Recherche appliquée

382 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées, jusqu'à 33 injections intrapéritonéales et plusieurs prélèvements de sang, une infection par le cytomégalovirus murin et un traitement anti-rejet pouvant provoquer une toxicité rénale, pour étudier la réponse immunitaire au virus dans un contexte de greffe. Le porteur indique que l'infection peut causer perte de poids, prostration, hépatite ou colite chez les souris sous traitement anti-rejet. Il affirme que ce projet "ne peut être mené sans" animaux, la réponse immunitaire ne pouvant selon lui se reproduire in vitro.

Objectifs

Suite à une transplantation d'organe, les patients sont à risque de faire un rejet de l’organe transplanté. Pour prévenir le rejet, ils doivent prendre un traitement anti-rejet pendant toute la durée de leur transplantation. Ce traitement affaiblit l’ensemble de leur système immunitaire, les exposant à faire des infections plus nombreuses et plus graves. L’infection virale la plus fréquente après une transplantation est l’infection au cytomégalovirus. Le cytomégalovirus est un virus très commun dans la population générale. Lorsque l’on s’infecte pour la première fois avec ce virus quand on est en bonne santé, on a peu ou pas de symptômes car une réponse immunitaire anti-virale efficace se développe rapidement pour limiter la multiplication du virus. Le virus devient alors dormant (c’est-à-dire à l’état de latence) pendant toute notre vie dans différents organes comme les reins, le foie, le cœur, les poumons. Quand un patient n’ayant jamais rencontré le cytomégalovirus est transplanté avec un organe d’un donneur chez qui le virus est présent, le patient n’est pas toujours capable de monter une réponse immunitaire efficace contre le virus du fait des traitements anti-rejet. L’infection au cytomégalovirus peut alors conduire à des complications graves et peut avoir des répercussions sur le fonctionnement et la survie du greffon. L’objectif de ce projet est d’étudier la réponse immunitaire dirigée contre le cytomégalovirus dans un contexte similaire à la transplantation. Nous nous interesserons en particulier à l’impact des différents traitements anti-rejet sur cette réponse ainsi que des différences génétiques entre donneur et receveur. Pour atteindre ces objectifs, il est prévu de développer un modèle dans lequel des cellules provenant d’organes de souris "donneuses" infectées de manière latente par le cytomégalovirus murin seront injectées à des souris "receveuses", traitées ou non par un traitement anti-rejet et n’ayant jamais été en contact avec le virus. Nous utiliserons des souris donneuses génétiquement différentes des souris receveuses afin de mimer au mieux ce qui se passe après une transplantation d’organe lorsque le receveur reçoit un organe infecté par le cytomégalovirus provenant d’un donneur génétiquement différent. La réactivation et la dissémination du virus seront étudiées dans les différents organes de la souris receveuse. Nous monitorerons aussi la réponse immunitaire dirigée contre le cytomégalovirus dans ce contexte particulier.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre comment le cytomégalovirus est transmis au receveur lors d’une transplantation d’organes et le rôle des différents acteurs immunitaires et leur importance respective dans la résolution de l’infection à cytomégalovirus chez les patients transplantés. Ces données nous aideront à savoir comment moduler cette réponse afin de la rendre efficace sans surrisque de rejet. Nous pourrions ainsi limiter la morbi-mortalité du cytomégalovirus et ainsi certainement prolonger la durée de vie des greffons.

Procédures

Sur les 382 animaux maximum prévus dans ce projet : - 46 animaux au maximum seront soumis à 1 seule injection intrapéritonéale sur animal virgile. - 129 animaux au maximum seront sourmis à 1 injection intrapéritonéale sur animal vigile en début de procédure, et 1 prélèvement sanguin total sous anesthésie générale profonde (suite à une injection intrapéritonéale d'anesthésiant) en fin de procédure suivie d’une mise à mort. - 27 animaux seront soumis à 1 injection intraveineuse sous anesthésie générale gazeuse, des prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie locale (soit 4 prélèvements sur une durée de 28 jours pour 1/3 de ces animaux, ou 8 prélèvements au total sur 60 jours pour 2/3 d'entre eux), et enfin 1 prélèvement sanguin total sous anesthésie générale profonde (suite à une injection intrapéritonéale d'anesthésiant) en fin de procédure suivie d’une mise à mort. - 180 animaux au maximum seront soumis à 1 injection intraveineuse sous anesthésie générale gazeuse, des injections intrapéritonéales répétées tous les 2 jours sur animal vigile (soit au maximum 33 injections intrapéritonéales sur une durée de 67 jours maximum), des prélèvements sanguins hebdomadaires effectués sous anesthésie locale (soit jusqu'à 8 prélèvements sanguins maximum sur une durée de 60 jours maximum), puis enfin 1 prélèvement sanguin total sous anesthésie générale profonde (suite à une injection intrapéritonéale d'anesthésiant) en fin de procédure suivie d’une mise à mort. Les injections intrapéritonéales ou intraveineuses durent moins d’1 minute, un prélèvement de l’ordre de 30 secondes (contention comprise). Les anesthésies durent environ 1 heure.

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales, intraveineuses, et les prélèvements sanguins répétés sont susceptibles de générer une nuisance, une douleur légère lors de l'injection/prélèvement, ainsi que de générer du stress chez l'animal. L’un des traitements anti-rejet que nous utiliserons peut engendrer une toxicité rénale chez les patients ; chez la souris, une toxicité rénale est généralement associée à une perte de poids. Ce traitement durera 2 mois au maximum. L'infection au cytomégalovirus, aux doses utilisées ici, n'engendre pas de symptômes chez les animaux immunocompétents (c'est-à-dire non traités avec les traitements anti-rejet). Néanmoins, pour les souris traitées sous traitement anti-rejet, l'infection peut causer l'apparition de signes généraux telles qu'une perte de poids ou une prostration, ou encore une hépatite (inflammation du foie non douloureuse) ou une colite (associée à des diarrhées). Cette infection au cytomégalovirus durera 2 mois maximum.

Devenir

Les souris seront mises à mort avec une méthode réglementaire en fin de procédure afin de récupérer différents organes (poumons, foie, coeur, reins, organes lymphoïdes et glandes salivaires). La mise à mort des animaux est donc nécessaire pour toutes les analyses biologiques et biochimiques. Toutes les souris ayant atteint un point limite avant la fin de la procédure seront également mises à mort avec une méthode réglementaire.

Remplacement

Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires qui aboutissent à la réponse immunitaire dirigée contre le cytomégalovirus ne peuvent avoir lieu qu’au sein d’un organisme vivant complet, ce qui est impossible à reproduire in vitro. Dans certains cas, la génération du stock de virus pourrait être remplacée par amplification sur lignées de cellules in vitro. Cependant, ceci a pour effet de diminuer la virulence du virus, contrairement au virus amplifié in vivo et isolé à partir des glandes salivaires. Etant donné que, dans notre cas, nous souhaitons utiliser une souche de virus non modifée et peu virulente afin d'étudier la réponse physiologique de certaines cellules immunitaires en particulier (ce qui n'est pas possible avec les autres souches de virus modifiée plus virulentes) et que ce virus doit être suffisamment virulent pour infecter des hôtes immuno-compétent et obtenir une infection latente (virus en état de dormance), une amplification initiale du virus in vivo (au niveau des glandes salivaires de la souris) est donc une étape nécessaire et non remplaçable par une amplification in vitro.

Réduction

Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe pour que les résultats soient significatifs. Les procédures dites « pilotes » permettront d’établir les conditions/protocoles optimaux pour les procédures suivantes, afin de réduire également le nombre de groupe. Pour certaines expériences, les groupes contrôles seront réduits à 3 animaux alors que les groupes expérimentaux seront au nombre de 5.Pour une des expérences qui a pour but de vérifier la possibilité de transmettre l'infection au cytomégalovirus via des cellules isolées d'un organe infecté de manière latente, nous avons choisi de réduire autant que possible le nombre d'animaux (n=3 pour tous les groupes, contrôles et expérimentaux), de limiter le nombre de groupes contrôles et de ne réaliser qu'une seule fois cette procédure (pas de duplicat prévu pour cette procédure). Pour les autres expériences, nous prévoyons des duplicats expérimentaux qui seront réalisés si besoin pour re-générer un nouveau stock de virus si ce dernier se retrouve insuffisant pour refaire certaines expériences, pour approfondir certaines analyses par des techniques plus poussées, ou pour valider la reproductibilité des résultats.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances et douleurs liées aux injections intrapéritonéales et aux prélèvements sanguins réguliers, nous alternerons régulièrement des sites d’injection intrapéritonéale et les sites de prélèvement (voie rétro-orbitale en alternant les deux yeux et voie submandibulaire). Un analgésique local sera utilisé pour les prélèvements sanguins au niveau rétro-orbital pour limiter la douleur. De même, une anesthésie générale sera réalisée avant l’injection intraveineuse (anesthésie gazeuse) et avant la mise à mort des souris (anesthésie gazeuse ou profonde par injection intrapéritonéale d'anesthésiants). L'infection au cytomégalivirus des animaux traités sous traitement anti-rejet étant susceptible de causer des symptômes spécifiques comme une inflammation du foie ou du colon, un monitoring spécifique sera réalisé afin de doser des enzymes du foie de façon habdomadaire, et nous surveillerons la survenue de diarrhées. Le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole avec un suivi adapté en termes de fréquence et de détermination des points limites (poids, comportement, aspect général). Les animaux seront pesés une fois par semaine et cette fréquence sera augmentée à 2 fois par semaine en cas de perte de poids supérieure à 10%. Des points limites ont été définis pour les différentes procédures afin d'intervenir en cas de nécessité afin de limiter la souffrance de l'animal. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement.

Choix des espèces

Du fait de sa similarité avec l’Homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire anti-virale dans le contexte allogénique. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées afin qu’elles aient un système immunitaire mature capable de répondre à l’infection.

2 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur puis des injections locales de vecteurs lentiviraux et des prélèvements de sang par ponction rétro-mandibulaire, pour modifier le microenvironnement tumoral au profit d'une réponse anti-tumorale. Le porteur décrit comme effets attendus des lésions cutanées, une ulcération et des troubles du comportement liés à la croissance de la tumeur, et fixe un point limite à une taille de tumeur jugée trop gênante. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèle non-animal" reproduisant la complexité du microenvironnement tumoral et présente la souris comme un "modèle de prédilection".

Objectifs

Le concept du projet est de modifier le micro-environnement tumoral afin de favoriser une réponse cellulaire anti-tumorale en se basant sur une injection locale de vecteurs lentiviraux exprimant une ou plusieurs protéines modulant le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Le laboratoire se concentre sur le développement de vaccins anti-tumoraux contre des antigènes viraux oncogéniques (issus du papillomavirus) ou des néo-antigènes (prostate, colon, pancréas). L’ensemble de ces cancers développent des tumeurs solides chez l’homme avec un micro-environnement défavorable à l’entrée et la fonctionnalité des cellules T effectrices générées par vaccination thérapeutique. La stratégie envisagée permettra un reconditionnement du foyer tumoral vers un environnement favorable à l’action de la réponse cellulaire induite. Si cette stratégie se révèle efficace chez l’animal, il sera possible d’envisager son utilisation pour induire un traitement des foyers primaires chez l’homme en parallèle à d’autres traitements immunothérapeutiques.

Procédures

Ce projet comprend les 4 expériences suivantes : 1ère expérience : Les animaux seront soumis à 1 injection en sous cutanée sous anesthésie gazeuse (5min), 1 injection en intra-tumoral sous anesthésie gazeuse (5min) ou 1 injection en intraveineux sur animal vigile (5min) et 3 prélèvements de sang par ponction rétro mandibulaire espacés de 7 jours sur animal vigile (inférieur à 1min). 2ème expérience : Les animaux seront soumis à 1 injection en sous cutanée sous anesthésie gazeuse (5min), 1 injection en intra-tumoral sous anesthésie gazeuse (5min). 3ème expérience : Les animaux seront soumis à 1 injection en sous cutanée sous anesthésie gazeuse (5min), 1 injection en intra-tumoral sous anesthésie gazeuse (5min), 1 injection en intramusculaire sur animal vigile (5min) et 3 prélèvements de sang par ponction rétro mandibulaire espacés de 7 jours sur animal vigile. 4ème expérience : Les animaux seront soumis à 1 injection en sous cutanée sous anesthésie gazeuse (5min), 1 injection en intra-tumoral sous anesthésie gazeuse (5min), 1 injection en intraveineux sous anesthésie gazeuse (5min) et 3 prélèvements de sang par ponction rétro mandibulaire espacés de 7 jours sur animal vigile (inférieur à 1min).

Impact sur les animaux

Notre stratégie se base sur l’utilisation de vecteurs lentiviraux pour exprimer modérément et de manière stable des protéines pro-inflammatoires en local. En principe, l’expression de ces protéines devrait se cantonner au site d’injection mais une possible diffusion en systémique est envisageable et sera monitorée par des prises de sang régulières et une observation visuelle des animaux tous les 3-4 jours. Au niveau de la croissance tumorale, les modèles sont largement décrits et les effets adverses de la croissance sont connus et seront monitorés : lésions cutanées, ulcération, capacité au déplacement des animaux, modification du comportement (isolation, tremblement, prostration, absence de toilettage).

Devenir

Pour toutes les expériences l’issue est identique : Le développement des tumeurs étant irréversible, les animaux seront mis à mort dans toutes les expérimentations selon les points limites établis. Si les animaux atteignent une régression totale de la tumeur, les animaux seront mis à mort au bout de 90 jours maximum après la fin du traitement car ils ne peuvent pas être réutilisé pour d’autres expérimentations. La stimulation du système immunitaire induite par l’implantation de la tumeur peut induire des biais importants pour toutes autres études. Les animaux d’élevage à fin d’expérimentation ne peuvent pas être adoptés.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de modèles expérimentaux non-animal permettant de mimer efficacement la complexité du micro-environnement tumoral. La souris est un modèle de prédilection pour ce type d’étude par rapport aux autres animaux de par sa facilité d’élevage, de l’existence d’outils permettant une analyse en détail du système immunitaire et des corrélats pouvant être réalisées avec les tumeurs chez l’homme. Un maximum d’étapes de validation de l’efficacité des produits développés dans le laboratoire seront effectués in vitro sur des lignées cellulaires ou des cellules primaires avant injection chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience est déterminé en prenant en compte que le développement d’une tumeur et son interaction avec le système immunitaire comporte une large variabilité inter-individu, comme chez l’homme. En choisissant des animaux de même sexe et âge, il est possible de réduire au maximum cette variabilité. En s’appuyant sur des résultats antérieurs obtenu par notre groupe et une approche statistique, il a été possible d’anticiper le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables et répétables sur les différents paramètres de l’étude. Le projet implique l’évaluation de plusieurs protéines immuno-régulatrices capable d’influencer le micro-environnement. La sélection rapide des meilleurs candidats dans un premier temps permettra de poursuivre leur caractérisation avec un minimum de groupes et donc d’animaux.

Raffinement

La croissance tumorale peut avoir un effet néfaste sur la santé de l’animal. Le site d’injection (flanc droit) a été choisi pour avoir un impact minimal sur les capacités motrices de l’animal et assurer un suivi visuel simple et régulier (3-4 jours) du développement de la tumeur (mesure de la taille de la tumeur au pied à coulisse) et une prise de décision rapide en cas d’apparition d’un trouble chez l’animal. Ces troubles peuvent être physiques (difficulté de se déplacer, lésion sur le corps) ou comportementaux (isolation, prostration). Grace à une documentation importante des modèles tumoraux utilisés chez la souris, il est possible d’identifier, de prévenir une partie de ces troubles (lésions cutanées légères nécessitant un traitement aseptisant) ou d’intervenir (surveillance accrue ou mise à mort) si une aggravation (ulcération au site d’injection, modification du comportement) est observée et non réversible. La majorité des procédures implique une mise à mort précoce de l’animal afin d’étudier la tumeur et son système immunitaire mais, dans certaines procédures, les animaux sont conservés pendant une plus grande période impliquant le développement de tumeurs de tailles importantes. Le point limite a été défini à un stade de taille de tumeuroù la gêne chez l’animal devient trop importante.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris est proche du système immunitaire humain. Il existe de nombreux modèles de tumeurs qui peuvent être utilisés chez la souris pour tester nos stratégies anti-tumorales. De plus, des études précédentes montrent que les vecteurs lentiviraux sont immunogènes chez la souris et de nombreux outils sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire. Les expériences seront effectuées sur des femelles car celles-ci présentent un phénomène de dominance moins marqué que les mâles. Chaque expérience n’impliquera que des individus d’un même sexe, ce qui permettra de s’affranchir de la variabilité inter-sexe.. Les modèles tumoraux choisis n’étant pas spécifiques d’un sexe en particulier (cancers du colon, du foie et de la prostate). Il a été jugé que la possible variabilité dans le développement de la réponse immunitaire antitumorale liée au sexe n’aura pas d’effet sur la portée de l’étude.

1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par Staphylococcus aureus en intraveineuse, puis reçoivent des composés par voie intrapéritonéale chaque jour pendant cinq jours, avec des prélèvements de sang répétés à la queue sur animal vigile, pour tester de nouvelles molécules antibactériennes. Le porteur suit la survie des animaux et indique que les injections et prélèvements provoquent une douleur légère et un stress lié à la contention. Il justifie le recours à la souris par un nombre croissant de souches résistantes qui font de la recherche de nouvelles molécules un "véritable challenge thérapeutique".

Objectifs

Staphylococcus aureus est une bactérie à la fois commensale et pathogène opportuniste. C’est l’une des bactéries le plus souvent isolée à partir de prélèvements sanguins et d’infections invasives. L’incidence annuelle des bactériémies à Staphylococcus aureus (BSA) dans la population générale est évaluée à 28 pour 100 000 en Europe avec un taux de létalité variant de 22 à 26%, et la BSA est un facteur de mauvais pronostic au cours des pneumonies nosocomiales à Staphylococcus aureus. Également, les infections ostéoarticulaires à Staphylococcus aureus sont caractérisées par un risque élevé d’échec thérapeutique, de séquelles, et de morbidité à long terme. En effet, si un traitement antibiotique existe contre les infections à Staphylococcus aureus, on observe un nombre croissant de souches résistantes (10 à 40 % des cas de BSA) faisant de la recherche de nouvelles molécules actives contre ce type d’infection un véritable challenge thérapeutique. Dans le cadre d’une collaboration, nous avons identifié un certain nombre de nouveaux composés de synthèse ayant une forte activité antibactérienne contre différentes espèces de bactéries parmi lesquelles Staphylococcus aureus. Le but de ce projet est donc de confirmer les résultats obtenus in vitro sur des cultures de Staphylococcus aureus dans un modèle murin d’infection.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est la recherche de nouveaux traitements contre les infections à Staphylococcus aureus. S’il existe un traitement antibiotique de référence contre ce type d’infection, de plus en plus de souches résistantes apparaissent, et la découverte de nouveaux traitements constituerait une avancée significative dans le traitement de ces infections.

Procédures

Les souris seront infectées une fois par voie intraveineuse, puis traitées une fois par jour pendant 5 jours par voie intrapéritonéale avec les composés à tester. Des prises de sang seront effectuées sur les souris vigiles par prélèvement de 5 microlitres dans la veine caudale, 4h, et 1, 2, 3, 5, 7 et 10 jours post infection. Nous utiliserons des doses infectantes déterminées par ailleurs. Les animaux infectés seront traités avec les composés chimiques sélectionnés et la survie des animaux sera suivie au cours du temps et comparée avec des animaux traités avec une solution saline.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront au cours de ce projet une injection intraveineuse et des injections intra péritonéales répétées (une fois par jour pendant 5 jours) ainsi que plusieurs prises de sang par incision de la veine caudale. Tous ces actes entrainent une douleur légère et un stress dû à la contention.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux en fin de procédure. Ces animaux ayant été infectés, il n’est donc pas possible de les réutiliser, de les replacer ou de les adopter.

Remplacement

Les différents composés étudiés ont été testés in vitro sur des cultures de Staphylococcus aureus et les concentrations minimales inhibitrices déterminées pour chaque composé actif contre cette bactérie. Nous devons maintenant vérifier que cet effet observé sur des bactéries en culture se retrouve dans un modèle d’infection in vivo. Dans un souci de remplacement et de raffinement, des tests de toxicité sur cellules nous ont permis de déterminer les doses de chaque composé n'entrainant pas de mort cellulaire. Ce sont ces doses qui seront utilisées dans ce projet.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux le plus restreint possible nous permettant d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ce nombre sera calculé en tenant compte de nos résultats précédents.

Raffinement

En termes de raffinement, les animaux seront réceptionnés à l’animalerie une semaine avant le début des expériences pour adaptation et hébergés par groupe de 5 dans un environnement enrichi (igloo et baguette en papier). Les animaux seront surveillés quotidiennement et à chaque intervention par les responsables du projet. En cas d’apparition de signes de souffrance et/ou de lésions, la surveillance serait renforcée et les plaies désinfectées. En cas de persistance de l’un ou l’autre de ces signes au-delà de 24h, le ou les animaux concernés serai(en)t immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement décrit dans la littérature comme modèle de l'infection in vivo. De plus, les systèmes de défense contre les bactéries pathogènes sont très conservés de la Drosophile aux Mammifères, et en particulier, les réponses cellulaires de l'hôte vis-à-vis du pathogène sont très similaires entre la souris et l'homme. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 8 semaines pour être dans les mêmes conditions que nos travaux antérieurs.

228 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie provoquant un infarctus, des échographies cardiaques sous anesthésie et des injections intra-myocardiques et intraveineuses, avec des risques de perforation de l'oreillette et d'hémorragie oculaire, pour tester l'effet de lymphocytes T régulateurs sur une greffe de cellules cardiaques. Les retombées annoncées pour les personnes en insuffisance cardiaque restent renvoyées au conditionnel et à une étape préclinique. Sur le remplacement, le porteur affirme que les alternatives sont impossibles et conclut que le recours à la souris est "indispensable" pour étudier les interactions entre système immunitaire et cœur.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d’étudier des lymphocytes T régulateurs et des cellules progénitrices cardiaques dans le contexte de la transplantation de cellules cardiaques différenciées à partir de cellules souches embryonnaires humaines. Nous cherchons à comprendre comment les Lymphocytes T régulateurs influencent la réponse immunitaire et la récupération cardiaque. Cette recherche est essentielle pour évaluer les avantages potentiels de la thérapie régénérative cardiaque et constitue une étape pré-clinique avant d'envisager des applications cliniques chez l'homme pour traiter l'insuffisance cardiaque.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d'améliorer les traitements cardiaques en utilisant des cellules cardiaques progénitrices pour réparer le cœur endommagé. Pour y parvenir, nous explorons comment ces cellules peuvent devenir plus efficaces en renforçant la tolérance du système immunitaire. Pour ce faire, nous intégrons les cellules régulatrices T, qui jouent un rôle essentiel dans le maintien de l'équilibre du système immunitaire. Nous comparons les cellules régulatrices T humaines et murines afin de déterminer la source la plus efficace. En utilisant des méthodes visant à favoriser la tolérance immunitaire, notre objectif est de réduire les risques de rejet des cellules progénitrices cardiaques et d'améliorer leur survie. En résumé, nous espérons renforcer la réparation du cœur endommagé, notamment dans un modèle animal d'insuffisance cardiaque (chez des souris), en utilisant ces cellules spéciales de manière mieux acceptée par le corps, ce qui pourrait entraîner une amélioration de la fonction cardiaque.

Procédures

Les animaux participant à ce projet seront soumis à plusieurs types d'interventions. Tout d'abord, une intervention chirurgicale sera réalisée pour induire un infarctus cardiaque, avec une durée de 15 minutes par souris. De plus, des échographies cardiaques sous anesthésie générale seront effectuées pour évaluer la fonction cardiaque, avec une durée de 5 minutes par souris. Les animaux recevront des injections intra-myocardiques quatre semaines après l'induction de l'infarctus, avec une durée de 10 minutes par injection. Les injections seront administrées par voie intraveineuse le même jour que les injections intra-myocardiques et à nouveau trois jours plus tard, avec une durée de 30 secondes par souris pour chaque injection. Ces interventions visent à évaluer les effets sur la récupération cardiaque. L'ensemble du planning expérimental s'étend sur sept semaines, avec des évaluations et des injections à des moments spécifiques pour suivre de près les effets sur la récupération cardiaque. Toutes les procédures sont conçues pour minimiser les souffrances des animaux et garantir leur bien-être.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues causées à la chirurgie cardiaque peuvent se manifester par divers symptômes, notamment des douleurs postopératoires, un risque accru d'infection et une réduction de la fonction cardiaque. De même, l'insuffisance cardiaque peut entraîner des symptômes tels que la fatigue, la dyspnée et la faiblesse. Par ailleurs, les injections de cellules et les procédures d'anesthésie peuvent générer des douleurs et du stress chez les animaux. Il est important de noter que les injections intra-myocardiques comportent des risques, tels que la perforation de l'oreillette. De plus, l'injection rétro-orbitaire peut entraîner une hémorragie oculaire. Toutes ces contraintes seront attentivement surveillées, et des mesures seront mises en place pour minimiser la souffrance des animaux et garantir leur bien-être.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l'échographie post-traitement, sept semaines après la chirurgie d'induction de l'infarctus aigu du myocarde. Cette décision est prise afin de collecter et d'analyser plusieurs organes et le sang de chaque animal. Cette approche nous permettra d'obtenir des données plus complètes pour le objective de l'étude. La mise à mort à ce stade garantissant que les animaux ne souffrent pas inutilement et que toutes les données nécessaires sont recueillies pour atteindre nos objectifs de recherche.

Remplacement

Nous utilisons des souris dans notre projet pour des raisons essentielles qui rendent les alternatives impossibles. Notre modèle de l'infarctus du myocarde reproduit fidèlement les caractéristiques cliniques de cette pathologie cardiaque, ce qui est crucial pour des résultats pertinents applicables en clinique. En outre, l'observation à long terme des effets de l'insuffisance cardiaque nécessite une période prolongée, difficile à réaliser en laboratoire. Les modèles animaux permettent un suivi détaillé de la maladie et des interventions thérapeutiques sur une période prolongée. Enfin, pour étudier les interactions complexes entre différents systèmes biologiques, comme le système immunitaire et cardiovasculaire, nous avons besoin d'organismes vivants. Bien que nous effectuerons certaines étapes in vitro pour évaluer les effets immuno-inhibiteurs des lymphocytes T régulateurs, l'utilisation d'animaux est indispensable pour atteindre nos objectifs de recherche et développer de nouvelles approches thérapeutiques pour l'infarctus du myocarde.

Réduction

Nous avons calculé le nombre d'animaux requis en utilisant une méthode statistique (calcul de la taille de l'échantillon) pour assurer des résultats significatifs et fiables, en se basant sur des tests visant à démontrer l'efficacité de nos traitements. En prenant en compte aussi des facteurs tels que la mortalité après l'infarctus pouvant atteindre 30% et le risque de perte des animaux, y compris après les injections intra-myocardiques, nous avons abouti à la décision d'inclure 57 animaux par groupe. Cela nous donnera un total de 228 souris pour notre étude. De plus, pour optimiser l'utilisation des animaux et réduire le nombre nécessaire, nous prévoyons de collecter et d'analyser plusieurs organes de chaque animal. Cette approche nous permettra d'obtenir des données plus complètes tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés dans l'étude.

Raffinement

Pour limiter la douleur et la souffrance des animaux, l’ensemble des procédures sera effectué sous anesthésie générale et les souris seront surveillées via une grille d’évaluation, avec des points limites définis, afin de pouvoir prendre en charge précocement toute douleur ou souffrance selon les scores obtenus. Des antalgiques sont prévus et un niveau de souffrance trop élevé entraînerait la mise à mort anticipée de l'animal sous anesthésie profonde. Toutes ces attentions particulières portées au bien-être animal seront complétées par un hébergement adapté c’est-à-dire avec des congénères et avec des éléments d’enrichissement dans les cages (abris et substrats pour la construction de nids).

Choix des espèces

Pour évaluer le potentiel thérapeutique des lymphocytes T régulateurs et des cellules cardiaques progénitrices sur la fonction cardiaque, nous devons utiliser un modèle animal. Les souris, en raison de leur système cardiovasculaire similaire à celui de l'humain, sont couramment utilisées pour les tests précliniques évaluant l'effet des traitements. Notre projet constitue une étape essentielle avant toute application clinique chez l'homme de ces approches thérapeutiques. Les souris de la souche plus couramment utilisée C57BL/6J, sont introduits dans notre animalerie vers l'âge de 10 semaines et y restent pendant une semaine pour s'acclimater. Nous réalisons nos expérimentations sur des animaux âgés de 11 à 12 semaines. Cette période a été choisie car, à cet âge, le cœur des rongeurs est suffisamment développé pour supporter des procédures chirurgicales telles que la thoracotomie et l'induction de l'infarctus du myocarde. De plus, le cœur des rongeurs de cet âge présente des capacités limitées de régénération spontanée, contrairement à celui des très jeunes rongeurs qui peuvent régénérer complètement leur cœur.

201 souris vont être utilisées, dont 153 tuées à l'issue et 48 transférées vers d'autres projets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intracérébrale sous anesthésie, précédée pour certaines d'une biopsie de la queue, avec des risques chirurgicaux, d'hypothermie et de douleur. Le projet évalue une nanomolécule contre la neuro-inflammation d'une leucodystrophie infantile. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier l'effet sur un "cerveau entier" symptomatique.

Objectifs

La leucodystrophie métachromatique est une maladie neurodégénérative héréditaire conduisant à une perte de myéline (isolation de la gaine nerveuse) qui s’accompagne de signes cliniques très sévères cognitifs et moteurs chez le jeune enfant avec une dégradation très rapide dans les 6 mois suivant les premiers symptômes et un décès des patients dans les deux ans au maximum. De nos jours la majorité des patients atteints de leucodystrophie metachromatique sont diagnostiqués lorsque leurs symptômes sont déjà bien installés (patients symptomatiques). Les traitements actuels, présentent de bons résultats pour les enfants traités en présymptomatique mais restent inefficaces une fois les symptômes présents. L’enjeu pour cette maladie est donc de trouver des traitements pouvant agir sur les patients symptomatiques. Une composante particulière de la MLD est la neuro-inflammation que développe les patients et qui est présente aussi dans le modèle murin de la pathologie. Dans ce contexte, nous proposons de mener ce projet de recherche qui a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle thérapie pour le traitement de la neuro-inflammation chez les patients MLD symptomatiques. L’évaluation de l’efficacité de la thérapie sera conduite In vivo dans un modèle de souris préclinique de MLD déjà connu. Le bien-être animal sera surveillé tout au long du projet avec mise en place de critères précis d’interruption. Au total le projet utilisera 201 souris au maximum.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet est d’établir la preuve de concept de l’efficacité d’une nouvelle nanomolécule développé par un collaborateur sur la neuroinflammation dans un modèle symptomatique de la leucodystrophie métachromatique pour pouvoir par la suite proposer une mise à disposition chez les patients atteints de leucodystrophie métachromatique.

Procédures

Une partie des souriceaux produits pour nos lots expérimentaux auront un prélèvement de 2mm de queue pour génotypage, l'acte est réalisé une fois, sur animal vigile, et dure environ 1minute par animal. Les animaux des lots expérimentaux recevront une injection intracérébrale (durée 40min) sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux seront euthanasiés 5 ou 15jours après l’injection, par une methode reglementaire.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont : - une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour le génotypage - un risque cardio-respiratoire et hypothermique durant l’anesthésie - un risque chirurgical (anesthésie, hypothermie, déshydratation, hématome, douleur, non récupération de la vigilance,) lors de la procédure d’injection intracérébrale par stéréotaxie (craniotomie ciblée avec ouverture minime au site d’injection, d’un unique trou limité à un diamètre d’une aiguille 26G). - un stress de l'animal lors de la contention. La mutation génétique du modèle n’entraîne que des modifications motrices tardivement dans des conditions de tests comportementaux particuliers, l’animal paraitra avoir un comportement normal dans l’enceinte de sa cage.

Devenir

En fin de procédure tous les animaux injectés seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires en post-mortem pour recueillir nos données de d’efficacité. Les animaux d’élevage seront maintenus au cours du projet jusqu’à l’âge de 12 mois maximum. Les animaux supplementaires générés pourront etre transférés pour d'autres projets pour respecter le principe de réduction.

Remplacement

À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle In vitro pour étudier l’effet thérapeutique de ce composé sur un cerveau entier symptomatique. Ce composé a déjà été validé dans plusieurs pathologies par nos collaborateurs. Choisir la souris permet de collecter des données d’intérêt en terme d’efficacité dans ce modèle particulierement car il reproduit la neuroinflammation développée chez les patients.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe en maintenant des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre de 12 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 201 souris sera nécessaire pour l’évaluation de l’effet du composé dans ce projet. De façon général nos résultats seront analysés statistiquement avec un seuil de 5 pourcent.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, La procédure a été mise en oeuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne (points limites) et des soins adaptés. Les animaux seront hébergés par 3 à 5 souris par cage ventilée au maximum, si nécessaire en cas d’agressivité de mâles les animaux seront séparés ou isolés. Un animal peut se retrouver seul lorsqu'il est le dernier animal de la cage et qu'aucun regroupement n'est possible (sexe, âge) avec des maisonnettes rajoutées dans ce cas en plus de l’enrichissement classique. En terme de raffinement pour les croisements nous privilégions aussi les croisement entre homozygotes qui ne nécessitent pas de prélèvements pour le génotypage. Au moment de l'euthanasie, un sédatif sera administré à l'animal avant d'injecter le composé euthanasiant. La chirurgie réalisée au cours de ce projet sera faite sous anesthesie générale et locale, avec un protocole d’analgesie et un suivi quotidien post opératoire. . Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. La lignée que nous utilisons dans ce projet développe des modifications motrices après l’âge de 18 mois, ainsi afin d’éviter l’apparition de ces signes nous euthanasierons nos animaux avant l’âge de 16 mois.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’un modèle animal pour reproduire et étudier la leucodystrophie métachromatique (MLD) et surtout pour évaluer l’effet thérapeutique d’une nanomolécule. Le modèle de choix pour étudier la MLD est la souris car il s’agit de la seule espèce pour laquelle un modèle de MLD a été créé. Nous prévoyons de conduire notre étude sur un modèle murin déjà connu de MLD déficient. Ce modèle génétiquement modifié est très proche de ce que l’on retrouve chez les patients. Les souris seront utilisées entre 12 et 15 mois pour les traitements à un stade symptomatique.

648 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle de maladie neurodégénérative, elles reçoivent un candidat médicament pendant plusieurs mois, par une pompe posée sous la peau ou un régime spécifique, avec des prélèvements sanguins mensuels et des tests comportementaux imposant isolement et jeûne. Le projet cherche à définir un schéma de traitement transposable à l'humain. Le porteur qualifie les atteintes de "nuisances légères" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les traits comportementaux de la maladie.

Objectifs

Notre projet vise à développer une thérapie contre une maladie neurodégénérative liée à un défaut génétique bien identifié, et responsable de nombreux dérèglements physiologiques et moléculaires dans les neurones. En utilisant un système in vitro innovant, nous avons identifié qu’une molécule était capable de restaurer un des défauts moléculaires dans les neurones d’un modèle souris de la maladie. Cette étude a permis de démontrer que le traitement améliore les défauts moteurs et cognitifs de l’animal après 1 mois de traitement. Cette première étude nous a également permis de caractériser précisément le mécanisme d’action cellulaire et moléculaire du candidat médicament. Le projet, divisé en 2 procédures, a pour objectif d’identifier un schéma de traitement transposable à l’homme confirmant l’intérêt thérapeutique du candidat médicament.

Bénéfices attendus

Grâce à un système in vitro innovant, nous avons mis en évidence qu’une molécule était capable de restaurer un des défauts moléculaires dans les neurones de souris et de patients atteints par notre pathologie d’intérêt. Nous avons démontré avec des premiers résultats preuve de concept l’intérêt thérapeutique de la molécule dans un modèle souris mimant notre pathologie d’intérêt. Nous cherchons maintenant à définir les bénéfices d’un traitement long terme chez des animaux à différents stades d’avancement de la maladie, reflétant la situation chez les patients et permettant de définir le meilleur schéma de traitement à envisager dans des études cliniques. En parallèle, nous travaillons à la caractérisation du mode et du mécanisme d’action moléculaire associé au candidat médicament. Ces études sont fondamentales pour la construction d’une stratégie clinique cohérente puisqu’elles nous permettront de décider s’il est pertinent ou non d’initier le traitement avant le développement des symptômes chez les patients, mais aussi de définir une durée de traitement et une posologie (dose, nombre prise par jour) adaptées.

Procédures

Une partie des animaux seront traités pendant un mois grâce à un dispositif vétérinaire assurant une délivrance continue de la molécule sans douleur ni atteinte du bien-être animal. L’installation de ce dispositif nécessitera une chirurgie sous-cutanée de 5 minutes maximum par animal. L’autre partie sera traitée grâce à un régime à façon spécialement formulé correspondant au régime habituel des animaux dans lequel la molécule est intégrée. Toutes les souris seront traitées avec le régime à façon sur une durée maximale de 10 mois. Pendant toute la durée du traitement, un prélèvement mensuel de sang (5min/animal) sera effectué après le début du régime afin de vérifier que le médicament est bien passé dans le sang (entre 3 et 10 prélèvements au total en fonction des groupes). Enfin, des tests comportementaux (tests de 30 min max hormis pour 1 test réalisé sur 48h) destinés à étudier l’effet du traitement sur les comportements anxio-depressif et locomoteurs des animaux seront effectués.

Impact sur les animaux

Le modèle utilisé dans cette étude est un modèle largement utilisé dont le phénotype évoluera avec l’âge, occasionnant l’apparition de symptômes cognitifs et moteurs qui sont uniquement décelés à l’aide de tests comportementaux fins conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnement pas de perte d’autonomie, et pas de perte de poids excessive. Nous ne nous attendons donc pas à observer d’altérations significatives de la qualité de vie, ni de mort prématurée chez ces animaux dû au phénotype. Nous pouvons identifier 3 nuisances légères : 1/ une potentielle douleur de nature interventionnelle : induction potentielle d'une légère inflammation due à la mise en place d'une mini-pompe. 2/ une légère douleur due aux prélèvements sanguins mensuels. 3/ une gêne potentiellement attendue sur les animaux lors de l’expérimentation, à savoir l’induction d’un stress léger lors de certains tests comportementaux impliquant soit un isolement prolongé de 48h afin d’analyser l’activité et le métabolisme de l’animal, soit une mise à jeun de 24h afin d’analyser l’anxiété de l’animal.

Devenir

​​La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux en vue des études immunohistochimiques et biochimiques qui nous permettrons de comprendre les mécanismes du traitement.​

Remplacement

Nous avons précédemment démontré sur un modèle cellulaire in vitro que le candidat médicament permettait de restaurer les défauts de transports neuronaux, caractéristiques de la maladie neurodégénérative que nous étudions. Ces résultats nous ont permis de démontrer le potentiel thérapeutique de notre molécule. L’étape actuelle consiste donc à démontrer que ces restaurations du transport neuronal se traduisent en amélioration des symptômes de la maladie. Pour cela, nous devons obligatoirement passer par une étude animale car aucun modèle in vitro ne permet actuellement de mimer fidèlement les traits comportementaux de la maladie et de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Notre projet correspond ainsi à un travail de préclinique visant à mettre au point des études cliniques qui seront conduites chez les patients atteints de cette maladie.

Réduction

La procédure 2 sera réalisée uniquement si la procédure 1 est validée. Dans nos deux axes d’étude, nous prévoyons une analyse du comportement des animaux, suivi d’analyses post- mortem des cerveaux. Puisque nous avons observé que les résultats comportementaux pouvaient varier en fonction du sexe dans le modèle souris, tous les groupes seront composés de 50% d‘animaux mâles et 50% d’animaux femelles afin de pallier de potentielles disparités dans les résultats. Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’un test statistique d’estimation de la taille d’échantillon optimale grâce aux variances déterminées dans des études préliminaires de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. Pour chacun des axes, dans l’éventualité où aucune différence significative n’est observée entre mâles et femelles, les animaux des deux sexes seront regroupés au sein d’un même groupe de traitement lors de l‘analyse des données afin d’augmenter la puissance des tests statistiques. Dans notre étude visant à caractériser l’efficacité du traitement à long terme à différents stades d’évolution de la maladie, nous ne prévoyons pas de traiter avec notre composé les animaux sains. En effet, nous avons déjà testé précédemment l‘effet de notre composé sur un nombre réduit d’animaux sains et nous n‘avons observé aucune toxicité, et aucune altération du comportement. Cela permet donc d‘éliminer plusieurs conditions expérimentales, dans un principe de réduction du nombre total d‘animaux utilisés.

Raffinement

Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les cages seront équipées d’une litière stérile et d’un enrichissement permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. Tous deux seront changés toutes les semaines. Les cages seront équipées d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard ou contenant le traitement, changés également toutes les semaines. Le transport des animaux sera effectué en cages occultées avec enrichissement et des croquettes mouillées dans la cage. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. Lors de la pose de mini-pompes sous-cutanées, la chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et la prise en charge de la douleur est prévue pendant et après l’opération (administration d’analgésique et procédure sur tapis chauffant). Un supplément d'alimentation hypercalorique et hydratée fourni par l'animalerie sera ajouté lors du temps de récupération. Bien que la chirurgie soit peu invasive et très rapide (5 min), des points limites suffisamment précoces et adaptés à la procédure ainsi que des critères d'arrêt des souffrances sont mis en place. La formulation du régime à façon présente l’avantage majeur de ne pas avoir à manipuler les animaux pour les traiter limitant grandement le stress classiquement associé aux autres voies d’administration. L’état de santé des animaux sera surveillé pendant toute la durée de l’étude. Après la chirurgie, la surveillance sera renforcée dans les heures suivant le réveil et le poids des animaux sera évalué chaque jour durant une semaine pour s’assurer que les souris récupèrent bien de la chirurgie.

Choix des espèces

Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de notre pathologie d’intérêt. Pour cela, nous utilisons des souris issues de la transgénèse classique. Le modèle souris choisi permet de comprendre le rôle de la protéine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les maladies neurodégénératives se développent dans la majorité des cas à l’âge adulte chez l’Homme. Le candidat médicament que nous développons est donc destiné à des adultes raison pour laquelle nous réalisons notre étude sur des animaux à l’âge adulte. Les animaux seront utilisés à l’âge de 8 ou 12 mois car c’est à partir de 6 mois qu’ils commencent à développer des troubles moteurs et cognitifs observables en étude de comportement.