Recherche appliquée

4 800 animaux, 2 400 souris et 2 400 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des composés par voie orale ou par injection, puis sont soumis à un test d'évitement passif où ils subissent jusqu'à cinq stimulus aversifs, un stimulus douloureux servant à créer une mémoire de peur. Le porteur teste des molécules ciblant le système nerveux central pour la mémoire et l'impulsivité, et précise que les animaux ne seront pas réutilisés pour ne pas biaiser les résultats. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne suffit pour un comportement "aussi complexe et intégré que la mémoire".

Objectifs

La mémoire émotionnelle correspond à la mémoire d'un évènement ayant suscité une émotion. De nombreuses pathologies sont associées à une altération de cette mémoire émotionnelle (schizophrénie, alzheimer, syndrome de stress post traumatique) et il est nécessaire de passer par des modèles animaux afin d'évaluer de nouvelles pistes thérapeutiques. Chez le rongeur c'est la mémoire de peur qui est classiquement évaluée comme modèle de mémoire émotionnelle humaine, c'est une émotion très conservée entre les espèces car indispensable à la survie. Cette mémoire émotionnelle s'acquière très facilement et souvent en un seul essai chez le rongeur. Une des activités de notre centre de recherche est de développer de nouveaux composés ayant pour cible le système nerveux central et des pathologies associées. C'est pourquoi l'objectif de ce projet va être d'évaluer les effets de nouvelles molécules et de molécules de référence sur des animaux dans un dispositif d'évitement passif qui permet de tester la mémoire basée sur l'association entre un environnement et un stimulus aversif. Ce dispositif va permettre également d'évaluer l'impulsivité excessive que peuvent présenter certains modèles animaux. Ainsi le second objectif de ce projet sera de mesurer les effets de nouveaux composés ciblant le système nerveux central sur une impulsivité exacerbée que l'on retrouve dans des pathologies du type trouble de l'hyperactivité et déficit de l'attention.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d'identifier et de caractériser de nouvelles molécules afin d'apporter les données précliniques nécessaires avant de passer au stade de développement clinique. A moyen - long terme ces données scientifiques permettront de développer de nouveaux candidats médicaments permettant de traiter certaines pathologies à l'origine de déficits de mémoire (schizophrénie par exemple) ou de troubles de l'impulsivité (syndrome d'hyperactivité et de déficit de l'attention par exemple).

Procédures

Les animaux vont recevoir une administration aigüe par voie orale, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intramusculaire de molécules à tester. Lors des tests de comportement les animaux pourront être exposés au plus à 5 stimulus aversifs d'une durée maximale de 3 secondes.

Impact sur les animaux

Deux effets indésirables principaux sont attendus sur les animaux : -le stress lié à la courte contention le temps de l’administration de produit, qui pourra également causer une courte et légère douleur sur le site de l'injection intrapéritonéale, intramusculaire ou sous-cutanée. -la douleur passagère liée aux stimulus aversifs de courte durée (1-3s) et répétés maximum 5 fois.

Devenir

Les animaux ne pourront pas être réutilisés dans d'autres projets et seront mis à mort à l'issue des 2 procédures. En effet l'objectif du projet étant de travailler sur les mécanisme de mémoire et/ou d'impulsivité, toute réutilisation des animaux dans d'autres études comportementales pourrait être biaisée par les tests précédemment réalisés.

Remplacement

Ce projet ayant pour but de tester l'action pharmacologique de nouveaux composés sur la mémoire émotionnelle à court ou long terme ou sur l'impulsivité, il est nécessaire de passer par des modèles animaux. En effet, l'évaluation d'un comportement aussi complexe et intégré que la mémoire mettant en jeu de multiples aires cérébrales ne peut être réalisée que sur un animal vigile. Il n'existe pas à ce jour de méthode de substitution (in vitro ou in silico) suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

En raison de la variabilité liée aux études comportementales, un effectif de 12 animaux est nécessaire afin d'obtenir un traitement statistique des résultats satisfaisant. Ces analyses statistiques, réalisées à l'aide d'un logiciel spécifique (Graphpad Prism) nous permettront de nous assurer de la réalité et de la reproductibilité d'éventuelles différences observées entre plusieurs groupe ayant reçu différentes molécules à tester. Les tests de plusieurs molécules ou plusieurs doses d'une même molécule pourront être groupés afin de n'utiliser qu'un seul groupe témoin et le cas échéant un seul groupe recevant une molécule de référence.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie centrale (température et hygrométrie contrôlées) groupés par 3 ou 4 par cage. Une période de 5 jours d'acclimatation après livraison est prévue avant toute expérimentation. Tout au long des études les animaux sont hébergés dans des cages adaptées à l'espèce avec la présence d'enrichissement de milieu (tunnel, igloo, bandes de papier pour nidification, briques de bois à ronger....) et avec accès à l'eau et à la nourriture. Les animaux sont observés chaque jour (week-end compris), une fiche de contrôle du bien-être animal comprenant 30 critères est renseignée chaque semaine. Si plus de trois critères ne sont pas satisfaits sans possibilité d'action correctrice, alors l'animal est exclu du protocole et mis à mort si nécessaire. Les membres de la structure bien-être animal effectuent une observation mensuelle de tous les animaux.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont largement caractérisés d'un point de vue comportemental. Ce sont deux espèces très classiquement utilisés et décrites dans la littérature concernant les tests d'évaluation de la mémoire émotionnelle, les protocoles sont très bien établis. Le rat et la souris ont un système nerveux central suffisamment évolué pour envisager une extrapolation à l'homme de certains résultats. En effet, de nombreux parallèles existent entre les caractéristiques de la mémoire étudiées chez le rat ou la souris et les caractéristiques de la mémoire chez l'humain. De plus, la souris et le rat sont deux espèces pour lesquelles il est possible d'avoir des effectifs suffisants permettant d'obtenir des résultats statistique robustes : conditions d'hébergements en animalerie raisonnables, quantités limités de nouveaux composés à synthétiser par la chimie. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte ou jeune adulte chez la souris comme chez le rat. En effet dans la littérature, les tests de mémoire sont classiquement décrits sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités cognitives et d'attention fonctionnelles. Eventuellement, des animaux plus âgés pourront être utilisés pour tester l'effet de nouveaux composés sur le vieillissement et le déclin de la mémoire associé.

Jusqu'à 16 prises de sang par semaine, dont une douzaine en 24 heures suivies d'au moins une semaine de récupération, des administrations par voie intraveineuse, orale, intramusculaire, sous-cutanée ou sur la peau, et des recueils d'urine par sonde ou par ponction de la vessie : 80 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aucun n'est tué, tous sont gardés en vie et la déclaration les compte comme réutilisés. Le projet mesure comment leur organisme absorbe, distribue et élimine des principes actifs destinés à de futurs médicaments vétérinaires, et le porteur cite parmi les effets le stress de la contention, l'inconfort et la douleur d'une ponction de vessie. Le texte ne nomme aucun de ces principes actifs, ne dit pas vers quels projets les chats repartiront, et indique qu'il n'y a "pas d'approche statistique prévue" pour fixer leur nombre.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de pouvoir tester différents principes actifs chez le chat et d'obtenir des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques. La pharmacocinétique et la pharmacodynamie sont des disciplines qui étudient le devenir de la molécule dans l’organisme. Le devenir du médicament selon les doses utilisées et sa voie d'administration est étudié chez l'animal: son absorption, sa distribution par la circulation sanguine, son métabolisme, son élimination. Les chats sont régulièrement utilisés pour la recherche biomédicale dans les domaines de santé animale (espece cible).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir déterminer les paramètres pharmacocinétiques des l'éléments tests. Et de montrer que cela n'a pas eu d'impact au niveau clinique en suivant certains paramètres hématologiques, biochimiques impact sur la pharmacodynamie. Ce projet est necessaire pour trouver de nouveaux principes actifs pour de futurs médicaments vétérinaires.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations (intraveineuse, orale, intramusculaire, souscutannée ou topique) . Pour cela les animaux auront une contention manuelle légère. la durée d'un administration est inférieure à la minute. Il y aura des prélèvements sanguins. Dans ce cas le nombre de prélèvements sanguins sera limité à 16 maximum par semaine (environ 1 mL prélevé) et une période de récupération sera respectée ( à minima 1 semaine). Les volumes de sang prélevé seront généralement de 1 mL environ. Aprés un total d'environ 12 prélèvements sanguins sur 24h une période de récupération d'au minimum 7 jours sera respectée. Dans tous les cas, le volume des prélèvements sera réduit au minimum pour chaque protocole, sans jamais dépasser 15% du volume sanguin de l’animal, et une période de récupération adaptée sera respectée : 1 semaine suite à un prélèvement de 7.5% du volume sanguin, 2 semaines pour 10%, 4 semaines pour 15%. La durée d'un prélèvement sanguin est inférieur à la minute. La période de récupération pourra être allongée si nécessaire.Les animaux peuvent être soumis à un recueil d'urine. Soit cela se fera par miction spontanée (aucun geste n'est fait à l'animal), soit prélèvement urinaire par cathétérisation urétral ou par cystocentèse ( contention manuelle légère) Durée de l'ordre de la minute.

Impact sur les animaux

Toutes administrations des différents éléments tests vont engendrer une contention de l'animal. Toute contention peut engendrer un stress, un inconfort. Les prélèvements de sang ou prélèvements d'urine peuvent également entrainer un stress pour la contention , un inconfort mais également de la douleur (cas d'un prélèvement d'urine par cystocentèse par exemple).

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés. Ces techniques de remplacement ne peuvent pas être appliquées dans ce projet.

Réduction

80 animaux sont inclus dans ce projet pour une durée de 5 ans. Cela représente en moyenne 16 animaux par an. On calculera pour chaque produit à tester le nombre d’animaux nécessaire, il sera, pour chaque protocole, toujours réduit au minimum, en tenant compte de la variabilité des résultats attendus. Il n'y a pas d'approche statistique prévue.

Raffinement

Les chats seront hébergés par groupe de 2 ou 3. De l'enrichissement (exemple: griffoir, coussin) sera présent dans chaque box autant que possible. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, observation des sites de prélèvement, observation du comportement de l'animal...) Toute intervention sur l'animal sera effectuée par une personne habilitée et expérimentée afin de réduire au minimum le stress.

Choix des espèces

Espèce cible pour les médicaments vétérinaires Jeune adulte. Stade avec un système immunitaire, métabolique mature

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues diabétiques par cinq injections de streptozotocine, elles reçoivent des îlots humains encapsulés par chirurgie abdominale, puis sont suivies trois mois avec prises de sang par section de la queue et tests de tolérance au glucose avant une seconde chirurgie et la mise à mort. Le porteur liste parmi les effets une perte de poids, une hyperglycémie et une possible nécrose de l'extrémité de la queue. Il juge le recours à l'animal "indispensable" et choisit la souris pour consommer moins d'îlots humains, "tissu rare", que le rat.

Objectifs

La transplantation d’îlots pancréatiques est une thérapie prometteuse du diabète de type 1. Celle-ci vise à remplacer les cellules béta pancréatiques (sécrétrices d’insuline) défectueuses par l’injection d’îlots sains (issus de dons multi-organe) par voie intra-portale dans le foie de patients diabétiques. Cette stratégie thérapeutique qui permet une régulation glycémique plus physiologique et moins contraignante que les injections pluriquotidiennes d’insuline. Cependant, cette approche thérapeutique comporte encore de nombreux verrous limitant son application clinique à grande échelle. En effet, un des verrous majeurs est la réaction inflammatoire massive générée au moment de la transplantation qui est à l’origine de la perte de près de 40% de la masse d’îlots implantée. Un second verrou majeur est la réaction immunologique de rejet qui nécessite la mise en place d’un traitement immunosuppresseur connu pour être délétère pour la survie et la fonction de la greffe à plus ou moins long terme. Depuis les années 80, de nombreuses équipes ont tenté de mettre en place un pancréas bioartificiel basé sur l’encapsulation des îlots pancréatiques. Néanmoins, à ce jour, aucun système n’a réellement montré d’efficacité à long terme sur la survie et la fonction des îlots. Ainsi, cette approche de protection des îlots doit être encore améliorée et c’est dans ce contexte que nous situons notre projet de recherche. Ainsi, dans le but de promouvoir cette thérapie en levant ces verrous, nous souhaitons tester différentes méthodes d’encapsulation des îlots à l’aide d’hydrogels. Nous souhaitons donc tester in vivo l’impact de l’encapsulation d’îlots humains dans le cadre d’une xénogreffe (le donneur est d'une espèce biologique différente de celle du receveur) dans la cavité abdominale de souris rendues diabétiques par injection intra-péritonéale de streptozotocine. Cette étude permettra d’évaluer l’effet protecteur de notre encapsulation sur les réactions de rejet et les réactions inflammatoires.

Bénéfices attendus

La transplantation d’îlots pancréatiques comporte de nombreux verrous limitant son application clinique à grande échelle. En effet, un des verrous majeurs est la réaction inflammatoire massive générée au moment de la transplantation qui est à l’origine de la perte de près de 40% de la masse d’îlots implantée. Un second verrou majeur est la réaction immunologique de rejet qui nécessite la mise en place d’un traitement immunosuppresseur connu pour être délétère pour la survie et la fonction de la greffe à plus ou moins long terme. Ainsi, l’encapsulation d’îlots pancréatiques permettrait de protéger leur destruction par les réactions inflammatoires et de rejet. De plus au vu de la pénurie d’organe inhérent à toute greffe d’organe, l’encapsulation permettrait d’utiliser des îlots pancréatiques d’espèces différentes. Par ailleurs, l’implantation de d’îlots encapsulés dans la cavité abdominale permet de se soustraire de ces réactions inflammatoires médiées par le sang à l’origine d’une destruction massive des îlots post transplantation. Ainsi, notre stratégie permettrait de maintenir à long terme la survie et la fonction des îlots et d’appliquer la stratégie de transplantation d’îlots pancréatiques à un plus grand nombre de patients diabétiques.

Procédures

L’injection de streptozotocine se fera en intra péritonéale à l’aide d’une aiguille 23G. L’injection réalisée sur animal vigile par 1 injection par jour sur 5 jours. La durée de l’intervention (et la contention) durera quelques secondes pour chaque injection. 24 h après la dernière injection, une mesure de glycémie sera effectuée à l’aide d’un glucomètre à partir d’une micro goutte de sang prise à la queue pour vérifier si l’animal est bien diabétique (durée de l’acte quelques secondes). Chez les souris devenus diabétiques, 2 modules d’encapsulation seront implantés dans l’abdomen. Ceci nécessitera une incision de l’abdomen de 1 cm. Chirurgie réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptée et durera environ 15 minutes. Des anti-inflammatoires seront administrés post-chirurgie au maximum pendant 3 jours. Concernant le suivi de la survie et de la fonction des îlots implantés, celui-ci durera 91 jours. Pour cela, tous les 15 jours la prise de poids (quelques secondes), la glycémie capillaire (lecteur de glycémie, quelques secondes) seront mesurées, une prise de sang par incision de l’extrémité de la queue sera effectuée pour la réalisation de divers dosage plasmatique (durée 5 minutes par souris) et un test de tolérance au glucose sera réalisé. Ce test est nécessaire afin de déterminer la fonction réelle de la greffe. Ce test durera deux heures et consistera à injecter dans le péritoine une solution sucré en utilisant une aiguille 23G et de mesurer la glycémie capillaire à l’aide d’un lecteur de glycémie toutes les 5, 10, 15, 30, 45, 60 et 120 min post injection du sucre. Avant le test, les animaux seront mis à jeun 4h (accès à l'eau ad libitum). Une mesure de la glycémie sera effectuée à jeun juste avant l'injection intrapéritonéale du glucose (durée par mesure de quelque seconde). 84 jours après implantation, les implants seront retirés (même méthodologie dispositions prises et durée d’intervention que pour l’implantation). Enfin, 7 jours plus tard les animaux seront mis à mort pour prélèvement final des organes.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus sont : - Perte de poids en lien avec l’induction du diabète - Douleurs post-opératoires faisant suite à la chirurgie réalisée pour la mise en place des hydrogels (Laparotomie) - Risque d’infection suite aux implantations des hydrogels - Stress en lien avec la répétition des injections d’insuline (si nécessaires) ou les mesures de glycémies et prises de sang au cours du suivi - Hyperglycémie lié au développement du diabète au cours de l’étude et durant les tests de tolérance au glucose - Détérioration (infection, nécrose) de l’extrémité de la queue suite aux prises de sang et aux mesures glycémiques -Hémorragie post section de la queue - Périodes de mise à jeun.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour la collecte de sang/organes et analyses.

Remplacement

Nous souhaitons valider de nouveaux hydrogels sur la fonction du greffon chez un sujet diabétique. Or la régulation glycémique est un mécanisme complexe faisant intervenir de nombreux organes tous interconnectés entre eux. Ainsi, afin d’étudier si un pancréas bio artificiel est efficace, il ne suffit pas de s’intéresser uniquement à la cellule à insuline isolé mais il est impératif de l’évaluer dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostasie du glucose sont présent. Le recours à une étude in vivo est alors indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés. De plus, ce nombre est basé sur les différences interindividuelles des animaux et des préparations d’îlots humains que nous isolerons mais aussi sur notre longue expérience obtenue au cours de la réalisation de nombreuses études métaboliques réalisées sur animaux rendus diabétiques par injection de STZ. Cette étude nécessitera 360 souris. Enfin, la succession des interventions sur les mêmes animaux permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour répondre à nos hypothèses.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages collectives ventilées et enrichies. En cas de procédure invasive une anesthésie et une analgésie adaptées seront mise en place. De plus, des points limites prédictifs et précoces ont été établis permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les animaux demeurant diabétique recevront une insulinothérapie. Les souris immunodéficientes seront maintenues et manipulées dans des conditions permettant de garantir leur état de santé.

Choix des espèces

Pour répondre à nos objectifs, nous avons choisi le modèle de la souris pour recevoir les îlots encapsulés car celui-ci a l’avantage d’avoir des caractéristiques physiologiques proches de l’Homme. De plus, dans un implant nous souhaitons encapsuler 10000 îlots/kg de poids corporel (quantité utilisée dans le cadre de la transplantation d’îlots chez l’homme nécessaire pour rétablir un équilibre glycémique). Ainsi, nous utiliserons moins d’îlots humain (tissus rare) que si nous utilisions le modèle du rat qui est 10 fois plus gros que la souris. La souche C57BL/6 nous permettra d’évaluer la capacité immuno protectrice de nos hydrogels sur les îlots pancréatiques humains. La souris de souche NSG nous permettra de contrôler la survie et la fonction de nos îlots humains encapsulés et implantés dans un environnement immunodéficient (Contrôle). Pour ce projet les souris seront uniquement utilisés à un stade adulte (Age: 8-12 semaines à leur arrivée à l’animalerie), stade de maturité sexuelle et possédant un système immunitaire mature.

1 470 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur colorectale, une irradiation puis l'injection d'un produit radioactif au lutétium-177, avant le prélèvement de leurs organes. Le porteur n'attend qu'une "perte de poids légère" et décrit peu d'effets, tout en fixant la gravité à modérée. Il justifie le choix de la souris par sa "petite taille", sa "grande fécondité" et son "coût de production peu élevé", et affirme que l'in vitro ne simule pas la complexité de l'organisme.

Objectifs

Nous proposons dans cette étude de développer, dans une première étape, un nouveau vecteur de TRT (radiomarqué avec le lutétium-177 - 177Lu) ciblant des protéines cibles radioinduites par une radiothérapie (RT) externe de 8 Gy. La RT va ainsi réchauffer la tumeur et induire l’augmentation des antigènes cibles mais aussi l’infiltration de la tumeur par des cellules immunitaires. Dans la seconde étape, nous évaluerons cette réponse immunitaire intra-tumorale et systémique induite par la combinaison de RT et TRT pour deux modèles syngéniques de cancer colorectal de souris

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer un nouveau radiopharmaceutique (candidat-médicament) de TRT marqué au 177Lu qui pourra être administré en combinaison avec une fraction de RT externe +/- une immunothérapie

Procédures

- Injection sous cutanée de la tumeur (une seule fois). Le développement de la tumeur prends 10 jours à partir de la date d'injection. - Ensuite le radiopharmaceutique est injecté par voie intra-veineuse (une seule injection sera faite sur les souris, durée d'injection =1h à 2h dépendament du nombre de souris à injecter) - Prélèvement d’organes en fin de manip ou à des temps d’étude bien définis (durée = environs 3 h).

Impact sur les animaux

Une perte de poids légère pourra être observée chez les souris traitées avec la radioactivité durant les trois premiers jours qui suivent l’injection. Aucun autre effet secondaire ou nuisance n’est attendu.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, selon le schéma décisionnel suivant : - Les animaux dont la greffe n’aura pas prise - Euthanasiés à des temps différents selon le planning de l’étude - Euthanasiés si points limites atteints

Remplacement

Etant donné que nous allons évaluer l’effet des modalités d’administration de la RT sur la réponse immunitaire, il nous est nécessaire de réaliser notre étude sur des modèles animaux. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour cette étude. Toutefois l’étude préalable des molécules d’intérêts sur culture cellulaire permet de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT)

Réduction

En comparaison avec une étude de biodistribution « classique » qui nécessite l’euthanasie des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie par SPECT (Single photon emission computed tomography), nous permet de suivre la biodistribution/pharmacocinétique de la molécule sur une longue période (7 jours) chez le même animal et donc de REDUIRE le nombre d’animaux d’autant. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant sur un nombre d’animaux relativement réduit de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques de souris permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. Afin de garantir la répétabilité des résultats il est nécessaire de réaliser les expérimentations en triplicat.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans des cages de 10 individus en présence d’enrichissement. Les irradiations seront réalisées sous anesthésie gazeuse et aucune toxicité n’est attendue aux doses utilisées. Les injections de chimiothérapies (CT) et d’immunothérapie seront réalisées en vigile en IP ou en per os. Les traitements par CT et immunothérapie ont déjà été réalisés dans ces conditions sans entrainer de toxicités particulières. Cependant si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids), les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse. Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

La petite taille des souris, leur grande fécondité, leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font un animal de choix pour les laboratoires.[1] De plus, le modèle murin est parfaitement approprié car les expérimentations in vitro ne permettent pas de simuler la complexité d’un organisme, notamment dans les études impliquant l’activation du système immunitaire. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant sur un nombre d’animaux relativement réduit de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques de souris permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. Les souris utilisées seront de 8 semaines minimum, âge adulte de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel plutôt stable > 20 g, ainsi qu’une bonne tolérance aux anesthésies, d’après les données de la littérature. [1]- Schuc et al., “Trials, tribulations, and trends in tumor modeling in mice" Toxicol Pathol (2004)

3 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intracérébrale de virus, de toxine ou de fractions issues de patients, jusqu'à deux chirurgies, puis un traitement administré une à deux fois par jour pendant un maximum de trente semaines, avec prélèvements de sang et de liquide céphalorachidien. Le porteur décrit une activité préclinique de service destinée à tester des composés, et renvoie le bénéfice à une "meilleure compréhension" et à l'identification de traitements. Il affirme que la souris a un système nerveux "identique" à celui de l'homme et conclut que le recours à l'animal vivant est "nécessaire".

Objectifs

Les maladies neurologiques se définissent par un dysfonctionnement du système nerveux central ou périphérique. Elles revêtent plusieurs formes et touchent un nombre important de personne dans le monde. L’origine de ces maladies est encore mal comprise et les traitements actuels visant à soulager les symptômes ne sont pas optimaux.  Le développement de nouveaux outils thérapeutiques est donc essentiel.  Pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques, nous proposons la réalisation de différents modèles murins de maladies neurologiques qui permettent d’en reproduire les symptômes afin d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements et de comprendre leurs mécanismes d’action via l'observation de l'activité neuronale en temps réel. Ces modèles sont générés soit par injection intracérébrale de virus, de toxine ou de fraction protéique purifiée issus de patients soit par un traitement systémique via une neurotoxine. Elles peuvent concerner des souris normales et des souris transgéniques. Aucune de ces lignées transgéniques ne montre de phénotype dommageable. Les approches mises en œuvre sont une chirurgie intracérébrale et l’administration chronique d’un traitement. Le bénéfice attendu est une meilleure compréhension des effets d’un traitement chronique à différentes doses sur la composante comportementale et cellulaire. La mesure des effets des traitements se fait par des analyses biochimiques et cellulaires sur les cerveaux et les tissus biologiques prélevés après la mise à mort des animaux. Des prélèvements de sang pourront aussi être réalisés tout au long du traitement.

Bénéfices attendus

Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensables avant les essais chez l’homme. Les expérimentations sont essentiellement menées sur l’animal. La génération de modèle expérimentaux de maladie neurologique chez la souris est donc nécessaire afin de tester différents composés thérapeutiques. Le bénéfice attendu est l'identification de nouveaux outils thérapeutiques.

Procédures

Les animaux subiront au maximum deux procédures chirurgicales d’une durée maximale d'une heure, ces chirurgies seront espacées de minimum 2 semaines. L'administration de traitement (30 secondes) pourra être réalisée une à deux fois par jour pour une durée de 1 jour et au maximum de 30 semaines. Prélèvements sanguins à la queue (1 minute) sur l'animal vigile (1 prélèvement/semaine ou par mois selon la durée de l'étude). Prélèvements de liquide dans lequel baignent le cerveau et la moelle épinière (1 prélèvement à la fin de l'étude, durée 10 minutes).

Impact sur les animaux

L’injection de virus entraine peu de nuisances chez l’animal. L’injection de toxines entraine un suivi spécifique. Les injections peuvent entrainer une perte de poids et une diminution de la mobilité. L’implantation nécessite un suivi spécifique, la pose de ciment afin de maintenir l’implant peut être douloureux les premiers jours. Les maladies neurologiques peuvent induire un déclin cognitif et des altérations motrices modérées. Aucune des lignées transgéniques utilisées ne montre de phénotype dommageable. Si l’administration de traitement entraine des effets indésirables, le traitement sera interrompu et l’animal surveillé.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort et les cerveaux prélevés pour des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité préclinique de service. Ce projet recourt à l’utilisation de souris pour plusieurs raisons éthiques : - L’utilisation d’approches neurobiologiques invasives ne peut être faite chez l’homme. -Dans le cadre des modèles de maladie neurodégénérative, l’objectif à terme est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (motrice, cognitive) de ces affections. Aucun modèle in vitro ne permet l’étude de telles fonctions. De ce fait, le recours à l’animal pour étudier les manifestations comportementales de la maladie et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire pour reproduire les symptômes de la maladie en vue de tester des nouveaux traitements. D’autre part, l’étude du cerveau sur animal en mouvement, nécessite le recours à l’animal vivant.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques. Afin de réduire le nombre d’animaux, une analyse de puissance a été effectuée, permettant de réduire le nombre maximum de 14 animaux par groupe soit 70 souris par étude incluant les groupes expérimentaux (4 doses différentes de composé) et leur contrôle. Pour chaque animal, un grand nombre de prélèvements post mortem sera réalisé pour maximiser l’utilisation qui peut être faite : les différentes structures cérébrales, la moelle, le LCR (liquide céphalorachidien), le sang et les organes. L’utilisation des mâles et des femelles nous permettra de porter une attention particulière au R de réduire dans la règle des 3R. En effet, tous les animaux transgéniques produits seront utilisés. L’analyse de l’activité neuronale in vivo nous permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisés, chaque animal étant son propre contrôle. Des analyses statistiques seront effectuées.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux (3 à 5 par cage). Mesures précoces : le confort de l’animal sera pris en compte à tout moment. Leur surveillance est assurée via une pesée hebdomadaire. Le constat de signes de souffrance entraine une surveillance accrue, avec enregistrement sous forme de fiche de suivi spécifique avec les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc.) et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « à surveiller ». Cette fiche est close quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, des traitements vétérinaires si nécessaire. Raffinement des procédures : les chirurgies sont réalisées sous anesthésie avec administration d’analgésique et d’anesthésique local permettant de réduire la douleur et l’angoisse des animaux. Un suivi post opératoire spécifique de 3 à 5 jours (dépendant de la gravité de la procédure) est mis en place avec une pesée quotidienne et l’observation de critères de bien être. Chaque critère est scoré. Des mesures spécifiques peuvent être prises : si l’animal manque de tonus, une injection intrapéritonéale de solution saline sera réalisée. En cas de plaies celles-ci seront nettoyées et désinfectées. Si malgré ces soins, les scores restent mauvais durant deux jours consécutifs, une décision de mise à mort est prise par l’expérimentateur. Si l’animal a bien récupéré, un suivi visuel journalier et une pesée hebdomadaire seront effectués. Administration du traitement : les administrations sont réalisées quotidiennement et les animaux sont habitués à la contention. Pour le traitement induisant des mouvements involontaires anormaux, nous utiliserons une litière en cellulose peu irritante et plus douce afin d’éviter d’éventuels problèmes d’irritations aux pattes et à la queue. Si le traitement provoque des effets indésirables, le traitement peut être interrompu et l’animal surveillé.  

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car son système nerveux est identique à celui de l’homme. Ces modèles ont un intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point de traitements thérapeutiques. De plus, l’injection de toxine ou de virus dans le cerveau est bien établie dans notre équipe et les travaux sur la souris sont largement décrits dans les études des maladies neurodégénératives. L’utilisation de la souris permet également de générer des modèles transgéniques pertinents et bien caractérisés permettant de tester des candidats médicaments pour différentes pathologies. Les maladies neurologiques apparaissent préférentiellement à l’âge adulte, les animaux seront donc utilisés à partir de 6 semaines jusqu'à l'âge adulte. En effet, à cet âge on peut considérer que le système nerveux central a atteint sa pleine maturité.