Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Méthode de génotypage invasif pour l’élevage de modèles de souris génétiquement modifiées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
180 000 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souriceau de trois à six jours subit une biopsie de la queue sur animal vigile pour déterminer son génotype, geste pouvant provoquer douleur et saignement. Les souris ne portant pas le génotype recherché sont réparties entre la formation, le don comme animaux de compagnie et la mise à mort, tandis que les autres alimentent les projets de recherche et les accouplements. Ce projet d'élevage produit et trie ces lignées génétiquement modifiées à très grande échelle pour la recherche en neurosciences.
Objectifs
L’objectif du projet est de produire des souris génétiquement modifiées et de caractériser leurs génomes de manière précoce avec la collecte d’échantillons d’ADN (biopsie de queue). Dans le cadre des projets de recherche de l’Institut, différents modèles de souris génétiquement modifiées sont utilisés pour les études en neurosciences. Plus particulièrement, les animaux jeunes sont utilisés pour des études sur le développement du cerveau. C’est pourquoi une identification et un génotypage précoce est requis.
Bénéfices attendus
Les recherches menées à l’institut grâce à l’utilisation d’animaux utilisés à des fins scientifiques ont des applications médicales multiples dans le cadre des maladies neurologiques et psychiatriques telles que les troubles neurodéveloppementaux, l’épilepsie, les mouvements anormaux, les maladies neurodégénératives, la dépression et l’addiction. Par ailleurs, la méthode utilisée pour l’identification et la caractérisation du génome permet de sélectionner les animaux d’intérêts et ainsi constituer des groupes expérimentaux stables de manière précoce.
Procédures
Une intervention d’une biopsie de queue est réalisée sur souris vigiles à l’âge de 3 à 6 post-natal. Cet acte technique dure moins de 1 minute.
Impact sur les animaux
La manipulation et la contention des souriceaux induisent un léger stress. Un risque de rejet des nouveau-nés par la mère ou de cannibalisme est possible. Le prélèvement à la queue induit une douleur lors du prélèvement et un saignement est possible.
Devenir
L’ensemble des animaux qui ne sont pas euthanasiés à l’issus de ce projet rentreront en utilisation continue pour d’autres projets autorisés. Les souris ne portant pas le génotype d’intérêt seront pour une première partie utilisées dans le cadre de formation tutorat, pour une seconde partie utilisées en animaux de compagnie et pour une troisième partie euthanasiés. Les animaux portant le génotype d’intérêt seront utilisés dans les projets de recherche de l’Institut ou pour le renouvellement des accouplements.
Remplacement
Une partie des projets du centre de recherche sont réalisés in vitro (biochimie et biologie cellulaire), nous utilisons des lignées cellulaires et des cellules souches embryonnaires afin de limiter le nombre d’animaux. Mais pour des raisons scientifiques (difficulté d’étudier le cerveau en culture) nous devons caractériser ces maladies sur le modèle murin. La plupart des gènes que nous étudions sont spécifiquement exprimés dans le Système Nerveux Central (SNC) et ne sont pas exprimés dans les lignées cellulaires, d’où la nécessité d'étudier les cellules neuronales dans les cerveaux des modèles murins. En effet, les modèles murins que nous étudions sont à ce jour les seuls modèles disponibles. Ils présentent l’avantage de mimer assez bien le phénotype humain. Le développement du cerveau est en effet bien conservé chez la souris, surtout pour les étapes de développement du cerveau qui nous intéressent, favorisant l’identification de phénotypes robustes.
Réduction
Le génotypage précoce des souriceaux permet de conserver uniquement les animaux avec le génotypage d’intérêt et de constituer des lots expérimentaux avant le sevrage des animaux, pour l’utilisation future dans des projets autorisés de l’Institut. Dans le cadre de formation/tutorat, nous utilisons une partie des animaux qui ne sont pas utilisés dans les projets de recherche. Compte-tenu de la nature du projet, aucun test statistique n’est utilisé. Le nombre d’animaux total a été calculé sur la base des productions des années antérieures. Le projet requiert l’utilisation de 180 000 animaux sur une période de 5 ans.
Raffinement
Comme défini dans l'agrément de notre établissement, les animaux sont stabulés dans des hébergements standards dans lesquels il y a un contrôle de la température et de l’hygrométrie, un cycle de lumière (12/12) et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau . Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et disposent d’un enrichissement de nidification. La manipulation et les prélèvements sont effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Un transfert d’odeurs est réalisé sur les gants de l’opérateur pour minimiser le risque de rejets des nouveaux- nés par la mère ou de cannibalisme . Une surveillance quotidienne est réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis.
Choix des espèces
Les équipes de recherche du centre travaillent sur le modèle souris. Par conséquent, la plateforme animalerie produit les souris génétiquement modifiées et collecte des échantillons d’ADN (biopsie de queue) de manière précoce dans le but de caractériser le génome. Pour les besoins des activités de recherche, une identification et un génotypage précoce sont requis. Les deux interventions sont réalisées à l’âge de 3 à 6 jours post natal.
Le TWEAK soluble, un nouveau biomarqueur de la neuro-inflammation au cours de la sclérose en plaques ?
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une encéphalomyélite auto-immune leur est induite par injection, provoquant une paralysie partielle, une perte de poids et des troubles du comportement, avec mise à mort dès un score clinique élevé maintenu deux jours. Le projet cherche à valider une protéine sanguine comme biomarqueur de suivi de la sclérose en plaques. Le porteur revendique un modèle "crucial et indispensable" tout en décrivant les modèles in vitro et la cohorte humaine qu'il utilise en parallèle.
Objectifs
L'objectif global de notre étude est de déterminer si la protéine TWEAK du sang peut être utilisée comme indicateur par les médecins pour le suivi des patients atteints de sclérose en plaques (SEP). À cette fin, nous devons d'abord déterminer quelle est la fourchette normale des valeurs de TWEAK dans le sang et quels sont les facteurs qui influencent son dosage (par exemple, les variations de la protéine au cours de la journée, la production d'anticorps contre TWEAK, etc.). Dans un deuxième temps, nous regarderons s’il y a une relation entre la quantité de cette protéine dans le sang et l'inflammation qui se produit dans le cerveau, et si/comment TWEAK pénètre dans le cerveau à partir du sang. Enfin, nous étudierons les avantages potentiels de la production d'anticorps dirigés contre TWEAK par certains patients et déterminerons s’ils les protègent de certains effets de la maladie. De plus, les symptômes gastro-intestinaux sont fréquents dans la SEP. Un de nos objectifs est aussi de déterminer si pendant la SEP chez la souris, des troubles des fonctions du tube digestif apparaissent en lien avec le système nerveux et TWEAK.
Bénéfices attendus
Actuellement, il n'existe pas d'outils non invasifs et fiables pour le suivi des patients atteints de SEP. Nous proposons cet outil de biomarqueur sanguin pour le suivi neuroinflammatoire de ces patients. L'utilisation du modèle murin d'EAE est cruciale et indispensable en ce sens. Actuellement, nous ne sommes pas en mesure de suivre les patients de manière rigoureuse et quantitative. Nous nous fions aux IRM utilisant un rehaussement à base de gadolinium pour indiquer la charge de la maladie. Cependant, nous ne sommes pas conscients des problèmes à long terme des agents de contraste utilisés durant l'IRM, et elles restent inaccessibles et coûteuses pour la plupart des patients, notamment ceux qui vivent loin des hôpitaux ou centres d’IRM. Enfin, en plus des IRM, les neurologues dépendent des symptômes cliniques du patient pour évaluer et réévaluer le succès des thérapies de modification de la maladie. Ces symptômes restent qualitatifs et des études ont montré qu'ils n'ont aucune corrélation avec ce qui se passe au niveau du SNC. Par conséquent, l'avantage de notre étude est de mettre au point un outil capable de mesurer la neuroinflammation et la progression de la maladie de manière quantitative, non invasive, peu coûteuse et accessible. De plus, l’étude exploratoire concernant les effets gastro-intestinaux de TWEAK pendant l'EAE nous permettra de comprendre les effets de cette cytokine sur un symptôme très courant chez les patients SEP et impactent la qualité de vie. Cette étude pourra fournir des informations precieuses pour comprendre les interactions entre l'axe cerveau-intestin médié par l'interaction du système immunitaire avec les deux qui sont sous-jacents à ces symptomes. En fin, toutes nos études peuvent aider à identifier de nouvelles cibles therapeutiques pour la neuroinflammation et les symptomes gastro-intestinaux chez les patients atteints de SEP, tout en contribuant à une meilleure comprehension des interactions entre ces differents systems durant la santé et la maladie.
Procédures
Parmi les 240 animaux, 150 seront induits en EAE. Ces animaux subiront deux injections pour induire l'EAE. Parmi ces 150, 30 recevront une injection de TWEAK murin recombinant une fois, et nous prevoyons de prélever du sang sur 30 autres animaux à trois reprises sur une période de 24h sous anesthésie gazeuse. Ces deux protocoles, seront réalisés par un manipulateur expérimenté.
Impact sur les animaux
Nos animaux modéliseront la SEP et on observera donc une diminution de la mobilité. Le modèle EAE est bien établi et constitue le modèle de SEP le plus utilisé avec plus de 15 000 publications depuis sa découverte . Le pic de sévérité de l'EAE se manifeste entre 21 et 23 jours après l'induction de la maladie, où on peut observer une paralysie partielle, ainsi qu’une diminution du poids corporel et de la consommation de nourriture et à des troubles du comportement. Ces effets indésirables peuvent persister tout au long de la période de la maladie. Une récupération partielle peut être observée à partir de 20 jours environ.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort 21 à 23 jours après l'induction à l'EAE. Cependant, si les souris atteintes d'EAE présentent des manifestations cliniques graves, mesurées par un score clinique égal ou supérieur à 4 pendant deux jours consécutifs, elles seront mises à mort avant cette periode pour éviter une souffrance plus longue.
Remplacement
Notre équipe est engagée dans la réduction de l'utilisation des modèles animaux autant que possible, tout en garantissant que nos travaux de recherche soient pertinents et fiables. Nous avons déjà mis en place des modèles in vitro pour réduire au maximum le nombre d’animaux qui serviront au progres scientifiques dans notre projet, mais dans le cadre de notre étude, le modèle murin d'EAE est le mieux adapté à notre objectif. Notre exploration combine des modèles in vitro, des modèles de souris et des travaux cliniques. Nous allons donc réduire notre dépendance à l'égard de l'extrapolation de données provenant d'animaux en utilisant des lignées cellulaires qui imitent l'organisme humain au niveau cellulaire. Par exemple, nous n'utiliserons pas le modèle murin pour déterminer comment, au niveau transcriptomique et moléculaire, TWEAK module l'inflammation. Nous utiliserons plutôt des lignées cellulaires immortalisées humaines d'intérêt, telles que des lignées cellulaires permettant d’établir un modèle de barrière hémato-encéphalique, de macrophages, etc. Pourtant il est à l’heure actuelle impossible de retracer l'origine et le devenir de la molécule TWEAK dans un système in vitro suffisamment abouti pour reproduire la complexité des interactions moléculaires, cellulaires, et multisystemiques dans l’organisme. En d'autres termes, il n'existe pas de cadre complet utilisant par exemple des organoïdes qui imiteraient le métabolisme d'une cytokine in vitro pour examiner sa cinétique à partir du cerveau, du foie, des reins, des poumons et d'autres organes pertinents. De plus, nos études d'IRM seront directement effectuées sur notre cohorte humaine, allégeant ainsi la charge d'utilisation de souris supplémentaires. Nous allons également directement incuber les cellules humaines avec les sérums de patients SEP au lieu d’injecter des souris avec
Réduction
Nous prenons au sérieux notre engagement à minimiser l'utilisation d'animaux et à respecter les principes des 3R dans nos recherches. Nous nous limitons donc réellement aux expériences et protocoles indispensables, évitant les répétitions inutiles et utilisant des méthodes alternatives lorsqu'elles sont disponibles. Comme on peut le constater dans la section 4.2, le nombre d'animaux que nous prévoyons d'utiliser est adéquat et rigoureux : il n'implique pas un trop grand nombre d'animaux (et donc un gaspillage), tout en conservant sa force statistique. Nous avons déterminé le nombre minimal et nécessaire d’animaux à n = 240 (90 témoins et 150 EAE). Il est important de noter que nous utilisons les mêmes animaux pour réaliser diverses expériences plutôt que d'en utiliser davantage. Nous pensons que le partage des animaux et du matériel biologique est nécessaire pour réduire le nombre d'animaux requis. Ainsi, lorsque cela est possible, nous prélèverons tous les organes dont nous avons besoin sur les mêmes animaux que ceux utilisés pour d'autres protocoles. Il convient de noter que nous n'utiliserons que des femelles, car l'inoculation de l'EAE chez elles a un taux de réussite plus élevé que chez leurs homologues masculins, ce qui contribue une fois de plus à réduire le nombre d'animaux. De plus, nous utilisons des tissus cérébraux de souris EAE conservés d’études précédentes pour effectuer les mises au point techniques préliminaires.
Raffinement
Nous sommes conscients que des souris en bonne santé sont essentielles pour mener une science de qualité, et nous nous engageons à prendre en compte le bien-être de nos animaux dans toutes les étapes de notre recherche. Nos protocoles d'induction de l'EAE se font par immunisation avec un peptide et l'administration d'une toxine (en sous-cutanée). Nous effectuerons des visites quotidiennes aux souris et les pèserons quotidiennement pour nous assurer qu'elles sont correctement nourries et nous surveillerons leur comportement et leur état général en nous basant sur la grille d’évaluation des symptômes cliniques de l'EAE dont le score va de 0 à 5. (0 : Aucune modification, 1 : queue molle, 2 : queue molle et faiblesse des pattes arrière, 3 : queue molle et souvent paralysie complète des pattes arrière, 4 : queue molle, paralysie complète de la patte arrière et partielle de la patte avant, 5 : la souris se roule spontanément dans la cage et la mise à mort et recommandée). Ainsi dès le score 2, nous surveillerons la prise hydrique et alimentaire et nous mettrons en place une analgésie, qui sera ajustée en fonction du score. Si les animaux n’arrivent pas atteindre la nourriture et l’eau du fait des troubles moteurs, nous mettrons la nourriture et l’eau à même le plancher de la cage. L’euthanasie est envisagée à partir d'un score 4 observé deux jours consécutifs. Le microenvironnement des souris sera enrichi de dômes en plexiglas ou en carton. Les souris auront accès à de la nourriture et de l'eau fraîches en permanence. Les conditions de logement pour les souris seront optimisées ; les cages seront aménagées pour permettre aux souris d'exercer leur comportement naturel et leur offrir des environnements enrichissants. Les stimuli de l'environnement extérieur seront réduits au minimum pour éviter de stresser les souris, et on maintiendra le nombre d’animaux par cage à 5.
Choix des espèces
Le modèle EAE a permis la publication de plus de 15000 articles et a servi de point de départ au développement de différentes thérapies pour la SEP. Il existe plusieurs modèles expérimentaux de la SEP mais qui ne reproduisent pas tous les symptômes physiques ou les mécanismes physiopathologiquees de la SEP. Le modèle EAE MOG est pertinent pour étudier la SEP sur son versant inflammatoire. Les souris EAE ont des voies immunitaires et de signalisation similaires à celles des humains et sont plus facilement manipulables que d'autres animaux tels que les primates. Puisque nous nous intéressons à l'évolution clinique et l’aspect inflammatoire de la maladie, le modèle murin EAE est le plus pertient. Des souris âgées de huit à douze semaines seront utilisées pour l'induction de l'EAE. Ce stade de development est couramment utilisé dans de nombreuses études. À ce stade, les souris sont considérées comme étant à l'âge adulte et leur système immunitaire est développé, les rendant plus susceptibles à l'EAE. De plus, c'est à ce moment-là que la prévalence de l'EAE est maximale (i.e., plus prévisible), ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilises. À mesure que les souris vieillissent, leur réponse immunitaire peut varier, ce qui rend l'induction de la maladie plus variable. D’autre part, il est préférable d'éviter d'utiliser des souris plus jeunes car leur système immunitaire n'est pas encore complètement développé, et elles ont également une myéline plus immature. Ces facteurs peuvent entraîner une variation importante dans la susceptibilité de l'animal à développer la maladie.
Régénération du nerf facial chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une section chirurgicale du nerf facial suivie de la pose d'un conduit de régénération, ce qui provoque une paralysie faciale durant au moins un mois, avant une seconde anesthésie sans réveil pour prélever le nerf. Le projet évalue la capacité d'un conduit issu du cordon ombilical à réparer le nerf facial. Le porteur indique un risque de douleur, d'inflammation et d'abcès, et présente le rat comme un "modèle privilégié" en raison de sa proximité anatomique avec l'humain.
Objectifs
Le nerf facial (NF) est responsable de la motricité de l’hémiface correspondante. Il joue un rôle majeur fonctionnel dont l’atteinte est responsable d’une paralysie faciale entrainant des séquelles précoces (fonctionnelles et esthétique) et tardives (contractures musculaires, syndromes sécrétoires…). A ce jour, plusieurs techniques chirurgicales de réhabilitation sont utilisées dont le but est la récupération motrice des muscles de la face via une réinnervation après remise en continuité nerveuse. On peut citer les sutures péri nerveuses directes ou l’autogreffe de nerf périphérique. L'objectif est d'évaluer la capacité d'un conduit issu du cordon ombilical à permettre une régénération nerveuse du nerf facial.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus sont une récupération de la fonction faciale la plus optimale, dont l’analyse est basée sur des critères objectifs, grâce à la stimulation de la régénération nerveuse par conduit de régénération nerveuse issu de vaisseaux ombilicaux. L’objectif est d’obtenir des résultats sur le rat avant d’élaborer un programme de recherche clinique sur l’Homme.
Procédures
La procédure prévoit une première intervention de 45 minutes consistant en une section/résection chirurgicale du nerf facial et interposition d'un conduit de régénération nerveuse entre les deux sections de nerfs par suture directe sous anesthésie générale. Les rats seront ensuite réveillés et surveillés quotidiennement à l'animalerie avec accès libre à l'eau et la nourriture pour une durée de 8 semaines pour les 20 premiers et une durée de 16 semaines pour les suivants (nombre calculé sur la base de la 1ère phase d'expérimentation). Une seconde anesthésie générale permettra la réalisation de tests evaluant la récupération de la fonction du nerf facial. Le nerf facial régénéré sera ensuite prélevé pour analyse. Les rats seront ensuite euthanasiés, au cours de la même anesthésie générale.
Impact sur les animaux
- Anesthésie générale d'une durée de 45min nécessaire pour l'exposition du nerf facial, sa section et sa réparation. - Isolement des animaux pendant 3h après l'intervention pendant le temps du réveil et afin d'éviter toute mutilation de la cicatrice avec un congénère avant d'être remis à 2 par cage. - Paralysie faciale du rameau buccal du nerf facial induite par la procédure d'une durée minimale d'un mois, et dont la rapidité de récupération sera évaluée. - En cas de trouble de la cicatrisation de l'incision de la joue, les conséquences pourront être une douleur et un état inflammatoire local (rougeur, oedème, suintement, chaleur local), et pouvant aller jusqu'à l'abcès local.
Devenir
A l'issu de la première intervention, les animaux seront maintenus en vie et hébergés dans l'animalerie avec libre accès à l'eau et la nourriture. Cette période est nécessaire afin d'évaluer la récupération clinique de la fonction faciale au cours du temps par un score de mouvement des vibrisses. A la fin de la procédure, une anesthésie générale sans réveil sera réalisée puisque le prélèvement du nerf est nécessaire aux analyses histologiques.
Remplacement
Le principe de remplacement a été utilisé pour mettre au point la technique opératoire de suture du conduit de régénération sur le nerf facial. Ces conduits ont été utilisés et manipulés au préalable pour vérifier leur capacité de résistance aux fils de suture via des expérimentations préliminaires sur fil de silicone. La composition optimale de l'hydrogel a pu être déterminé au préalable afin d'éviter des échecs au cours des procédures chirurgicales sur les animaux. Afin d'évaluer la régénération nerveuse d'un point de vue fonctionnel clinique (score de mouvement des vibrisses), electrophysiologiques (enregistrement de l'activité nerveuse) et histologique (sur prélèvement complet de nerf), le modèle animal est nécessaire. Le rat est choisi du fait de sa proximité anatomique avec l'Homme concernant le nerf facial.
Réduction
Le principe de réduction est utilisé via la réalisation d'un protocole Go-no Go. En effet, à l'issue du premier "round" de 20 animaux, si une condition est jugée d'emblée innefficace, elle ne sera pas réutilisée lors du second "round", et le nombre de sujets nécessaires aura pu être calculé afin d'utiliser le nombre de rat minimal. Par ailleurs, les deux rameaux buccaux du nerf facial seront utilisés afin de réduire le nombre d'animaux utilisé. Une section et suture directe "enveloppée" par le conduit sera réalisée du côté droit. Une résection de 4mm de nerf facial et suture du conduit aux deux extrémités libres du nerf sera réalisée du côté gauche.
Raffinement
L'expérimentation sera réalisée dans le respects des textes réglementaires relatifs à la protection et à l'utilisation des animaux de laboratoire. Le projet s'inscrit dans une démarche éthique suivant la règle des 3R en optimisant les conditions de vie, d'hébergement et de soins des animaux. En post-opératoire immédiat les animaux seront isolés 3h le temps du réveil et afin d'éviter toute mutilation de la plaie opératoire avec un congénère. Puis, pour leur bien-être, les animaux opérés seront remis à deux par cage. Les soins prodigués aux animaux ainsi que les conditions d'hébergement (température, dimension cage, luminosité, bruit, enrichissement...) seront conformes à l'arrêté du 1er fevrier 2013 fixant les conditions d'hébergement des animaux utilisés à des fins scientifiques. Une évaluation des points limites selon l'échelle validée et transmise au comité éthique sera effectuée à 3h, 12h, 24h, 36h et 48h puis de manière quotidienne durant toute la durée de l'expérimentation. Un score supérieur ou égal à 7 implique la mise à mort de l'animal afin d'éviter toute souffrance inutile. Pour chaque rat, une analgésie locale en sous cutanée sera réalisée durant l'intervention puis en post opératoire toutes les 4h durant 5 jours.
Choix des espèces
L’anatomie du nerf facial du rat est comparable à celle de l’Homme. Par ailleurs, le rat possède un nerf facial de taille relativement importante compte tenu de sa taille, facilitant les procédures chirurgicales. L'accessibilité de ce nerf, chirurgicalement, est aisée puisque la branche buccale est située sous le tissu cutané. La paralysie engendrée par la section de la branche buccale du nerf facial n'empêche pas le rat de se nourir et est facilement évaluable cliniquement par le mouvement des vibrisses. Ce modèle animal en fait un modèle privilégié des travaux de recherche de la régénération nerveuse.
Supplémentation en graine de chia de la rate obèse gestante : effet sur l’enrichissement en acides gras oméga-3 de la mère et du fœtus
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
256 rats vont être utilisés, dont 224 tués à l'issue et 32 femelles non gestantes réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les rates reçoivent un régime gras pendant six semaines pour les rendre obèses, puis une supplémentation en graine de chia pendant la gestation, avant d'être tuées un jour avant la mise bas avec leurs fœtus pour prélever plusieurs organes. Le projet étudie le transfert des oméga-3 vers le fœtus. Le porteur reconnaît qu'aucune transposition directe à la femme enceinte ne sera possible et qu'il n'existe pas de modèle in vitro équivalent.
Objectifs
Les lipides appelés acides gras oméga 3 jouent un rôle crucial dans le développement du cerveau du fœtus pendant la grossesse. Il existe plusieurs types d’acides gras oméga 3, une première catégorie (gras oméga 3 essentiels) qui doit être apportée par l’alimentation car elle n’est pas fabriquée par le corps humain et une deuxième catégorie, nécessaire pour le développement du cerveau, fabriquée à partir de la première mais en quantité très faible, insuffisante pour répondre au besoin de l’organisme. Ainsi dans des situations vulnérables comme la grossesse, la couverture de ce besoin est vitale pour le fœtus. Quelques études ont montré des effets bénéfiques d’une supplémentation en acides oméga 3 essentiels sur la santé de l’enfant. Malgré ces éléments favorables, aucune recommandation n’est faite chez la femme enceinte. Dans l’étude nationale ELFE, 75% des femmes enceintes sont en dessous des apports satisfaisants en acides gras oméga 3 essentiels qui sont de 2g/j. La graine de chia est connue pour être très riche en acides gras oméga 3 essentiels. Les résultats des études chez l’animal et des essais cliniques suggèrent que l’ajout des graines de chia dans l’alimentation de l’adulte augmente la concentration en ces deux catégories d’oméga 3. Cependant, aucune étude ne s’est intéressée au transfert de ces oméga-3 vers le fœtus à travers le placenta et à la quantité de ces oméga 3 dans la circulation fœtale qui influence le développement cérébral, suite à une supplémentation en graine de chia de l’alimentation des mères gestantes. Les objectifs du projet sont d’étudier si l’effet d’une supplémentation en graine de chia des rates gestantes (1) augmente la quantité en oméga 3 et particulièrement la deuxième catégorie de la mère au moment de la mise bas ; (2) améliore le métabolisme des oméga-3 dans le placenta et le transfert de ces nutriments importants, vers le fœtus à des périodes clés pendant la gestation et à la naissance. Cette étude se place dans un contexte d’obésité maternelle chez la rate gestante de souche Wistar, où il est connu que la formation de la deuxième catégorie des acides gras est plus faible.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de la supplémentation en chia sont une augmentation du stockage des acides gras oméga 3 dans le tissu adipeux maternel et de la transformation des oméga 3 essentiels en oméga 3 de deuxième catégorie dans le foie maternel résultant à une amélioration du rapport oméga 6/oméga 3 dans la circulation sanguine de la mère et du fœtus. Si des bénéfices en termes d’amélioration en acides gras oméga 3 sont observés la rate à l’issue de cette étude aucune transposition directe des résultats ne pourra être réalisée chez la femme et seule une étude clinique permettrait de le prouver. Supplémenter l’alimentation des femmes enceintes avec de la graine de chia, dès le début de la grossesse, serait envisageable puisque les doses utilisées chez la rate, sont celles déjà testées chez l’homme adulte, sans que des effets indésirables n’aient été observés. La prise en considération de la vulnérabilité accrue de la femme en période de grossesse serait évidemment à considérer.
Procédures
Les rates seront soumises à une manipulation nutritionnelle pendant les 6 semaines qui précèdent la gestation (régime gras), puis durant la gestation (graine de chia) (20 jours), et à un seul prélèvement de sang (2 min/animal).
Impact sur les animaux
Les rates seront soumises à une manipulation nutritionnelle pendant 6 semaines avant la gestation (régime gras modéré), qui peut engendrer une prise de poids modérée sans conséquence sur la posture et la mobilité de l'animal. Un léger stress de courte durée pourra être perçu lors du prélèvement de sang au niveau de la queue effectué par une personne habilitée. Au moment de l’accouplement, nous nous assurerons que la rate est en période d’ovulation avant de la mettre au contact du mâle pour éviter tout stress.
Devenir
Si aucun évènement n’a justifié l’euthanasie prématurée des animaux, ils seront euthanasiés aux temps de prélèvements de tissus préalablement établis dans les procédures expérimentales. Les rates sont suivies jusqu’à un jour avant la naissance, temps auquel elles sont euthanasiées, notamment pour un prélèvement de Sang, Foie, Tissu adipeux et glande mammaire. Les foetus seront euthanasiéà ce même temps, pour prélever placenta, cerveau et Cœur. Les femelles non gestantes (32 rates) seront recyclés dans la mesure du possible, vers les autres protocoles de l’animalerie.
Remplacement
Il s’agit d’une étude in vivo visant à évaluer des stratégies nutritionnelles sur la production de lait maternel. Il n’existe donc pas de modèle in vitro ou ex vivo permettant le remplacement de l’étude animale. Tous les animaux utilisés pour ce projet proviennent d’élevages reconnus et sont nés en captivité. Il n’existe pas encore de méthode alternative (modélisations, modèles in vitro) permettant de rendre compte de la complexité des mécanismes physiologiques dans la mise en place de la lactation, pendant la phase de gestation.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au minimum. Il prend en compte la nécessité d’avoir au moins 8 mères différentes par groupe expérimental pour des raisons de calcul statistique et de garder 3 fœtus mâles et 3 fœtus femelles par mère pour tenir compte d’un effet sexe et d’un effet « portée ».
Raffinement
Des mesures sont mises en place lors du seul prélèvement de sang au niveau de la queue, avec une analgésie locale qui sera appliquée 15 min avant l’incision. Les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel agréé et seront pesés 3 fois par semaine ce qui permettra de surveiller une éventuelle perte de poids et de vérifier leur état général. Les rats sont hébergés dans des portoirs ventilés avec différents enrichissements de milieu (frisottis, tunnels, morceau de bois) afin de réduire leur stress.
Choix des espèces
L'avantage du modèle rat sur le modèle porcin utilisé dans certaines références bibliographiques est la petite taille des animaux (permettant d'augmenter les effectifs et donc de diminuer la variance des mesures) et la rapidité de croissance et de reproduction, permettant de réaliser des protocoles expérimentaux en beaucoup moins de temps. Les mâles seront commandés à l’âge de 6 semaines et les femelles à l’âge de 4 semaines auprès du fournisseur. Les rates seront acclimatées pendant une dizaine de jours avant d’être mis sous régime « High Fat » pendant 6 semaines afin de les rendre obèses. Nous effectuerons ensuite des frottis vaginaux sur 4 jours afin de mettre uniquement les femelles en oestrus en accouplement. La supplémentation du régime alimentaire en graine de chia sera testée sur deux périodes,15ème (G15) et 20ème (G20) jours de la gestation qui correspondent à deux périodes importantes dans la croissance fœtale et particulièrement dans le développement du cerveau du foetus. Afin de déterminer l’impact de la supplémentation sur le métabolisme de la descendance, 3 fœtus mâles et 3 fœtus femelles par mère seront prélevés à G15 et G20.
Validation préclinique de séquences d’IRM multiparamétriquesur un modèle murin de sarcome des tissus mous EU1/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
22 souris vont être utilisées, dont 20 tuées à l'issue et 2 réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Partiellement immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules de sarcome humain sous la peau puis deux examens d'IRM, avant que la tumeur ne soit prélevée après mise à mort. Le projet vise à valider des séquences d'IRM pour évaluer les tumeurs sans biopsie. Le porteur justifie la mise à mort par le risque infectieux lié au statut immunodéprimé et affirme que la mesure du flux sanguin est "impossible" sur cultures cellulaires.
Objectifs
Dans les sarcomes des tissus mous, pathologie rare, de mauvais pronostic, et touchant les humains et les animaux à tout âge, il n’existe aucun marqueur pronostic ni prédictif de réponse à la radiothérapie. Ce projet permettra de valider in vivo à la fois de nouvelles techniques IRM permettant une évaluation de la biologie tumorale et de son hétérogénéité, et de valider des méthodes de traitement d’image pour isoler des sous-populations tumorales et ainsi mesurer des marqueurs endogènes. Ces thématiques de recherche sont celles de l’équipe. Les résultats de ce projet préclinique seront directement utilisables chez l’Homme sans nécessité d’autre expérimentation animale, dans le cadre d’un protocole approuvé. De même, une translation ultérieure en soins vétérinaires chez le chat et le chien est envisagée dans le cadre d’un projet. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs, un établissement pour l’hébergement et l’autre pour l’imagerie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra par ailleurs de relier les données d’IRM avec l’observation au microscope. Il est le préalable de projets cliniques chez l’Homme et en médecine vétérinaire afin d’utiliser ces mêmes séquences IRM, dans le but de prédire la réponse aux traitements et pouvoir poser des diagnostics sans avoir besoin de biopsie.
Procédures
Les souris sont des animaux partiellement immunodéprimés pour permettre une greffe de cellules tumorales d'origine humaine sans rejet. Les conditions d'hébergement et de soins sont adaptées au statut immunodéprimé des animaux. Dans l’EU1, les souris seront xénogreffées. L'injection sous la peau du flanc de cellule tumorale de sarcome humain, geste d'une durée de 20 secondes, comportera 2 lignées tumorales disponibles, déjà utilisées et validées. Un IRM sera réalisé dans l’EU2 un examen IRM d'une durée de 1h30 n’engendre pas de douleur. La seconde IRM d'une durée de 1h30, dans l’EU2, est précédée d’une injection intrapéritonéale d'un marqueur d'hypoxie. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie et après antalgie dans l’eau de boisson. Après la seconde IRM, les animaux seront mis à mort et les tumeurs seront prélevées dans l’EU2 pour analyse histologique.
Impact sur les animaux
Au plan du bien-être animal, les animaux ne présentent aucun déficit moteur ou social lié à cette injection sous la peau. Ils continuent donc d’être hébergés dans des conditions adaptées aux animaux immunodéprimés. La pousse tumorale peut se traduire par une protubérance au niveau du flanc. Celle-ci peut créer un inconfort et une gêne mais sans entraver la mobilité de l'animal.
Devenir
Du fait du phénotype athymique, ces souris seraient à risque infectieux local et systémique majeur après la chirurgie de retrait de greffe. Par ailleurs, une chirurgie carcinologiquement satisfaisante ne serait techniquement pas réalisable, et le risque de dissémination microscopique local et à distance rend ces souris à la fois à risque de récidive et inéligibles à des protocoles ultérieurs. La mise à mort s’avère donc nécessaire. Les animaux sont mis à mort pour pemrttre le prélèvmeent del a tumeur. compte tenu des risques liés à leur statut immunitaire et à la difficulté de l'intervention chirurgicale, l'extraction de la tumeur ne seriat pas bénéfique aux animaux.
Remplacement
Il s’agit dans un premier temps de mettre au point un protocole expérimental et de tester de nouvelles méthodes d’acquisition en IRM très haut champ magnétique, préalablement validés in vitro avant d’être appliqué à l’animal. L’autre objectif est une corrélation des données IRM avec des données biologiques. Il est nécessaire de passer par une expérimentation in vivo du fait de la mesure absolument nécessaire d’un flux sanguin (condition impossible sur cultures cellulaires) et d’une comparaison aux données microscopiques. L'examen IRM est basésur la détection de flux de liquides, dont le sang, ce qui est difficelement envisageable sur desm odèles non vivants et d'autre part, le projet s'intéresse non seulement à la tumeur mais aussi à son environnement et à sa vascularisation, lesquels sont encore à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro.
Réduction
L’IRM est une technique non-invasive et non-irradiante. Elle nous permet de réutiliser les animaux et donc de réduire leur nombre. Un total de seulement 22 souris sera utilisé pour obtenir suffisamment de données et pour valider la technique de mesure. Afin de pouvoir réduire au maximum le nombre d’animaux tout en permettant de tirer des conclusions statistiquement significatives, le nombre d’animaux (2 groupes de 11) nécessaire a été calculé sur les bases de tests non paramétriques et sur la base de données de prise de greffe lors de précédentes expérimentations. Par ailleurs chaque animal sera imagé 2 fois.
Raffinement
Afin que l'injection soit mieux supportée, elle sera effectuée en situation sous-cutanée, chez des souris déjà suffisamment développées, avec ajout d’antalgique dans l’hydratation, et avec un suivi rapproché. Le projet a été pensé pour obtenir des résultats à la fois fiables et dans un délai le moins étendu possible. Les deux examens IRM seront réalisés sous anesthésie générale et n’engendreront pas de stress pour l’animal. Les animaux seront récompensés sous forme alimentaire à leur réveil après l’anesthésie. Lors du transport entre les deux animaleries, 50m environ, les cages seront placées dans un chariot en prenant soin de les protéger de l'environnement extérieur qui pourrait les refroidir. Les cages seront recouvertes par une bâche. L'apparition de grosseur fera l'objet d'une surveillance régulière. Une évaluation de la souffrance de l’animal sera mise en place, avec adaptation de la prise en charge selon le score calculé, et en cas d’atteinte des points limites les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris est à la fois proche de l’Homme, accessible, et peut être analysée sur l’IRM à très haut champ. La résolution spatiale de l’appareil sera suffisante pour permettre une validation précise. Puis les souris immunodéficientes avec xénogreffe de sarcome des tissus mous humain permettront une validation technique de la méthode d’imagerie, une première confrontation entre les données de tissu tumoral d’origine humaine (xénogreffe) et l’anatomopathologie, et un suivi longitudinal. Nous utiliserons des sarcomes des tissus mous dont la lignée tumorale a déjà été utilisée plusieurs fois sur modèles animaux. De plus, la souris est l’animal le plus utilisé pour le développement de modèles pathophysiologiques et les outils d’analyse immunologiques sont bien maîtrisés à la fois dans le monde et dans notre équipe. Par ailleurs les résultats obtenus pourront être confrontés aux données existantes dans la littérature.
Prélèvements sanguins chez le cheval
- Recherche appliquée
- Maladies animales
4 chevaux vont être utilisés comme donneurs de sang pendant dix à vingt ans, avec une adoption envisagée à la fin, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent des prélèvements sanguins répétés sur animal vigile, jusqu'à 35 litres par an, pouvant provoquer déshydratation, apathie et perte de poids. Le sang collecté sert à fabriquer deux médicaments vétérinaires commercialisés en Europe. Le porteur indique qu'il n'existe "pas de méthode de remplacement" et précise que les chevaux pourront être tués en cas de contamination ou de dégradation de leur état.
Objectifs
Les boiteries associées à des problèmes ostéo-articulaires dégénératifs non-infectieux et des lésions tendineuses ou ligamentaires chez le cheval représentent un problème de santé mondial d’envergure qui compromet la carrière sportive de nombreux chevaux et/ou le bien-être animal. De nombreux traitements vétérinaires médicaux indiqués pour ces pathologies présentent des limites : effets secondaires, réduction des symptômes sans prévention d’une nouvelle dégradation de la lésion, absence de régénération tissulaire, lésion du cartilage, temps d’attente avant compétitions,… Ce projet permettra la mise en place d’un deuxième site de chevaux donneurs de sang afin de sécuriser l’approvisionnement des médicaments vétérinaires titulaires d’une autorisation de mise sur le marché en Europe.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de sécuriser l’approvisionnement de deux médicaments vétérinaires commercialisés en Europe avec la mise en place d’un deuxième site de chevaux donneurs de sang. En fournissant la matière première (sang de cheval), ce projet permettra permettant la fabrication des médicaments vétérinaire qui permet le traitement de l’inflammation articulaire chez le cheval et de réduire la boiterie associée, ainsi que la cicatrisation des blessures des tendons et des ligaments suspenseurs chez les chevaux.
Procédures
Les animaux sont soumis à des prélèvements sanguins uniquement. Les prélèvements s'effectuent sur des animaux vigiles. les prélèvements peuvent s'effectuer avec une 1 semaine de repos minimum et allant jusqu'à 4 semaines. Une durée de 30 minutes est prévue par litre de sang.
Impact sur les animaux
Des prélèvements sanguins seront effectués sur les chevaux à des fréquences régulières dans un espace dédié. Les contentions liées à ces prélèvements peuvent générer du stress chez les animaux. Des prélèvements volumineux et répétés pourraient entraîner dans la foulée du prélèvement sanguin des symptômes d’intensité faible à modérée comme : une déshydratation, de l’apathie, une diminution de l’hématocrite et/ou de façon plus chronique une perte de poids.
Devenir
À la fin de la période d’utilisation du cheval (entre 10 et 20 ans), si le cheval présente un bon état physique/clinique, il pourra être (sur décision du vétérinaire désigné) mis à l’adoption. Cependant, les chevaux pourront éventuellement être mis à mort pour autopsie, prélèvements d’organes ou de tissus et analyses complémentaires : - En cas de positivité à un des pathogènes spécifiques de la liste d’exclusion et si seulement des examens complémentaires post-mortem sont nécessaires. - En cas d’une détérioration anormale de l’état clinique de l’animal, et si suite à un examen clinique de l’animal par un vétérinaire, des points limites sévères sont atteints.
Remplacement
Il n’y a pas de méthode de remplacement à ce jour (médicament avec AMM et commercialisé en Europe).
Réduction
Un total de 4 chevaux, incluant les périodes de quarantaine et de qualification des chevaux, est nécessaire pour avoir à minima 2 chevaux qualifiés par an pour les prélèvements sanguins dans le but d’atteindre une production de 35L de sang par an progressivement. Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés, les chevaux seront gardés le plus longtemps possible (environ entre 10 et 20 ans) si leurs statut sanitaire et condition physique leur permettent de rester qualifiés.
Raffinement
Les chevaux pourront être isolés physiquement de leurs congénères pendant des périodes de quarantaine mais continueront à avoir un contact visuel et auditif avec eux. Afin de diminuer le stress généré pendant cet isolement, un contact quotidien avec l’Homme sera poursuivi. Une période d’acclimatation systématique avant prélèvement sanguin est prévue dans le but de limiter leur stress. Un entrainement aux différentes conditions nécessaires aux actes sera mis en place : acceptation du licol, marche en longe, habituation à la zone dédiée de prélèvements sanguins et plus particulièrement au travail. Cet entrainement sera effectué de façon progressive avec du renforcement positif (récompenses : friandises, caresses et ou clicker). Les animaux sont observés quotidiennement, ou plus si jugé nécessaire, ce qui permet de détecter tout signe comportemental anormal et ou toute anomalie clinique non attendue. En cas de déviation de l'état normal d'un animal, le vétérinaire désigné ou le vétérinaire d'astreinte, décidera d'augmenter les fréquences d'observations, d'isoler l'animal (e.g. : paddock isolé ou infirmerie) et ou d'envisager un traitement pour soulager l'animal. Des points limites seront définis pour apporter des soins adaptés ou un arrêt temporaire des prélèvements sanguins avec d’autres soins ou une euthanasie si nécessaire. Du fourrage sera distribué de façon ad libitum et des concentrés seront ajoutés en cas de prélèvements volumineux répétés dans le temps et ou de perte d’état d’embonpoint. Les chevaux pourront boire avant et après le prélèvement. Des solutions de réhydratation pourront être administrées après un prélèvement en cas de déshydratation. Un hématocrite de contrôle sera effectué après les prélèvements supérieur à 2,5L. En cas d’hématocrite inférieur à 25 pourcents, des mesures seront mises-en-place : réhydratation orale ou systémique du cheval, traitement adapté, distribution de concentrés, isolement du cheval. Des mesures aseptiques seront mises en place pour la réalisation des prélèvements sanguins, le personnel sera formé et qualifié pour effectuer ces gestes techniques, une alternance de ponction des veines jugulaires sera mise en place. La Structure du Bien Être Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
Espèce cible des pathologies traitées. Les chevaux utilisés : sont nés et élevés en Europe ; ont entre 3 et 10 ans (pour la production de cellule-souches) ou 20 ans (pour la production de diluant) ; doivent être indemnes de toute anomalie clinique et d’une liste de plus de 20 pathogènes spécifiques.
Evaluation préclinique d’une immunothérapie innovante dans la Maladie d’Alzheimer et autres pathologies liées à la protéine Tau chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
2 286 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles portent des modèles de la maladie d'Alzheimer ou un système immunitaire déficient, et subissent une biopsie sur souriceau vigile, jusqu'à 59 injections dans l'abdomen, des prélèvements sanguins répétés et des tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le projet vise à évaluer une immunothérapie ciblant les cellules immunitaires liées à la protéine Tau. Le porteur affirme que ces interactions ne peuvent être reproduites en culture cellulaire et juge le modèle animal "totalement indispensable".
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est une pathologie neurodégénérative caractérisée par la perte progressive de la mémoire et des fonctions cognitives. Elle est définie par deux types de lésions cérébrales : celles liées à la protéine A-Béta, et celles liées à la protéine Tau. Ces agrégats protéiques induisent une réaction immunitaire à plusieurs composantes. La première composante, consiste en une inflammation chronique cérébrale pouvant avoir des effets bénéfiques ou délétères. Des études récentes ont montré l’existence d’une seconde composante, par laquelle des cellules immunitaires infiltrent le cerveau et promeuvent la progression du déclin cognitif. Plusieurs analyses chez l’Homme et dans des modèles expérimentaux suggèrent que ces cellules ont un rôle délétère dans la MA. Des études ont montré que la modulation de ces cellules immunitaires délétères permet de réduire la perte de mémoire et de modifier l’inflammation cérébrale dans un modèle murin de pathologie A-Béta. Ces cellules immunitaires régulatrices pourraient également contrôler les réactions immunitaires pathogènes liées à la protéine Tau pathologique. Sur la base d’études pré-cliniques dans un modèle murin de pathologie Tau, l’objectif de ce projet est d’évaluer une approche thérapeutique innovante ciblant les cellules immunitaires dans la MA et d’autres pathologies liées à la protéine Tau.
Bénéfices attendus
La Maladie d’Alzheimer (MA) touche environ 1 million de personnes en France, avec 225 000 nouveaux cas chaque année. Cette maladie, sans traitement, nécessite une prise en charge importante liée à la perte d’autonomie des patients. Des études précliniques antérieures dans un modèle murin de MA ont apporté la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique d’un traitement à faible dose d’une molécule. Cette preuve nous a permis d’initier un premier essai clinique pilote pour évaluer l’efficacité thérapeutique de ce traitement modulant les réponses immunitaires délétères dans la MA précoce. Ce projet vise à présent à évaluer et établir la preuve de concept pré-clinique de l’efficacité accrue d’une nouvelle approche ciblant les réponses immunitaires pathogènes associées aux agrégats de protéine Tau. Ces études devraient ouvrir la voie au développement de nouveaux essais cliniques thérapeutiques dans la MA et dans d’autres maladies neurodégénératives, dans le but de proposer une prise en charge plus efficace aux nombreux patients touchés par ces maladies.
Procédures
Les animaux modèles de la Maladie d’Alzheimer développent une maladie neurodégénérative avec des déficit cognitif au cours du temps. Un autre modèle animal utilisé dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rends plus sensible aux infections. Les animaux seront identifiés génétiquement à l’aide d’une biopsie (inférieur à 1mm) effectuée de manière précoce sur animal vigile. Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à des injections répétées au niveau de l’abdomen (intra-péritonéale) à raison d’un maximum d’une injection quotidienne durant 3 semaines à l’âge de 3 mois puis de rappel toutes les 3 semaines durant 5 jours jusqu’à l’âge de 9 mois (environ 20 secondes par injection). Les injections seront réalisées sur animal vigile avec au minimum 1 injection et au maximum 59 injections intra-péritonéales sur la durée du traitement. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile toutes les semaines durant 3 semaines puis au maximum toutes les 2 semaines sur la durée du traitement (environ 30 secondes à 1 minutes par prélèvement). Les animaux seront prélevés entre 1 et 9 fois sur la durée du traitement. Des tests comportementaux seront effectués à l’âge de 9-10 mois. Ces tests durent entre 5 et 20 minutes chacun ; certains ne sont effectués qu’une seule fois, d’autres sont répétés tous les jours pendant 6 jours. Les souris seront habituées au lieu d’évaluation au préalable et auront un repos de 24h minimum entre chaque test. Enfin, les animaux seront euthanasiés selon différentes méthodes réglementaires à l’issue de la période de maintien prévue en vue des prélèvements et analyses.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec des déficit cognitif au cours du temps. Cela pourrait entrainer des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). Un autre modèle animal utilisé dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rend plus sensible aux infections. La biopsie (
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires. Une première partie dans le cadre du maintien des lignées sera euthanasiés en fin de période reproductive sans réalisation de prélèvement. Une seconde partie euthanasiée afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact du traitement sur les différents marqueurs de progression de la pathologie.
Remplacement
L’ensemble de ce projet vise à mieux comprendre les interactions neuroimmunes au cours des maladies neurodégénératives. Il nécessite donc l’utilisation d’un système expérimental intégré, permettant de comprendre la physiologie du système nerveux central et ses interactions encore mal connues avec le système immunitaire. Ces interactions ne peuvent être reproduites par des cultures cellulaires, qui ne permettent que l’étude du contact entre les cellules immunitaires et les cellules nerveuses. Or, ce type d’interaction ne constitue qu’une fraction minoritaire des échanges en jeu dans les maladies neurodégénératives. Des simulations informatiques ont également été effectuées et nous ont permis de valider que des réponses immunitaires spécifiques contre la protéine Tau étaient possibles. Cependant, l’effet de la modulation de ces réponses sur les maladies neurodégénératives ne peuvent être évaluées que dans un organisme vivant. Un modèle animal est donc de ce fait totalement indispensable.
Réduction
Le projet impliquera un total de 2286 souris. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Les souris utilisées pour une partie des analyses biologiques seront les mêmes animaux que ceux utilisés pour les tests comportementaux. Par ailleurs, une analyse statistique sera réalisée et nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
L’ensemble des procédures réalisées au cours de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.) quand cela est compatible avec les expériences. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi, etc.). De plus, la lignée utilisée est déjà bien caractérisée et connue de l’équipe, et les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est une espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. Il s’agit également d’une espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux des pathologies neurodégénératives et de lignée immunodéficiente nécessaire à la mise en œuvre de ce projet. Justification des stades de développement : Dans le cadre de l’entretien des modèles transgéniques à phénotype potentiellement dommageable, les animaux seront utilisés à partir de la maturité sexuelle (8 semaines). Dans le cadre des traitements, ils seront initiés à l’âge de 3 mois, correspondant au stade précoce de la pathologie. Les animaux seront ensuite analysés à 9-10 mois (âge normal d’apparition des troubles cognitifs). Justification du sexe : Concernant les modèles transgéniques utilisés, nos résultats préliminaires indique qu’il existe une différence de phénotype comportemental et neuroimmunitaire entre mâles et femelles. Ainsi, l’ensemble des expériences sera réalisé sur les deux sexes de manière indépendante.
Étude des effets d’une modification protéique, l’O-GlcNAcylation, sur le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique durant la gestation chez le rat Wistar.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
964 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles reçoivent un régime gras et sucré pendant plusieurs semaines, une injection sous-cutanée quotidienne et des gavages de glucose répétés pendant la gestation, avant d'être tuées un jour avant la mise bas pour prélever leurs organes et ceux des fœtus. Le projet cherche à comprendre le rôle d'une modification protéique dans l'hypertrophie cardiaque liée au diabète gestationnel. Le porteur affirme que reproduire le développement cardiaque in vitro n'est "pas envisageable" et juge l'usage d'animaux "indispensable".
Objectifs
Les défauts cardiaques et l’hypertrophie myocardique sont 3 fois plus fréquents chez des enfants de mères diabétiques. L’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel a longtemps été considérée comme une conséquence de l’hyperinsulinémie fœtale. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire conduisant à l’hypertrophie cardiaque dans un contexte de diabète gestationnel n’a été validé. L’identification et la compréhension de ces mécanismes sont des enjeux scientifiques et cliniques afin d’améliorer la prise en charge des patients. L’O-GlcNAcylation est une modification protéique qui est augmentée lors d’hyperglycémie et qui a été démontrée comme étant impliquée dans l’hypertrophie cardiomyocytaire. L’hypothèse de ce projet est que l’augmentation des niveaux d’O-GlcNAcylation associée à l’hyperglycémie, pourrait être un facteur pathogénique de l’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel. Les objectifs de ce projet sont : (1) Définir l’implication de l’O-GlcNAcylation dans le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique au cours de la grossesse (2) Identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans les atteintes du développement cardiaque induites par l’hyper O-GlcNAcylation.
Bénéfices attendus
Les défauts cardiaques et l’hypertrophie myocardique sont 3 fois plus fréquents chez des enfants de mères diabétiques. L’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel a longtemps été considérée comme une conséquence de l’hyperinsulinémie fœtale. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire conduisant à l’hypertrophie cardiaque dans un contexte de diabète gestationnel n’a été validé. Les bénéfices associés à ce projet sont 1) une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique dans un contexte de diabète gestationnel et 2) identifier des cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux subissent 1 unique procédure qui correspond à une alimentation standard ou riche en sucre et lipides sur une période de 9 à 17 semaines. 1 jour avant l’accouplement et jusqu’au sacrifice ou la mise bas les mères recevront une fois par jour, une injection sous cutanée de NButGT afin d’augmenter les niveaux de O-GlcNAcylation indépendamment de la diète. Entre la 12ème semaine d’âge et jusqu’à la mise bas, 1 fois par semaine, des tests de tolérance au glucose oral ainsi que des mesures de glycémie seront réalisées afin de valider l’intolérance au glucose. Le test de tolérance au glucose orale consiste en un gavage oral de glucose et au suivi de la glycémie sur les 2 heures suivantes. Les mesures de glycémie sont réalisées grâce à un glucomètre avec prélèvement d’une goutte de sang à la queue des animaux. L’étude de l’impact structurel et fonctionnel du diabète +/- O-GlcNAcylation sera réalisée via une échocardiographie et un électrocardiogramme sur les animaux à 60 jours post naissance. A la fin de cette période, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les différents organes (cœur, aorte, rein, poumons, foie, sang).
Impact sur les animaux
L’alimentation riche en sucre et gras utilisée dans ce projet est une alimentation très bien décrite dans la littérature. A ce jour, aucune étude n’a démontré une modification délétère du phénotype des animaux nourris avec cette diète. L'injection sous cutanée peut entrainer une inflammation localisée qui sera surveillé quotidiennement.
Devenir
A la fin de la procédure (procédure sans réveil), l’ensemble des animaux seront euthanasiés. Après euthanasie, le cœur, l’aorte, les poumons, les reins, le foie et le sang seront prélevés pour des analyses.
Remplacement
Le développement cardiaque est un processus complexe et intégré faisant intervenir une multitude d’acteurs. Mimer le développement cardiaque par des approches in vitro n’est pas envisageable ; rendant l’usage d’animaux indispensable pour mieux comprendre le lien entre l’hypertrophie cardiaque, le diabète gestationnel et l’O-GlcNAcylation.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en ayant des données statistiques assez puissantes (dans la mesure du possible les tests seront réalisés en aveugle, afin d’augmenter la puissance de l’étude). Enfin, lorsque cela est possible, plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux, afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Au total, le nombre d’animaux maximal utilisé dans ce projet est de 964 animaux. Lors de la phase d’analyse, des tests statistiques type ANOVA 1 voie seront réalisés.
Raffinement
Après leur arrivée, les animaux seront placés par 3 dans des cages avec enrichissements et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Lors de la procédure d’accouplement et après cette dernière, les animaux seront placés individuellement dans des grandes cages avec enrichissements et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. L’alimentation et l’eau de boisson seront assurées par un membre de l’équipe, assurant une surveillance quotidienne des animaux. Lors de l'euthanasie des animaux, et lorsque cela est possible (euthanasie des mères, des animaux à 60 jours), une couverture anesthésique sera mise en place. L'euthanasie des animaux à 12 jours et à la naissance (J0) ne peut être réalisé respectivement que par dislocation et décapitation. Ces gestes sont connus de l’équipe qui y a régulièrement recourt et qui les maitrise.
Choix des espèces
Ce modèle est l’un des modèles les plus utilisés en recherche. De plus, notre équipe possède une expertise sur ce modèle animal, son comportement et sur l’ensemble des procédures associées. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’objectif du projet est d’étudier le lien entre une modification protéique, l’O-GlcNAcylation, et l’hypertrophie cardiaque pédiatrique dans un contexte de diabète gestationnel. Afin d’étudier l’impact sur le développement cardiaque, différents stades de développement sont nécessaires dans ce projet. L’utilisation d’animaux au stade embryonnaire E15,5 ; E20,5, à la naissance (J0), à 12 et 60 jours post naissance (J12 et J60), permet d’obtenir une information complète sur l’impact de l’O-GlcNAcylation lors du développement cardiaque embryonnaire et post-natal.
Etude de l’effet de peptides dérivés de l’endogline sur l’hémostase et sur l’angiogenèse chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 060 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines portent une maladie du saignement, avec hémorragies et malformations des vaisseaux, et subissent une coupure de la queue pour mesurer le temps de saignement, une ponction cardiaque ou la pose puis le retrait chirurgical d'implants aux flancs, pour tester des peptides contre une maladie génétique rare. Le porteur indique que des tests sur plaquettes humaines et une optimisation par ordinateur ont précédé ces expériences. Il présente la mise au point d'un traitement local comme "essentielle", les patients n'ayant aujourd'hui aucune solution sans risque.
Objectifs
Ce projet porte sur l’étude de peptides (séquence d’acides aminés), dérivés d’une protéine des vaisseaux sanguins. L’absence de cette protéine entraîne chez l’homme une maladie génétique rare, responsable de malformations des vaisseaux sanguins et de saignements de nez spontanés et récurrents. Au cours des 15 dernières années, plusieurs traitements ont été proposés mais aucun n’a été totalement efficace, entraînant soit des risques de formation de caillots dans le sang, soit une résistance ou une rechute de la maladie. Développer une nouvelle solution thérapeutique visant l’hémostase (le mécanisme permettant d’arrêter un saignement), et notamment les plaquettes serait essentiel pour traiter la maladie. Dans ce contexte, nous avons récemment démontré qu’un peptide dérivé de cette protéine est capable d’agir sur les plaquettes sanguines et de les agréger, permettant l’arrêt du saignement. Lors d’une étude préliminaire, nous avons montré que ce peptide est également efficace sur un modèle de souris mimant cette maladie, faisant de ce peptide une potentielle cible thérapeutique. Nous cherchons à optimiser ce peptide et avons identifié trois variants de sa séquence semblant améliorer son efficacité. Le but de ce projet est donc de tester sur différents modèles de souris l’efficacité des variants sur le temps de saignement, l’effet sur l’agrégation plaquettaire et l’effet sur la formation des vaisseaux sanguins.
Bénéfices attendus
Cette étude pourrait permettre de proposer une nouvelle solution thérapeutique au traitement d’une maladie génétique rare. En effet, à terme, le but est de développer un traitement local, qui non seulement arrêterait le saignement mais apporterait également un effet préventif. Les patients n’ayant à l’heure actuelle pas de traitement sans risque de complication, de résistance ou de rechute, le développement de nouvelles thérapeutiques améliorerait leur prise en charge.
Procédures
Une injection sous-cutanée d’analgésique (15 secondes /souris), une injection intra-péritonéale d’anesthésique (15 secondes /souris) puis une coupure de l’extrémité de la queue, sous anesthésie (10 min). Après un mois de repos, de nouveau une injection sous-cutanée d’analgésique (15 secondes /souris), une injection intra-péritonéale d’anesthésique (15 secondes /souris) puis un prélèvement sanguin au niveau du cœur, sous anesthésie générale (30 secondes /souris). Ou : Une injection sous-cutanée d’analgésique (15 secondes /souris) puis, sous anesthésie gazeuse, une injection d’implant gélifié au niveau des flancs (2 fois 15 secondes /souris). Une à deux semaines plus tard, une injection sous-cutanée d’analgésique (15 secondes /souris), puis sous anesthésie gazeuse, une incision de la peau au niveau des flancs pour récupération des implants (2 fois 1min/souris).
Impact sur les animaux
Les souris modèles de pathologies du saignement peuvent présenter des nuisances dues à leur phénotype : hémorragies en cas de blessures, saignements de nez, malformation des vaisseaux sanguins. Les manipulations peuvent entraîner un stress à l’animal après réveil, avec un risque de reprise de saignement dans les jours suivants. Elles peuvent également entraîner un stress et une légère douleur au moment de l’anesthésie et de la prémédication (contention, piqure). Les implants gélifiés peuvent entraîner une légère gêne.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort sous anesthésie générale afin d’effectuer des prélèvements et réaliser des études ex vivo.
Remplacement
Des études fonctionnelles in vitro ont été réalisées avec des plaquettes humaines de volontaires sains afin de démontrer l’efficacité du peptide sur la coagulation du sang. L’optimisation de la structure des variants a été réalisée par ordinateur, 3 variants sur les nombreux identifiés ont été sélectionnés pour être testés dans nos différents modèles murins. Ces expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet de notre peptide dans l’optique du développement d’une nouvelle thérapie.
Réduction
Les modèles de souris que nous allons utiliser existent déjà, ces souris nous sont rendues disponibles via des collaborations du responsable du projet. Seul le nombre de souris nécessaire aux procédures nous seront envoyées, permettant d’éviter la création d’un nouveau noyau d’élevage. Les mêmes souris seront utilisées pour le test de temps de saignement et les tests ex vivo d’étude des fonctions plaquettaires, réduisant ainsi le nombre de souris totales utilisées dans l’étude.
Raffinement
Les souris seront hébergées par cage de 2 à 5 afin d’éviter l’isolement et la surpopulation, en présence d’enrichissement (matériel de nidification, igloos). Elles recevront une alimentation standard et de l’eau à volonté. Les souris issues de modèles de pathologie de saignement feront l’objet d’une surveillance accrue afin de prévenir tout signe de souffrance. Des points limites ont été établis afin d’anticiper la mise à mort de l’animal si nécessaire. Les procédures seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie, qui sera contrôlée régulièrement au cours de la procédure. D’autre part, des souris immunodéficientes seront utilisées pour l’injection d’implant gélifié, afin d’éviter le phénomène de rejet.
Choix des espèces
La souris est le seul modèle permettant de réaliser à la fois des tests d’hémostase in vivo et d’obtenir suffisamment de sang nécessaire aux études ex vivo. Par ailleurs, le modèle souris nous permet d’utiliser des modèles transgéniques mimant les pathologies de saignement faisant l’objet de notre étude. Le stade de développement des souris, de 8 à 12 semaines, a été choisi par analogie avec la littérature pour l’étude des pathologies de saignement.
Etude de la contribution neuroinflammatoire à la spasticité post-traumatique et de sa modulation par Stimulation Transcutanée dans un modèle murin de lésion de moelle épinière
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On implante à chacune une fenêtre vitrée, et 450 subissent une section de la moelle épinière qui paralyse leurs pattes arrière, avant une rééducation et une stimulation électrique dont le porteur veut optimiser les réglages. Il signale une paralysie postérieure, des difficultés à vider la vessie qui imposent des massages abdominaux deux fois par jour, et une douleur résiduelle malgré les antalgiques. Les retombées annoncées pour les patients paralysés sont formulées comme un espoir, appuyé sur l'actualité d'une équipe suisse.
Objectifs
Ce projet mettra en place un modèle murin de traumatisme médullaire permettant de clarifier les mécanismes neuroinflammatoires régulés par ce traitement et d'optimiser les paramètres de stimulation en vue d'accélérer et maximiser la récupération fonctionnelle. Compte tenu de la diversité des paramètres électriques ajustables (fréquence de stimulation, durée et intensité des impulsions, nombre de répétitions quotidienne/hebdomadaire, positionnement des électrodes relativement à la lésion...), une approche rationnelle doit être mise en oeuvre sur modèle murin. Il s'agit donc non seulement d'un enjeu de recherche fondamentale mais aussi de recherche cliniquement applicable.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de mettre en place et valider le premier modèle souris permettant de tester l’effet de la stimulation électrique transcutanée sur la récupération fonctionnelle après traumatisme de moelle épinière. Il permettra également d’évaluer l’effet anti-spastique de cette stimulation en vue d’application à d’autres pathologies comme la sclérose en plaques, les AVC, les hémorragies, la sclérose amyotrophique… Il permettra notamment de mieux comprendre les effets thérapeutiques en fonction de la fréquence de stimulation utilisée notamment en évaluant le potentiel immunomodulateur de ces différents protocoles et leur impact neurotrophique. Il est ainsi attendu qu’une optimisation rationnelle des traitements proposés aux patients puisse être mise en place sur la base de biomarqueurs circulants choisis pour caractériser à la fois la gravité du traumatisme et sa réponse aux traitements électriques. En clarifiant les actions directes et indirectes des impulsions électriques sur le système nerveux central, ce projet permettra également de clarifier les conditions dans lesquelles l’implantation d’électrodes est requis pour obtenir l’effet thérapeutique souhaité. La prise en charge des patients humains pourrait devenir à la fois moins invasive et plus efficace.
Procédures
Sur cinq ans, 750 animaux seront implantés avec fenêtre vitrée. 450 de ces souris seront soumises à une transection de moelle épinière thoracique . La paralysie transitoire des membres postérieurs sera prise en charge dans le cadre d’un protocole de rééducation et d’électrothérapie dont nous souhaitons optimiser les paramètres. Tous les animaux recevront des anti-inflammatoires en post-trauma comme en clinique humaine. 87% de ces animaux traumatisés recevront un traitement complémentaire : soit une rééducation fonctionnelle, soit une stimulation électrique transcutanée, soit la combinaison des deux traitements. La durée des expériences sera limitée à 62 jours post-trauma, sauf pour les animaux a forte récupération dont la stabilité sera évaluée sur 360 jours. La réponse au traitement de ces animaux sera comparée à celle de 300 animaux non lésés. Les animaux seront soumis à des sessions d’imagerie intravitale ni douloureuses, ni destructives. Sur tous les animaux, la réponse musculaire réflexe sera évaluée sous anesthésie volatile légère grâce à des enregistrements électromyographiques de la contraction induite par stimulation du nerf tibial. Sous anesthésie gazeuse également, des prélèvements sanguins seront réalisés 1 fois par semaine à raison de 50µl par prélèvement (sans dépasser un volume maximum de 7,5% de la volémie de l'animal de façon hébdomadaire). 20% des animaux seront soumis à une antibiothérapie préalable au traumatisme pour étudier l'impact du microbiote sur les phénomènes étudiés. La majorité des animaux sortiront du projet dans les 62 jours suivant le traumatisme initial et soumis à une procédure terminale sous anesthésie profonde permettant de collecter les tissus et prélèvements sanguins/LCR nécessaires aux études et caractérisations post-mortem. Les animaux ayant le mieux récupérer seront éventuellement gardé pendant 360 jours pour évaluation trimestrielle de la stabilité de leurs performances.
Impact sur les animaux
Les différentes techniques d'exploration utilisées dans ce projet sont suceptibles d'engendrer les nuisances suivantes : diahrée post-prise antibiotiques, gêne locomotrice avec paralysie temporaire unilaterale postérieure pouvant occasionner une difficulté à la prise alimentaire, risque éventuel de difficulté de la vidange de la vessie peut-être observé dans les premiers jours, stress et/ou douleur résiduelle modérée malgré la prise d’antalgique et anti-inflammatoires.
Devenir
Tous les animaux (750) seront sacrifiés soumis à une procédure terminale sous anesthésie profonde permettant de collecter les tissus et prélèvements sanguins/LCR nécessaires aux études et caractérisations post-mortem. La majorité d'entre eux sera sacrifiée avant le jour 62. Les meilleurs récupérateurs seront conservés pendant un an pour évaluer de façon trimestrielle la stabilité de leurs facultés sensorimotrices.
Remplacement
Les pathologies neurodégénératives et traumatismes médullaires sont des processus complexes impliquant l’interaction entre de très nombreux organes et systèmes physiologiques (nerveux, immunitaire, endocrinien, cardiovaculaire… ) qu’il est nécessaire d’analyser et de comprendre. Aucun modèle cellulaire ou aucun modèle in silico ne sont aujourd’hui en mesure de rendre compte de cette complexité. Le modèle d’hémisection est nécessaire pour permettre de tirer des conclusions sur les mécanismes de récupération fonctionnelle. A ce jour il n’existe pas de méthodes de remplacement, mais l’actualité récente de la recherche en Suisse démontre l’intérêt de la recherche animale pour aider les patients tétraplégiques à retrouver une certaine utilisation de leurs membres. Notre modèle murin permettra de clarifier les mécanismes d’action du traitement par SET en réduisant au maximum les facteurs de variabilité (conditions traumatiques, gravité des lésions, diversité des genres, âges et conditions de vie des patients). Il permettra également de réaliser une optimisation rationnelle du traitement clinique à partir d’indicateurs difficiles d’accès chez le patient (évolution dynamique du phénotype de cellules inflammatoires).Un des critères principaux de l'effet du traitement est l'évolution des capacités motrices, avec et sans traitement, au cours du temps. Cette étude ne pourrait donc pas etre réalisée autre que in-vivo
Réduction
Sur la base de nos travaux passés, les lots d’animaux sont dimensionnés au minimum pour s’assurer de la significativité statistique des quantifications in vivo et sur tranches en utilisant le test de Mann Whitney dédié aux petits échantillons. Ainsi il est nécessaire de réaliser la quantification in vivo pour 8 animaux par groupe à J62. Compte tenu d’une probabilité d’environ 70% d’obtenir une fenêtre claire sur deux mois post-traumatiques suivant l’expertise des expérimentateurs chirurgiens, il est prévu d’utiliser 12 animaux par groupe pour les expériences intravitales. Les expériences d’imagerie sur coupes histologiques sont moins bruitées et permettent de moyenner l’analyse sur un plus grand volume de tissus pour obtenir des résultats moins variables. Le nombre d’animaux nécessaires à chaque temps est donc de 3 au lieu de 8 in vivo. Afin de couvrir les 6 temps d’intérêts, 18 animaux seront nécessaires par groupe pour réaliser les expériences d’immunohistochimie. Le nombre de 750 animaux a donc été établi afin d'avoir un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe permettant d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences avec significativité statistique. Le modèle souris est choisi en raison de sa très bonne récupération spontanée suite à un traumatisme de moelle, récupération que nous souhaitons accélérer par une prise en charge thérapeutique de type clinique tout en étudiant dans le même temps l’implication du système immunitaire. Les mêmes animaux et les mêmes données servent ainsi à la recherche fondamentale ET à la recherche applicative.
Raffinement
Reception et adaptation de 7 jours. Après anesthésie gazeuse légére et injection d'antidouleurs, l'anesthésie est approfondie par injection intrapéritonéale d'anesthésique avant d'être positionnés sur un tapis chauffant. Les yeux sont oints de gel hydratant , et de l'anesthésique local appliqué avant toute incision. Après l'opération, une injection sous-cutanée d'une solution d'anti-inflammatoires est réalisée le jour de la chirurgie puis tous les deux jours pendant 10 jours. Les animaux sont hébergés dans des cages individuelles respectant la surface minimale requise, avec objet d’enrichissement de l’environnement (dômes en carton ou en plexiglas ou encore coton) et un accès non limité à la nourriture et l’eau. Le cycle jour/nuit, la température et l'humidité sont contrôlés. Les animaux sont visités tous les jours par des personnes compétentes dans le domaine de l’expérimentation et du bien-être animal comme attesté par les autorités référentes. Pour s'assurer de la bonne vidange de la vessie le bas du ventre de chaque animal est palpé 2 fois par jours. Dans le cas éventuel où la vessie ne se viderait pas, nous appliquons des massages jusqu'a vidange de celle ci. Du gel sucré énergétique est mis à disposition au fond de la cage pendant la procédure afin de s’assurer que l’animal a les apports énergétiques dont il a besoin. Le recours à l’anesthésie a lieu aussi souvent que nécessaire pour limiter le stress ou la douleur inhérentes aux manipulations requises pour les prélèvements ou les sessions d’imagerie. Les animaux sont pesés quotidiennement les 5 premiers jours avec pour poids de référence le poids avant la procédure chirurgicale. Une variation de plus de 20% pendant plus de 3 jours, malgré la supplémentation sous-cutanée en solution sucrée, sera considérée comme un point limite. Les procédures seront accompagnées d'un suivi rigoureux des signes cliniques (score de douleur: Grimace scal Langford et al). La mise a mort de l'animal sera effectuée s'il atteint son point d'arrêt.
Choix des espèces
Nous utilisons la microscopie de fluorescence intravitale. Il est donc nécessaire d’étudier des animaux transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents. Nous disposons d’une lignée dans laquelle les populations cellulaires d’intérêt sont génétiquement marquées de différentes couleurs et dont le phénotype est aujourd’hui très bien caractérisé par nos travaux précédents. Ceci évite de perdre des animaux en mise au point de protocole. Dans le cadre du traumatisme de moelle, la souris démontre une très bonne récupération spontanée tout en impliquant des processus physiologiques fortement similaires à ceux rencontrés chez l’humain : neurodégénération et repousse de colatérales d’axones, angiogénèse et recrutement de cellules inflammatoires, gliose réactionnelle… Les observations sont donc facilement transférables au contexte clinique. Les vastes connaissances actuelles sur l’organisation de la moelle épinière chez la souris et de son comportement en font un modèle pré clinique de choix dans lequel les signes de douleur ou souffrance sont aisément détectables et interprétables. Tous les animaux seront des animaux adultes de plus de 10 semaines sans limitation d’age pour rendre compte de la diversité des âges observées chez les patients traumatisés médullaires. Seront néanmoins exclus les animaux de moins de 10 semaines pour s’affranchir des phénomènes inhérents au développement tant pour des raisons méthodologiques de pose de fenêtre vitrée que pour des raisons physiologiques liée à la plasticité des jeunes animaux. Tous les animaux seront de animaux adultes de plus de 10 semaines sans limitation d’age pour rendre compte de la diversité des âges observées chez les patients traumatisés médullaire. Seront néanmoins exclus les animaux de moins de 10 semaines pour s’affranchir des phénomènes inhérents au développement tant pour des raisons méthodologiques de pose de fenêtre vitrée que pour des raisons physiologiques liée à la plasticité des jeunes animaux.
Plasticité Microgliale et Obésité
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
232 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 224 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit un régime gras, subit un jeûne de 24 heures et des prélèvements de sang répétés à la queue, avant un prélèvement terminal dans le cœur, pour étudier des cellules du cerveau, la microglie, dans l'obésité. Le porteur indique que le jeûne provoque une perte de poids et une sensation de faim, et que les prélèvements causent stress et douleur. Il affirme qu'aucune culture cellulaire ne reproduit ces populations et renvoie au long terme les pistes contre l'obésité et le diabète.
Objectifs
Le cerveau joue un rôle essentiel dans la régulation de la prise alimentaire via le contrôle de la sensation de faim et du contrôle de la glycémie. Des régions spécialisées du cerveau contribuent à cette régulation en intégrant les informations liées à l’état nutritionnel provenant des organes périphériques (intestin, foie, pancréas, tissu adipeux). Les cellules microgliales, représentant 5 à 20 % de la population totale de cellules gliales, cellules du cerveau qui ne sont pas des neurones. Elles détectent les signaux extracellulaires et jouant un rôle important dans le maintien de l’intégrité du cerveau. Au repos, ces cellules possèdent de longs prolongements cellulaires mobiles leur permettant de détecter les perturbations du milieu interne. Quand les cellules microgliales détectent une modification, elles entrent dans un état actif et prennent une forme plus arrondie appelée amiboïde. Cette plasticité est considérée comme une première étape importante dans la détection des changements locaux et le déclenchement de réponses spécifiques. Il existe de plus en plus d'indices suggérant que les cellules microgliales contribuent à la régulation de la balance énergétique. Ces cellules sont idéalement positionnées pour détecter et réagir aux signaux circulants car elles expriment des récepteurs pour un large éventail de nutriments, de signaux hormonaux ou immunologiques. L’objectif du projet est de déterminer si les cellules microgliales du tronc cérébral réagissent à une modification du régime alimentaire (obésité, jeûne) et de définir la cinétique de ces éventuelles modifications
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment les cellules microgliales réagissent à une modification du régime alimentaire. Nous souhaitons également déterminer si ces modifications sont précoces et si elles précédent l’installation du surpoids et du diabète. A plus long terme, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement de l’obésité et de ses comorbidités, en particulier le diabète de type II.
Procédures
Le projet a pour objectif de tester la contribution des cellules microgliales dans la régulation de l’homéostasie énergétique. L’accomplissement de cet objectif nécessite des pesées régulières et une manipulation des animaux qui peut être une source de stress physique. Le suivi du statut glycémique requiert des prélèvements d’une goutte de sang dans la veine de la queue. La mise à jeun de 24h est une source de stress pour l’animal accompagnée d'une sensation de faim, entrainant une perte de poids corporel chez les animaux ainsi que des modifications du statut métabolique. Une partie des animaux sera alimenté par une alimentation riche en graisse succeptible d'induire un prise de poids . Un prélèvement sanguin terminal intracardiaque sera effectué juste avant la mise à mort. Un prélèvement d'une goutte de sang sera réalisé chaque semaine au niveau de la veine de la queue sur certains animaux. La glycémie sera alors mesurée à l’aide d’un glucomètre et de bandelettes.
Impact sur les animaux
Les pesées régulières et la manipulation des animaux pourront constituer une source de stress physique. Les prélèvements répétés d’une goutte de sang dans la veine latérale de la queue pourront induire un stress physique et de la douleur. La mise à jeun de 24h est une source de stress pour l’animal induisant une sensation de faim.
Devenir
Les analyses histologiques et biochimiques post-mortem permettront de déterminer l'impact de la consommation d'un régime alimentaire gras sur l'histologie et la physiologie des cellules microgliales du tronc cérébral.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici, car il n’existe pas de méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’implication des cellules microgliales dans le contrôle de la balance énergétique. En effet il s’agit d’étudier ici la réactivité de sous-populations microgliales, aux signaux métaboliques et hormonaux complexes associés à l’obésité et au jeûne. La culture de cellules microgliales ne permettrait pas d’étudier les différentes populations de façon spécifique comme nous souhaitons le faire dans cette étude in situ. De plus, la localisation spécifique de certaines de ces populations microgliales qui conditionne sans doute leur fonctionnement ne pourrait être conservée in vitro. Enfin, les modifications métaboliques et hormonales se mettant en place au cours de l’obésité ou du jeûne ne peuvent être parfaitement mimées in vitro.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire à ce projet est de 232. POUR LE NOMBRE DE LOTS (23 lots) : Le nombre de lots nécessaires dépend du nombre de variables testées. Dans cette étude, les différentes variables sont : 1/ le type d’animaux (souris non obèse vs souris génétiquement obèse), 2/ le statut nutritionnel ou le régime alimentaire des animaux (régime standard vs régime obésogène), 3/ le temps d’exposition au régime alimentaire spécifique et 4/ la nature des analyses post-mortem réalisées. POUR L’EFFECTIF PAR LOT : L’analyse de la morphologie des cellules microgliales et les analyses biochimiques imposent un effectif minimum de 8 animaux par lot. Dans ce projet, le critère principal d’exclusion pour les comparaisons statistiques finales repose sur l’échec de la mise en place du régime obésogène qui est compris entre 30 et 35 % ce qui implique d’ajouter 4 animaux dans les lots soumis au régime alimentaire riche en gras.
Raffinement
L’état clinique des animaux est suivi quotidiennement et tout repérage d’un état anormal fait l’objet d’une quantification par une grille de score, permettant une prise en charge adaptée. Les animaux sont habitués à la manipulation et à la contention. Les actes pouvant générer de la douleur sont réalisés sous analgésie et/ou anesthésie : La mise à mort est réalisée sous analgésie préopératoire et anesthésie générale. L’hébergement se fait en cage collective. Deux enrichissements au choix (en plus des nids composés de lanière de papier) seront placés dans la cage et modifiés toutes les deux semaines parmi : dôme, tunnel, bûchette, coton.
Choix des espèces
La souris deumeure le meilleur modèle pour les études en rélation avec la régulation de la balance énergétique et l'obésité. Ce modèle dévellope une obésité sous régime gras et est le plus documenté dans la littérature. Pour la mise en place de l'obésité grâce à un régime enrichi en graisses, des souris de 5 semaines seront utilisées. Il est important de débuter le régime obésogène peu après le sevrage pour en maximiser les effets sur la croissance pondérale. Pour les expérimentations n’incluant pas l’étude des effets du régime obésogène, des souris adultes de 8 semaines seront utilisées.
Souris humanisées : génération de souris humanisées à l’aide de cellules hématopoïétiques humaines transduites avec un gène d’intérêt thérapeutique
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues immunodéficientes, elles reçoivent un agent toxique puis une greffe de cellules humaines, avec des poses d'implants par chirurgie, pour mettre au point un modèle de souris "humanisée" servant à tester des thérapies géniques. Le porteur indique que la greffe peut déclencher une maladie du greffon contre l'hôte, avec anémie progressive et perte de poils au bout de plusieurs mois. Il affirme qu'aucune coculture de cellules ne prédit ces effets à l'échelle de l'organisme et conclut au recours "requis" à la souris.
Objectifs
L’objectif de ce projet de recherche est de mettre en place un modèle de souris permettant d’ évaluer des thérapies géniques à base de cellules immunitaires génétiquement modifiées, pour traiter des maladies humaines.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche permettra de mettre en place un modèle de souris humanisées à l’aide de cellules hématopoïétiques humaines transduites avec un lentivirus, afin par la suite de pouvoir tester dans ce modèle l’efficacité de l’injection de cellules hématopoïétiques génétiquement modifiées sur des maladies inflammatoires et/ou cancéreuses.
Procédures
Des souris immunodéficientes seront réceptionnées puis acclimatées au moins 5 jours. Elles recevront au maximum 4 administrations intrapéritonéales afin de faciliter la prise de la greffe dans les deux premiers jours suivant l’acclimatation (injection sur animal vigile, moins de 5min). Ensuite, 24-48h après la dernière des ces injections elles recevront une greffe de cellules humaines par voie intraveineuse à la veine de la queue (animal vigile : moins de 5 minutes / Animal anesthésié : maximum 30 minutes). Afin d’évaluer l’efficacité de potentiels traitements sur la prise de la greffe, des composés chimiques ou biologiques pourront être administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’au maximum une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie ou en moins de 5 min sur animal vigile; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’au maximum une heure sinon); ou par minipompe ou implant (intraveineux, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement (max une heure). En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Les études dureront au maximum 1 an mais en moyenne 3-6 mois.
Impact sur les animaux
Les administrations de Busulfan pourront générer une toxicité modérée manifestée par une perte de poids transitoire. Les animaux récupèreront leur poids initial en 3 semaines environ. A très long terme (plusieurs mois), une anémie est susceptible d’apparaître. Bien que de la douleur suite à l’injection ne soit pas attendue, son absence sera contrôlée lors des premières administrations. La greffe est susceptible (risque très faible compte tenu du tri des cellules) de générer une maladie du greffon contre l’hôte d’intensité modérée, se manifestant par une anémie progressive et des dépilations. Ces manifestations sont susceptibles d’apparaître après plusieurs mois. Dans le cas d’administrations par injections ou dans le cas de prélèvements sanguins, ceux-ci génèreront une douleur limitée à celle d’une piqûre d’aiguille. Dans le cas d’intervention chirurgicale (pose de minipompe, implant), une douleur modérée transitoire pourrait être générée mais sera gérée par un traitement antalgique adéquat.
Devenir
Après la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés.
Remplacement
Les effets d’une greffe de cellules immunitaires génétiquement modifiées se matérialisent à l’échelle de l’organisme dans son ensemble, et bien qu’il existe des systèmes de coculture de cellules, il n’est à ce jour pas possible d’en prévoir les effets sur un organisme dans sa globalité. Il en est de même pour la prédiction de l’efficacité de molécules visant à influencer la prise de la greffe. C’est pour cette raison que l’utilisation de ce modèle murin est requise.
Réduction
Sur la base de la littérature, le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure est de 10 animaux par groupe. Cependant, les premières études visant à établir les conditions de la greffe permettront de modifier au besoin ce nombre, s’il est insuffisant, ou au contraire s’il peut être réduit. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux par groupe. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps.
Raffinement
Les cellules injectées auront été au préalable triées afin de minimiser le nombre de lymphocytes T qui seraient susceptibles de générer une maladie du greffon conte l’hôte. Lors des premières administrations de Busulfan, les animaux seront observés au moins deux fois lors des 6 premières heures afin d’évaluer les effets indésirables. Si de la douleur est constatée sur les premiers animaux, une analgésie à la buprénorphine sera délivrée a posteriori, et mise en place préventivement (30 minutes avant minimum) pour les animaux suivants. Les animaux seront pesés au minimum deux fois par semaine et leur état clinique sera contrôlé, avec une attention particulière pour l’anémie (couleur des muqueuses, température et niveau d’activité des animaux), et pour l’apparition de lésions dermatologiques (alopécie, irritation des yeux) du fait du risque de développement d’une maladie du greffon contre l’hôte. Le risque principal étant la mise en place d’anémie après plusieurs mois, lors des études de mise en place du modèle, des numération formule sanguine permettant d’évaluer l’anémie seront réalisées (environ toutes les 2 semaines) afin de suivre ce paramètre. L’évolution de l’hématocrite suite à la greffe sera un critère de choix de la souche finale de souris. Les points limites concernant l’état général de l’animal sont listés en détail dans la procédure. De la nourriture sera placée au fond de toutes les cages ainsi que de la nourriture gélifiée lorsque que certains animaux présenteront au moins 10% de perte de poids. En cas de déshydratation constatée sur certains animaux, les animaux concernés seront réhydratés une (déshydratation légère) ou deux fois (déshydratation modérée ou sévère) par jour par voie sous cutanée. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Dans le cas où l’administration de composé nécessite une chirurgie (implants), une analgésie, un suivi adapté et des mesures post-chirurgicales sont mises en place pour prévenir la souffrance des animaux. Il ne sera possible de réaliser qu’une pose et un retrait d’implant maximum par animal.
Choix des espèces
La greffe de cellules hématopoïétiques humaines chez la souris immunodéficiente est bien décrite dans la littérature. Par la suite, la mise en place de ce modèle chez la souris nous permettra dans le cadre d’autres projets de l’utiliser en combinaison avec d’autres modèles établis chez la souris de maladie pour lesquelles la greffe de cellules hématopoïétiques génétiquement modifiées pourrait présenter un intérêt thérapeutique. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.