Recherche appliquée
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Etude du rôle de TBK1 dans les cellules microgliales sur la dégénérescence et la régénérescence des motoneurones dans des modèles murins de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
174 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. 114 reproduisent une sclérose latérale amyotrophique évoluant vers la paralysie et sont tuées aux stades symptomatique ou terminal, et 60 subissent une lésion chirurgicale du nerf sciatique suivie d'électromyographie sous anesthésie. Le porteur indique que le modèle de SLA est à "phénotype dommageable" et que la lésion du nerf provoque douleur et perte de mobilité, tout en pariant que la mutation étudiée n'aggravera pas ces atteintes. Il affirme qu'un modèle in vivo mammifère est "crucial" pour étudier les interactions entre motoneurones et cellules immunitaires.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui touche 7000 adultes en France, caractérisée par une atteinte des motoneurones et résultant par la paralysie et le décès des patients 2 à 5 ans après le diagnostic. Tandis que la plupart des cas de SLA sont sporadiques, certaines formes sont familiales. Les formes génétiques de SLA sont cruciales pour la recherche car elles permettent de modéliser la maladie. Cependant, la plupart des mutations dans les gènes impliqués dans la SLA induisent plutôt un gain-de-fonction-toxique inconnu - difficile à étudier. Recemment, des mutations dans un nouveau gène ont été impliquées dans la SLA. Les mutations dans ce gène induisent une perte de la protéine, un phénomène plus facilement étudiable. Ce gène est impliquée dans la dégradation des protéines et la réponse immunitaire. Comme il a déjà été montré que les cellules immunitaires étaient impliquées dans la SLA, nous étudions plus spécifiquement le rôle de ce gène dans les cellules immunitaires du cerveau. Nous cherchons à savoir si des cellules immunitaires déficientes en ce gène produisent une réponse altérées à un stress des neurones, et si elles améliore ou au contraire altèrent les problèmes moteurs associés au stress.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre le rôle de notre gène d'intêret, un gène dont la mutation peut causer la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), dans les cellules immunitaires du cerveau. Si nous montrons que la perte de ce gène dans ces cellules est toxique, cela contribuerait à expliquer pourquoi des mutations dans ce gène peut causer la SLA. Si nous montrons au contraire que ces cellules immunitaires sans ce gène sont bénéfiques pour les neurones, cela pourrait en faire une cible thérapeutique pour ralentir le cours de la maladie chez tous les patients atteints de SLA.
Procédures
** • 114 souris d'une première lignée transgénique d’intérêt etudiée, subiront uniquement un suivi par pesée et test de la mesure de la force musculaire (2 minutes par souris) une fois par semaine. • La totalité de ces 114 souris seront euthanasiés au stade symptomatique (à 5 mois) ou terminale (à 6 mois) pour prélèvement des organes. Deux méthodes d’euthanasie distinctes seront utilisées, nécessaire pour l’analyse des differents types d'échantillons. • 60 souris d'une deuxième lignée transgénique d’intérêt etudiée, subiront une chirurgie sous anesthésie pour léser le nerf sciatique, à 4 mois (jeune), ou à 12 mois (agées). Elles recevront une analgésie 2 fois par jour pendant les 3 jours suivant la chirurgie et les sutures seront désinfectées (5 min par souris). Tous les jours, on évaluera la paralysie de la patte par mesure de l’écartement entre les doigts de la patte (2 min par souris). En plus, au niveau fonctionnelle, la qualité de la réinnervation musculaire est evalué toutes les 3 semaines entre 6 et 18 semaines après lésion du nerf, par l'électromyographie, sous anesthésie (8 min par souris). Une analgésie sera faîte 30 min avant le début de l'électromyographie afin de prévenir toute gène dû aux piqures d'électrodes à leur réveil. • La totalité de ces 60 souris seront euthanasiés 1 semaine ou 5 mois après lésion du nerf, pour prélèvement des organes d'intéret.
Impact sur les animaux
** Modèle de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) : Le modèle souris transgénique de SLA est un modèle à phénotype dommageable. Cependant, nous nous attendons à ce que la délétion de notre gene d'intêret dans les cellules immunitaires du cerveau n’aggrave pas ce phénotype, au contraire, elle devrait plutôt améliorer le phénotype. Lésion du nerf sciatique chez la souris: Les souris subissant une lésion du nerf sciatique peuvent éprouver de la douleur dans les premiers jours. Il y aura aussi une diminution (transitoirement) de leur mobilité. Cependant, nous nous attendons à ce que la délétion de notre gene d'intêret dans les cellules immunitaires du cerveau n’aggrave pas ce phénotype, au contraire, elle devrait plutôt augmenter la vitesse de la régénérescence. Mesure de la réinnervation musculaire par l'électromyographie: L'application de l'électromyographie peut éprouver de la douleur au réveil des souris.
Devenir
** Tous les animaux dans les procédures sont utilisées à la fin de la procedures pour des analyses (histologique ou durée de la maladie) - et donc euthanasiées.
Remplacement
Avant de réaliser les expériences in vivo que nous proposons dans ce protocol, nous avons mené des études in vitro, pour tester si notre hypothèse est solide. Nous avons utilisé des cultures primaires de cellules microgliales (isolées de cerveaux de souris nouveau nées), avec une délétion de notre gène d'intêret, pour tester si elles répondent différemment que les cellules microgliales contrôles - à un stimulus inflammatoire. Nos résultats étant prometteurs, nous avons donc décidé de passer à des expériences plus complexes, in vivo. Comme notre question concerne les intéractions entre les motoneurones et les cellules immunitaires, un modèle in vivo est crucial. Des intérations aussi complexes seraient difficiles à modéliser en culture.
Réduction
Nous avons déterminé notre stratégie de croisement afin de produire le moins possible de génotypes non intéressants. Cependant, cette stratégie est nécessaire pour que tous les génotypes étudiés soient générés dans la même portée. Pour l'étude de l'effet sur les souris modèles de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), le modele de la maladie humaine avec phenotype dommageable, nous avons besoin de 20 souris par génotype. Il s’agit du nombre minimal de souris nécessaire pour évaluer un modificateur génétique dans les souris SLA - défini par des consignes internationales de la communauté de la recherche contre la SLA. Pour l'analyse des organes à deux differentes stades de la maladie, on a besoin 6 souris par génotype (nombre minimal de souris nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable de ce type de résultats). Le nombre d'animaux utilisés pour cette premiere partie est de 114. Pour l'étude de la lésion du nerf sciatique, nous utilisons une lignée transgénique avec modification de notre gène d'interet, mais sans phenotype dommageable. Nous aurons besoin de 5 souris/génotype pour s’assurer une analyse finale robuste (nombre minimal nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable de ce type de résultats). L'analyse doit être fait à 2 stades différentes: pendant la régénérescence, et après régénérescence complète, pour déterminer les effets sur la vitesse et l'éfficacité. Et à 2 âges differentes, jeune et agé, pour déterminer l'effet du vieillissement sur la capacite regenerative du nerf. Pour la suivie de la régénérescence complète du nerf, 2 méthodes complémentaires sont nécessaires: la première mesure le niveau de la régénérescence du nerf (chaque jour), la deuxième mesure le niveau de la ré-innervation musculaire (à 2 stades pendant régénérescence). Le nombre d'animaux utilisés pour cette deuxième partie est de 60. Le nombre TOTAL d'animaux utilisés : 174.
Raffinement
** Pour la stimulation environnementale (enrichissement), nous utilisons toujours des petites maisons en carton et des fibres en carton permettant de faire des nids dans chaque cage. Les femelles sont hébergées ensembles (au moins 2 par cage) et les mâles sont hébergés entre fratrie autant que possible mais peuvent être séparés en cas de bagarre. Pour les souris modèles de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), les souris montrant des signes de paralysie sont surveillées quotidiennement par un expérimentateur. Un mélange de poudre de nourriture et d'eau est proposé dans la cage aux souris ayant des difficultés à se déplacer afin d'éviter une deshydratation et une dénutrition. Un soin particulier est apporté aux yeux des souris partiellement paralysées qui peuvent être salis. Proche du stade terminal, les souris sont surveillées 1 à 2 fois par jour, tous les jours. Pour la lésion du nerf sciatique, nous allons léser un seul nerf sciatique pour éviter que la souris ne soit trop paralysée durant la première semaine après la chirurgie. Les souris subissant une lésion du nerf sciatique peuvent éprouver de la douleur dans les premiers jours mais qui sera bien pris en charge, pré- et post- opératoire par des analgésiques. Durant la première semaine après la chirurgie, nous ajoutons de la nourriture en poudre avec de l’eau directement dans la cage, car le membre opéré est partiellement paralysé. Les femelles sont hébergées entre 2 et 4 par cage, entre femelles ayant subi la chirurgie au même moment. Pour la mesure de la réinnervation musculaire par l'électromyographie, ce test peut éprouver potentiellement de la douleur au réveil des souris, mais qui sera pris en charge, pré-opératoire par des analgésiques. Pour les deux procédures, des points limites sont définis : les souris doivent impérativement être euthanasiées si elles les atteignent.
Choix des espèces
Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) : souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre motoneurones et cellules immunitaires dans un système nerveux central mammifère (pour l'étude, souris SLA), mais aussi dans un système nerveux périphérique à la jonction entre motoneurone et muscule de membres éloignés (pour l'etude, lésion du nerf sciatique). Par conséquent, poissons/mouches/vers ne sont pas de bon modèle pour répondre à nos questions. Nous avons une grande expérience avec les souris, et les deux modèles (SLA et lésion du nerf sciatique) sont mieux établis chez la souris que chez le rat; c’est pourquoi nous avons décidé d’utiliser les souris comme modèle pour ce projet. Dans un premier temps: l'étude de l'effet sur le phénotype des souris SLA et étude histologique du stade terminale. Les souris SLA atteignent le stade terminal vers 6 mois. Pour l'étude histologique du stade symptomatique avant le stade terminal, les souris sont utilisées at 5 mois (quand la perte de pois atteigne 10 pourcents). Dans un deuxieme temps: l'étude du nerf sciatique dans les souris avec modification du gène d'intêret : la chirurgie est faite au stade adulte/jeune à 4 mois, et au stade adulte/agée à 12 mois - suivi de 1 mois (pour étudier la régénérescence complète/efficacité) ou 1 semaine (pour étudier la vitesse de la régénérescence).
Evaluation en vue d’optimiser l’efficacité des beta-glucanes de levure administrés oralement sur la réponse immunitaire (mucosale et systémique) innée et l’efficacité vaccinale chez les juvéniles de bar commun
- Recherche appliquée
- Maladies animales
1 113 bars communs juvéniles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 032 dans des procédures classées sévères. Ils reçoivent des injections intrapéritonéales sous anesthésie et subissent une infection bactérienne expérimentale, y compris une recherche de dose létale, avant d'être tués pour analyses. Le porteur indique que l'infection provoque des symptômes cliniques suivis par une grille de score, les poissons atteignant le score maximal étant tués avant le stade létal. L'étude vise à tester des bêta-glucanes de levure censés renforcer l'immunité des bars d'élevage, présentés comme un moyen de limiter le recours aux antibiotiques.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont : - d’évaluer l’efficacité de β-glucans, extraits naturels de parois de levures, administrés par voie orale en complément à un aliment commercial, sur la protection immunitaire (mucosale et systémique) innée du bar commun Dicentrarchus labrax en élevage - d’évaluer la protection immunitaire croisée conférée contre d’autres infections bactériennes, chez cette même espèce préalablement vaccinée à l’aide d’ un vaccin commercial pour la vibriose.
Bénéfices attendus
Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont : - d’identifier des β-glucans, extraits naturels de parois de levures permettant de renforcer la résistance du bar commun en élevage contre des pathologies bactériennes émergentes - d’évaluer chez le bar commun préalablement vacciné contre la vibriose, la protection accrue que peut conférer ces β-glucans contre des pathologies bactériennes atypiques Ces données permettraient d’optimiser la protection immunitaire spécifique et non spécifique du bar commun en élevage contre les maladies bactériennes et de prévenir ou diminuer l’impact de ces pathologies sur les élevages. L’utilisation en dernier recours de produits à action antibactérienne en serait limitée, réduisant d’autant le risque d’apparition d’antibiorésistance
Procédures
Les interventions effectuées sur les poissons après anesthésie de ceux-ci sont soit une injection intra péritonéale, soit une euthanasie pour prélèvements et analyse post mortem. Avant toute injection intra péritonéale, les poissons sont anesthésiés. Le temps de manipulation des poissons lors d’une injection est de moins de 2 minutes par poisson entre sa capture et son retour dans l’aquarium. Les poissons euthanasiés le sont individuellement après anesthésie profonde dans une solution d’anesthésiant puis euthanasiés en moins de 30 secondes dans un bain concentré d’anesthésique. Les poissons prélevés pour analyses sont de plus décérébrés avant autopsie. Pour les prélèvements le temps de manipulation est de moins de 1 min et demi.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont : - le stress induit par les prises de sang effectuées sur animaux anesthésiés par ponction sanguine à l’aide d’une aiguille montée sur seringue - les injections intra-péritonéales effectuées sous anesthésie générale dans le cadre du challenge infectieux bactérien ou de la vaccination des poissons. - l’euthanasie de poissons pour analyses post mortem et prélèvements Les effets indésirables attendus correspondent aux changements comportementaux des animaux et aux symptômes cliniques qui seront induits lors de la recherche de la LD50 et du challenge infectieux et qui seront quantifiés selon la grille d’évaluation quantitative du point limite l’infection bactérienne sur les poissons. Les symptômes cliniques sont évalués afin de ne pas atteindre le stade léthal. Dès qu’un score de 3 sera atteint, les poissons seront euthanasiés afin de ne pas atteindre des effets létaux et se maintenir à des effets sub-létaux.
Devenir
Les poissons prélevés lors des deux points prévus d’échantillonnage pour analyses sont euthanasiés par sédation profonde préalable puis euthanasie dans une solution d’anesthésique. Ils sont ensuite soumis à observation post mortem et prélèvements pour analyses. Les poissons présents en fin de la période d’observation post challenge sont euthanasiés selon la même procédure, ne pouvant être ni réutilisés ni replacés pour des raisons sanitaires.
Remplacement
La finalité de cette expérimentation est d’évaluer l’effet d’une supplémentation alimentaire en β-glucans extraits de parois de levures sur la protection immunitaire spécifique et non spécifique d’un poisson d’élevage : le bar commun. Il est difficile chez cette espèce de doser les immunoglobulines protectrices suite à une vaccination et encore moins d’analyses sériques permettant d’évaluer un niveau de protection croisée. Cette étude ne peut être réalisée par analyses sériques ou autres méthodes d’analyses biologiques
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par aquarium dans les 8 groupes expérimentaux est réduit au minimum requis pour sécuriser l’interprétation statistique des résultats sur les différents objectifs visés. Chaque groupe est testé en triplicata (3 aquariums x 8 groupes) pour tenir compte d’un potentiel effet bassin et de garantir la validité des résultats notamment le taux de survie, lors du challenge bactérien.
Raffinement
L’aliment commercial est formulé pour couvrir les besoins nutritionnels du Bar au stade juvénile. Les β-glucans extraits de paroi de levures sont largement utilisés et reconnus pour leur innocuité. Les aquariums sont en circuit recirculé sur eau de mer artificielle. Chaque circuit comprend un système de filtration mécanique et biologique assurant le maintien d’une qualité d’eau optimum. Les paramètres de qualité d’eau sont mesurés quotidiennement et maintenus à l’optimum physiologique pour le bar. Une attention particulaire est portée à la prise alimentaire maintenue optimale pour éviter le développement de comportement agressifs ou de cannibalisme. La densité d’élevage prévue est assez basse pour éviter le développement de comportements territoriaux et agressifs.Les critères comportementaux des poissons (comportement de nage, agressivité) et les critères physiques (changement de morphologie, lésions externes) servant à définir quantitativement les points limites lors des différentes phases de l’essai sont observés 2 fois/jour et servent à définir un score de 1 à 3 pour évaluer les points critiques.Tout poisson atteignant un score de 3 est prélevé et euthanasié . Les poissons euthanasiés sont préalablement anesthésiés jusqu'à atteindre un stade d'anesthésie profonde, puis euthanasiés dans une solution surdosée d’ anesthésiant. Les injections intrapéritonéales sont réalisées par du personnel formé aux bonnes pratiques vétérinaires et sont effectuées après sédation profonde des poissons. La manipulation est effectuée poisson par poisson, rapidement en moins de 2min pour limiter le stress associé. Le challenge bactérien induit un état infectieux.Le comportement et l’état physique ainsi que les mortalités des animaux sont observés 2 fois par jour dans chaque aquarium.Si après l’évaluation quantitative du point limite, le score obtenu atteint 3, les animaux concernés sont prélevés et euthanasiés comme indiqué ci-dessus afin de ne pas atteindre un stade létal.Le 11éme jour du challenge, les animaux survivants sont euthanasiés après sédation profonde et euthanasie dans une solution d’anesthésique concentrée
Choix des espèces
Les pathologies bactériennes émergentes impactent de plus en plus la production aquacole méditerranéenne dont celle du bar, d’où le choix de cette espèce d’élevage. L’objectif de cet essai est d’évaluer l’effet d’une supplémentation de l’aliment avec différents β-glucans extraits de paroi de levures sur la résistance de poissons vaccinés et leur éventuelle protection croisée contre d’autres pathologies bactériennes. L’expérimentation sera réalisée sur du bar commun au stade juvénile, d’un poids initial de 10 gr en début d’essai et de 18-19 gr en fin d’essai. Ce stade de développement correspond au stade de vaccination de rappel des poissons par injection et au stade de développement du poisson le plus sensible aux pathologies bactériennes en élevage.
Thérapie optogénétique de la rétine et role des différents types cellulaires dans le traitement de l’information visuelle sur un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
4 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines rendues aveugles par un modèle de rétinite pigmentaire, elles reçoivent une injection intraoculaire d'un vecteur viral, subissent des examens répétés de l'œil sous anesthésie et une biopsie de la queue pour génotypage, avant prélèvement des yeux. Le porteur indique que l'injection peut provoquer de petites hémorragies oculaires et que l'anesthésie comporte un faible risque de défaillance cardio-respiratoire. Il affirme qu'il "n'existe pas de méthodes substitutives in vitro" et retient la souris pour la ressemblance de sa rétine avec celle de l'humain.
Objectifs
La rétinite pigmentaire (RP), forme la plus commune des dégénérescences rétiniennes congénitales, se développe en deux étapes successives. Au début de la maladie, les patients perdent uniquement leur capacité à voir en condition scotopique. Cette incapacité liée à la dégénérescence des photorécepteurs à bâtonnet, représente un handicap mineur puisque dans un environnement normal et bien éclairé, ces patients conservent leur vision, leur permettant une vie quasi normale. Cependant, la maladie progresse par la perte de fonction et la dégénérescence des photorécepteurs à cône. Cette perte secondaire des cônes qui entraîne une perte de la vision centrale et une quasi-cécité chez les patients atteints de RP. Trouver des stratégies pour redonner la vision à des personnes l’ayant perdu est un enjeu crucial afin de permettre aux personnes touchées de rester autonome. Notre stratégie consistera à exprimer des protéines photosensibles dans des cellules de rétines aveugles de manière à les rendre sensibles à la lumière. Afin de trouver la stratégie thérapeutique la plus efficace possible, il nous faut comprendre comment les différents neurones qui forment le réseau rétinien travaillent ensemble pour traiter l’information visuelle. Dans la première partie, nous tenterons de comprendre le rôle des différents types cellulaires dans le traitement de l’information visuelle. Dans un second temps, nous tenterons de redonner la vision à un modèle de s souris aveugles ( modèle murin de la rétinite pigmentaire). Grâce aux progrès de la recherche en génétique, il est possible d’utiliser un vecteur viral pour introduire l’expression d’un gène d’intérêt dans une cellule cible. L’œil présente des caractéristiques favorables pour le transfert de gènes par des virus adéno-associés (AAV). Le virus adéno-associé est un virus non pathogène et non immunogène et permet un transfert de gène efficace dans les cellules in vivo Les animaux seront injectés par voie intraoculaire à l’âge adulte (8 semaines).
Bénéfices attendus
Ce projet conduira : - à l'identification de cibles thérapeutiques prometteuses pour les maladies dégénératives de la rétine, - les résultats de cette étude permettront d'approfondir les connaissances sur le rôle général des types cellulaires dans le codage de l’information dans la rétine. - cette étude pourra permettre le développement d’une nouvelle classe de thérapies géniques pour proposer des traitements aux personnes souffrant des maladies héréditaires de la rétine.
Procédures
Tous les animaux subiront une injection intraoculaire de la thérapeutique à évaluer effectuée sous anesthésie générale et locale (5 à 10 min). Par la suite, les animaux seront amenés à effectuer un examen de l’œil répétés, une fois par quinzaine (6 fois maximum par animal) sous anesthésie gazeuse (2 min). Enfin, les animaux seront euthanasiés selon deux méthodes réglementaires en fonction des prélèvements et analyses à réaliser.
Impact sur les animaux
L'injection intra-oculaire peut provoquer des lésions temporaires comme de petites hémorragies oculaires ; Ces dernières se résorbent rapidement, en général dans les 24 heures qui suivent l’injection. Au cours des anesthésies, un faible risque de défaillance cardio-respiratoire est à prévoir. Pour la caractérisation génétique de l'animal, nous devrons faire une biopsie de la queue. Une biopsie prélevée au niveau de la queue pour déterminer le profil génétique des animaux peut causer de la douleur
Devenir
Les animaux sont euthanasiés afin de récupérer les yeux des animaux et effectuer les analyses histologiques nécessaires à notre étude.
Remplacement
Nous étudions dans ce projet l’efficacité de l’expression de protéines sensibles à la lumière (optogénétiques) dans les cellules cibles de la rétine. L’induction ne peut être effectuée qu'in vivo puisque le circuit de la rétine doit être intact avant l’expression de la protéine optogénétique. Il n'existe pas de méthodes substitutives in vitro. De plus de nombreuses barrières biologiques qui constituent de véritables obstacles pour les vecteurs de transfert de gène n’existent pas dans les modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est basé l’expérience du laboratoire dans des expérimentations similaires. Il sera toujours limité au minimum nécessaire pour fournir des données biologiquement et statistiquement significatives. Des outils statistiques adaptés seront utilisés pour l’analyse de nos résultats. Au total, 4000 animaux sont nécessaires à cette étude sur une période de 5 ans.
Raffinement
- Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation (cages de stabulation avec enrichissement, nourriture et boisson à volonté). - Ils bénéficieront d’une anesthésie générale fixe ou gazeuse selon le type d’expérimentation. Pour les injections intraoculaires, une anesthésie préalable de la cornée sera réalisée. - Application d'une pommade anti-inflammatoire et antibactérienne en post-injection intraoculaire - les souris seront placées sur un tapis chauffant lors des injections intraoculaires pour éviter une hypothermie pouvant être induite par l’anesthésie . - Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. - Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque type d’expérimentation - Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum.
Choix des espèces
Nous avons sélectionné le modèle murin car la structure de sa rétine de la souris est semblable à celle de l’Homme. Nous utilisons dans cette étude : - Un modèle murin de rétinite pigmentaire - Des modèles murins transgéniques permettant une expression spécifiques de protéines dans des types cellulaires. -Les injections sont effectuées à l’âge de 8 semaines, âge auquel le circuit de la rétine des souris est mature.
Analyse comparative des relevés de température selon différentes modalités avec un transpondeur sous-cutané interscapulaire et une sonde rectale chez le modèle canin et porcin
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
Cochons : 3
6 animaux non-humains, trois chiennes et trois mini-porcs déjà utilisés dans une étude antérieure, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans être tués à l'issue. Ils subissent de nombreuses prises de température rectales répétées, jusqu'à vingt et une pour les chiennes, ainsi qu'une anesthésie menée volontairement sans support chauffant, et les chiennes une ovariectomie. Le porteur indique des risques de lésions, saignements et inflammation de la muqueuse rectale et une possible hypothermie. À l'issue, les chiennes sont proposées à l'adoption et les mini-porcs réutilisés, le projet visant à valider une puce de mesure présentée comme un "raffinement".
Objectifs
L’objectif de cette étude est de vérifier si l’implantation d’un transpondeur d'identification RFID (radio frequency identification) équipé d'un capteur de température, permet lorsqu'il est implanté en sous-cutané au niveau interscapulaire d’obtenir des mesures représentatives de la température corporelle et équivalentes ou corrélées à celles obtenues par voie rectale. Pour in fine utiliser le transpondeur RFID comme alternative à la mesure par voie rectale. Il s’agit d’une étude pilote qui sera réalisée sur deux modèles animaux, le chien et le mini-porc.
Bénéfices attendus
La validation du dispositif de mesure permetterait le raffinement des protocoles de mesures de températures qui sont réalisés en routine par la voie rectale chez le chien et le mini-porc. Permettant une amélioration du confort de l’animal sur la procédure de prise de température au cours d’études précliniques et cliniques mais aussi, une diminution des risques liés à la contention pour les techniciens et les animaux.
Procédures
Jour 1 : Un total de 6 prises de températures par individu (vigile) pour le protocole de mesure à l'état basal au cours de la journée (mini-porc et chien) Jour 2 : Un total de 5 prises de températures par individu (vigile) pour le protocole de mesure lors de la mise en excercice (chien) Jour 3 : Un total de 9 prises de températures par individu (vigile) pour le protocole de mesure post-prandial (mini-porc et chien) Jour 4 : Anesthésie et chirurgie d'ovariectomie pour les chiennes et prises de températures au cours de l'anesthésie et avec un prélèvement vigile avant induction de l'anesthésie et avec un prélèvement vigile avant induction de l'anesthésie. Jour 5: Anesthésie pour les mini-porcs et prises de températures au cours de l'anesthésie. Ce qui fait un total de 21 prélèvements vigiles par animal pour les chiens et 16 prélèvements vigiles par animal vigile pour les mini-porcs.
Impact sur les animaux
Sévérité légère : La principale nuisance attendue chez les animaux est relative à la prise de température répétée au niveau rectal, avec l'apparition d'éventuelles lésions, saignements ou inflammation de la muqueuse rectale pouvant entrainer des douleurs lors de l'insertion du thermomètre. De plus pour les besoins de l'étude la procédure d'anesthésie se fait sans apport d'un support chauffant, pouvant conduire à une forte hypothermie qui pourrait être à l'origine d'une augmentation des risques post-anesthésiques chez les animaux. Si une diminution de la température centrale sous le seuil des 36°C est atteinte pour les deux modèles, une couverture chauffante sera employée pour éviter une hypothermie sévère.
Devenir
Les animaux vont suivre l'ensemble des procédures mentionnées au cours d'une seule semaine d'expérimentation. Les chiennes seront par la suite inscrites pour les procédures d'adoption après avis vétérinaire confirmant leur bon état clinique. Quant aux mini-porcs, ils seront réutilisés par la plateforme.
Remplacement
En amont de la phase in vivo, une phase in vitro de métrologie à l'aide d'un bain marie sera réalisée afin de déterminer la précision et la calibration des puces et sondes rectales. Cette phase in vitro permet ainsi de remplacer une phase in vivo de test.
Réduction
Au total, six animaux (trois chiens et trois mini-porcs) ayant déjà participé à une précédente étude, de gravité modérée, seront utilisés dans cette étude pilote. Il ne sera pas nécessaire de mettre en place un groupe témoin, car chaque animal constitue sa propre référence..
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des boxs sur caillebottis par groupe 3 individus (permettant des intéractions sociales) avec un enrichissement environnemental (jouets et objets à macher). Une phase d’habituation au thermomètre rectal sera mise en place grâce à un renforcement positif (récompense alimentaire). Du Tronothane (anesthésique local utilisé pour le traitement des douleurs rectales) sera appliqué sur la muqueuse avant chaque mesure et le thermomètre sera préalablement enduit d'un lubrifiant vétérinaire.
Choix des espèces
L'établissement utilisateur emploie ces 2 modèles lors de ces études. Les chiens et mini-porcs ont été choisis pour cette étude pilote car le transpondeur est destiné à être utilisé plus tard sur ces deux modèles en particulier dans le cadre des études précliniques. Les animaux utilisés dans l'étude sont adultes (2 ans pour les chiens et 1 à 2 ans pour les miniporcs). D'une part car les animaux adultes possèdent un système thermorégulateur mature et d'autre part, ceux-ci sont issus de précédentes manipulations d'où leur maturité.
Altérations métaboliques dans la prise compulsive d’alcool
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
96 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 81 tués pour prélèvement du cerveau et 15 proposés pour servir à des formations à l'expérimentation animale. Ils sont isolés et soumis pendant 21 semaines à une alcoolisation volontaire, à quatre prélèvements sanguins sous anesthésie et à des sessions où la prise d'alcool est associée à un événement aversif. Le porteur indique que l'isolement et ce modèle augmentent l'anxiété des rats, et reconnaît que 15 d'entre eux ne développeront pas l'appétence pour l'alcool attendue. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux vivants ne permet d'évaluer un comportement d'addiction à l'alcool.
Objectifs
Le métabolisme cérébral est profondément altéré suite à une prise excessive et répétée d'alcool. L'objectif ici est donc de démontrer qu'en corrigeant le métabolisme cérébral en changeant certains apports alimentaires chez le rat, l'on peut modifier des comportements associés à l'addiction à l'alcool.
Bénéfices attendus
Comprendre les altérations métaboliques en lien avec l'addiction à l’alcool et les façons d'intervenir de manière efficace pour les corriger pourraient permettre à terme le développement de stratégies thérapeutiques ciblées et efficaces contre cette maladie psychiatrique.
Procédures
Les animaux suivront une procédure comportementale avec alcoolisation volontaire sur une période de 21 semaines maximum. Au cours de celle-ci, ils auront de manière espacée (deux semaines d'écart minimum), 4 prélèvements sanguins à la queue sous anesthésie générale (durée inférieure à 15 minutes) ; deux fois, espacé de deux semaines, 6 sessions de comportement de 30 minutes/jour avec prise d'alcool associée à un événement aversif modéré (pour reproduire le symptôme pilier de l'addiction qui est de persister dans la recherche et la prise de la drogue en dépit des conséquences négatives) ; ainsi qu'un régime alimentaire modifié et contrôlé pendant un mois. A l’issue de l'étude, les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux prélevés pour des analyses biochimiques ultérieures.
Impact sur les animaux
L’effet du modèle de consommation d’alcool que nous allons utiliser et l’isolement des animaux nécessaire pour cette expérimentation ont un impact d’ordre modéré sur l’animal, augmentant son niveau d’anxiété mais n’induisant pas par exemple de symptômes physiques de manque. Des nuisances modérées sont également attendues lors des sessions comportementales associées à un événement aversif. Des nuisances légères sont attendues pour ce qui est des injections sous-cutanées des traitements antalgiques potentiels. Nous n'anticipons pas d'effets indésirables des régimes alimentaires modifiés, sur la base des protocoles et des produits publiés qui vont être utilisés.
Devenir
Les animaux ayant suivi l'ensemble des procédures auxquels ils sont destinés seront tous mis à mort afin de prélever les cerveaux pour analyses biochimiques. Cependant, il est estimé sur la base de protocoles comportementaux similaires que 15 animaux sur le total ne satisferont pas au critère comportemental d'appétence pour l'alcool nécessaire à la poursuite de l'étude. Ceux-ci seront proposés pour être réutilisés dans le cadre de formations à l’expérimentation animale ou autre formation d’enseignement. La décision sera prise en concertation avec le vétérinaire référent et/ou un membre de la Structure chargée du Bien Etre des Animaux.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettront l’évaluation d’un comportement caractéristique de l'addiction à l'alcool.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe estimé sur la base de procédures similaires réalisées auparavant. Le suivi longitudinal des animaux pendant plusieurs mois permettra également de renforcer l'analyse statistique, et donc de réduire le nombre d'animaux par condition.
Raffinement
Les animaux seront herbergés dans les conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Nous serons cependant obligés de les isoler par rapport à l'étude pour suivre leur consommation individuelle d'alcool, mais avec des cages avec grilles en portoirs ouverts, proches les unes des autres, permettant ainsi le maintien d’un certain nombre d’interactions sociales entre les animaux, ce qui limitera toute nuisance associée à un isolement plus strict. Ils seront hebergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils seront manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux contentions et aux manipulations. Pour les prélèvements de sang, les animaux seront anesthésiés avec un anesthésique gazeux. Le suivi et les pesées au quotidien des animaux permettront de veiller à ce qu’ils ne souffrent pas et de mettre en place des stratégies de soins et des points limites adaptés. En cas de signe d’alerte, l’alimentation sera supplémentée par une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie. Un antalgique pourra également être injecté en utilisant des aiguilles courtes et fines.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, ainsi qu'au niveau du métabolisme. Les registres comportementaux explorés (associés à l'alcool) sont également facilement appréhendables dans cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes (de 10 à 12 semaines, de 220 à 280 g), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, tout au long de l'étude qui prendra plusieurs mois.
Evaluation préclinique de substances d’essai
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 4200
Cochons d'Inde : 420
Lapins : 60
Chiens : 120
Furets : 60
Cochons : 60
8 520 animaux non-humains de sept espèces, souris, rats, cobayes, lapins, furets, cochons et chiens, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour évaluer la pharmacocinétique et la toxicité de candidats médicaments. Ils reçoivent des substances par de multiples voies, jusqu'à 91 jours de suite, et subissent des prélèvements répétés de sang, de liquide céphalo-rachidien ou d'urine. Environ 4 200 sont tués, notamment après prélèvement terminal ou administration de substances toxiques, les autres étant réutilisés selon un score qui les envoie à la mort au-delà d'un seuil, et 60 chiens rendus à l'élevage. Le porteur affirme que ces modèles animaux "ne peuvent pas être remplacés" par des méthodes alternatives.
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier la pharmacocinétique, la bio-distribution ou la toxicité de candidat médicaments. Les résultats de ces études sont indispensables pour la mise sur le marché de nouveaux médicaments et pour la réalisation des autres études précliniques dans de bonnes conditions. En maitrisant la pharmacocinétique, il est possible de choisir des doses efficaces qui ne présentent pas d’effet sur l’animal.
Bénéfices attendus
Les études de pharmacocinétique et de toxicité permettent de cibler les doses du candidat médicament appliquées dans les études de pharmacologie préclinique.
Procédures
Les animaux sont soumis à des administrations de substance par diverses voies (intrapéritonéale, per os, souscutanée, intraveineuse, intramusculaire, intraplantaire, intranasale, intratrachéale, intradermique, transdermique ou transmucosale, intrathécale, injection dans le genou ou la cheville), de manière unique ou répétée à diverses fréquences (1 à 3 fois par jour, pendant 1 à 91 jours), à l'état vigile ou sous anesthésie générale (de manière systématique pour les voies intradermique, intrathécale et injection dans le genou ou la cheville, et à l'appréciation du responsable de projet pour les autres voies). En routine, les administrations sont réalisées sur des groupes de 5 mâles et/ou 5 femelles pour les rongeurs et de 3 mâles et/ou 3 femelles pour les non-rongeurs. A l'administration de substance peuvent s'ajouter des prélèvements de fluides physiologiques, tels que le sang, le liquide céphalo-rachidien ou l'urine, de manière unique ou répétée à diverses fréquences. Ces prélèvements sont réalisés sur animal vigile ou anesthésié au gaz isoflurane. Chez le rongeur, un maximum de 7 prélèvements sanguins peut être réalisé le 1er jour, 1 ou 2 les jours suivants, puis 1 prélèvement par semaine pendant plusieurs semaines. Par exemple, chez un rat de 300g, un volume de 200 µL de sang pourrait être prélevé à la veine sublinguale à chaque point-temps. Dans ce cas, une réhydratation de l’animal (injection sous-cutanée de sérum physiologique, à volume égal à celui prélevé) est prévue pendant les premiers jours de l’étude, tant que la fréquence de prélèvement est supérieure ou égale à 1 tous les 24 heures. Chez le non-rongeur, un maximum de 8 prélèvements sanguins peut être réalisé le 1er jour, 2 les quatre jours suivants, puis 1 prélèvement par semaine pendant plusieurs semaines. Par exemple, chez un chien de 10 kg, un volume d’au moins 5 mL pourrait être prélevé à la veine jugulaire à chaque point-temps. De manière générale, le volume total prélevé chez un animal est proportionnel à sa volémie totale et par conséquent, à son poids corporel.
Impact sur les animaux
Des effets toxiques majeurs ne sont pas attendus. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée au médicament. Une procédure spécifique est toutefois présente dans ce dossier pour prendre en compte ce cas rare ou lorsque les prélèvements vivo sont importants
Devenir
Pour les 6 procédures décrites dasn ce projet, tous les animaux, de toute espèce, soumis à un prélèvement terminal et/ou ayant reçu une substance toxique (atteinte des points limites) ou dont les effets à long terme sont inconnus, sont mis à mort. Les animaux gardés en vie, et potentiellement réutilisés, sont ceux issus de groupe contrôle ou ayant reçu une substance dont les effets à long terme sont connus, et n'ayant pas subi de procédure de catégorie "sévère". La réutilisation des animaux (souris, rats, cobayes, lapins, furets, cochons et chiens) est soumise à l’approbation du vétérinaire. Un suivi de la réutilisation est mis en place au sein de l’entreprise, et un score est établi afin d’empêcher une réutilisation excessive, notamment dans des procédures de sévérité modérée. Dans le cas des rongeurs, les scores de réutilisation (procédure légère: 1 point, procédure modérée: 4 points) s’incrémentent pour chaque procédure appliquée à l’animal. La réutilisation est possible tant que le score cumulé est inférieur à 8. Au-delà, les animaux sont euthanasiés. Dans le cas des non-rongeurs, l’état des animaux est évalué à chaque fin d’étude.
Remplacement
Les techniques, décrites et validées dans ce projet, sont utilisées dans divers modèles animaux qui ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement, le système immunitaire, les paramètres physiologiques, le métabolisme ou l’interaction entre différents organes ou systèmes.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, voir section 3.4.13.). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, en mettant à disposition des animaux, de l’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, des tapis chauffants, des lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
La distribution d'une substance ou ses effets sur la biologie clinique chez l'animal de laboratoire sont prédictifs de ce qui peut se produire en clinique. Par ailleurs, l'innocuité d'une substance ainsi que sa cinétique doivent être évaluées chez une espèce rongeur et une espèce non-rongeur. Le choix de l'espèce sera fonction de la substance testée et dépendra des tests préliminaires de pharmacocinétique ou d'innocuité. Principalement rongeurs (rats, souris, cobayes) sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique. Ces procédures décrites dans ce projet peuvent être utilisées de façon longitudinale sur des rongeurs depuis la période néonatale jusqu'à l'âge adulte. Lapins, furets, chiens et cochons adultes conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique.
Evaluation préclinique de produits de santé de dialyse péritonéale après implantation dans l’organisme
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
300 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées sévères. Chacun est opéré sous anesthésie pour l'implantation d'un cathéter abdominal, puis subit des dialyses péritonéales répétées jusqu'à cinq fois par jour sur animal vigile, avec prises de sang. Le porteur indique des douleurs liées au cathéter, des inflammations, des pertes de poids et des risques d'infection bactérienne, et précise que l'observation des organes abdominaux en fin d'étude interdit de garder les animaux en vie. Ces essais servent à constituer des dossiers précliniques pour la mise sur le marché de produits de dialyse, le porteur jugeant le recours à un animal de gabarit suffisant "nécessaire".
Objectifs
Ce projet vise à développer un modèle de dialyse péritonéale chez l'animal en vue d'étudier l'efficacité des produits à tester, répondant ainsi aux besoins scientifiques et cliniques actuels. Ces études entreront dans la constitution de dossiers précliniques, étape nécessaire à l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché et à l'utilisation clinique de ces produits chez l'humain. La tolérance locale (effet d'un produit étranger sur les tissus vivants avec lesquels il est mis en contact) pourra également être évaluée. La dialyse péritonéale est une technique qui permet de participer à l'évaluation des toxines produites par l'organisme et présentes dans le sang pour compenser une fonction rénale défaillante. Pour cela, un liquide appelé dialysat est injecté dans la cavité abdominale via un catheter. Il se trouve en contact avec le péritoine, membrane semi-perméable qui tapisse cette cavité. Les petites et moyennes molécules déchets de l'organisme présentes dans le sang pourront alors passer à travers cette membrane pour se concentrer progressivement dans le dialysat. Le dialysat ainsi chargé des déchets sera enfin retiré de la cavité abdominale par le catheter. Ces étapes seront répétées jusqu'à plusieurs fois par jour ou la nuit, selon la sévérité de l'insuffisance rénale du patient. De part sa simplicité de mise en place et de réalisation, la dialyse péritonéale représente une alternative intéressante à l'hémodialyse, qui nécessite un important appareillage, des déplacements en centre de dialyse, etc. La dialyse péritonéale peut être gérée à domicile par le patient luimême de façon autonome ou assistée. Les dialysats doivent donc être évalués pour prouver leur efficacité et sécurité. Du fait du contact étroit entre le dialysat et les organes obdominaux (digestifs, reproducteurs...), il est essentiel de prouver leur absence de toxicité avant leur mise sur le marché, d'autant plus qu'ils seront utilisés chez des patients fragiles atteints d'insuffisance rénale avancée. Afin d'étudier l'efficacité et la sécurité des dialysats, le recours à des modèles animaux de taille suffisante (ex : lapin) sont nécessaires. Ces modèles animaux permettent d'évaluer l'efficacité de la filtration du dialysat par le péritoine, en comparant les quantités de dialysat injectées et récupérées par exemple. La sécurité peut également être évaluée dans ces modèles par analyses des tissus qui ont été au contact avec le dialysat.
Bénéfices attendus
Grace à l'élaboration d'un modèle animal fiable et reproductible, les données de sécurité et de performance obtenues au cours des études permettront de répondre aux exigences réglementaires et de qualité attendues des prouits de santé pour dialyse péritonéale mis sur le marché. Un tel modèle animal pourra permettre par exemple de sélectionner parmi un panel de produits en développement celui présentant le plus de bénéfices, en comparant leurs données de performance et de sécurité. De tels essais sont essentiels dans la stratégie de réduction du nombre d'animaux utilisés, en poussant seulement le développement des produits les plus intéressants et en écartant rapidement des recherches les produits ne présentant pas des qualités de sécurité ou de performance suffisamment satisfaisantes. Une fois le produit le plus intéressant sélectionné, ce modèle animal permet aussi de comparer ce produit en développement à d'autres déjà commercialisés, pour s'assurer qu'il représente un bénéfice au moins égal ou supérieur.
Procédures
L’ensemble des animaux sera opéré sous anesthésie générale et traitement analgésique pour placer le cathéter péritonéal au niveau de la cavité abdominale de façon stérile. L'intervention est estimée à environ 30 minutes par lapin. Les dialyses péritonéales consisteront en l’injection du dialysat via le cathéter, à une période de stase, puis au drainage du dialysat via le cathéter. En général, la durée de stase va de quelques minutes à plusieurs heures afin d’être représentatif d’une dialyse réalisée chez l’homme (exemple : 60 minutes de stase chez le lapin correspondent à 2h chez l’homme). Les dyalises peuvent être répétées plusieurs fois par jour (en fonction de leur durée) et au maximum 5 fois par jour. Les dialyses n’étant pas douloureuses, elles seront réalisées sur animaux vigiles. Enfin, des prises de sang pourront être réalisées sur les animaux (vigiles ou sous anesthésie) en cours d’étude.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables connus pouvant survenir chez l’animal sont : une douleur liée à l’implantation du catheter, l'inflammation de la zone opérée (abdomen), la perte de poids ou d’appétit en lien avec l'anesthésie ou la chirurgie, les infections bactériennes, le stress induit par les manipulations répétées des animaux les jours de dialyses.
Devenir
Afin de s’assurer de la sécurité des produits de dialyse péritonéale, une observation de la cavité abdominale et des organes abdominaux est nécessaire. Ceci permet d’évaluer la performance et la tolérance locale de ces produits, ce qui est l’objectif des études réalisées sur ce modèle animal. Des prélèvements de tout ou partie de certains organes peuvent éventuellement être nécessaires, en particulier en cas d’anomalie constatée, pour évaluer les effets tissulaires à l’échelle microscopique. L’ensemble de ces facteurs explique l’impossibilité en fin d’étude de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
Les échanges moléculaires s'effectuant à travers la membrane péritonéale sont complexes. Des modèles informatiques ou in vitro permettent d'apporter certaines connaissances sur ce point. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de fournir l'ensemble des réponses nécessaires à l'évaluation de la performance et de la sécurité des produits de dialyse péritonéale en vue de leur utilisation chez l'humain. Pour l'heure, les interactions complexes s'établissant entre le produit infecté et la membrane péritonéale ne peuvent être recrées ex vivo.
Réduction
Grâce à l’apport des méthodes n’ayant pas recours à l’utilisation d’animaux vivants (modèles informatiques ou in vitro tels que des courbes d’osmolarité…), il est possible de déterminer en amont les meilleures concentrations de produit de dialyse péritonéale à injecter chez l’animal. Ainsi, dans la phase in vivo du développement de ces produits de santé, il est possible de tester uniquement les concentrations approuvées par les techniques ex vivo, ce qui réduit drastiquement le nombre d’animaux devant être utilisés. Par ailleurs, le donneur d’ordre demandant la réalisation de ces tests s’engage à ne pas faire renouveler à l’identique un essai déjà mené précédemment. De plus, l’interprétation des résultats nécessite toujours de comparer ceux obtenus chez des animaux qui reçoivent le produit évalué avec ceux obtenus d’animaux qui reçoivent un produit « contrôle », dont l’effet attendu est déjà connu. Pour réduire encore le nombre d’animaux inclus en étude, il est possible d’utiliser un même groupe « contrôle » pour plusieurs groupes « test » recevant des produits à tester différents. Enfin, nous avons déjà mentionné la possibilité de réaliser des études pour sélectionner parmi un panel de produits celui qui présente le plus d’intérêt à être développé, réduisant ainsi le nombre de tests réalisés sur des produits ayant un intérêt moindre. Par ailleurs, si l’effet attendu d’un produit est trop incertain, il est possible de réaliser une étude dite « pilote » sur quelques animaux seulement. Les résultats de cette première étude à petite échelle servent à confirmer ou infirmer les interrogations concernant ce produit. Une étude à plus large échelle, incluant le nombre d’animaux nécessaire sur le plan normatif ou statistique, ne sera alors réalisée qu’une fois les doutes levés.
Raffinement
Des mesures sont mises en place pour limiter : - Le stress des animaux : une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ensuite, et avant la chirurgie d’implantation du catheter, une période d’habituation aux actes spécifiques (massage abdominal, contention…) peut aussi être réalisée pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (jouets, plateforme de repos…), et ces mesures sont renforcés en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…) - La douleur des animaux : la chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie (à base de morphiniques). Les animaux sont suivis de façon quotidienne, 7 jours sur 7. En phase post-opératoire, ces suivis sont renforcés et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (surveillance ou réfection des pansements, désinfection des sites chirurgicaux à chaque réfection de pansement…). En cas d’anomalie clinique, sanitaire ou comportementale, l’équipe vétérinaire assure l’examen clinique et le suivi de l’animal, afin de mettre en place une gestion adéquate de la douleur ou de l’anomalie constatée selon chaque cas. - le risque d’infection : un traitement antibiotique peut permettre de contrôler ce risque. - la perte de poids ou d’appétit en lien avec l’anesthésie ou la chirurgie : Un suivi quotidien du transit et de l’alimentation est systématiquement mis en place à la suite des chirurgies chez le lapin, et ce jusqu'à la reprise d'un comportement alimentaire normal. En cas d’apparition de symptômes de ce type, des mesures seront mises en place : distribution d’aliments plus appétants (légumes frais, friandises…), mise à disposition d’un aliment de convalescence, voire distribution à la pipette pour aider à relancer la prise alimentaire spontanée.
Choix des espèces
La réalisation de la chirurgie et l'utilisation des produits de dialyse péritonéale nécessitent que la cavité abdominale soit d'une taille suffisante. Ceci permet une mesure précise des volumes administrés et récupérés, autorisant un calcul fiable de l'efficacité de filtration. Le choix d'un animal de gabarit assez important est également éncessaire pour permettre la réasliation de prises de sang d'un volume suffisant à l'évaluation de l'efficacité de la dialyse, tout en respectant les volumes maximums pouvant être prélevés sans avoir d'impact délétère sur les animaux. Pour cela, le lapin est un modèle reconnu pour la réalisation de ce type de tests, du fait de son gabarit adapté et des similitudes constatées entre la structure de leur péritoine et celle du péritoine humain. L’utilisation d’animaux adultes d’un poids minimum de 2,5 kg lors de la chirurgie est recommandée, afin de limiter les risques liés à l’anesthésie et de permettre la mise en oeuvre des techniques chirurgicales et post-opératoires adéquates.
Mécanismes de transport de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) à travers les barrières du système nerveux central – applications thérapeutiques.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 418 dans des procédures classées sévères et 254 opérées sous anesthésie sans réveil. Elles reçoivent des injections de protéines puis un accident vasculaire cérébral provoqué par injection de thrombine dans une artère cérébrale, suivi d'IRM et de tests de récupération fonctionnelle non précisés, avant prélèvement du cerveau. Le porteur indique que ces procédures peuvent provoquer perte de poids, douleurs post-opératoires et déficits fonctionnels, les souris perdant plus de 15 % de leur poids étant mises à mort. Il affirme que les méthodes sans animaux n'apporteraient pas le même niveau d'information et retient la souris comme modèle d'AVC.
Objectifs
Le système nerveux central (SNC) compte plusieurs barrières qui ont pour rôle le maintien de l’homéostasie cérébrale, notamment en régulant le transport de molécules entrant ou sortant du SNC, ce qui peut constituer un obstacle à l’administration d’agents thérapeutiques. L’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une protéase clé du système fibrinolytique sanguin. Par ses propriétés, le tPA est le seul traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques Les expériences menées in vitro et in vivo suggèrent que le tPA vasculaire peut traverser les barrières du SNC et se retrouver dans le compartiment cérébral par un mécanisme actif spécifique d’un récepteur et que ce transport implique une seule partie du tPA (appelée « domaine Finger »). L’objectif de cette étude est de mieux comprendre les mécanismes de transport du tPA à travers les barrières du SNC par des approches in vivo sur des souris et de convertir ces découvertes en approches thérapeutiques pour vectoriser le passage d’agents thérapeutiques connus, incapables d’atteindre leur cible par injection intraveineuse. Ces outils seront testés dans un modèle d’AVC ischémique (développé au laboratoire) réalisé sur des souris, afin de proposer une stratégie thérapeutique pour améliorer la prise en charge des patients victimes d’AVC.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées pour permettre le passage de molécules thérapeutiques du compartiment sanguin au compartiment cérébral. Une meilleure compréhension des interactions sang/cerveau permettra d’une part, à évaluer le potentiel thérapeutique de différentes molécules, et d’autre part, une amélioration de la prise en charge des patients victimes d’un AVC ischémique.
Procédures
1 : Injection intraveineuse de protéines à travers les barrières du système nerveux central (SNC) (20 minutes). Prélèvement liquide cerebro-spinal (LCS), du sang, et du cerveau 10, 30 ou 60 minutes après injection des protéines (20 minutes) 2 : Injection intra-carotidienne de protéines à travers les barrières du SNC (10 minutes). Prélèvement LCS, sang, et cerveau 5 minutes après injection des protéines (20 minutes). 3 : a. Evaluation du potentiel thérapeutique des protéines après un modèle d’accident vasculaire (AVC) sans rtPA (traitement médicamenteux pour un AVC ischémique) Jour 0 (J0) : Induction d’un AVC ischémique par injection de thrombine dans l’artère cérébrale moyenne (40 minutes) / 20 minutes après injection des protéines (20 minutes) J+1 : Evaluation des lésions cérébrales par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (15 minutes) J+1, J+7, J+15 : Etude de la récupération fonctionnelle avec test de comportement (5 minutes) Prélèvement LCS, sang et cerveau à J+1 et J+15 (20 minutes) b: Evaluation du potentiel thérapeutique des protéines après un modèle d’AVC avec administration précoce de rtPA J0 : Induction d’un AVC ischémique (40 minutes) / 20 minutes après injection des protéines et du rtPA (20 minutes) J+1 : Evaluation des lésions cérébrales par IRM (15 minutes) J+1, J+7, J+15 : Etude de la récupération fonctionnelle avec un test de comportement (5 minutes). Prélèvement LCS, sang et cerveau à J+1 et J+15 (20 minutes) c: Evaluation du potentiel thérapeutique des protéines après un modèle d’AVC avec administration tardive de rtPA (J0) : Induction d’un AVC ischémique (40 minutes) / 4 heures après injection des protéines et du rtPA (20 minutes) J+1 : Evaluation des lésions cérébrales par IRM (15 minutes) J+1, J+7, J+15 : Etude de la récupération fonctionnelle avec un test de comportement (5 minutes). Prélèvement LCS, sang et cerveau à J+1 et J+15 (20 minutes). L’ensemble des procédures, hormis les tests comportementaux, sera fait sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les rongeurs seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Dans chaque phase du projet, le minimum de souris a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquation avec les tests statistiques prévus lors de ce projet. Le nombre de souris pour chaque étude a été défini à partir d’une analyse de puissance et de nos données sur chaque modèle.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage, coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront pesés tous les jours et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques suivant l’approche chirurgicale. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant l’ensemble des procédures, les souris seront sous anesthésie générale (isoflurane 2% O2/N2O 30/70%) et sous anesthésie locale (Xylocaine 5%, nébuliseur). Les yeux seront couverts (vitamine A en gel et gel oculaire) afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir leur déshydratation.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC et les techniques employées sont bien connues et maitrisées dans notre équipe. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend donc cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Concernant l’ensemble des procédures, les souris utilisées seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.
Evaluation de la toxicité de composés à visée thérapeutique et de solutions de resuspension chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse ou non de tumeur
- Recherche appliquée
- Cancers
Toutes tuées, au prélèvement d'organes ou de sang terminal, au point limite ou en fin d'étude, 7 925 souris vont être utilisées pour mesurer la toxicité de composés d'immunothérapie anticancéreuse et de leurs solutions de mise en suspension, sur 75 études au plus en cinq ans. La déclaration en compte 575 en souffrance modérée et 7 350 en souffrance sévère. Immunodéprimées ou non, greffées ou non de cellules tumorales sous la peau ou dans la veine, avec des risques cités de nécrose de la tumeur ou de paralysie, elles peuvent recevoir le composé jusqu'à une fois par jour pendant quatre semaines et subir des microprélèvements de sang à la queue, des prises de sang derrière l'œil sous anesthésie et un prélèvement terminal derrière l'œil ou dans le cœur. Pour cette étude de toxicité, le porteur invoque l'efficacité du composé, qui dépendrait de "son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme", et conclut qu'il est "nécessaire d'utiliser des animaux".
Objectifs
Chaque année, plus de 19 millions de cancers sont diagnostiqués à travers le monde, responsables de plus de 10 millions de décès. L'immunothérapie des cancers (immuno-oncologie) est une révolution dans le domaine du traitement des cancers. L'objectif est de réactiver les cellules du système immunitaire pour les conduire à reconnaître et à éliminer les cellules tumorales. Nous développons des composés thérapeutiques visant à stimuler le système immunitaire pour induire un contrôle durable des tumeurs : • des anticorps monoclonaux qui vont « marquer » les cellules cancéreuses et permettre aux cellules immunitaires de les reconnaître pour les détruire. • des anticorps multispécifiques capable de se lier, à la fois, aux cellules immunitaires et aux cellules tumorales. Ce co-engagement induit une forte activation des cellules immunitaires et la destruction des cellules cancéreuses. • des conjugués anticorps-médicaments capables d'amener des toxines dans les cellules cancéreuses en utilisant des anticorps comme support. L’objectif de ce projet consiste à évaluer/détecter une éventuelle toxicité de composés à visée thérapeutique et de solutions de resuspension chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse ou non de tumeur. Il pourra également permettre d’identifier les cellules immunitaires ou les substances impliquées dans celle-ci.
Bénéfices attendus
Le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès dans le monde en 2020. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. L’immunothérapie est aujourd’hui une nouvelle approche thérapeutique qui a permis une avancée majeure dans le traitement du cancer. Le projet permettra de caractériser des composés thérapeutiques agissant sur la cible d'intérêt, et ainsi sélectionner ceux qui feront ensuite l'objet d'études d'efficacité dans le cadre d'autres projets.
Procédures
• Sur animal vigile : Pesée (de 1 à 7 fois/semaine, 20 s) ; Tonte du flanc en vue de la greffe ou de la mesure du volume tumoral (1-3 fois, 10 s) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (1 injection, 15 s) ; Greffe de cellules tumorales en intraveineuse (1 injection, 15 s) ; Modification de la distribution des animaux dans les cages lors de la randomisation (1 fois) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 1 fois /jour pendant 4 semaines, 15 s) ; Administration de la molécule déplétante/neutralisante (maximum 1 jour sur 2 pendant 4 semaines, 15 s) ; Mesure de tumeur (de 1 à 4 fois/semaine, 20 s) ; Microprélèvement de sang au niveau de la veine caudale (prélèvement d’un volume inférieur ou égal à 20 µL dans la limite de 25% du volume total de sang sur une période de 28 jours, 30 s) ; Administration de la solution de resuspension du composé thérapeutique (maximum 1 fois/jour pendant 4 semaines, 15 s). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire, d’un volume inférieur à 7.5% du volume sanguin total avec un temps de récupération de 1 semaine minimum ou inférieur à 10% du volume sanguin total avec un temps de récupération de 2 semaine minimum (4 fois maximum, 30 s) ; Prélèvement de sang terminal par voie rétro-orbitaire, d’un volume maximal de 800 µL (1 fois, 1 min) ou en intracardiaque, d’un volume maximal de 1 mL, sous analgésie (1 fois, 5 min).
Impact sur les animaux
Stress et douleur légère lors de l’injection des cellules tumorales en sous-cutanée ou en intraveineuse. Stress et douleur légère lors de l’administration du composé thérapeutique, de la molécule déplétante/neutralisante ou de la solution de resuspension du composé en intra-péritonéal, sous-cutané, per os ou intraveineux. Inconfort lors de la manipulation de l’animal vigile pour les gestes de tonte du flanc, pesée et mesure de tumeur. Stress lié à la modification de la distribution des animaux dans les cages lors de la randomisation. Possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse et difficulté de mobilité/engourdissement au réveil. Stress et douleur légère lors des micro-prélèvements sanguins. Possibilité d’effets indésirables liés à la greffe tumorale : Perte de poids, modification du comportement, nécrose, ulcération et/ou inflammation de la tumeur (tumeur en sous-cutanée), paralysie (tumeur en intraveineux). Possibilité d’effets indésirables liés au composé thérapeutique : Perte de poids transitoire, modification temporaire du comportement.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux (pour chaque procédure) lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur au cours de l’étude ; Prélèvement sanguin terminal ; Atteinte d’un point limite justifiant l’euthanasie ; Fin de l’étude.
Remplacement
Evaluer les effets pharmacologiques d’un composé thérapeutique visant à réactiver le système immunitaire implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement (et de la tumeur), ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.
Réduction
Afin de limiter le recours aux animaux, les molécules sont préalablement testées in vitro et sélectionnées sur la base des résultats obtenus dans les modèles cellulaires. Seules celles présentant la meilleure activité sont choisies pour être évaluées chez l’animal. Les conditions et le taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester sont également déterminés dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires dans les procédures impliquant une greffe tumorale. En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 10 souris maximum par groupe sont nécessaires pour obtenir une évaluation, statistiquement interprétable, de l’éventuelle toxicité d’un composé thérapeutique et 5 souris maximum par groupe pour celle d’une solution de resuspension, en tenant compte de la variabilité inter-individuelle et des signes cliniques observés. Ces études sont menées avec des analyses statistiques basées sur les tests ANOVA, Mann Whitney, test T de Student, test de Log-rank et/ou de Gehan-Breslow-Wilcoxon. Afin de prendre en compte le succès de l’induction tumorale pour les études nécessitant une greffe tumorale sous-cutanée, il est nécessaire d’ajouter 30% d’animaux dans ces dernières, soit 13 souris maximum par groupe. Les volumes de prélèvements de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un maximum de 75 études sera mené sur 5 ans. Au cours de l’étude, les organes et/ou tumeurs peuvent être prélevés pour mutualiser l’utilisation des animaux dans le but d’étudier différentes questions et paramètres au sein de la même étude et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant la multiplication des expériences.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, euthanasie de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Les volumes de prélèvements de sang seront limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permettra de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un prélèvement terminal, sous anesthésie générale pourra également être réalisé. La taille des aiguilles utilisées lors des injections sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. Des points limites précoces relatifs à l’apparence/comportement de l’animal, à l’aspect et au volume de la tumeur ainsi qu’à la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de l’étude, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou l’euthanasie de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. Le composé et/ou les cellules tumorales greffées en intraveineuse pourront induire une perte de poids des animaux plusieurs jours post-injection. A partir de 10% de perte de poids, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Le volume des tumeurs sera suivi au minimum 1 fois/semaine. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou du volume tumoral (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (3-4 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies et l’activation du système immunitaire. Enfin, le modèle murin est un modèle de choix du fait de l’existence de souris immunodéprimées et de souris génétiquement altérées qui permettent d’évaluer le rôle de nos composés thérapeutiques sur le système immunitaire. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.
Lésions rénales : Evaluation de l’efficacité de composés chimiques ou biologiques sur les lésions rénales chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 750
Pour tester des candidats médicaments contre les lésions des reins, 750 souris et 750 rats, soit 1 500 rongeurs, vont être utilisés, tous tués à l'issue pour récupérer leurs organes et "de grands volumes de sang". La déclaration en compte 1 000 en souffrance modérée et 500 en souffrance sévère. Sous anesthésie générale de deux heures au plus, les vaisseaux d'un rein ou des deux sont clampés pour y couper la circulation, ou l'uretère gauche est ligaturé pour provoquer une fibrose, puis les composés sont administrés par le nez, la trachée, le muscle, la peau, la bouche ou l'abdomen, au cours d'études de deux mois au plus. Le porteur annonce une douleur modérée d'environ trois jours "compte tenu de l'analgésie prévue", une pesée quotidienne et une réhydratation sous la peau des rongeurs déshydratés, et écrit que les points limites "sont listés en détail dans la procédure", liste que le résumé ne reproduit pas.
Objectifs
L’objectif est de tester l’efficacité thérapeutique de composés chimiques ou biologiques dans des modèles de lésions rénales résultant en des états inflammatoires aigus et chroniques du rein : lésions dues à une ischémie/reperfusion rénale ou à une obstruction urétérale unilatérale causant de la fibrose. En général, la lésion rénale initiale est associée à une insuffisance rénale aiguë (déclin rapide et potentiellement réversible de la fonction rénale), tandis que la fibrose tend à se produire dans le cadre de la maladie rénale chronique. La maladie rénale chronique peut par ailleurs résulter d’une non résolution d’insuffisance aiguë. Chez l’homme, plusieurs agressions initiales peuvent déclencher des lésions rénales. L’objectif de ce projet est de modéliser chez le rongeur deux d’entre elles : l’ischémie-reperfusion (arrêt temporaire du flux sanguin dans un rein ou les deux), et l’obstruction des voies urinaires (uretère). Ces modèles nous permettront de tester des candidats médicaments visant à traiter des patients présentant des lésions rénales. Les lésions d'ischémie reperfusion (IR) rénales sont une cause fréquente d'insuffisance rénale aiguë chez les patients. Aucun traitement spécifique n'est actuellement disponible. Parmi les modèles in vivo existants, le modèle de clampage du pédicule rénal (contenant les vaisseaux sanguins rénaux) chez la souris est couramment décrit dans la littérature et utilisé en raison de l’existence de nombreuses souches de souris transgéniques. Ce clampage temporaire génère une ischémie rénale. Selon l’objectif à atteindre, le clampage peut être réalisé sur un rein (pour mimer une ischémie-reperfusion au cours de la transplantation de l’organe) ou sur les deux reins à la fois (pour mimer une ischémie-reperfusion secondaire à une forte hypotension). Aucun traitement n’existe à ce jour pour la fibrose rénale chez l’homme. Le modèle d'obstruction urétérale unilatérale (UUO) sera utilisé pour modéliser des affections rénales aboutissant à un fibrose rénale. Ce modèle d’obstruction urétérale se caractérise par une dilatation tubulaire, une expansion interstitielle, une perte de masse tubulaire proximale, une hypertrophie, une hydronéphrose, une infiltration de leucocytes, la mort des cellules épithéliales tubulaires et la présence de fibroblastes, qui conduisent tous à une fibrose tubulo-interstitielle progressive.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation mode préventif ou thérapeutique sur les lésions rénales. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces lésions rénales pour laquelle les options sont pour le moment limitées.
Procédures
Les lésions rénales seront induites sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines soit ischémie reperfusion unilatérale ou bilatérale rénale ou par ligature de l’uretère gauche. Ces trois procédures auront lieu sous anesthésie générale qui durera au maximum deux heures. Afin d’évaluer l’efficacité de potentiels traitements sur les lésions rénales, des composés chimiques ou biologiques pourront être administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’au maximum une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie ou en moins de 5 min sur animal vigile; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’au maximum une heure sinon). Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Les études dureront au maximum 2 mois.
Impact sur les animaux
La constitution de groupes lors de la randomisation impliquera un remaniement des groupes sociaux qui pourra générer un stress léger durant moins de 3 jours. Les chirurgies pourront générer une douleur modérée durant 3 jours environ compte tenu de l’analgésie prévue. Dans le cas d’administrations par injections ou dans le cas de prélèvements sanguins, ceux-ci génèreront une douleur limitée à celle d’une piqûre d’aiguille.
Devenir
Après les trois procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.
Remplacement
L'étude des mécanismes impliqués ne peut être remplacée par des modèles cellulaires en raison des très nombreux types cellulaires composant le rein et de la complexité des voies de signalisation cellulaire modifiées par l'ischémie reperfusion rénale ou l’obstruction des voies urinaires, à l’origine de fibrose. Ainsi, ce projet ne peut être évalué que dans un modèle in vivo chez l’animal tant pour la compréhension précise de ces phénomènes que pour la mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est réduit au minimum nécessaire pour permettre une analyse statistique fiable des résultats. Dans le cas où des composés auraient besoin d’être testés dans les deux modèles au même moment, les animaux sham seront mis en commun pour ne pas être dédoublés. Sur la base de la littérature, le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure est de 10 animaux par groupe. Cependant, les premières études visant à établir les modèles permettront de modifier au besoin ce nombre, s’il est insuffisant, ou au contraire s’il peut être réduit. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 20 animaux par groupe. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Les analyses statistiques à réaliser sur les autres paramètres mesurés en cours d’étude seront effectuées au moyen du test ANOVA.
Raffinement
Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et analgésique avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermostatée. Une surveillance quotidienne stricte, avec évaluation du réveil et de l’état de santé post-opératoire, permet de détecter rapidement toute complication éventuelle et d’adapter immédiatement la prise en charge, en respect des points limites préétablis, en particulier par un traitement analgésique adapté. Les animaux recevront une analgésie préalable à la chirurgie (buprénorphine au moins 30 minutes avant la chirurgie) et un anesthésique local sera utilisé (SC autour du site d’ouverture chirurgicale au moins 5 minutes avant, et sur le feuillet musculaire avant fermeture de la peau). En cours d’étude, les animaux seront pesés 2 fois par semaine jusqu’à la chirurgie puis tous les jours à partir de la chirurgie. La déshydratation sera évaluée quotidiennement à partir de la chirurgie et les animaux déshydratés seront réhydratés par voie sous cutanée. A partir de la chirurgie, de la nourriture gélifiée sera placée en fond de cage, pendant une semaine Les points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans la procédure. Si la litière venait à se souiller plus rapidement que ce qui est constaté habituellement, la fréquence de change des cages sera augmentée.
Choix des espèces
Ces modèles sont décrits dans la littérature chez le rat et la souris. Les mâles seront privilégiés car leur utilisation est bien décrite dans la littérature. La souris sera privilégiée lorsque l’utilisation de souches génétiquement modifiées est nécessaire. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.
Impact d’une exposition aberrante à la lumière au cours de l’adolescence sur le système circadien, l’humeur et la cognition chez le rongeur diurne Arvicanthis ansorgei
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Isolés dans des cages individuelles dès l'âge de 20 jours et jusqu'à la fin des procédures, 302 rongeurs diurnes de l'espèce Arvicanthis ansorgei passent deux électrorétinogrammes sous anesthésie, avant et après la période d'adolescence où l'équipe teste l'effet de la lumière bleue la nuit. Le protocole prévoit aussi sept tests comportementaux que le texte ne nomme pas, 15 à 20 jours d'obscurité constante, deux injections dans l'œil sous anesthésie, l'une pour tracer les voies de la rétine au cerveau, l'autre pour détruire les cellules à mélanopsine, et une chirurgie du cerveau de 30 à 45 minutes suivie d'une injection dans l'abdomen. Avec ces procédures, d'un niveau de souffrance modéré, l'équipe veut vérifier si la lumière bleue nocturne à l'adolescence favorise des troubles du rythme, de l'humeur et de la cognition à l'âge adulte, effets qu'elle dit attendre, "objet même de la question". Tous sont tués à la fin pour prélever leur rétine et leur cerveau.
Objectifs
Le cycle lumière/obscurité de 24 heures de l’environnement synchronise l’horloge biologique du cerveau. La lumière exerce à la fois des effets positifs et négatifs en fonction de ses caractéristiques (moment d’exposition, durée, intensité spectre, etc…). La littérature montre qu’une exposition aberrante à la lumière, c’est-à-dire une exposition la nuit notamment dans la région bleue du spectre, altère les rythmes de l’organisme, la cognition et induit des états dépressifs chez l’animal et chez l'Homme. Un candidat clé pour la médiation des effets de la lumière sont les cellules à mélanopsine localisées dans la rétine. En effet, la lumière pénètre dans l’organisme au travers la rétine, et est captée par un type de cellules particulier : les cellules photoréceptrices à mélanopsine. Ces cellules permettent la conversion du signal lumineux en un signal biochimique, transmissible alors à d’autres cellules. Ici, le signal sera transmis jusqu’aux structures du cerveau qui régulent les rythmes biologiques, l’humeur et la cognition. Les adolescents présentent un risque particulier à l’exposition nocturne à la lumière bleue car l'apparition de la plupart des maladies mentales surviennent avant l'âge de 25 ans et ils présentent une sensibilité plus importante à la lumière. Nous émettons l’hypothèse que l'exposition à la lumière bleue la nuit pendant l'adolescence va contribuer au développement de troubles circadiens, affectifs et cognitifs à l'âge adulte. Afin de vérifier cette hypothèse, notre étude sera réalisée sur un modèle de rongeur diurne : Arvicanthis ansorgei. (La physiologie de l’homme étant diurne, l’utilisation de cette espèce de rongeur est plus pertinente que les rongeurs habituellement utilisés en laboratoire telle que les rats ou les souris, ayant une physiologie nocturne). Les objectifs sont de déterminer : 1) Impact de l’exposition à la lumière bleue nocturne sur le système circadien, l'humeur et la cognition à l'aide de différents tests comportementaux validés. 2) Conséquences de l’exposition à la lumière bleue nocturne sur la rétine, son fonctionnement et ses projections vers le cerveau. 3) Caractérisations des effets de la lumière bleue dans les régions cérébrales cibles des cellules à mélanopsine, régulant le système circadien, l'humeur et la cognition. Cette analyse multidimensionnelle, allant de la cellule au comportement de l’animal, aura des résultats déterminants aux niveaux fondamental et clinique.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de décortiquer l’impact de l'exposition à la lumière bleue nocturne pendant l’adolescence sur le développement des troubles circadiens, affectifs et cognitifs à l’âge adulte. Les données obtenues permettront d’élaborer de nouvelles stratégies pour limiter les effets délétères d’une exposition aberrante à la lumière bleue chez les adolescents.
Procédures
Afin de définir l'impact d'une exposition nocturne à la lumière bleue, notre projet comporte 4 types d'interventions. La première est appelée l'électrorétinographie (ERG) et permet d'évaluer la fonction visuelle. Le test est identique à celui pratiqué chez l'homme, sauf que l'animal doit être endormi le temps des enregistrements. Les tests durent environ 45-60 minutes, et auront lieu à deux reprises : un ERG avant l'exposition à la lumière en guise de contrôle, et un second après l'exposition à la lumière, pour évaluer son impact. Ensuite, les animaux seront soumis à 7 tests comportementaux validés permettant d'étudier l'effet de la lumière sur leur système circadien, l'humeur et la cognition. La durée d'un test est variable et dépend du nombre d'animaux à faire passer. (Environ 5 minutes pour un animal) Afin d'étudier l'implication des cellules à mélanopsine de la rétine dans la médiation des effets induits par la lumière, les animaux seront soumis à différentes injections oculaires : une injection comportant une molécule appelée "traceur" permettant de marquer les voies de projections allant de la rétine jusqu'au cerveau, et une seconde comportant deux autres types de molécules, permettant d'une part leur fixation spécifique aux cellules à mélanospine (épargnant toutes les autres), et d'autre part, leur destruction. Ces deux injections oculaires se feront sous anesthésie générale et analgésie. Enfin, afin de vérifier l'implication d'une structure cible du cerveau impliquée dans la régulationd e l'humeur et de la cognition, nous allons réaliser une chirurgie sur animaux anesthésiés, dans laquelle nous injecterons des molécules pharmacologique pour moduler l'activité de cette structure d'intérêt. La durée totale de la procédure varie entre 30 et 45 minutes. Après récupération de l'animal, un activateur de ces molécules sera administré par injection dans la cavité abdominale, et permettra de d'inhiber le type de neurone dans la structure d'intérêt.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent être soumis à différentes interventions, susceptibles de causer des nuisances listées ci-dessous : 1) Impact généré par l'exposition à la lumière : nous nous attendons à une altération du système circadien, visuel, de l’humeur et de la cognition (objet même de la question). 2) A partir de 20 jours d'âge et jusqu’à la fin des procédures, les animaux seront placés individuellement dans des cages afin de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu. L’isolement de l'animal sur une longue période est susceptible d’induire du stress chez les rongeurs, hébergés habituellement en groupe. 3) Afin d’évaluer les paramètres de leur système circadien (horloge biologique), les animaux seront placés pendant 15-20 jours à l’obscurité constante. Le placement de l’animal en obscurité constante est la procédure standard utilisée afin d’évaluer le fonctionnement endogène du système circadien, ce qui n‘induira aucune nuisance chez l’animal. 4) Pour étudier l’impact de la lumière sur l’humeur et la cognition, les animaux seront soumis à différents tests comportementaux susceptibles d’induire du stress. 5) Les animaux seront soumis à des anesthésies, des injections dans l'oeil, ainsi qu'à des chirurgies cérébrales susceptibles d’induire une douleur modérée, un risque infectieux et/ou inflammatoire, une perte de poids, etc. 6) Les animaux seront également soumis à une technique d'électrorétinographie (ERG - permettant d'évaluer la fonction visuelle) susceptible d’induire des anomalies oculaires dans certains cas (inflammation, infection, rougeur, opacité…)
Devenir
Suite à l'ensemble des procédures les animaux seront mis à mort, les organes tels que la rétine et le cerveau seront prélevés afin de réaliser des analyses post-mortem.
Remplacement
Le but de ce projet est d’évaluer l’impact d’une exposition aberrante à la lumière durant l’adolescence sur le système circadien, visuel, la cognition et l’humeur. A ce jour, il n’est pas possible de modéliser informatiquement les différentes structures du cerveau sur lesquelles reposent ces fonctions, ni de reconstruire l’ensemble des structures impliquées, de la rétine aux régions cérébrales cibles, ce qui nécessite donc d’avoir recours au modèle animal. Le projet nécessite la réalisation d’expériences dans un environnement intégral, à l’échelle de l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé par méthode mathématique à l'aide de logiciels conçus à cet effet et sur la base notre connaissance du modèle de rongeur utilisé, des techniques mentionnées et de nos expériences à ce sujet, ainsi que sur la littérature scientifique actuelle. De plus afin de réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons certaines approches non invasives (tests comportementaux) et longitudinales (ERG) ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. - Plusieurs prélèvements de tissus ainsi que certaines mises au point techniques seront réalisés chez le même animal. L'effet délétère de la lumière bleue sera évalué entre les groupes par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux tout au long des procédures. - Durant toute la durée des procédures les animaux seront placés individuellement dans des cages dans une pièce avec d'autres animaux isolés. Les animaux peuvent se voir et ont accès aux odeurs et bruits générés par leurs congénères. Ils restent ainsi en contact visuel et olfactif avec leurs congénères hébergés dans la même pièce. De plus, pour pallier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (matériel de nidification et baton à ronger). Les procédures considérées comme invasives seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Durant ces procédures la température de l’animal sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Les animaux sont ensuite suivis tous les 2 jours à l’aide d’une grille de score permettant d’objectiver différents paramètres (apparence, poids, examen clinique, comportement) et d’établir des points limites permettant d’interrompre les procédures et donc de soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Le choix de notre modèle animal s'est porté sur l'espèce de rongeur Arvicanthis ansorgei. En effet, notre étude multi-échelle (allant du comportement à la cellule) vise à identifier les effets délétères d'une exposition aberrante à la lumière bleue chez les adolescents (P20), afin in-fine, d'élaborer de nouvelles stratégies pour limiter son impact. Il semble donc plus pertinent d'utiliser un modèle diurne (période d'activité le jour, période de repos la nuit), comparable à la physiologie de l'homme. L’objectif du projet est d’exposer les animaux à de la lumière bleue nocturne à l’adolescence (P20) et d’évaluer ensuite les conséquences de cette exposition sur le système circadien, l’humeur et la cognition au stade adulte (P40).
Etude de la transmission du virus Langat par la tique Ixodes ricinus
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
484 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le virus Langat, subissent une petite incision de la queue chaque jour pendant quinze jours et sont exposées à des piqûres de tiques pendant plusieurs jours, pour étudier la vitesse de transmission du virus de l'encéphalite à tiques. Le porteur indique que l'infection peut provoquer perte de poids, poil ébouriffé et paralysie des membres postérieurs, et affirme que les piqûres de tiques sont "indolores". Il conclut qu'il est "très difficile voire impossible" de reproduire cette transmission vectorielle in vitro.
Objectifs
Le virus de l’encéphalite à tique (TBEV) est présent dans les glandes salivaires de la tique avant d’être transmis par la salive de la tique lors du gorgement sur un hôte vertébré. Les tiques vectrices appartiennent à différentes espèces : Ixodes ricinus à l'ouest (sous-type européen) et Ixodes persulcatus (sous-types sibérien et extrême-oriental) Les humains sont des hôtes accidentels qui jouent un rôle insignifiant dans l'épidémiologie de la maladie. L'infection par le sous-type de l'Extrême-Orient peut être plus grave, 20 à 40 % des patients développant une maladie neurologique sévère avec un taux de létalité de 20 à 40 % pour ceux qui progressent. L'étude de la vitesse de transmission du virus de l'encéphalite à tique par les tiques revêt plusieurs intérêts importants : 1. Prévention et sensibilisation : Comprendre la vitesse de transmission du virus TBE permet de sensibiliser les populations vivant dans des zones à risque et de leur fournir des informations précises sur les mesures de prévention. 2. Détection précoce : En comprenant combien de temps il faut pour que le TBEV soit transmis, les professionnels de la santé peuvent être mieux informés pour diagnostiquer rapidement les cas d'encéphalite à tique chez les personnes mordues par une tique infectée. 3. Développement de vaccins : L'étude de la vitesse de transmission du virus TBE peut aider à orienter la recherche et le développement de vaccins efficaces. 4. Évaluation des risques : L'analyse de la vitesse de transmission du virus TBE par les tiques peut aider à évaluer les risques associés à certaines régions géographiques ou à certaines espèces de tiques. Cela permet aux autorités sanitaires de mettre en place des mesures de surveillance et de prévention ciblées pour réduire la propagation de la maladie. 5. En résumé, étudier la vitesse de transmission du virus de l'encéphalite à tique par les tiques est essentiel pour la prévention, le diagnostic précoce, le développement de vaccins et l'évaluation des risques.
Bénéfices attendus
Le risque d'infection par le virus de l'encéphalite à tiques (TBEV) après une morsure de tique reste largement inconnu. L’étude de la vitesse de transmission du virus de l'encéphalite à tique par les tiques est essentielle pour la prévention, le diagnostic précoce, le développement de vaccins et l'évaluation des risques. Ces informations sont essentielles pour lutter contre l'encéphalite à tique et minimiser son impact sur la santé publique.
Procédures
Le virus sera injecté une fois en début de procédure. La durée de l’injection est de quelques secondes. Des prélèvements seront réalisés tous les jours à la queue après une petite incision pendant 15 jours consécutifs. Chaque prélèvement ne dure que quelques secondes. Un prélèvement final sera réalisé par voie rétro-mandibulaire juste avant la mise à mort (30 secondes). Les souris seront exposées à des piqûres de tiques pendant 4-5 j pour les larves et les nymphes et environ 7 jours pour les adultes. Les piqûres de tiques sont indolores pour l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux infectés peuvent présenter selon la dose de virus des symptômes qui peuvent consister en une perte de poids, un malaise se traduisant par un poil ébouriffé et une perte de vivacité, une atteinte neurologique se manifestant par une paralysie des membres postérieurs.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été infectés par un virus.
Remplacement
La transmission vectorielle est un phénomène complexe. Elle nécessite de bien comprendre les interactions entre le vecteur : la tique, le virus et l’hôte vertébré. La tique transmet l’agent pathogène lors d’un repas de sang au cours duquel le virus, une fois amplifié dans les glandes salivaires se transmet dans la salive de la tique. Or cette salive possède de nombreux rôles dont certains permettent de moduler la réponse immunitaire de l’hôte vertébré. L’agent pathogène est alors moins bien reconnu par le système immunitaire et peut donc mieux se développer. Il est donc très difficile voire impossible de mimer cette interaction in vitro sur des cellules. Le modèle animal est donc beaucoup plus pertinent.
Réduction
Nous envisageons lors de la première procédure de travailler sur un petit nombre d’animaux par groupe (8 animaux des deux sexes) afin de déterminer la dose de virus adaptée à notre expérience soit un sous-total (par expérimentation) de 108 individus répartis en 2 cages par groupe (4 individus de sexe différent par cage). Dans le cadre de la deuxième expérience, nous prévoyons d’utiliser de 20 à 24 individus par groupe. Dans le cadre de la troisième expérience, nous utiliserons 10 souris par groupe, soit un effectif total de 20 souris par expérience, ce qui nécessitera d’utiliser des tests statistiques non paramétriques. En prenant en compte un effet cage, les effectifs proposés devraient nous permettre d'obtenir, pour chaque répétition de l'expérimentation, des résultats significatifs pour effets forts à très forts.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement dès l’apparition d’une gêne quelconque. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur prenant en compte l’ensemble des symptômes susceptibles d’être déclarés lors de l’infection, notamment les symptômes neurologiques. Plusieurs points limites ont été définis. Lorsque le premier point limite sera atteint, les animaux seront observés bi-quotidiennement. Du gel hydrique sera ajouté dans la cage si les animaux présentent un amaigrissement important ou bien si leur mobilité diminue. Les animaux seront mis à mort lorsque les points limites terminaux seront atteints. Des igloos en carton ou du coton seront mis à disposition dans chaque cage, afin que les animaux soient dans une ambiance confortable.
Choix des espèces
Nous souhaitons posséder un modèle simple d’infection de tiques sur des souris. Il est nécessaire qu’il s’agisse d’un modèle proche de la réalité de la transmission par des vecteurs. L’utilisation de membranes de gorgement n’est pas satisfaisant car elle ne mime que très partiellement la transmission naturelle. Les souris sont des animaux déjà retrouvés infectés dans la nature par le virus de l’encéphalite à tique. Les souris seront des mâles et femelles âgés de 4 à 7 semaines car il a été montré à travers la littérature que les jeunes souris développaient une meilleure allure de la courbe de l’infection, à savoir, plus lente et progressive permettant ainsi de pouvoir avoir le temps d’apposer nos tiques et qu’elles se mettent en gorgement avant le pic de virémie. Par ailleurs, les souris seront observées pendant 15jours.