l’administration unique ou répétée du produit à tester (médicament ou dispositif médical) suivie par des observations régulières des animaux, pesées corporelles, suivi de la consommation alimentaire, examen ophtalmologique, évaluation des effets sur la tolérance locale (si applicable), évaluation des effets sur les paramètres sanguins ou urinaires, évaluation des effets neurocomportementaux ou sur les fonctions respiratoires, cardiovasculaires et immunologiques, analyse macroscopique et/ou histopathologique, évaluation de la pharmacocinétique et pharmacodynamie du produit. Ces études permettront d’accéder aux essais cliniques afin de confirmer la sécurité et l’efficacité du produit chez l’Homme avant sa mise sur le marché ou d’obtenir l’autorisation de mise sur le marché (dispositif médical). Le nombre d’études pouvant être réalisées au total sur ce projet est de 110 sur 3 ans.
Bénéfices attendus
Les études de toxicologie générale ou de pharmacologie de sécurité ou de tolérance locale sont réglementairement requises par les lignes directrices Européennes et Internationales et représentent une étape essentielle avant de réaliser des essais cliniques sur un médicament humain (sur des volontaires sains à court terme et sur les patients à moyen et long terme), ou pour l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché pour les dispositifs médicaux. Elles visent à définir le profil de toxicité ou de tolérabilité des produits à tester et donc rendre les essais cliniques plus sûrs pour les patients ou volontaires participant à l'essai. Elles permettent aussi de définir la dose qui sera testée (avec une marge de sécurité) pour la première administration à l’Homme. Ce projet permettra donc d’avancer dans le développement des solutions thérapeutiques, prophylactiques (préventives) ou diagnostiques innovantes pour le traitement de certaines maladies chez l’Homme.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins, sur animal vigile, en accord avec les recommandations du comité d’éthique et de la structure du bien-être animal. Des récoltes d’urines et de fécès pourront être réalisées en plaçant les animaux dans des cages spécifiques. Les animaux recevront les produits à tester par différentes voies, orale ou injections, avec si nécessaire mise sur siège à contention pour des administrations intraveineuses lentes ou des voies orales sur animaux matures. Les animaux pourront être équipés d’un gilet contenant une pompe ou avec des capteurs pour enregistrer les paramètres ECG. Les animaux pourront être anesthésiés pour tout acte nécessitant une immobilisation de l’animal pour une durée limitée à quelques minutes, comme les examens ophtalmologiques ou les examens physiques détaillés. Pour des examens plus longs ou pour des prélèvements (tels que la moelle ossseuse, liquide céphalorachidien ou biopsies diverses) ou pour des chirurgies telles que les implantations de cathéter ou d’implant de télémétrie, l’anesthésie sera plus longue et plus profonde avec un protocole adapté. Le nombre d’anesthésies et de prélèvements sera réduit au maximum de ce qui est nécessaire pour diminuer au maximum l’inconfort des animaux. Les animaux pourront être isolés pendant 24h en post-opératoire des chirurgies de cathétérisme intrathécal pour éviter que les congénères touchent la plaie et qu'on ait des infections. - La fréquence de ces administrations varie en fonction du produit (par exemple 1 fois par jour, 1 fois par semaine) - La durée des administrations est généralement rapide quelques secondes à quelques minutes pour les voies orale et administrations, sous-cutanée, intraveineuse ou intramusculaire. Les administrations par perfusion continue peuvent durer de plusieurs heures par jour ou être en continu. - Des prélèvements seront réalisés pour évaluer les effets sur les paramètres sanguins et urinaires ; généralement 2 à 4 fois par étude. L'évaluation de la pharmacocinétique/pharmacodynamique et mesure des biomarqueurs dans le sang sont réalisés plusieurs fois par étude (généralement 2 à 6 occasions). - Le nombre et la durée des interventions sont adaptés en fonction de l'utilisation clinique, de la durée d'étude, de la cinétique d'exposition, des effets attendus et sont définis dans le plan d'étude.
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les animaux peuvent être les suivantes : - Stress, inconfort ou douleur brève, n’excédant pas quelques minutes, lors des procédures d’administration et de prélèvement de sang. Dans le cas d’administration intraveineuse lente la procédure d’administration peut être plus longue (maximum 2h) avec placement de l’animal en chaise à contention. Pour des prélèvements sanguins, l’animal peut être isolé (maximum 1h) dans un compartiment individuel. - Hébergement dans une cage individuelle pour collecte d’urines pendant 72h maximum - Anesthésie de quelques minutes et réveil d’anesthésie avec éventuellement désorientation/perte d’équilibre ou hypothermie lors des examens physiques détaillés ou des examens ophtalmologiques ou tout autre acte nécessitant une sédation légère. - Anesthésie et douleur légère à modérée en post-opératoire (quelques jours) pour la pose des cathéters ou d’implants de capteurs collectant des données physiologiques. - Stress, inconfort lié au port d’un gilet avec une pompe pour les animaux implantés avec un cathéter en permanence depuis la chirurgie jusqu’à la fin de période de traitement. - Stress, inconfort lors de la mise en place d’électrodes ou d’un brassard avec mise en siège à contention pour une évaluation des fonctions vitales telles que ECG ou pression artérielle, pour une durée maximale telle que décrite pour les administrations. - Pour des cas exceptionnels, stress, inconfort lié à la mise à jeun avec isolement dans un compartiment individuel pour une durée maximum de 16h pour recueil d’urines/feces. - Modification ponctuelle et de courte durée du cycle nycthémèral lorsque des actes d’études (prise de sang pour de la bioanalyse, par exemple) devant se faire pendant la période nocturne. - Effets toxicologiques ou pharmacologiques ou effets locaux (sites d’administration) légers à modérés dus à l’administration des médicaments à tester (perte de poids, léthargie, excitation, baisse de la consommation de nourriture, tremblements, irritation ou inflammation locale au site d’administration…).
Devenir
En accord avec le plan d’étude utilisé les animaux pourrons être 1) euthanasiés en fin d’expérimentation en vue d’examens et de prélèvements d’organes ou tissus (examens macroscopiques et/ou microscopiques) tels que requis par la réglementation pour la détermination des organes cibles ; 2) gardés en vie et retourner en zone d’hébergement hors étude suite à l’avis du vétérinaire avec l’évaluation de la gravité réelle des procédures subies ; 3) replacés en accord avec la structure en charge du bien-être animal et les vétérinaires ; 4) hébergés en attente d’inclusion en étude, conditionnée par un examen vétérinaire favorable.
Remplacement
Actuellement, il n’existe pas encore d’alternatives à l’utilisation d’animaux pour évaluer la toxicité de substances dans leur globalité sur un corps entier avec une connectitivé de tous les organes et tissus. Pour le moment, les approches alternatives (NAMs) ne permettent pas elles seules de déterminer la toxicité de substances suite à une expoxition systémique. Dans ces études, un relevé des signes cliniques et des paramètres sanguins des animaux est requis, ainsi qu’une évaluation macroscopique et microscopique des organes nécessitant d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, pour évaluer l’ensemble des paramètres demandés par les lignes directrices.
Réduction
Le nombre d’animaux pour les études réglementaires est défini dans les lignes directrices internationales applicables (notamment ICH) et adapté en fonction du nombre de doses testées, du nombre de produits testés et de la présence ou non d’une période de réversibilité. Pour les études préliminaires, le nombre d’animaux par lot est établi au plus juste afin d’obtenir des résultats exploitables et en tenant compte des objectifs de l’étude, du nombre de doses testées et du nombre de produits ; il est précisé dans le plan d’étude. Le plan d’étude est évalué par le comité d’éthique avant le démarrage de l’étude. Dans la mesure du possible, notamment pour les études préliminaires, il n’est pas nécessaire d’avoir un lot contrôle puisque l’on dispose de données prétest ou de données historiques relevantes pour les interprétations. Le développement d’études avec un Virtual Control Groupe (basé sur une banque de données des paramètres principaux de toxicologie obtenue à partir d’études avec le même design et sur le même modèle animal) permettra de limiter également l’utilisation d’animaux contrôles, y compris dans les études réglementaires. Dans les études de télémétrie, le design est en carré latin, l'animal est son propre contrôle et recoit chaque dose produit à tester tour à tour. Ce type de design permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Dès que cela est possible, les paramètres de pharmacologie de sécurité sont évalués dans les études de toxicologie ce qui évite la réalisation d'études de pharmacologie de sécurité standalone et réduit le nombre d’animaux utilisés. Lors que cela est possible, les animaux contrôles réverses peuvent retourner en stock au sein de l’établissement utilisateur, après accord vétérinaire. Lorsqu’aucun effet du genre de l’animal n’est attendu, un seul sexe pourra être utilisé dans l’étude.
Raffinement
Pour améliorer leur bien-être, les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans la mesure du possible et auront au moins 15 jours d’acclimatation dans la salle d’étude avant la première administration. Pour limiter le stress des animaux, des séances d'habituation au transfert en compartiment de procédure seront réalisées avec la distribution de récompenses. Les animaux bénéficient également de divers enrichissements tels que des jouets (en rotation sur la semaine), des bâtonnets de bois à ronger, des graines de tournesol/raisins secs, des tunnels en carton et de fruits et légumes en plus de l’alimentation classique. L’hébergement en volière sera privilégié (au moins pour les primates juvéniles) car il comporte des tubes en PVC, des perchoirs, des barrières visuelles et des balançoires. La musique sera présente dans l’ensemble des hébergements. Des récompenses alimentaires seront distribuées après les actes contraignants. Les animaux seront progressivement habitués aux administrations orales, au placement sur siège lors d'administration IV longue, ... Les techniques engendrant le moins de stress ou d’inconfort sur une durée la plus courte possible pour l’animal seront privilégiées. Les actes pouvant engendrer du stress ou de l’inconfort seront réduits au minimum nécessaire (nombre et durée) et seront réalisés sous anesthésie avec un protocole analgésique adapté le cas échéant. Les animaux sont observés au moins 1 fois par jour (incluant le week-end) afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile. En cas de signes cliniques ayant des répercussions sur le bien-être animal, des mesures rapides et appropriées seront prises par le vétérinaire (mise en place d’un traitement médical, interruption des administrations, réduction de la dose testée par exemple). Pour les études préliminaires de recherche de doses, le choix de la dose ultérieure est raffiné et adapté en fonction des effets cliniques observés à la dose précédente, sous supervision éthique. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec un protocole d’analgésie adapté (cf section anesthésie/analgésie de chaque procédure). Pour les candidats médicaments biologiques, un prétraitement pourra être réalisé avec des anti-histaminiques ou corticoïdes pour limiter le risque de réaction immunogène.
Choix des espèces
L’utilisation du primate non humain se justifie d’un point de vue réglementaire car c’est une des espèces non-rongeurs acceptée pour la réalisation d’études précliniques. Le choix du primate non humain est basé sur la réglementation qui réserve l’utilisation de primates non humains aux études précliniques sur des candidats médicaments destinés à traiter des pathologies humaines invalidantes ou mortelles et sous réserve qu’il existe des éléments scientifiques indiquant que la finalité de la procédure ne peut pas être atteinte en utilisant d’autres espèces. Ces données scientifiques peuvent être des données pharmacocinétiques, de métabolisme et de pharmacodynamie et/ou des analogies entre l'Homme et l'animal. L’âge des animaux sera déterminé en fonction du type d’étude et de la population ou des animaux cibles du produit, cela peut varier de l’âge juvénile jusqu’à l’âge adulte, correspondant à la maturité sexuelle. Ce choix est fait en prenant en considération l’ensemble des études réglementaires précliniques qui pourraient être nécessaires pour les essais cliniques chez l’Homme et l’autorisation de mise sur le marché d’un nouveau médicament.
Mise au point de modèles tumoraux murins et études d’efficacité de nouveaux composés thérapeutiques anticancéreux dans le cadre d’une plateforme préclinique
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
En moyenne trente-cinq mesures par souris sur douze semaines de croissance tumorale : 9 840 souris vont être utilisées dans cette plateforme préclinique, toutes tuées à l'issue, 9 780 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 60 en gravité sévère. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales, une puce implantée sous la peau sous anesthésie, des administrations de composés dont certaines par gavage, et des prélèvements sanguins. Une partie des souris sont immunodéficientes puis reconstituées avec un système immunitaire humain, une autre génétiquement modifiée pour exprimer des protéines humaines. Les études pilotes servent à écarter les lignées tumorales "trop agressives", et le porteur indique n'y appliquer aucun test statistique.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’évaluer de nouveaux modèles tumoraux chez la souris et d’utiliser ces modèles dans des études d’efficacité visant à tester de nouvelles thérapies anticancéreuses. Les modèles utilisés sont soit des souris génétiquement modifiées exprimant une ou plusieurs protéines humaines en remplacement de leurs équivalents murins, correspondant à des cibles pertinentes pour les traitements anticancéreux, soit des souris immunodéficientes reconstituées avec un système immunitaire humain fonctionnel. Ces derniers modèles permettent de reproduire les interactions entre des cellules tumorales humaines et un système immunitaire humain. Le projet comprend dans un premier temps des études pilotes, nécessaires avant toute étude d’efficacité. Ces études pilotes ont pour but d’évaluer de nouvelles lignées de cellules tumorales, de définir des conditions expérimentales adaptées permettant d’obtenir une croissance tumorale homogène et reproductible, et d’identifier et d’exclure les lignées trop agressives. Ces dernières pourraient en effet compromettre le bien‑être des animaux et rendre les études scientifiquement non exploitables. Le projet inclut également des études pilotes de tolérance, réalisées chez un nombre limité de souris, afin d’évaluer la toxicité de nouvelles molécules anticancéreuses n’ayant pas encore été utilisées chez l’animal. Les composés présentant une toxicité inacceptable sont exclus, ou bien les conditions expérimentales (dose, voie et/ou fréquence d’administration) sont ajustées afin d’assurer une utilisation sûre chez l’animal. Enfin, lorsque les conditions expérimentales sont validées, le projet comprend des études d’efficacité au cours desquelles les nouvelles molécules anticancéreuses sont évaluées dans les modèles tumoraux précédemment caractérisés.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à contribuer à la recherche anticancéreuse en développant, caractérisant et utilisant des modèles tumoraux chez la souris présentant une forte pertinence biologique. Les modèles employés reposent sur des souris génétiquement modifiées exprimant des protéines humaines du système immunitaire, ou sur des souris reconstituées avec un système immunitaire humain fonctionnel. Ces modèles permettent de reproduire de manière plus représentative certaines interactions entre les tumeurs et le système immunitaire humain. Les études réalisées à l’aide de ces modèles ont pour objectif d’améliorer l’évaluation préclinique de nouvelles molécules anticancéreuses, en fournissant des données plus pertinentes sur leur efficacité et leur tolérance avant toute utilisation chez l’Homme. En renforçant la valeur prédictive des études précliniques, ce projet contribue à améliorer la transposition des résultats vers la situation clinique, à réduire le risque d’échec lors du développement ultérieur des médicaments et à limiter l’exposition inutile des patients à des traitements inefficaces ou toxiques. À terme, ces travaux participent à l’optimisation du développement de stratégies thérapeutiques innovantes contre le cancer et visent à faciliter l’accès des patients à de nouveaux traitements mieux adaptés.
Procédures
Les interventions réalisées dans le cadre de ce projet comprennent la greffe de cellules tumorales, le suivi de la croissance tumorale, l’administration de composés et des prélèvements sanguins. La greffe de cellules tumorales consiste en une injection unique, réalisée le plus souvent par voie sous cutanée (SC) dans le flanc, et plus rarement par voie intraveineuse (IV). Les injections SC sont effectuées sous anesthésie (≤10 min) afin d’éviter les mouvements de l’animal, d’assurer une injection homogène et de limiter le stress. Les injections IV, très rapides (quelques secondes), sont réalisées sans anesthésie. Tous les souris reçoivent une puce électronique implantée par voie SC sous anesthésie, permettant l’identification individuelle et le suivi de la température corporelle, en remplacement de méthodes plus invasives, réduisant ainsi le stress lié aux manipulations répétées. La croissance tumorale est suivie par des mesures du volume tumoral, réalisées soit à l’aide d’un pied à coulisse chez un animal vigile, soit par imagerie in vivo sous anesthésie, selon le type de tumeur. La contention nécessaire à la mesure au pied à coulisse est brève (
Impact sur les animaux
Certaines souches de souris sont immunodéficientes et présentent une sensibilité accrue aux infections opportunistes ; elles sont donc maintenues sous des conditions sanitaires strictes. En l’absence d’infection, ces animaux restent en bon état général. Les manipulations peuvent être associées à un stress transitoire, limité par des contentions brèves et adaptées. Les injections réalisées chez des animaux vigiles sont de courte durée et peuvent entraîner une gêne légère et transitoire. Bien que très rares, des irritations locales ou des complications au site d’injection peuvent survenir. Dans des cas spécifiques et exceptionnels, des volumes plus importants peuvent être injectés, ce qui peut entraîner des effets physiologiques légers, aigus et transitoires durant quelques minutes (modifications respiratoires ou cardiaques, baisse temporaire de l’activité) (modifications respiratoires ou cardiaques, baisse temporaire d’activité). Les injections sous cutanées de cellules tumorales sont réalisées sous anesthésie afin d’éviter les mouvements de l’animal et d’assurer une injection homogène ; une douleur locale légère et transitoire peut être observée après le réveil. Le gavage peut occasionnellement provoquer un inconfort léger et transitoire et, plus rarement, des complications mécaniques. Les prélèvements sanguins, réalisés sous anesthésie, peuvent être associés à une douleur légère et transitoire, avec un risque très faible de complications locales. La croissance de tumeurs solides peut entraîner une gêne locomotrice ou des altérations cutanées, tandis que les tumeurs disséminées peuvent provoquer des signes généraux modérés. Enfin, certains composés ou pré traitements peuvent induire des réactions locales ou systémiques transitoires. Les composés dont le profil est encore inconnu peuvent présenter une toxicité. Des études pilotes permettent d’identifier et d’exclure précocement les lignées cellulaires tumorales ou les composés susceptibles d’entraîner des situations défavorables pour le bien‑être animal. Des signes cliniques non anticipés peuvent survenir ; les signes modérés sont pris en charge et intégrés aux points limites, tandis que les signes sévères entraînent l’arrêt de l’étude.
Devenir
Afin de recueillir un maximum d’informations scientifiques à l’issue des études, des prélèvements sont réalisés sur les tumeurs ainsi que, le cas échéant, sur d’autres organes et sur le sang. Ces prélèvements nécessitent la mise à mort des animaux à la fin de l’étude. Pour cette raison, l’ensemble des animaux inclus dans le projet est mis à mort à l’issue des procédures, afin de permettre la collecte des échantillons nécessaires à l’analyse
Remplacement
Les lignées tumorales et les composés étudiés font l’objet d’une phase préalable de caractérisation approfondie en laboratoire, notamment par des essais réalisés sur cellules en culture. Ces travaux permettent d’évaluer les caractéristiques biologiques pertinentes, telles que le comportement des cellules et la présence de cibles thérapeutiques, sans utiliser d’animaux. Les études décrites dans ce projet ne sont mises en œuvre chez l’animal qu’après l’achèvement de ces étapes préalables et lorsque les méthodes alternatives disponibles ont été exploitées. Le recours à un modèle animal intervient uniquement lorsque les données obtenues in vitro ne permettent plus de répondre aux questions scientifiques posées et que l’étude dans un organisme vivant constitue l’étape suivante nécessaire du développement préclinique.
Réduction
Le nombre de souris utilisées par lot est limité au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables et interprétables. Ce nombre est défini en tenant compte de la variabilité naturelle de la croissance tumorale, du risque de prise tumorale variable pour des lignées encore peu caractérisées, ainsi que de la variabilité biologique observée dans certains modèles, en particulier ceux reposant sur la reconstitution d’un système immunitaire humain. Des études pilotes sont mises en œuvre lorsque les données disponibles chez l’animal sont insuffisantes. Elles permettent de tester des lignées cellulaires ou des composés sur un nombre limité d’animaux, afin d’identifier les conditions expérimentales les plus pertinentes et d’exclure précocement des lignées trop agressives ou des composés présentant une toxicité inacceptable, avant toute utilisation dans des études d’efficacité impliquant des effectifs plus importants. Ces études sont conçues à partir de l’ensemble des informations disponibles, incluant les données issues de la littérature scientifique et, le cas échéant, celles provenant de composés comparables, afin de limiter le nombre de conditions testées. En raison de leur caractère exploratoire et afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, aucun test statistique n’y est réalisé et les effectifs sont maintenus au minimum nécessaire. Pour les études d’efficacité, le nombre d’animaux est calculé de manière à permettre la réalisation d’analyses statistiques adaptées, tout en restant aussi faible que possible. Les effectifs retenus permettent de prendre en compte l’hétérogénéité biologique tout en garantissant la robustesse scientifique des résultats. Enfin, à l’issue de chaque étude, des prélèvements biologiques (tumeurs, sang et/ou des organes) peuvent être réalisés post mortem afin de maximiser les données obtenues et d’éviter des répétitions expérimentales inutiles, conformément au principe de réduction des 3R.
Raffinement
Les conditions d’hébergement, de manipulation et de suivi des souris sont mises en œuvre afin de limiter au maximum le stress, la douleur et l’inconfort. Les animaux sont hébergés sous statut sanitaire contrôlé, en groupes sociaux stables, dans des cages enrichies comportant du matériel favorisant les comportements naturels, avec un accès libre à l’eau et à l’alimentation. Une période d’acclimatation est respectée avant le début des études. Les souris sont équipées de puces implantables permettant leur identification individuelle et le suivi de la température corporelle. L’utilisation de ces puces remplace des méthodes d’identification et de mesure plus invasives et permet de simplifier les manipulations, tout en réduisant le stress lié aux interventions répétées. Les manipulations sont réduites au strict nécessaire et réalisées sous anesthésie lorsque cela est recommandé. Les injections sont effectuées à l’aide de matériel adapté et dans le respect des volumes autorisés. Les prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie, limités au nécessaire, et espacés afin de permettre une récupération adéquate. Les sites de prélèvement peuvent être alternés pour éviter toute irritation ou lésion liée à des ponctions répétées. Un suivi clinique régulier est assuré tout au long des études, avec une fréquence adaptée à la procédure. Des dispositifs de suivi peu invasifs sont privilégiés afin de réduire le stress, notamment pour la mesure de la température corporelle. Des points limites spécifiques, classés en modérés ou sévères, sont définis pour chaque procédure afin de permettre une prise en charge rapide des animaux présentant des signes cliniques. Une souris présentant trois signes modérés ou un signe sévère est mise à mort. En cas de signes modérés, un suivi renforcé et des mesures de soutien adaptées peuvent être mis en place. Tout signe clinique inattendu est évalué avec le vétérinaire et la structure en charge du bien‑être animal, puis intégré aux points limites pour les études ultérieures.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour ce projet car elle constitue l’espèce de référence pour les études précliniques en oncologie et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques anticancéreuses. Les modèles murins, y compris les modèles génétiquement modifiés ou humanisés, permettent de reproduire des processus biologiques complexes impliqués dans la croissance des tumeurs et la réponse aux traitements, notamment les interactions entre la tumeur, son environnement et le système immunitaire. Ces interactions ne peuvent pas être reproduites de manière satisfaisante par des méthodes alternatives réalisées uniquement sur cellules ou tissus isolés. La souris présente également des avantages scientifiques et pratiques importants, tels qu’une taille adaptée aux procédures expérimentales, une manipulation facilitée, une cinétique de développement tumoral compatible avec les objectifs des études, ainsi qu’une large base de connaissances scientifiques permettant une interprétation fiable des résultats. Le recours à cette espèce permet ainsi d’obtenir des données pertinentes pour la recherche sur le cancer. Les souris immunocompétentes génétiquement modifiées sont utilisées à l’âge de jeune adulte, période à laquelle leur développement physiologique et immunitaire est stabilisé. Ce stade permet une croissance tumorale reproductible et une bonne tolérance aux procédures expérimentales. Les souris immunodéficientes reconstituées avec un système immunitaire humain sont utilisées à un âge plus avancé, nécessaire à la mise en place et à la stabilisation fonctionnelle du système immunitaire humain.
Barrière immunitaire aux produits de thérapie génique : mécanismes et nouvelles stratégies d’évitement chez la souris MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
5 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures que le porteur déclare intégralement en gravité légère. Chacune reçoit deux à quatre injections, dont une de cellules immunitaires et une du vecteur de thérapie génique, puis subit jusqu'à neuf prélèvements sanguins étalés sur six mois. Elles sont tuées pour analyser les lymphocytes dans le sang, la rate, les ganglions, le foie et les muscles, et une perte de poids supérieure à 20 % déclenche la mise à mort. Pour justifier de ne pas anesthésier certains gestes, le porteur note que ces injections "sont pratiquées chez l'homme sans anesthésie, ni administration d'analgésique".
Objectifs
Les vecteurs dérivés de virus adéno-associés (AAV) sont les plus utilisés en thérapie génique dans le traitement des maladies génétiques. Ces vecteurs sont bien tolérés chez l’homme, et leur bénéfice thérapeutique est tel que plusieurs d’entre eux ont reçu des autorisations de mise sur le marché. Cependant, quelques barrières subsistent et viennent limiter leur efficacité et leur utilisation. L’une d’entre elles est la barrière de la réponse immunitaire. En effet, notre système immunitaire a pour fonction de préserver l’intégrité de l'organisme en éliminant les éléments qui viendraient perturber trop fortement l’équilibre maintenu avec notre environnement. Il est ainsi logique que l’administration du vecteur de thérapie génique d’origine virale, puisse pâtir d’une réponse immunitaire qui tente de contrôler voire d’éliminer le produit injecté. Fort heureusement, certaines stratégies basées sur la modification des composants du vecteur ainsi que sur l’utilisation de médicaments immunomodulateurs visant à réduire la réponse immunitaire, peuvent atténuer ces effets immuns délétères en induisant une tolérance immune permettant ainsi un bénéfice thérapeutique pour le patient. Toutefois, ces stratégies sont encore mal maîtrisées. Afin d’élargir l’application de ces traitements au plus grand nombre de patients et de maladies génétiques différentes, notre projet vise, chez la souris, à caractériser certains paramètres impliqués dans l’établissement d’une tolérance immune à l’encontre des vecteurs AAV et à développer des co-traitements immunomodulateurs plus efficaces et moins toxiques pour le patient. Plus spécifiquement, nous étudierons à l’aide de différents modèles de souris les cellules de l’immunité que sont les lymphocytes T et B, et le rôle du ciblage par les vecteurs AAV de certains tissus tels le foie ou le muscle dans la balance immunité/tolérance.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de clarifier certains aspects de la tolérance immunitaire vis à vis des vecteurs AAV en disséquant les réponses lymphocytaires qui sont induites de manière différentielle en fonction du tissu et des cellules ciblées par le vecteur. Il permettra aussi de définir les caractéristiques du vecteur AAV qui peuvent diminuer la réponse immunitaire, et idéalement, induire une tolérance robuste. Enfin, il permettra de proposer de nouveaux traitements immunosuppresseurs adaptées à ces traitements AAV innovants. Comme nous l’avons fait depuis 20 ans, les résultats que nous obtiendrons seront rapidement publiés dans des revues internationales afin de renforcer la connaissance de la communauté scientifique sur le sujet et, le cas échéant, d’accélérer le passage en phase préclinique de certains vecteurs AAV développés par notre institution ou par d’autres.
Procédures
__ Partie 1 du projet : Les souris receverons deux injections: 1x injection de cellules immunitaires par voie intraveineuse, suivie après 24 heures par 1x injection du vecteur médicament AAV (intraveineuse ou intramusculaire). Les souris seront ensuite suivies sur une période allant de 2 semaines (avec 2 prélèvements de sang), à 6 mois (avec 9 prélèvements de sang). __Partie 2 Les souris receverons trois injections: 1x injection de cellules immunitaires par voie intraveineuse, 1x injection du vecteur médicament AAV après 24 heures (intraveineuse ou intramusculaire), et 1x injection après quelques semaines (voie sous-cutanée ou intradermique). Les prélèvements de sang seront bimensuels pour le 1er mois (2x); ensuite mensuels. Leur nombre total sera défini par le temps de suivi qui sera choisi en fonction des résultats de la partie 1. __Partie 3 Les souris receverons trois injections : 1x Injection de cellules immunitaires au niveau de la veine caudale, 1x injection du vecteur médicament AAV (veine caudale ou voie intramusculaire), 1x Injection de cellules à tolériser au niveau de la veine caudale. Prélèvements de sang hebdomadaires sur 1 mois (4x), puis plus espacées jusqu’à la fin. __Partie 4 Les souris receverons d’abord deux injections : 1x Injection de lymphocytes (intraveineuse), 1x injection du vecteur médicament AAV (intraveineuse ou intramusculaire) Avant ou après l’injection du vecteur, injections répétées par voie intrapéritonéale d’agents immunomodulateurs. Le nombre de ces injections variera en fonction des agents. Par exemple : 3 à 5 fois/ semaine pendant 1 à 3 semaines pour le methotrexate (3 à 15x en tout). Prélèvements de sang mensuels sur 6 mois (6x). __Partie 5 Mêmes interventions que les parties 1 à 4, mais réalisés sur des males.__ Injections intraveineuses (veine caudale), intrapéritonéales et sous-cutanées effectuées sur animal vigile, durée
Impact sur les animaux
Les gestes techniques pratiqués (injections intraveineuse, sous-cutanée, intrapéritonéale, prélèvement de sang) pourraient conduire à de faibles nuisances pour l’animal, tel qu’un stress léger et une douleur aigue de très courte durée. Les administrations intramusculaires et intradermique, sous anesthésie légère, seront sans douleur. Lors de nos études précédentes, aucun effet indésirable ou toxicité n’ont été observés chez les animaux traités par les vecteur-médicaments AAV ou des cellules immunitaires
Devenir
L’étude de la réponse immunitaire passe par l’analyse des populations lymphocytaires dans différents tissus (sang, rate, ganglions, foie…) et l’analyse de l’efficacité du traitement par rAAV (sur les muscles notamment). L’analyse de ces tissus (sauf le sang) ne peut se faire que sur animaux préalablement mis à mort. De ce fait, dans chaque procédure, les animaux seront tous mis à mort.
Remplacement
Les réponses immunes sont la résultante d’interactions complexes impliquant de multiples types cellulaires et se déroulant dans plusieurs organes (rate, ganglions lymphatiques, moelle osseuse, foie, muscle etc…) et avec des cinétiques particulières. Ainsi, seuls les animaux sont capables de mimer la complexité de la réponse immune et il n’existe pour le moment aucune méthode substitutive.
Réduction
(1) Afin d’utiliser un minimum d’animaux nous permettant de répondre à la problématique posée, nous avons utilisé une approche statistique pour calculer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir un résultat significatif. Ce nombre est respecté pour chaque procédure. (2) Dès que possible, nous effectuerons un suivi longitudinal de la réponse immune par prélèvement de sang sur les mêmes individus. Sur x point de temps, cela réduit le nombre d’animaux utilisés d’un facteur x. (3) De plus, sur les mêmes individus, nous analysons le maximum de tissus des animaux post-mortem afin de collecter le maximum d’informations sur chaque animal. (4) Dans la plupart des procédures, nous avons évité de répliquer les groupes contrôles en testant les vecteur-médicaments AAV deux par deux. Ceci réduit le nombre total de souris contrôles d’un facteur 2. Il n’est pas possible de tester plus de 2 vecteurs à la fois pour des raisons pratiques de lourdeur expérimentale.
Raffinement
De manière générale, les expérimentateurs qui travailleront sur ce projet ont en plus de leurs formations plusieurs années d’expériences quant à la manipulation des souris. Ils sont donc très sensibilisés au bien-être animal, ce qui permet de facto de limiter stress et angoisse des animaux afférents par exemple aux simples gestes de contentions. Durant les expériences, nous utiliserons des méthodes expérimentales adaptées par exemple lors des prélèvements de sang (anesthésie préalable, application éventuelle d’une compresse pour stopper d’éventuels saignements) ou lors de l’administration des produits (administration d’anesthésiques préalable pour les injections intramusculaires et intradermiques, suivi vigilant de l’état des animaux). Il est à noter que ces types d’injection classiques sont pratiquées chez l’homme sans anesthésie, ni administration d’analgésique. L’endormissement plus ou moins profond de l’animal permet la réalisation du geste expérimental sans que celui-ci ne bouge et puisse se blesser. Après toute intervention, les animaux seront quand même observés avec attention de façon quotidienne. Si des signes d‘inconfort ou de douleur venaient à apparaitre, l’animal sera surveillé plus fréquemment et pesé. En absence d’amélioration sur une semaine, ou en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial, la souris sera euthanasiée.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est très proche du système immunitaire humain, faisant du modèle murin le modèle de référence pour les analyses des complexes réponses immunes, se déroulant via de nombreux types cellules et dans divers organes. Il bénéficie en outre de l’existence de nombreuses souches modifiées pour des éléments du système immunitaire, permettant d’en analyser le rôle. Chez la souris, le système immunitaire est considéré comme adulte à partir de 6 semaines d’âge. Nous utiliserons donc majoritairement des souris jeunes adultes de 6-12 semaines pour étudier les réponses immunes d’organismes adultes. Les souris seront analysées et/ou euthanasiées entre 6 semaines et 6 mois afin d’évaluer les réponses immunitaires précoces et tardives, respectivement. Le cas échéant, des évaluations à plus long-terme pourraient être menées.
Étude préclinique de nouvelles thérapies dans les maladies auto-immunes, les maladies rares et en oncologie chez la souris 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une partie des souris utilisées sont des NSG, dépourvues de système immunitaire fonctionnel, ce que le porteur nomme un "phénotype dommageable". 2 184 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par dislocation cervicale pour prélèvement d'organes. Les interventions déclarées se résument à une ou deux injections, quatre prélèvements sanguins sur animal éveillé et un prélèvement sous anesthésie, réparties entre deux établissements. Le porteur admet que l'une des procédures "peut induire des douleurs non prévues" parce que la toxicité des molécules testées n'est pas connue, sans en dire davantage sur le contenu de ces études d'oncologie et de maladies auto-immunes.
Objectifs
L’objectif de cette étude est de développer de nouvelles molécules innovantes pouvant être utilisées pour le traitement de maladies auto-immunes ou dans le cadre du cancer. L’objectif principal sera donc de réaliser, chez la souris, une analyse toxicologique de ces molécules mais également étudier leurs effets sur le développement de différents types de cancer chez la souris. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs, ; les deux premières procédures, dans le premier établissement utilisateur et les trois dernières dans le deuxième établissement utilisateur.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à déterminer si les molécules innovantes nouvellement identifiées permettent notamment d’inhiber ou de ralentir le développement de différents types de tumeurs chez la souris. L’ensemble des résultats obtenus sera crucial pour envisager l’utilisation de ces molécules en clinique chez l’homme.
Procédures
1 ou 2 injections (
Impact sur les animaux
Les procédures correspondantes au projet peuvent induire du stress et une angoisse liés à la manipulation/ contention des animaux. Les prises de sang effectuées ainsi que les injections de traitements peuvent induire un inconfort, une angoisse et une douleur légère de courte durée chez celles-ci. Une des procédures peut induire des douleurs non prévues, inhérentes au fait que la toxicité des nouvelles molécules n'est pas connue. Les manipulations des souris lors des prises de sang effectuées peuvent induire un inconfort, une angoisse et une douleur de courte durée chez celles-ci. L'utilisation d'un phénotype dommageable, les souris NSG.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale, des prélèvements d'organes sont réalisés sur ces animaux et des analyses ex-vivo sont effectuées sur ces derniers.
Remplacement
L'évaluation préclinique est une étape importante dans le développement d'un médicament avant son utilisation en clinique. Avant l’expérimentation sur animal, les molécules sont testées au préalable sur différents modèles bio-informatiques (modélisation des structures des molécules et d'affinités pour les cibles thérapeutiques choisies) in vitro (lignées de cellules tumorales et cellules non tumorales) afin d’évaluer leur activité. L'utilisation du modèle souris permet l’étude de différentes pathologies in vivo. Afin de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques, il est nécessaire d’avoir recours à des organismes modèles de l’Homme. L’utilisation de modèles de souris permet d’étudier la physiologie de ces pathologies au sein d’un organisme vivant dans tout son ensemble.
Réduction
Le nombre de souris correspond au nombre minimal requis pour avoir une différence significative de réponse biologique entre les différents groupes. Dans les procédures expérimentales définies (études précliniques de pharmacocinétiques, de toxicité et d'efficacité), les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans un milieu enrichi et amélioré. Des analgésiques peuvent être administrés aux souris. L’utilisation d’une grille unique de score est mise en place ainsi que l'application de points limites stricts et spécifiques au projet. La grille de score est décrite dans chacune des procédures L’aspect général des animaux ainsi que le suivi pondéral seront transcrits dans la grille de score. Le bien-être des animaux est analysé et est pris en compte tout au long des protocoles expérimentaux. Des points limites pour lesquels les animaux seront mise à mort ont été défini. Il n'y a pas d'échanges d'animaux entre les deux établissements utilisateurs, pas de transports d'animaux entre ces deux sites.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal qui permet d’élargir nos connaissances sur le développement, la physiopathologie de différentes pathologies mais aussi tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Son utilisation permet de connaitre la physiologie in vivo des différentes pathologies chez des modèles de souris. Le choix de l'espèce se porte sur le fait que cette espèce est un modèle de mammifère dont le profil pharmacologique permet une utilisation préclinique. Jeunes adultes entre 5 à 8 semaines pouvant finir leur croissance. Les animaux plus âgés ne sont pas souhaités dans la mesure où la présence de graisse peut entrainer une modification de la biodisponibilité de la molécule.
Développement d’antiviraux virucides à large spectre non toxiques
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Perte de poids, hypothermie, difficultés respiratoires : réunir ces critères déclenche la mise à mort immédiate. 3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dont 1 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes sont infectées par instillation intranasale sous anesthésie, par le virus respiratoire syncytial ou la grippe A, puis manipulées chaque jour pour la pesée et la prise de température, traitées par gavage, injection ou instillation, 2 880 passant deux séances d'imagerie. Le porteur reconnaît que l'infection peut aller jusqu'à une atteinte clinique sévère, voire la mort, et présente ces antiviraux comme une "avancée importante en médecine" dont le passage au développement préclinique et clinique reste entièrement à venir.
Objectifs
Ce projet a pour objectif principal l’optimisation et l’évaluation approfondie d’une nouvelle famille d’antiviraux développée conjointement par les différents laboratoires co-porteurs. Cette nouvelle classe d'antiviraux utilise des molécules organiques (bêta-cyclodextrines) mimant les récepteurs cellulaires pour se lier aux virus et détruire physiquement leur structure de façon irréversible et non toxique. Elle constitue donc une forme de nanoparticules antivirales. S’appuyant sur une expertise complémentaire en virologie et en science des matériaux, ces trois équipes ont mis en évidence le fort potentiel thérapeutique de ces molécules. Néanmoins, plusieurs verrous scientifiques majeurs subsistent, que ce projet vise à lever afin d’accélérer le développement de cette famille d’antiviraux. En identifiant des molécules plus puissantes dotées d’une activité à large spectre, nous ambitionnons de renforcer l’efficacité in vivo contre le virus respiratoire syncytial, le virus influenza A et d’autres virus humains d’importance majeure. Cet objectif est particulièrement crucial pour la prise en charge des virus respiratoires circulants chez les populations à risque et constitue un enjeu clé de la préparation pour faire face aux pandémies. Nous étudierons également la possibilité de modifications chimiques visant à conférer une biodisponibilité orale, un critère déterminant pour faciliter l’administration, améliorer l’observance thérapeutique et soutenir de futures études cliniques. Une autre question centrale portera sur la capacité de l’inactivation virale induite par ces molécules à générer des débris viraux immunogènes, susceptibles de stimuler une réponse immunitaire protectrice et une mémoire immunologique. L’objectif est ainsi de développer non seulement un antiviral hautement efficace, mais également une molécule capable de conférer une protection durable contre l’infection. Les résultats attendus permettront d’optimiser davantage la structure de ces antiviraux et de les rapprocher d’un développement clinique, tout en contribuant à l’émergence de nouveaux outils et méthodologies de recherche. Les travaux portant sur les stratégies de conjugaison pour une administration orale et sur la détection in vivo de ces macromolécules complexes apporteront des connaissances essentielles à la synthèse et à la caractérisation de nouveaux matériaux bioactifs ciblant les virus respiratoires.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait constituer une avancée importante en médecine en validant un concept de traitement capable de convertir une simple inactivation virale en une réponse immunitaire protectrice, robuste et durable. L’optimisation de la biodisponibilité orale des composés lèvera un verrou technologique déterminant, ouvrant la voie à leur transfert vers le développement préclinique et clinique.
Procédures
3600 animaux concernés pour l’ensemble des interventions, chaque type d’intervention impliquant une proportion variable : Anesthésie et instillation intranasale : chaque animal recevra une anesthésie chimique unique d’environ 20 minutes (par injection, 30s), nécessaire pour l’administration intranasale. Cette intervention sera réalisée sur tous les 3600 animaux. Manipulation et contention pour le suivi clinique : les animaux vigiles seront manipulés quotidiennement pour la mesure du poids et de la température corporelle, chaque opération durant environ 1 minute par animal. Cette mesure sera effectuée sur l’ensemble des 3600 souris. Traitement des animaux : les souris traitées recevront les solutions de composés par gavage, instillation intra-nasale ou injection, durée de l’administration inférieure à 1 minute. Imagerie: effectuée sous anesthésie gazeuse, à deux reprises espacées de quatre jours, chaque séance (anesthésie incluse) durant moins de 5 minutes. Cette intervention sera réalisée sur 2880 animaux. Imagerie: Les souris recevront une injection sous anesthésie gazeuse (durée de l’injection inférieure à 30 secondes). Prélèvement sanguin : deux échantillons seront prélevés sur chaque animal anesthésié, (1 minute). Cette intervention concernera 10% des effectifs soit 360 animaux. Mesure des paramètres respiratoires : réalisée à deux reprises au cours du protocole sur les animaux vigiles, chaque mesure durant 2 à 3 minutes. Cette intervention sera appliquée à tous les animaux. Ces interventions ont été planifiées pour limiter la durée de manipulation et le stress des animaux tout en garantissant la collecte de données fiables sur l’ensemble du groupe. Génotypage : une petite partie des souris pourra être l’objet d’un prélèvement de 1mm de queue.
Impact sur les animaux
Le protocole implique une manipulation quotidienne des animaux afin d’une part de leur administrer les composés antiviraux, et d’autre part pour évaluer différentes constantes physiologiques (poids, température, etc.). Il faut mentionner que les molécules testées ont une base organique de type sucre et sont très bien tolérées par les animaux. Ces manipulations répétées sont susceptibles d’induire un stress modéré chez les souris, notamment lorsque les traitements nécessitent une injection (IP ou IV). L’infection virale nécessite une anesthésie générale de courte durée (< 1 heure), réalisée par injection parentérale de l’anesthésique, pouvant entraîner une douleur transitoire liée à la piqûre. Une légère perte de poids est parfois observée le lendemain de l’anesthésie. L’infection virale induit une pathologie dont la sévérité dépend du virus et de la dose d’inoculum administrée, pouvant aller jusqu’à une atteinte clinique sévère, voire une mortalité. Une perte de poids et une hypothermie sont notamment observées au cours des infection par le virus influenza. Une gêne respiratoire, objectivée par des mesures de pléthysmographie, est détectable entre J4 et J10 post-infection. Enfin, les sessions de pléthysmographie, bien que de courte durée (environ 3 minutes), peuvent également générer un stress lié à l’isolement temporaire de l’animal durant la phase de monitoring. Enfin, l’éventuel génotypage des souris IFNAR-/- va induire une nuisance liée au prélèvement de 1mm de queue, correspondant principalement à une douleur transitoire au moment du geste, associée à un stress de courte durée lié à la contention et à la manipulation, ainsi qu’à un inconfort local temporaire au site de prélèvement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Notre thématique de recherche ne peut être mise en œuvre sans recours à des modèles animaux. En effet, l’évaluation de l’efficacité de nos nanoparticules antivirales repose sur l’étude d'interactions biologiques complexes s’exerçant à l’échelle de l’organisme entier. L’établissement d’une réponse immunitaire protectrice, incluant la capture des débris viraux immunogènes et le recrutement de cellules immunocompétentes vers les sites d’infection, nécessite une coordination systémique entre les systèmes lymphatique, vasculaire et les tissus cibles. De plus, les enjeux de biodisponibilité et de pharmacocinétique liés à l’administration orale impliquent des processus de barrières biologiques et de métabolisme qu’aucune approche in vitro ou ex vivo ne peut actuellement reproduire fidèlement. L’étude intégrée de ces mécanismes d'action et de la mémoire immunologique induite nécessite donc impérativement le recours à des modèles animaux diversifiés, conformément aux principes éthiques des 3R.
Réduction
Notre stratégie de réduction est basée sur l’emploi de tests statistiques nous permettant de valider nos hypothèses scientifiques sur la base de résultats obtenus avec le nombre minimal d’animaux en termes d’effectifs. Afin de garantir la robustesse des résultats tout en respectant le principe de Réduction (3R), les effectifs ont été calculés pour détecter une taille d’effet importante de d = 1,4 (différence de Cohen) avec une puissance statistique de 80 % (risque alpha = 5 %). Ce calcul de la taille d’effet s’appuie sur nos données préliminaires ainsi que sur la pertinence biologique attendue. Il vise à identifier uniquement des variations d’une amplitude significative afin d’écarter les différences minimes et dénuées d'intérêt clinique. En fixant l’effectif à n = 10 par groupe, et en prenant en compte ces paramètres statistiques, l'étude devient calibrée pour détecter des tailles d'effet importantes et garantit donc la robustesse et la reproductibilité des conclusions biologiques. Ces paramètres permettent de mettre en évidence des différences biologiquement pertinentes, même en présence d'une variabilité interindividuelle modérée au sein de groupes de 10 animaux. Les analyses statistiques seront réalisées en fonction de la nature des données (sécrétion de cytokines, détresse respiratoire, réplication virale…), avec des tests t de Student ou des tests non paramétriques (Mann-Whitney) pour les comparaisons simples, et des modèles d’ANOVA à deux facteurs pour les analyses intégrant plusieurs facteurs expérimentaux (nanoparticules et voies d’administration). Des corrections pour comparaisons multiples (Benjamini-Hochberg) pourront être appliquées. La taille d’échantillon est définie à partir de la réplication virale qui correspond à la variable biologique principale de réponse, correspondant au critère quantitatif retenu pour évaluer l’effet des conditions expérimentales. En complément, des analyses multivariées de type analyse en composantes principales (ACP) seront réalisées afin de visualiser les structures globales des données et d’identifier d’éventuels regroupements ou tendances au sein des différents paramètres expérimentaux.
Raffinement
Le bien-être animal est un axe central de notre démarche, visant à minimiser le stress et la souffrance tout au long du challenge infectieux. Les souris sont hébergées par groupes de cinq au sein de cages à couvercle filtrant, dans un environnement climatisé avec accès ad libitum à l’eau et à une alimentation standard. Afin de favoriser les comportements naturels et réduire l'anxiété, l'environnement est enrichi par des carrés de coton (type Neslets/Sizzle-nest), des bûchettes de bois à ronger et des abris en carton. Une surveillance quotidienne rigoureuse permet de déceler tout signe clinique précurseur (perte de poids, hypothermie, difficulté respiratoires, diarrhée, poil hérissé, léthargie, yeux clos ou dos courbé). Pour prévenir toute souffrance inutile, des points limites précis ont été établis : tout animal répondant à l'ensemble des critères prédéfinis sera immédiatement euthanasié. Nous veillons à réduire l'impact des manipulations par des techniques de précision : les prélèvements sanguins sont réalisés avec des micro-aiguilles pour minimiser les volumes prélevés et les traumatismes tissulaires. De même, les administrations de composés antiviraux sont effectuées par injections lentes, garantissant une meilleure tolérance et réduisant la variabilité induite par le stress. Bien que la pléthysmographie impose un bref isolement (2 à 3 minutes), la répétition de la procédure permet une habituation rapide des animaux, confirmée par une diminution du temps d'acquisition dès la deuxième mesure. Lors des génotypages des souris IFNAR-/- nécessitant un prélèvement de queue, une application locale de pommade anesthésiante sera réalisée. De plus, une hémostase par pression manuelle sera faite immédiatement après prélèvement et jusqu'à l'arrêt du saignement. Enfin, une surveillance post-prélèvement sera effectuée jusqu’à 24 heures pour s'assurer de la parfaite cicatrisation du site de prélèvement.
Choix des espèces
Le choix de la souris est guidé par la possibilité de disposer de souris génétiquement modifiées (NF-kB luciférase, IFNAR KO) et donc de pouvoir suivre des processus dynamiques sur les mêmes animaux sans avoir à les euthanasier pour réaliser des mesures. De plus, la disponibilité de certaines souris immunodéficientes nous permet d’élargir le panel de virus ciblés (hPIV3). De plus, la souris constitue un modèle pertinent pour étudier les mécanismes pathologiques induits par les infections virales respiratoires ainsi que la mise en place de réponses humorales et cellulaires adaptatives. Souris âgées de 8 semaines car le système immunitaire est mature.
Etude de la faisabilité et de la sécurité d’un traitement par ultrasons focalisés de haute intensité (HIFU) délivré par voie transcutané chez le porc pour le traitement de tumeurs pancréatiques.
- Recherche appliquée
- Cancers
Maintenus sous anesthésie jusqu'à six heures pendant qu'une sonde à ultrasons focalisés porte leurs tissus à plus de 80 °C, 10 porcs vont être utilisés, six tués sans jamais se réveiller, quatre soumis à des procédures d'un niveau de souffrance léger. L'objectif déclaré est de montrer qu'un nouveau dispositif transcutané détruit des tumeurs du pancréas sans abîmer les organes voisins. Tous sont tués pour que leurs foies soient prélevés et analysés. Le porteur affirme que le traitement "ne devrait pas causer de douleur", et présente le projet comme un essai sur des tumeurs pancréatiques alors que les porcs sont sains et que les lésions sont dupliquées dans le foie pour économiser des animaux.
Objectifs
Les tumeurs du pancréas font parties des cancers les plus agressifs avec un taux de survie à 5 ans inférieur à 5 %. L’absence de symptome typique fait que la maladie est le plus souvent non opérable au moment du diagnostic. Les avancées récentes sur les autres moyens thérapeutiques, notamment les chimiothérapies, n’ont pas permis une amélioration significative de la survie. La situation d’impasse thérapeutique actuelle dans laquelle se trouvent les patients justifie la mise en place de nouvelles approches thérapeutiques parmi lesquelles les ultrasons focalisés de haute intensité (HIFU) représentent une approche pertinente. Les HIFU sont délivrés par une sonde qui concentre les ultrasons dans une zone focale et permettent la destruction du tissu visé par effet thermique sans risque pour les structures voisines. En effet, les ultrasons permettent d’élever localement la température jusqu’à plus de 80°C à distance de la sonde qui les émet sans abîmer les tissus qu’ils traversent grâce à l’effet de focalisation. Les cellules de la zone cible sont détruites dès lors que la température dépasse les 60°C. Cette zone de cellules mortes est appelée lésion. Lors des travaux antérieurs nous avons acquis une expertise clinique de traitement de tumeurs pancréatiques envahissant les vaisseaux mésentériques. Ces traitements étaient réalisés au bloc opératoire durant une laparotomie. Nous avons depuis développé une nouvelle sonde HIFU permettant un traitement totalement non-invasif des tumeurs pancréatiques. Cette nouvelle sonde a été pensée pour s’adapter aux contraintes anatomiques impliquées par la voie transcutanée. L’objectif des essais in vivo est d’évaluer la faisabilité de créer des lésions HIFU dans le pancréas sans atteinte des structures voisines.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de démontrer la faisabilité et l’innocuité d’un nouveau dispositif médical utilisant les ultrasons focalisés pour détruire les tumeurs pancréatiques. En cas de résultats satisfaisants, un essai clinique de Phase I/II chez des patients porteurs de tumeurs pancréatiques localement avancées pourra être envisagé.
Procédures
Les animaux subiront une injection intra musculaire pour débuter l’anesthésie (la moitié des animaux seront anesthésiés une seconde fois plus tard) puis, une fois anesthésié, un cathéter sera mis en place au niveau de la veine de l’oreille. L’anesthésie durera 6h au maximum avec traitement antidouleur pendant lequel aura lieu le traitement HIFU.
Impact sur les animaux
L’animal subira un stress lors de la prémédication et une douleur légère de courte durée lors de la mise en place du cathéter dans l’oreille. Le traitement HIFU ne devrait pas causer de douleur. Lors du prélèvement de sang à J1, l’animal subira un stress (contention) et une légère douleur (insertion de l’aiguille dans la veine).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélever les foies qui seront analysés.
Remplacement
La mise au point du traitement HIFU a été préalablement évaluée par simulation informatique puis testée in vitro et ex vivo. Ces alternatives ont été utilisées à leur maximum, ce qui a permis de repousser le passage à l’animal. Toutefois, l’évaluation des effets du traitement par HIFU dans l’organe perfusé ainsi que sur les tissus biologiques qui seront traversées par les ultrasons entre la peau et l’organe ciblé nécessite une exploration in vivo, compte tenu de la complexité à reproduire cet environnement in vitro. De plus, les ultrasons ne se comportent pas de la même façon entre un organe in vitro et in vivo. À ce jour, ces interactions ont été insuffisamment caractérisées pour être étudiées directement chez l’Homme.
Réduction
Le nombre de lésions réalisable dans le pancréas étant limité à 1 ou 2, la duplication de lésions dans le foie permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude. Aucun test statistique ne sera appliqué, seule de la statistique descriptive (moyenne, écart-type des tailles, volumes de lésions) sera effectuée.
Raffinement
L’analgésie administrée est la même que celle utilisée chez les patients. L’animal est monitoré (fréquence cardiaque, saturation en oxygène et température) ce qui permet d’ajuster l’anesthésie et l’analgésie. L’animal est réchauffé par un matelas chauffant. Outre la mise à disposition d’objets à mâchouiller et d’un ballon, les techniciens animaliers disposent d’un temps de jeu, d’échange avec les porcs, leur mettent à disposition des friandises dans la litière pour qu’ils puissent exprimer leur comportement naturel de fouissage. Des points limites adaptés permettront de prendre des mesures adéquates ou d’arrêter la procédure.
Choix des espèces
La sonde de traitement HIFU est adaptée à l’homme. Le porc présente une anatomie permettant ce test. Afin que le pancréas et le foie soient suffisamment gros et que la paroi de l’animal soit suffisamment épaisse pour se rapprocher des conditions rencontrées en clinique, des porcs de 40-45 kg seront utilisés.
Collecte de différentes matrices biologiques chez le lapin
- Recherche appliquée
- Cancers
Un seul lapin va être utilisé, anesthésié puis tué avant tout réveil. Quatre écouvillons lui sont passés dans la bouche, le nez, l'œil et le rectum, cinq minutes maximum par site, avant une injection d'euthanasiant directement dans le cœur. Ces échantillons, avec de l'urine et des fèces, serviront de référence pour valider une méthode d'analyse chez un client engagé dans un programme de bactéries anticancéreuses, sans qu'aucune expérience porte sur le lapin lui-même. Le porteur écrit qu'il n'est "pas nécessaire de recourir à plusieurs donneurs" et que ces matrices "ne peuvent être issues que d'un lapin".
Objectifs
L’objectif du projet est de collecter diverses matrices biologiques issues d’un lapin, qui serviront par la suite de référence pour la validation de méthodes d’analyses qui seront réalisées chez le client, dans le cadre de son programme de développement clinique de bactéries à activité anti-cancéreuses. Des écouvillons issus de différents sites (buccal, nasal, lacrymal et rectal) ainsi que des échantillons d’urine et de fèces seront ainsi collectés sur un seul animal (lapin mâle).
Bénéfices attendus
Les résultats attendus permettront de contribuer à la validation d’une méthode ex-vivo pour la quantification de bactéries actuellement développées pour traiter certains types de cancer. Le programme de développement étant bien avancé, il est nécessaire de procéder à ces étapes analytiques avant la rédaction d’un essai dit de « bonne pratique de laboratoire » (GLP ) chez le lapin puis d’un essai clinique.
Procédures
L’animal subira une injection intramusculaire d’anesthésique (5 secondes) puis un prélèvement à l’aide d’un écouvillon fin des cavités buccale, nasale, lacrymale et rectale (maximum 5 minutes par site) qui se terminera par une injection intracardiaque d’un euthanasiant pour assurer la mort (5 secondes).
Impact sur les animaux
Une douleur légère peut être ressentie par l’animal lors de l’injection intramusculaire de l’anesthésique. L’entièreté de la procédure sera réalisée ensuite sous anesthésie générale et l’animal sera mis à mort à son issue.
Devenir
L’animal sera mis à mort (procédure sans réveil)
Remplacement
Un essai de toxicité sera réalisé par le client chez le lapin (requis par les autorités de santé) et les matrices nécessaires aux investigations analytiques ne peuvent être issues que du même modèle animal. Aussi, ces matrices biologiques ne peuvent être issues que d’un lapin.
Réduction
La présente demande ayant pour but de soutenir une étude de validation et les matrices étant considérées comme naïves, il n'est pas nécessaire de recourir à plusieurs donneurs. Tous les échantillons peuvent donc provenir d'un seul animal.
Raffinement
L’entièreté de la procédure sera réalisée sous anesthésie fixe et sans réveil. Le prélèvement par écouvillon ne durera que 5min par site au maximum et aucune nuisance n’est attendue.
Choix des espèces
Lors d’évaluation de nouvelles thérapies à visée humaine, au minimum 2 modèles animaux doivent être utilisés. Des études ont déjà montré des résultats très encourageants chez la souris et les études chez le lapin sont toujours en cours. Un lapin adulte de 3 à 4kg sera utilisé pour ce projet.
Traitement du cancer de la prostate par ultrasons focalisés : passage du traitement par un dépôt de chaleur à la liquéfaction du tissu.
- Recherche appliquée
- Cancers
Anesthésiés par une injection dans la cuisse, intubés, branchés à un respirateur, l'abdomen ouvert : 5 porcs vont être utilisés dans une procédure menée sous anesthésie, tués avant tout réveil. Le traitement par ultrasons focalisés dure environ trente minutes par zone, de trois à six zones par animal, pour un total de quatre heures. Le projet porte sur le cancer de la prostate, mais c'est le foie qui est traité, choisi pour son épaisseur et parce qu'il permet plusieurs lésions sur un même animal. Ils sont tués parce que les lésions doivent passer à l'IRM et parce que le porteur juge la chirurgie trop lourde pour que l'animal s'en remette.
Objectifs
Le cancer de la prostate est actuellement le deuxième cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez l’homme. Malgré un taux de survie augmenté, les effets secondaires des traitements (incontinence urinaire, impuissance, inflammation du rectum...) restent une préoccupation majeure. Depuis près de 20 ans, une des techniques indiquées pour détruire ce cancer est le traitement par ultrasons focalisés de haute intensité (HIFU : High Intensity Focused Ultrasound). Cette technique a pour avantage de diminuer les risques post-opératoires et les effets secondaires. Aujourd’hui, beaucoup de recherches tournent autour d’une autre technique pour détruire physiquement la tumeur. Au lieu de créert une élévation de température dans la tumeur, on fait éclater les cellules en créant localement des bulles qui s’agitent. Le tissu va alors se liquéfier. Il a été montré que cette destruction induit également une réaction immunitaire contre la tumeur. Cette réaction immunitaire permettrait d’apprendre au corps à détruire les cellules issues de ce même cancer limitant ainsi les risques de diffusion et de récidive. Le but de ce projet est de vérifier que le traitement de la tumeur réalisé correspond bien à ce qui est demandé au logiciel qui pilote la machine sans dommage secondaire.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de proposer une amélioration du traitement du cancer de la prostate par HIFU en clinique qui pourra réduire les effets secondaires chez les patients.
Procédures
Chaque animal sera anesthésié par une injection (10 secondes) dans le muscle de la cuisse sans que l’animal soit tenu. Dix minutes après, il sera intubé et branché à un respirateur. Son abdomen sera ouvert pour avoir accès au tube digestif et au foie sous anesthésie générale et antidouleur. La procédure de traitement durera environ 30 minutes par zone, entre 3 et 6 zones par animal et au total durera 4 heures.
Impact sur les animaux
L’animal subira un stress et une douleur légère et courte lors de la prémédication et possiblement une douleur légère et courte lors de la mise en place du cathéter à l’oreille (piqure). .
Devenir
La mise à mort des animaux est nécessaire car les lésions effectuées par le traitement doivent passer à l’IRM afin de mesurer les lésions et la chirurgie qui est effectuée sur l’animal est lourde et serait difficile à l’animal de s’en remettre.
Remplacement
Les paramètres de traitements ont été fixés par simulation informatique et des essais ont été fait sur foie de génisse. Ainsi certaines questions ont pu être résolues sans avoir recours à des animaux. Cependant ce type de traitement est très dépendant de la circulation sanguine, l’animal vivant est alors nécessaire.
Réduction
Ce modèle utilise le foie plutôt que la prostate car il a des propriétés similaires pour ce type de traitement et il permet de faire plusieurs traitements sur un même foie, ainsi le nombre d’animaux peut être divisé au minimum par deux. Le nombre d'animaux a été déterminé à l'aide d'un test statistique.
Raffinement
Outre la mise à disposition d’objets à mâchouiller et d’un ballon, les techniciens animaliers disposent d’un temps de jeu, d’échange avec les porcs, leur mettent à disposition des friandises dans la litière pour qu’ils puissent exprimer leur comportement naturel de fouissage. Ils sont régulièrement sortis de leur box pour pouvoir courir dans un plus grand espace de l’animalerie. Les animaux sont anesthésiés sans contention. L’antidouleur administré est le même que celui utilisé chez les patients. Les paramètres vitaux de l’animal sont monitorés ce qui permet d’ajuster l’anesthésie comme chez l’homme. L’animal est réchauffé par un matelas à air chaud. Les organes non prélevés dans ce projet seront proposés à d’autres chercheurs.
Choix des espèces
La sonde de traitement HIFU est adaptée à l’homme. La épaisseur des lésions nécessite une épaisseur de foie que seul le porc présente pour ce test. Il permet d’effectuer de trois à six lésions. Afin que le foie soit suffisamment gros pour faire des lésions de taille suffisante, des porcs de 40-45 kg seront utilisés (14 semaines environ).
Evaluation de nouvelles thérapies immunomodulatrices pour le traitement des maladies auto-immunes induite par immunisation murine
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Environ quinze études par an, commandées au fil de l'eau pour valider des candidats médicaments avant le passage à l'être humain : 4 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Injectées jusqu'à quatre fois par semaine pendant quinze semaines, elles développent une réaction immunitaire dirigée contre leur propre organisme, imitant le diabète de type 1, la maladie cœliaque ou le lupus, et subissent en plus des prélèvements sanguins, des mesures de glycémie et, pour certaines, des endoscopies sous anesthésie. Le porteur annonce perte de poids, déshydratation, lésions cutanées et diarrhées sanglantes comme effets attendus de ces maladies induites. Sur le remplacement, il affirme que les cultures cellulaires et les simulations informatiques ne reproduisent pas la complexité d'un "organisme entier", et qualifie ces modèles de "cruciaux".
Objectifs
Les maladies auto-immunes sont des maladies dans lesquelles le système immunitaire, qui normalement protège le corps contre les infections, se retourne par erreur contre les propres cellules et tissus de l'organisme. Parmi les maladies concernées, on trouve le diabète de type 1, la maladie cœliaque (intolérance au gluten), ou encore le lupus. Pour mieux comprendre ces maladies, les chercheurs utilisent des modèles animaux, principalement des souris. Ces modèles permettent d'observer comment la maladie se développe, quelles cellules du système immunitaire sont impliquées, et comment les dommages sur les organes se produisent ou peuvent être limités. Dans ce projet, des souris sont utilisées pour reproduire en conditions contrôlées certains mécanismes de ces maladies. Pour cela, les animaux reçoivent des substances qui déclenchent ou amplifient une réaction immunitaire dirigée contre leur propre organisme. Cela permet d'étudier comment cette réaction se met en place et comment elle pourrait être freinée ou corrigée. L'objectif général est de mieux comprendre ces mécanismes, dans le respect des règles éthiques en vigueur, afin d'ouvrir la voie à de nouveaux traitements pour les patients. Environ 15 études sont prévues par an dans le cadre de ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche est susceptible d'apporter plusieurs bénéfices importants, tant pour la compréhension des maladies que pour le développement de futurs traitements : - Mieux comprendre comment le système immunitaire s'emballe : les chercheurs pourront observer comment certaines substances du corps déclenchent une réaction immunitaire anormale, et identifier les cellules responsables de cette réaction. - Étudier la réponse des cellules immunitaires : en particulier les globules blancs appelés lymphocytes T, qui jouent un rôle central dans les maladies auto-immunes. - Mesurer la production d'anticorps : les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire. Ce projet permettra d'évaluer si certaines substances sont capables de déclencher la production d'anticorps spécifiques, ce qui est important pour comprendre la maladie. - Tester des stratégies pour moduler la réponse immunitaire : c'est-à-dire explorer des approches pour calmer ou réorienter le système immunitaire lorsqu'il attaque le corps. - Valider des candidats médicaments : ce projet permettra d'obtenir une première preuve que certaines molécules thérapeutiques sont efficaces et faisables, avant d'envisager des essais chez l'humain. À terme, ces travaux contribuent à améliorer la prise en charge des patients atteints de maladies auto-immunes, en ouvrant la voie à des traitements plus ciblés et plus efficaces.
Procédures
Les animaux utilisés dans ce projet sont soumis à différents types d'interventions, toutes réalisées dans des conditions encadrées et par du personnel formé : - Administrations et injections : les souris reçoivent des substances par différentes voies. Ces gestes sont réalisés sur l'animal éveillé ou anesthésié, durent environ 10 secondes chacun, et peuvent être répétés jusqu'à 4 fois par semaine, sur une durée maximale de 15 semaines. - Prélèvements sanguins : de petites quantités de sang sont prélevées sur l'animal éveillé, en 15 à 20 secondes, au maximum une fois toutes les deux semaines. - Pour certains modèles, Mesure du taux de sucre dans le sang : une petite goutte de sang est prélevée 1 à 2 fois par semaine sur l'animal éveillé, en environ 15 secondes. Un test de tolérance au glucose (qui consiste à mesurer la glycémie à plusieurs reprises sur 2 heures) est réalisé 6 fois de suite, et répété 2 fois au cours de l'étude. - Pour d’autres modèles, analyse urinaire par miction spontanée ou massage abdominale ne durant que quelques secondes. Très rarement pour un modèle particulier de l’endoscopie peut être réalisée sur quelques animaux. Ils sont alors anesthésiés quelques minutes.
Impact sur les animaux
L'utilisation de ces modèles animaux peut entraîner certains effets indésirables, directement liés aux maladies étudiées et non aux traitements expérimentaux eux-mêmes : - Perte de poids - Baisse de l'activité et de la mobilité, souvent liée à la fatigue causée par la maladie - Déshydratation, notamment dans les modèles de diabète ou de maladie cœliaque - Atteintes cutanées (lésions ou irritations de la peau) - Diarrhées avec parfois présence de sang dans les selles Ces effets sont étroitement surveillés tout au long des études. Des mesures de prise en charge sont mises en place dès l'apparition des premiers signes, afin de limiter l'inconfort des animaux et d'intervenir rapidement si nécessaire
Devenir
Les animaux sont euthanasiés pour les prélèvements d’organes nécessaires à l’atteinte des objectifs de l’étude.
Remplacement
LL'utilisation de modèles d’immunisation est cruciale pour le développement et l'évaluation de nouvelles thérapies. Ces modèles permettent d'étudier les réponses immunitaires dans un environnement contrôlé, offrant une approche unique pour comprendre les interactions cellulaires et les mécanismes pathologiques spécifiques. Ils surmontent les limitations des systèmes in vitro (sur des cellules en laboratoire) et in silico(sur ordinateur), qui ne peuvent reproduire la complexité d'un organisme entier. Les simulations informatiques identifient des cibles pertinentes à valider expérimentalement. Les tests in vitro étudient certaines réponses cellulaires et testent des molécules immunomodulatrices, mais ne simulent pas les interactions dynamiques entre organes. Les modèles animaux, eux, offrent des avantages uniques : - Complexité physiologique : Ils permettent d'étudier les interactions entre le système immunitaire et d'autres organes, impossible à reproduire in vitro ou in silico. - Progression de la maladie : Ces modèles permettent d'observer l'évolution de la pathologie sur une longue période, crucial pour comprendre la maladie et évaluer l'efficacité des traitements. - Biomarqueurs et diagnostic : Ils facilitent l'identification de nouveaux biomarqueurs pour le diagnostic précoce et le suivi de la progression de la pathologie. - Évaluation de la sécurité : Essentiels pour tester la sécurité des nouvelles thérapies avant les essais cliniques humains. - Étude des complications : Ils permettent d'étudier les complications à long terme, comme les problèmes cardiovasculaires, cutanés, etc. - Personnalisation des traitements : Ces modèles aident à identifier des sous-groupes de patients répondant différemment aux traitements.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est préalablement basé sur les publications scientifiques. Ensuite, sur la base des données expérimentales, un biostatisticien est consulté pour optimiser le nombre d’animaux à utiliser selon le type de mesures effectuées. Seules les molécules ayant montré en amont une activité anti-inflammatoire in vitro sont testées sur les animaux (in vivo). L’utilisation de techniques précises de pointes comme l’examen permettant la caractérisation des types cellulaires, l’analyse de biomarqueurs et l’étude des tissus d’intérêt permettront d’obtenir des données détaillées à partir de petits échantillons. Les modèles décrits dans ce projet sont choisis pour leur pertinence clinique, réduisant ainsi le besoin de tests supplémentaires sur d’autres animaux.
Raffinement
De nombreuses mesures sont prises pour assurer le confort et le bien-être des animaux tout au long du projet : - Conditions d'hébergement optimales : les souris sont hébergées dans des environnements à conditions sanitaires strictement contrôlées (absence de pathogènes), en petits groupes de 5 animaux maximum par cage. Elles disposent d'une litière douce et d'éléments d'enrichissement favorisant leurs comportements naturels (abris, matériaux pour nicher, zones d'enfouissement). - Soins adaptés aux animaux malades : pour les souris développant des symptômes (comme le diabète ou la maladie cœliaque), un protocole de soins spécifique est mis en place dès les premiers signes : changement de litière trois fois par semaine, surveillance renforcée de la consommation d'eau, et apport de compléments nutritifs (gels hydratants et énergétiques). - Manipulation douce : les soigneurs utilisent des techniques de manipulation adaptées (tunnels, préhension dans le creux de la main) pour réduire le stress des animaux lors des interventions. - Surveillance continue 24h/24 : les animaux peuvent être hébergés dans des cages connectées qui détectent automatiquement toute anomalie de comportement (inactivité, agitation, litière humide), permettant une intervention vétérinaire rapide. - Grille de score et les points limites spécifiques à chaque modèle sont appliqués : un système d'évaluation régulière de l'état de santé des animaux est utilisé. Il permet de définir des seuils d'intervention clairs pour agir de manière anticipée et éviter toute souffrance inutile. - Mesures spécifiques pour les souris immunodéficientes : ces animaux, plus vulnérables aux infections, sont hébergés dans des équipements ventilés et manipulés sous hotte de protection.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix en pharmacologie. Elles partagent une grande partie de leur génome avec les humains, permettant de modéliser les maladies humaines et d'étudier les effets des médicaments. Leur petite taille et leur cycle de reproduction rapide facilitent les études à long terme. Les souris, étant des mammifères, ont des systèmes biologiques comparables à ceux des humains, rendant les résultats plus pertinents. Les souris adultes (à partir de 8 semaines d’âge) sont utilisées dans ce projet pour mimer la pathologie chez les patients adultes car l’immunité varie fortement en fonction de l’âge. De plus le système immunitaire est complètement mature à partir de 6 semaines d’âge chez la souris.
Signatures physiopathologiques des réseaux épileptogènes dans les hétérotopies corticales
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 589
Électroporées in utero après ouverture de l'abdomen de leur mère, opérées à la naissance ou à l'âge adulte par craniotomie pour recevoir électrodes ou canules, 779 souris et 589 rats vont être utilisés, dont 184 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils développent des crises d'épilepsie spontanées ou provoquées par des injections répétées d'un agent convulsivant ou par un séjour de vingt minutes dans une enceinte chauffée, avec secousses musculaires, mâchonnements et hypersalivation. Leur activité cérébrale est enregistrée trois jours par mois, pendant un à six mois selon l'espèce. Tous sont tués pour prélever le tissu cérébral, les crises provoquées qui ne cessent pas d'elles-mêmes après cinq minutes étant stoppées par injection d'une benzodiazépine.
Objectifs
Les malformations du cortex cérébral sont à l'origine d'épilepsies pharmaco-résistantes chez l’enfant et l’adolescent. L'étude des mécanismes conduisant à ces épilepsies est un défi, car les malformations corticales sont généralement diagnostiquées seulement après les premières crises. En outre, il est impossible d'accéder directement aux changements qui se produisent dans le cerveau des patients et conduisent à l'émergence et à la progression de l'épilepsie. C’est pourquoi les organismes modèles sont essentiels pour mieux comprendre cette maladie et de son évolution, et pour développer de meilleurs traitements. Dans ce projet, nous utiliserons des enregistrements électrophysiologiques pour étudier l'activité électrique du cerveau, des analyses du transcriptome pour mesurer l'expression des gènes, ainsi que des analyses histologiques et anatomiques. Cette approche combinée, multimodale, sera appliquée chez plusieurs modèles rongeurs reproduisant des malformations corticales similaires à celles rencontrées chez l’humain, et responsables de crises d’épilepsie. Cette étude nous aidera à mieux comprendre l’évolution pathologique de l'activité cérébrale, en la reliant aux régions cérébrales impliquées et aux changements dans l'expression des gènes, à des étapes cruciales de cette évolution : avant que les crises n’apparaissent, au moment des premières crises et lorsque la maladie est établie. Notre objectif à long terme est d’identifier de nouveaux marqueurs prédictifs de la progression de l’épilepsie, ainsi que des candidats potentiels pour des thérapies ciblées visant à en infléchir l’évolution.
Bénéfices attendus
Notre objectif à long terme est de mieux comprendre les réseaux responsables des crises dans les hétérotopies de la matière grise (des malformations cérébrales responsables d'épilepsie), d’identifier de nouveaux marqueurs prédictifs de la progression de l’épilepsie, ainsi que des gènes candidats ou mécanismes potentiels pour des thérapies ciblées visant à en infléchir l’évolution. Le volet expérimental présenté ici fait partie d’un projet collaboratif au périmètre plus vaste impliquant également des études cliniques menées chez des patients, permettant ainsi un dialogue fructueux entre recherche clinique et préclinique.
Procédures
Les animaux seront soumis à interventions chirurgicales réalisées sous anesthésie/analgésie : 1) pour les femelles gestantes, laparotomie afin d’exposer les cornes utérines et procéder à la transfection par électroporation (entre 30 min et 1h) ; 2) pour les jeunes adultes et les adultes, incision de la peau et implantation des émetteurs de télémétrie entre peau et muscle, incision du scalp et craniotomie pour implantation des électrodes (2h) ; 3) pour les nouveau-nés et juvéniles, incision du scalp et craniotomie pour mise en place de canules pour délivrer des vecteurs viraux (15 à 25 min). Ces interventions sont uniques et sont associés à des soins pré-, per- et post-opératoires. Les animaux seront également soumis à des protocoles d’induction de crises d’épilepsie par des moyens pharmacologiques (injections répétées toutes les 10 min de doses sous-convulsives d’un agent convulsivant, maximum 6 doses et 1h), ou par l’hyperthermie (placement dans une enceinte chauffée pendant 20 min maximum). Lorsque ces crises induites ne cessent pas spontanément après 5 min, elles sont stoppées par injection d’une benzodiazépine. Les animaux seront également soumis à des enregistrements continus et à long terme de l’activité cérébrale réalisés sous monitoring vidéo, sur des périodes de 1-3 mois pour les souris et 4-6 mois pour les rats. Ces enregistrements sont réalisés dans la cage et l’environnement de stabulation, sans contrainte (émetteurs sans fil pouvant être allumés/éteints sans contention grâce à des transpondeurs magnétiques). Ces périodes d’enregistrement durent 3 jours par mois (4-5 sessions de 3 jours sur une période de 6 mois chez le rat ; 3 sessions de 3 jours sur une période de 3 mois chez la souris).
Impact sur les animaux
Les animaux vont subir les nuisances associées aux interventions chirurgicales (laparotomie pour les femelles gestantes et l’implantation des émetteurs de télémétrie, incision du scalp et craniotomie pour implantation des électrodes et des canules), ainsi qu’à l’inconfort associé à la récupération post-chirurgie. Ces nuisances seront contrôlées par l’anesthésie et l’analgésie, ainsi que par les soins pré-, per- et post-opératoires. Les animaux vont subir des crises d’épilepsie spontanées ou induites par des moyens pharmacologiques ou l’hyperthermie. Les crises d’épilepsie spontanées du modèle rat présentant des malformations bilatérales sont des crises « absence » associées à un arrêt comportemental mais sans convulsion ni perte de conscience ni de contrôle postural. Même si elles sont très fréquentes, elles n’entrainent aucun désagrément majeur. Lorsqu’elles sont induites par des conditions favorisant leur survenue (pharmacologie, hyperthermie), les crises sont d’abord associées à des secousses myocloniques des membres et du corps, des mâchonnements, de l’hypersalivation. La phase ultime de la crise est convulsive, tonico-clonique et généralisée. Elle est associée à une perte de conscience brève et transitoire. Si les crises d'épilepsie n'entraînent pas de douleurs physiques, des blessures peuvent néanmoins survenir, liées à des chocs possibles contre les parois de l'enceinte d’observation lors des secousses myocloniques ou des convulsions. Ces blessures, très légères (ex saignements du museau suite à un choc), sont difficiles à prévenir (les parois de la cage ne peuvent pas être capitonnées afin de permettre l’observation) et ne surviennent que très rarement. De plus, les manifestations épileptiques sont peu marquées du fait de l'immaturité des animaux aux stades de développement testés (étude limitée aux stades juvéniles). La récupération post-crise fait l’objet d’un suivi attentif. Si un état de mal épileptique survient et se prolonge plus de 5 minutes, il est stoppé par injection d’une benzodiazépine. La mort de l’animal peut survenir dans de rares cas.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèvement du tissu cérébral en vue d’analyses histologiques et anatomiques. Ces analyses sont destinées à confirmer la présence de malformations corticales et à mesurer leur position et étendue, ceci, notamment, afin de réaliser des corrélations anatomo-fonctionnelles. Ces analyses sont également destinées à mesurer l’étendue des régions cérébrales concernées par l’expression des protéines transduites par les vecteurs viraux ou confirmer le site d’implantation des canules ou des électrodes. Enfin, la mise à mort est nécessaire afin d’explanter, le cas échéant, les dispositifs expérimentaux utilisés pour les explorations fonctionnelles (implants de télémétrie, électrodes).
Remplacement
Une part importante des expérimentations est réalisée in vitro (principe de remplacement), sur tranches de tissu cérébral maintenue en survie artificielle lors d’enregistrements électrophysiologiques, ou pour des études transcriptomiques et anatomiques réalisées après extraction de tissu et préparation de spécimens histologiques. Les explorations fonctionnelles menées in vivo sont limitées aux explorations ne pouvant être effectuées que chez l’animal entier. C'est le cas des explorations liées aux crises d'épilepsie, qui nécessitent pour se manifester de préserver le contexte in vivo, permettant d'évaluer modifications comportementales liées à la crise, en plus de l'activité électro-clinique globale.
Réduction
Ce projet combine des approches multiples (moléculaires, anatomiques et fonctionnelles, in vivo et ex vivo) menées chez 4 organismes modèles (et des témoins) appartenant à 2 espèces de rongeurs au sein d’une même équipe de recherche (3 chercheurs, 1 post-doctorant, 1 doctorant, 2 ingénieurs), permettant une utilisation au plus juste des effectifs d’animaux soumis à expérimentation. Les estimations d'effectif sont faites en utilisant un outil d'estimation des effectifs basé sur le calcul de puissance et en tenant compte du taux de succès des expérimentations.
Raffinement
Les explorations fonctionnelles menées in vivo sont limitées aux explorations ne pouvant être effectuées que chez l’animal entier : il s’agit de l’enregistrement de l’activité cérébrale par électro-encéphalographie, pratiquée dans des conditions très semblables aux explorations effectuées chez les patients avec épilepsie (principe de raffinement). Ces enregistrements sont effectués par télémétrie, grâce à des transmetteurs télémétriques permettant des enregistrements sans contrainte ("sans fil"). Les transmetteurs utilisés permettent, en plus du suivi de l'activité électrique cérébrale, de suivre la température corporelle, l'activité motrice et le rythme cardiaque, ce qui garantit une surveillance continue des indicateurs cliniques. Enfin, une partie des animaux explorés fait l'objet d'un suivi vidéo continu pour surveiller les indicateurs comportementaux associés aux crises d'épilepsie.
Choix des espèces
Le rat est adapté aux études électrophysiologiques et comportementales, mais il n’existe que peu de rats génétiquement altérés. La transfection par électroporation (voir procédures) permet d’inactiver l’expression corticale de gènes d'intérêt de manière focale et de créer un cortex mosaïque au sein duquel une population altérée se développe dans un environnement sauvage. Il est ainsi possible de créer des modèles avec des hétérotopies sous-corticales semblables à celles des patients, comme des hétérotopies en bande ou des hétérotopies nodulaires. La souris est adaptée aux études électrophysiologiques et comportementales, et de nombreuses lignées génétiquement altérées sont disponibles, permettant l'étude des conséquences de l'invalidation d'un gène, dans un tissu ou un organe spécifique. Ici, nous étudierons 2 modèles d'hétérotopies induites par l'inactivation conditionnelle et restreinte au télencéphale dorsal de 2 gènes, par croisement avec une lignée Cre. Les 2 modèles présentent des hétérotopies sous-corticales et péri-ventriculaires semblables à celles des patients.