Recherche appliquée

188 souris humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation, une greffe de tumeur, quatorze injections et plusieurs prélèvements sanguins, plus des séances d'imagerie sous anesthésie, pour comparer deux types de cellules CAR-T dans un cancer du sang et un cancer du pancréas. Le porteur renvoie les retombées pour les patients, une immunothérapie mieux tolérée, au conditionnel et au long terme, l'objectif immédiat restant de mesurer les effets secondaires chez la souris. Sur le remplacement, il affirme que ses résultats doivent être validés dans un "organisme vivant entier", seul système qui montrerait cette baisse des effets indésirables.

Objectifs

Les cellules CAR-T représentent une avancée majeure en immunothérapie du cancer. Cependant, si ce traitement donne des résultats remarquables dans le contexte des cancers du sang, 30% des patients traités rechutent. De plus, ce type de traitement induit très fréquemment des effets secondaires très préjudiciables à la santé du patient, notamment une tempête cytokinique et une toxicité neurologique. Ces effets secondaires découlent d’une hyperactivation de la réponse innée induite par les cellules CAR-T. L’analyse de ces processus nécessite donc l’utilisation de modèles de souris humanisées, dans lesquelles les cellules CAR-T pourront interagir avec notamment un compartiment myéloïde également humain autologue. Nous avons récemment établi un nouveau protocole permettant de générer des cellules CAR-T ayant un potentiel antitumoral fortement augmenté. Le projet proposé consiste à comparer la survenue de ces effets secondaires après l’injection de cellules CAR-T classiques ou des cellules CAR-T obtenues suivant notre protocole. Nous comparerons la survenue de ces effets secondaires dans deux modèles tumoraux : un modèle de cancer du sang et un modèle de cancer du pancréas.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre à terme d’établir les bases expérimentales permettant le repositionnement du médicament anti-diabétique en immunothérapie. En effet, initialement décrit dans la prise en charge du diabète, ce traitement pourrait être à la base d’un protocole permettant d’obtenir une nouvelle génération de cellules CAR-T . Ces cellules, en levant les verrous liés à la faible persistance et l’anergie induite par le microenvironnement tumoral mais également en minimisant la survenue d’effets secondaires très préjudiciables à la santé du patient, pourraient induire une nette amélioration de la prise en charge des patients traités par l’immunothérapie basée sur l’utilisation de cellules CAR-T.

Procédures

Suivant les conditions expérimentales, les animaux seront soumis à une irradiation légère (durée 3 minutes), 7 injections (

Impact sur les animaux

Les souris subiront un stress léger consécutif aux manipulations fréquentes (suivi de croissance tumorale, suivis par prises de sang). Les souris subiront des injections sous anesthésie locale engendrant un stress temporaire léger. Les souris subiront une irradiation légère sans effet retardé et des séances d'imagerie sous anesthésie générale ayant un impact léger (préhension, déplacement). Enfin, la croissance tumorale elle-même peut induire une gêne physique légère ou modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements et les analyses sur organes nécessaires à l'étude.

Remplacement

L’objectif du projet est d’évaluer l’intérêt thérapeutique d’un nouveau protocole d’élaboration de cellules CAR-T que nous avons mis au point, notamment la minimisation de la survenue d’effets secondaires délétères pour la santé du patient. Nous avons, en amont des expériences exposées ici, réalisé un grand nombre d’expériences ex vivo montrant une diminution de l'activation de certaines cellules en présence de cellules CAR-T obtenues suivant le protocole que nous avons développé par comparaison avec des cellules CAR-T classiquement obtenues. Nous avons notamment pu établir que des monocytes cultivés en présence ces cellules CAR-T produisent moins de cytokines pro-inflammatoires et présentent un phénotype moins activé que ceux cultivés en présence de cellules CAR-T classiques. A présent, afin d'obtenir des résultats au plus proche d'un essai clinique, nos résultats doivent être validés dans un organisme vivant entier, seul système qui puisse montrer que cette moindre activation du compartiment myéloïde se traduit par une diminution des effets secondaires (perte de poids, fièvre, atteinte neuronale).

Réduction

Un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera réalisé par imagerie par bioluminescence afin de réduire le nombre d'animaux utilisés (l'animal est son propre témoin pour certains paramètres, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux) . Les groupes d'études sont mis en oeuvre le plus souvent en même temps afin de réduire le nombre de groupes contrôles. Le nombre de souris utilisées dans chaque procédure a été établi sur la base de l'experiences acquise au cours de 20 années de travaux antérieurs. Au cours de ce projet, nous utiliserons le nombre de souris minimal requis pour obtenir des résultats statistiquement représentatifs.

Raffinement

Les animaux sont hébergés avec un enrichissement constitué de sizzlenests et de maisonnettes en carton. Les interventions seront faites sous anesthésie générale. Nous utiliserons l’imagerie par bioluminescence qui permet un suivi longitudinal et non invasif de la croissance tumorale, ce qui nous permettra de définir un critère d’efficacité des immunothérapies basé sur cette approche pour les études ultérieures. Ceci permettra aussi de détecter au plus tôt les tumeurs pour arrêter le plus tôt possible les procédures. Les souris seront surveillées quotidiennement (examens cliniques) pendant toute la durée de la procédure expérimentale afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. Afin de minimiser les douleurs lors des injections sous cutanée et intraveineuse au niveau de la veine caudale ou faciale, les souris seront anesthesiées localement par apllication d'un spray lidocaïne. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Le modèle de souris est humanisable ce qui permet de suivre les conséquences d'interactions complexes de nombreux partenaires cellulaires autologues au sein d'un organisme vivant. Il constitue donc le modèle le plus adéquat aux études précliniques. Pour générer les cellules d'intérêt pour l'humanisation, il est indispensable d'utiliser des souris âgées de moins de 2 jours. En effet, des travaux recents montrent que passé cet âge, la reconstitution de la lignée lcellulaire d'intérêt est fortement altérée. Pour les tests sur souris humanisées, les souris utilisées seront agées de 6 à 8 semaines en début d'expérience: âge optimal pour obtenir une reconstitutton du système immunitaire inné.

22 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, vingt tuées et deux réutilisées. Elles reçoivent une greffe de cellules de sarcome humain sous la peau, puis deux IRM dont une avec injection d'un marqueur d'hypoxie, avant prélèvement des tumeurs. Le porteur décrit une gêne liée à la protubérance tumorale au flanc sans entrave à la mobilité, et justifie la mise à mort par le risque infectieux propre à ces animaux immunodéprimés. Il présente l'IRM comme non invasive, ce qui autorise la réutilisation de deux souris, et affirme que la mesure du flux sanguin est impossible sur cultures cellulaires.

Objectifs

Dans les sarcomes des tissus mous, pathologie rare, de mauvais pronostic, et touchant les humains et les animaux à tout âge, il n’existe aucun marqueur pronostic ni prédictif de réponse à la radiothérapie. Ce projet permettra de valider in vivo à la fois de nouvelles techniques IRM permettant une évaluation de la biologie tumorale et de son hétérogénéité, et de valider des méthodes de traitement d’image pour isoler des sous-populations tumorales et ainsi mesurer des marqueurs endogènes. Ces thématiques de recherche sont celles de l’équipe. Les résultats de ce projet préclinique seront directement utilisables chez l’Homme sans nécessité d’autre expérimentation animale, dans le cadre d’un protocole approuvé. De même, une translation ultérieure en soins vétérinaires chez le chat et le chien est envisagée dans le cadre d’un projet. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs, un établissement pour l’hébergement et l’autre pour l’imagerie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra par ailleurs de relier les données d’IRM avec l’observation au microscope. Il est le préalable de projets cliniques chez l’Homme et en médecine vétérinaire afin d’utiliser ces mêmes séquences IRM, dans le but de prédire la réponse aux traitements et pouvoir poser des diagnostics sans avoir besoin de biopsie.

Procédures

Les souris sont des animaux partiellement immunodéprimés pour permettre une greffe de cellules tumorales d'origine humaine sans rejet. Les conditions d'hébergement et de soins sont adaptées au statut immunodéprimé des animaux. Dans l’EU1, les souris seront xénogreffées. L'injection sous la peau du flanc de cellule tumorale de sarcome humain, geste d'une durée de 20 secondes, comportera 2 lignées tumorales disponibles, déjà utilisées et validées. Un IRM sera réalisé dans l’EU2 un examen IRM d'une durée de 1h30 n’engendre pas de douleur. La seconde IRM d'une durée de 1h30, dans l’EU2, est précédée d’une injection intrapéritonéale d'un marqueur d'hypoxie. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie et après antalgie dans l’eau de boisson. Après la seconde IRM, les animaux seront mis à mort et les tumeurs seront prélevées dans l’EU2 pour analyse histologique.

Impact sur les animaux

Au plan du bien-être animal, les animaux ne présentent aucun déficit moteur ou social lié à cette injection sous la peau. Ils continuent donc d’être hébergés dans des conditions adaptées aux animaux immunodéprimés. La pousse tumorale peut se traduire par une protubérance au niveau du flanc. Celle-ci peut créer un inconfort et une gêne mais sans entraver la mobilité de l'animal.

Devenir

Du fait du phénotype athymique, ces souris seraient à risque infectieux local et systémique majeur après la chirurgie de retrait de greffe. Par ailleurs, une chirurgie carcinologiquement satisfaisante ne serait techniquement pas réalisable, et le risque de dissémination microscopique local et à distance rend ces souris à la fois à risque de récidive et inéligibles à des protocoles ultérieurs. La mise à mort s’avère donc nécessaire. Les animaux sont mis à mort pour pemrttre le prélèvmeent del a tumeur. compte tenu des risques liés à leur statut immunitaire et à la difficulté de l'intervention chirurgicale, l'extraction de la tumeur ne seriat pas bénéfique aux animaux.

Remplacement

Il s’agit dans un premier temps de mettre au point un protocole expérimental et de tester de nouvelles méthodes d’acquisition en IRM très haut champ magnétique, préalablement validés in vitro avant d’être appliqué à l’animal. L’autre objectif est une corrélation des données IRM avec des données biologiques. Il est nécessaire de passer par une expérimentation in vivo du fait de la mesure absolument nécessaire d’un flux sanguin (condition impossible sur cultures cellulaires) et d’une comparaison aux données microscopiques. L'examen IRM est basésur la détection de flux de liquides, dont le sang, ce qui est difficelement envisageable sur desm odèles non vivants et d'autre part, le projet s'intéresse non seulement à la tumeur mais aussi à son environnement et à sa vascularisation, lesquels sont encore à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro.

Réduction

L’IRM est une technique non-invasive et non-irradiante. Elle nous permet de réutiliser les animaux et donc de réduire leur nombre. Un total de seulement 22 souris sera utilisé pour obtenir suffisamment de données et pour valider la technique de mesure. Afin de pouvoir réduire au maximum le nombre d’animaux tout en permettant de tirer des conclusions statistiquement significatives, le nombre d’animaux (2 groupes de 11) nécessaire a été calculé sur les bases de tests non paramétriques et sur la base de données de prise de greffe lors de précédentes expérimentations. Par ailleurs chaque animal sera imagé 2 fois.

Raffinement

Afin que l'injection soit mieux supportée, elle sera effectuée en situation sous-cutanée, chez des souris déjà suffisamment développées, avec ajout d’antalgique dans l’hydratation, et avec un suivi rapproché. Le projet a été pensé pour obtenir des résultats à la fois fiables et dans un délai le moins étendu possible. Les deux examens IRM seront réalisés sous anesthésie générale et n’engendreront pas de stress pour l’animal. Les animaux seront récompensés sous forme alimentaire à leur réveil après l’anesthésie. Lors du transport entre les deux animaleries, 50m environ, les cages seront placées dans un chariot en prenant soin de les protéger de l'environnement extérieur qui pourrait les refroidir. Les cages seront recouvertes par une bâche. L'apparition de grosseur fera l'objet d'une surveillance régulière. Une évaluation de la souffrance de l’animal sera mise en place, avec adaptation de la prise en charge selon le score calculé, et en cas d’atteinte des points limites les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est à la fois proche de l’Homme, accessible, et peut être analysée sur l’IRM à très haut champ. La résolution spatiale de l’appareil sera suffisante pour permettre une validation précise. Puis les souris immunodéficientes avec xénogreffe de sarcome des tissus mous humain permettront une validation technique de la méthode d’imagerie, une première confrontation entre les données de tissu tumoral d’origine humaine (xénogreffe) et l’anatomopathologie, et un suivi longitudinal. Nous utiliserons des sarcomes des tissus mous dont la lignée tumorale a déjà été utilisée plusieurs fois sur modèles animaux. De plus, la souris est l’animal le plus utilisé pour le développement de modèles pathophysiologiques et les outils d’analyse immunologiques sont bien maîtrisés à la fois dans le monde et dans notre équipe. Par ailleurs les résultats obtenus pourront être confrontés aux données existantes dans la littérature.

Sur 224 souris, 72 reçoivent dans un muscle de la patte une injection de notexine, une toxine qui déclenche la régénération du muscle, et sont suivies 3, 12 ou 24 jours, 48 reçoivent dans ce même muscle un virus porteur d'un gène, suivies cinq semaines, et toutes sont marquées par tatouage des phalanges et génotypées par un prélèvement de queue. Le projet étudie deux lignées qui reproduisent un dérèglement de lipides en cause dans la myopathie myotubulaire, où les souris peuvent développer une faiblesse musculaire importante, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées à l'issue pour disséquer leurs muscles. Un lot de souriceaux de deux semaines est en outre exploité pour établir des cultures de cellules musculaires. Le porteur écrit que la toxine "pourrait rarement provoquer une nuisance modérée (irritations et démangeaisons)", et précise dans le même passage que le muscle injecté "retrouve sa fonction normale" au bout d'une vingtaine de jours.

Objectifs

La myopathie myotubulaire est une maladie génétique néonatale très grave caractérisée par une hypotonie et une atrophie musculaire sévère. C’est une maladie incurable qui conduit au décès des patients par détresse respiratoire dès le plus jeune âge. Le gène responsable de cette maladie code la Myotubularine. C'est une enzyme qui régule une classe de lipides appelée phosphoinositides (PIs). Ce projet a pour objectif de caractériser et d’étudier deux modèles de souris qui reproduisent la dérégulation des lipides contrôlés par la Myotubulaine. Notre but est d’identifier les processus cellulaires ciblés par ces lipides dans le tissu musculaire et comment leur dérégulation impacterait l’apparition et la progression de la maladie. Dans ce contexte, des résultats de l’équipe montrent que l’accumulation les lipides régulés par la Myotubularine régulent le systéme de dégradation des protéines. D’autre part, nos expériences dans des modèles cellulaires dépourvus de la Myotubularine montrent que ces cellules manifestent des défauts de différentiation musculaire. Nous proposons ainsi d’étudier les impactes de la dérégulation des lipides régulés par la myotubularine MTM1 dans le modèle murin (in vivo) spécifiquement dans le muscle squelettique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de décortiquer dans un contexte intégré et physiologique les effets musculaires de la dérégulation des lipides régules par la Myotubularine et ainsi apportera une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques mis en jeu dans la myopathie myotubulaire liée à l’X. Il permettrait ainsi de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques pour cette maladie génétique incurable.

Procédures

Injection d'une toxine (Notexin) à faible dose qui induit la régénération du muscle et donc la formation de nouvelle fibres musculaires: Nombre 72, Durée = 3J ou bien 12J ou bien 24J Post injection (en intramusculaire). Injection d'un viris (l'Adeno-associated virus) pour permettre l’acheminement de gène (non oncogène) dans un tissu afin d'étudier en détail la fonction de ce gène d’intérêt : Nombre 48, Durée 5 semaines post injection (en intramusculaire). Tous les animaux utilisés dans ce projet sont identifiés par un tatouage aux phalanges et sont génotypés suite à un prélèvement de queue inférieur à 0,5mm par le service de l’animalerie habilités pour ce geste.

Impact sur les animaux

Les souris concernées dans cette étude peuvent développer une faiblesse musculaire importante. Chez l’homme la pathologie liée à la perte de fonction des gènes étudiées dans ce projet induit une myopathie rare et sévère avec qui entraine le décès chez les nouveau-nés ou à l’enfance. De ce fait on suspecte que les protéines étudiées sont nécessaires au développement du muscle qui démarre pendant la vie fœtale. Afin d’étudier ce process et de s'affranchir de l’analyse des fœtus, on a choisi de reproduire la formation du muscle en injectant une toxine (Notexin) à faible dose qui induit la régénération du muscle et donc la formation de nouvelles fibres musculaires. Cette injection se fait d’une manière localisée (Tibialis de la souris) mais pourrait rarement provoquer une nuisance modérée (irritations et démangeaisons). La formation de nouvelles fibres musculaire dans le modèle murin se fait assez rapidement au bout d’une vingtaine de jours et le muscle retrouve sa fonction normale. De même, afin d'approfondir le lien entre nos gènes d’intérêt et la régénération musculaire, on propose d’utiliser un outil d’acheminement des gènes pour les exprimer dans un tissu : les Adénovirus associés. C’est une approche fréquemment employée dans le muscle et utilisée dans les thérapies géniques chez l’homme. L’injection de ces virus est localisée (Tibialis) et ne provoque pas d’effets nuisibles notables chez les souris (résultats antérieurs publiés par le porteur du projet). Enfin tous les animaux utilisés dans ce projet sont identifiés par un tatouage aux phalanges et sont génotypés suite à un prélèvement de queue inférieur à 0,5mm par le service de l’animalerie habilités pour ce geste.

Devenir

A l'issue des procédures 1 2 et 3, les animaux sont mis à mort et les muscles sont disséqués et analysés. Ces analyses sont indispensables pour comprendre comment l’altération des phosphoinositides impacte des processus importants de la proteostase musculaire dans le contexte de la myopathie myotubulaire.

Remplacement

En dépit de l’exitance de modèles cellulaires (cellules musculaires de souris dépourvus de l’expression de MTM1 et de Fbxw7) développés par le porteur du projet, ces modèles ne traduisent pas la physiopathologie de la maladie. En effet, cette myopathie apparait dès la naissance chez l’homme et s’aggrave progressivement en touchant spécifiquement le muscle (la fibre musculaire formée qui ne peut pas être reproduite en culture cellulaire). Cette particularité rend l’exploration des cellules musculaires en culture très limitante (restreint aux aspects moléculaires et cellulaire de la perte de l’expression de la protéine MTM1) pour étudier la physiologie de la maladie et envisager des solutions thérapeutiques. De même, il n’existe pas à ce jour des systèmes cellulaires plus intégré (type organoïde) pour étudier le muscle qui est un organe complexe soumis à l’innervation et la contraction. En ce qui concerne la régénération musculaire, c’est un processus complexe qui met en œuvre l’ensemble des cellules résidentes dans le muscle (fibres musculaires, cellules immunitaires, cellules de soutiens du stroma, cellules nerveuse…) et de ce fait impossible à reproduire dans un système in vitro/in cellulo ou ex vivo). Ainsi, le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est 8 animaux pour les lignées sans intervention et 6 animaux pour les mêmes lignées avec intervention. Deux animaux en plus par groupe seront inclus afin d’anticiper des pertes. Ainsi le nombre de souris/groupe est réduit à son maximum en respectant les contraintes statistiques dans les publications scientifiques, sans compromettre les objectifs du projet et pour permettre des analyses statistiques fiables. Le nombre de souris utilisé est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs en tenant compte de la variabilité entre individus et entre groupe experimentaux.

Raffinement

L’effet de la réexpression de MTM1 et de Fbxw7 dans le muscle des deux modèles étudiés par l’outil AAV fera l’objet d’un suivi. Dans les deux cas, afin de restreindre la réexpression de MTM1 et Fbxw7 dans les cellules musculaires et minimiser au maximum des effets indésirables potentiels, les deux gènes seront sous contrôle d’un promoteur musculaire (expression restreinte au muscle squelettique). La procédure de suivi des animaux injectés par la Notexin ou des Adeno associated virus consistera à faire des observations quotidiennes. Tout effet indésirable peu importe son degré fera l'objet d'un suivie. Une observation des animaux en expérimentation est réalisée quotidiennement. L’état général de l’animal est évalué : prise de nourriture, toilette et mouvements habituels sont considérés comme des signes de bonne santé. La douleur est évaluée par les signes de prostration, de perte d’appétit ou de poids et de mouvements pénibles. Le poids qui traduit entre autres la masse musculaire (atteinte musculaire suite à la délétion des gènes d’intérêt) sera mesuré dès la naissance et tous les 3 jours. L’environnement des animaux est enrichi (bandes de papier Sizzle-Nest pour la nidification, cube de bois pour usure des dents, tunnel ou d'igloo). Pour les animaux qui développeront une faiblesse musculaire (myopathie), l'accès à la nourriture et à l'eau sera facilité en plaçant des croquettes humidifiées et de l'hydrogel dans la cage. Des points d'alertes et des points limites sont fixées par le responsable afin d'entreprendre l'action à appliquer pour réduire la souffrance animale.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris parce que le modèle animal de la perte fonctionnelle de la Myotubularine reproduit les principales caractéristiques de la maladie humaine et permet ainsi de se rapprocher le plus de la physiopathologie de la maladie. Le modèle Fbxw7 n’est disponible que chez la souris. D’autre part, l’étude de la myogenèse in vivo après la régénération musculaire a été trés bien décrite chez la souris. C’est un processus conservé et de ce fait traduit ce qui se passe chez l’homme. Il n'existe pas de modèles alternatifs et accessibles pour induire et suivre la myogenèse au cours du temps. Les cultures primaires de cellules satellites isolées de souris de 2 semaines présentent l'avantage de reproduire la différenciation musculaire ex vivo et de complémenter les résultats acquis in vivo, permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Les souris sans intervention seront utilisées entre 2 et 20 semaines selon le besoin (survie du phénotype). Un lot de souriceaux âgés de 2 semaines sera utilisé afin d’établir des cellules primaires et compléter l’étude in vivo après régénération (diminuer le nombre de souris). Cet âge est la meilleure fenêtre de prélèvement pour isoler les cellules souches du muscle (cellules satellites).

3 984 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par une sonde introduite dans l'orifice urinaire sous anesthésie, puis reçoivent des injections répétées d'antibiotiques avant d'être tuées pour prélever vessie et prostate. Le porteur affirme que les souris ne montrent aucun signe extérieur d'infection ni de douleur, tout en reconnaissant un stress lié aux administrations répétées. Il présente l'étude des organes comme "impossible sans modèle animal" et oppose l'"organisme entier" aux analyses en tube à essai jugées "trop simplistes".

Objectifs

Les infections urinaires masculines (IUM) sont fréquentes et difficiles à traiter. Elles sont différentes des infections urinaires survenant chez la femme car chez l’homme, en plus de l’infection des urines et de la vessie il y a également une infection de la prostate. Malgré le traitement par antibiotique, les prostatites (infection de la prostate) récidivent très fréquemment, dans 20% des cas. Il a été montré que dans la grande majorité des cas, ces récidives sont dues à des bactéries qui n’ont pas été tuées par l’antibiotique et qui persistent donc dans la prostate. Ces rechutes vont être à l’origine d’une altération de la qualité de vie des patients et de la prescription de nouveaux antibiotiques qui peuvent provoquer des effets indésirables et sélectionner des bactéries résistantes au traitement antibiotique, rendant ainsi les infections plus difficiles à traiter. Il est donc urgent de comprendre pourquoi ces bactéries persistent dans la prostate, pour en améliorer le traitement. Pour cela, l’étude directe de la prostate est nécessaire, ce qui ne peut être réalisé chez l’humain. L’objectif de notre projet est de comprendre la discordance entre la non-réponse aux antibiotiques (persistance de bactéries dans la prostate) et la supposée sensibilité à l’antibiotique dans les tests habituellement réalisés en laboratoire de ville (examen bactériologique des urines). Pour ce faire, nous utiliserons un modèle d’infection urinaire de souris provoquant une infection de la prostate.

Bénéfices attendus

Notre objectif est d’améliorer le traitement des infections urinaires masculines pour éviter les rechutes.

Procédures

Tous les animaux sont infectés sous anesthésie générale. Les produits anesthésiants sont injectés dans le ventre de la souris à l’aide d’une petite aiguille. Les bactéries sont injectées à l’aide d’une petite sonde rentrée dans l’orifice urinaire. Cette étape d'infection dure environ 3 minutes par animal. -Le traitement antibiotique est réalisé par des injections sous cutanées d’antibiotiques sur un animal vigile (durée du geste d'environ 15 secondes). La fréquence (toutes les 4 à 12 heures) ainsi que la durée du traitement (24 heures à 5 jours) dépendent de l’antibiotique utilisé. -Les urines sont recueillies au cours d’une miction spontanée. -L’animal est mis à mort par surdosage en médicament anesthésiant administré sur animal vigile par une piqûre dans le ventre. -La vessie et la prostate sont ensuite prélevés stérilement après la mort de l’animal. -La durée de l'infection est variable de 48 heures à 21 jours.

Impact sur les animaux

Les souris ne présentent pas de signe extérieur d’infection dans ce modèle. Leur comportement est normal. Elles urinent de manière normale sans signe extérieur évoquant de la douleur au moment de la miction. Les produits administrés ne sont pas douloureux. Les administrations répétées d’antibiotiques pourront avoir un impact sur le bien-être animal et provoquer un stress auquel nous serons particulièrement attentifs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de prélever stérilement leurs organes (vessie, prostate ) après la mort pour analyser les bactéries qui s'y trouvent.

Remplacement

L’accessibilité aux organes touchés par l’infection urinaire masculine (prostate et vessie) en dehors des urines reste très limitée chez l’homme. Or l’étude simple des urines ne permet pas d’expliquer la récidive de l’infection urinaire. L’analyse des bactéries dans les prostates et les vessies est donc nécessaire et impossible sans modèle animal. L’étude des bactéries et de la réponse à l’antibiotique dans les tubes à essais est trop simpliste et ne rend pas compte des facteurs multiples qui sont impliqués dans un organisme entier.

Réduction

Grâce à une analyse statistique, nous réduisons au minimum le nombre de souris utilisées tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs c'est à dire qui nous permettent de conclure de manière fiable sur le plan mathématique. Les contrôles ayant été infectés par la même souche seront comptabilisés dans les analyses des différentes procédures ce qui pourra permettre de diminuer le nombre de contrôles dans une procédure ultérieure. De nombreuses analyses dans les tubes à essais seront réalisées en amont pour choisir les bactéries, les antibiotiques et les conditions les plus pertinentes afin de réduire les animaux utilisés. Nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d’analyses possibles à partir d’un même animal. Tous les organes prélevés sont congelés pour pouvoir les réanalyser au besoin ultérieurement.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi c'est à dire avec des cotons pour jouer par exemple, avec une semaine d’adaptation avant l’expérimentataion. Un suivi quotidien sera réalisé. L’infection urinaire est réalisée sur une souris anesthésiée. Les souris seront euthanasiées si leur état se dégrade brusquement ou si elles présentent un état de souffrance. Une grille de score est prévue à cet effet qui sera également remplie quotidiennement.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme espèce animale pour réaliser les expériences de ce projet est pertinent car l’infection urinaire chez la souris est très proche de celle chez l’Homme. Ce modèle est utilisé depuis de nombreuses années dans la littérature scientifique. Nous étudierons des souris adultes de 8 à 12 semaines et uniquement de sexe masculin car la prostatite ne survient que chez les hommes adultes.

520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de vancomycine déclenchant une insuffisance rénale aiguë, des prélèvements d'urine par pression abdominale, et pour une partie une incision dorsale pour microscopie in vivo. Le porteur indique que l'atteinte rénale peut provoquer une perte de poids et une déshydratation, les souris perdant plus de 20 % de leur poids étant mises à mort. Il cherche à comprendre puis à prévenir cette toxicité et affirme que l'étude de la fonction rénale rend l'usage de la souris "indispensable".

Objectifs

L’insuffisance rénale aiguë médicamenteuse est une cause fréquente de morbi-mortalité et d’hospitalisations. La vancomycine est un antibiotique largement utilisé dans la prise en charge des infections bactériennes à germes multirésistants. Malgré le développement de formules purifiées, le risque de toxicité rénale reste élevé et se manifeste par une insuffisance rénale aiguë . Aucune approche thérapeutique de l'insuffisance rénale provoquée par la vancomycine n’a actuellement été mise au point. Le seul mécanisme généralement proposé était la toxicité directe de la vancomycine sur un type particulier de cellules rénales. Or l'action de la vancomycine sur le rein semble plus complexe . Il a été montré un nouveau mécanisme de toxicité médiée par l'accumulation de l’antibiotique et de protéines dans le rein. Un modèle animal de souris a permis de valider la formation après une injection rapide de vancomycine de dépôts dans les cellules rénales et de caractériser ce nouveau mécanisme de toxicité. Cependant, le rôle d'autres protéines dans l'accumulation de la vancomycine reste inconnu. Une meilleure compréhension mécanistique de cette toxicité rénale ainsi que la recherche de stratégies thérapeutiques innovantes visant à la prévenir ou la prendre en charge constitue un enjeu important. Le projet vise à répondre à ces questions en explorant plusieurs hypothèses : 1) Quel est le rôle des protéines dans l'accumulation rénale de vancomycine? 2) La modulation de l'entrée et de la sortie de vancomycine dans les cellules rénales peut elle modifier la toxicité de la vancomycine? 3) La modification de l'acidité urinaire peut elle diminuer l'accumulation de vancomycine et la toxicité rénale en conséquence?

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer une approche thérapeutique innovante actuellement inexistante dans la néphropathie induite par la vancomycine et avancer dans la compréhension des mécanismes physiopathologiques de cette néphropathie afin d'en réduire les conséquences. Même s’il est résolutif, un épisode d’insuffisance rénale aiguë sévère s’accompagne d’un surrisque d’évolution vers l’insuffisance rénale chronique et constitue un réel problème de santé publique. Une meilleure prise en charge de ces insuffisance rénale aiguë peut également réduire les coûts liés aux hospitalisations prolongées et le nombre de patients évoluant vers l’insuffisance rénale chronique qui est associée à une baisse de la qualité de vie et des coûts élevés de prise en charge. Enfin, ces nouvelles stratégies thérapeutiques obtenues grâce à nos résultats pourront être mises à l’épreuve ultérieurement lors d’études cliniques.

Procédures

1- Injections intra péritonéales de médicaments dilués dans du serum physiologique sur animal vigile : dans une procédure, maximum trois fois par jour pendant un maximum de 2 jours consécutifs plus une dernière injection pour l'anesthésie finale. Ce qui fait un total de 7 injections sur 3 jours. Dans les autres procédures, 3 injections sur 3 jours. l'injection est rapide(quelques secondes). 2- Un prélèvement d'urine par pression abdominale sur animal vigile pendant quelques secondes. Un prélèvement d'urine est prévu à J0 ou J1 et J3, ce qui fait deux prélèvements en tout. 3- Pour la microscopie in vivo (6 animaux par lot de 20) réalisée une seule fois, une incision dorsale est pratiquée après une analgésie et une anesthésie générale. Cette étape est réalisée sur un plateau thermostaté à 37 degrés. La préparation et l'observation durent 20 minutes environ 4- Prélèvement du sang sous anesthésie ( 30 secondes environ), sur un plateau thermostaté; suivi de l'euthanasie par une méthode règlementaire en vue des différents prélèvements et analsyes necéssaires.

Impact sur les animaux

Le stress généré par les injections intrapéritonéales (contention et douleur au site d'injection) . Stress lié aux traitements dans l'eau de boisson (néophobie du rongeur). L'incision cutanée (pour une partie des animaux) et l'induction d'une insuffisance rénale aigue provoquent indubitablement une douleur, une altération de l'état général et un stress de l'animal : - douleur provoquée par l'incision cutanée - altération de l'état général : perte de poids, déshydratation. - stress induit par des manipulations quotidiennes. Complications liées à l'anesthésie (détresse respiratoire, stress thermique). Ces nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Remplacement

Une partie des expériences concernant la précipation de la vancomycine selon le pH a pu être effectuée in vitro mais pour étudier l'impact des différents traitements proposés sur la fonction rénale, l'utilisation de la souris est indispensable. Il est nécessaire de suivre le comportement de la vancomycine du compartiment sanguin au compartiment rénal qui est un système tissulaire complexe composé de plusieurs types cellulaires.

Réduction

Les expériences précédentes qui ont mis en évidence la précipitation de la vancomycine dans les cellules rénales ont permi d'évaluer l'hétérogénéité de certains paramètres étudiés. Des lots de 10 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence des différences entre les groupes et s'assurer de la reproductiblité des résultats d'une série à l'autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants chez des mâles. Puis nous confirmerons les résultats sur un troisième lot de 10 souris femelles. Le nombre total d'animaux pour ce projet est de 520 souris. Des test statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont acclimatés dans l'animalerie au moins une semaine avant le début de la procédure. L’animalerie est agréée par le ministère de l'agriculture. Elle dispose d’un système de ventilation et de traitement de l’air avec une hygrométrie et une température contrôlées quotidiennement. Hygrométrie 55 plus ou moins 10 pour cent et température 20-24 degrés. Cycle d’éclairage rongeurs 12heures par jour. Isolation phonique. Les animaux seront hébergés dans des cages en portoir ventilées (5 souris maximum par cage) avec un enrichissement par litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments de tailles différentes tels que des morceaux de bois pour leur permettre de ronger, et des billes de cellulose pour les obliger à les déployer pour faire des nids. Une surveillance quotidienne du bien-être animal (pesée et comportement) sera réalisée par le personnel de l’animalerie et le porteur de projet. Le critère d'arrêt est la perte de poids de plus de 20 pour cent par rapport au poids initial (avant traitement). La durée du traitement par la vancomycine est très court et ne devrait pas engendrer une insuffisance rénale trop sévère et dommageable pour les souris. Pour assurer le bien être des animaux, les étapes les plus délicates que sont l'imagerie in vivo et l'euthanasie seront réalisées sous anesthésie générale avec une antalgie en plus pour l'incision dorsale nécéssaire à l'observation au microscope.

Choix des espèces

Ce modèle animal de souris déja utilisé a permis de valider antérieurement la formation de dépots dans les cellules rénales après un bolus de vancomycine et de caractériser le phénomène obstructif conduisant à l'insuffisance rénale. Afin d'assurer la reproductibilité des résultats, il apparait préférable de poursuivre la recherche sur ce même modèle de souris. Un modèle in vitro ne permet pas de modéliser la néphropathie à la vancomycine du fait de la complexité et diversité cellulaire du rein. 8-12 semaines d'age, période d'acclimatation d'une semaine. Etat adulte de maturation du rein chez la souris et âge avec lequel le modele a été validé.

196 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe intracérébrale de cellules humaines de glioblastome lors d'une chirurgie stéréotaxique, suivie de trois séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur attend une neuroinflammation, un état fébrile temporaire, une perte d'appétit et une léthargie après l'injection. Il caractérise un biomarqueur d'imagerie du gliome et qualifie le recours à des animaux vivants d'"indispensable" pour le caractère translationnel des lignées humaines.

Objectifs

Les cancers du cerveau sont encore aujourd’hui de mauvais pronostic, et notamment le plus agressive le glioblastome qui est aussi le plus fréquent. Ces cancers sont classés et identifiés grâce à des analyses réalisées directement sur le tissu malade à partir de biopsies cérébrales. L’un des critères majeurs est la présence d’une mutation spécifique sur le gène appelé IDHmut. Cette mutation apporte des éléments pronostics important pour les patients puisque les tumeurs cérébrales IDHmut ont un meilleur taux de survie que les IDH non mutés. La greffe de cellules humaines de glioblastome est un modèle animal de cancer du cerveau largement utilisé depuis plusieurs décennies pour disséquer les mécanismes de croissance du cancer. Ce modèle permet aussi de tester et d’évaluer de nouvelles thérapies. Des lignées cellulaires portant la mutation IDHmut seront greffées sur des souris afin de créer un modèle se rapprochant des caractéristiques des cancers humains. Ce projet permettra de caractériser les différences entre les souris portant la mutation et des souris témoins et fournira de nouvelles méthodes d’imagerie in vivo. Ces nouvelles méthodes en imagerie médicale sur les souris seront utilisées pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les glioblastomes (GBM) sont les plus fréquents et les plus grave des gliomes diffus de l’adulte, avec une médiane de survie globale qui ne dépasse pas 15 mois. Ce projet permettrait de caractériser un nouveau biomarqueur d’imagerie (mesuré en spectroscopie par résonance magnétique) dans un modèle bien connu de GBM chez la souris. Ce biomarqueur sera ensuite associé à d’autres marqueurs fonctionnels (grâce aux ultra-sons ou aux biomarqueurs d’imagerie en tomographie d'emission de positrons) qui pourront servir pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. En effet, la possibilité d’obtenir ces biomarqueurs sur des modèles précliniques sera une aide précieuse pour une évaluation précoce de nouveaux outils thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule chirurgie d'une durée de 30 minutes. Par la suite les animaux auront 3 examens d'imagerie non invasive de 1 heure maximum chacun pendant lesquels les animaux seront anesthésiés et endormis.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur ces animaux sont l’inflammation locale et en particulier le déclenchement de médiateurs de l’inflammation dans le cerveau. Cette neuroinflammation modérée et locale peut provoquer un état fébrile temporaire dans les heures suivant l’injection, se traduisant par une perte d’appétit et une léthargie. Cette nuisance exclusivement liée à l’injection stéréotaxique ne sera pas répétée et ne durera pas plus de 12 heures. Une douleur pendant la chirurgie et post-chirurgicale peut apparaître et sera anticipée, évaluée et traitée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de la procédure, afin de permettre des analyses post-mortem in vitro seront réalisées sur les échantillons de cerveaux. En effet, les données d’imagerie in vivo doivent être complétées par les analyses in vitro qui permettent d’apporter des mesures plus variées et précises sur les problématiques métaboliques et vasculaires.

Remplacement

Le projet a été construit après un passage en revue de la littérature actuelle et une comparaison détaillée des données expérimentales mises à notre disposition. Le projet contient des protocoles d’imagerie in vivo (TEP, IRM, ultrasons) permettant d’étudier le métabolisme tumoral au sein de son microenvironnement, ce qui implique l’utilisation d’animaux vivants. Les équipements d’imagerie (microTEP, microIRM et sonde ultrasonore) sont adaptés à la souris. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour assurer le caractère translationnel des résultats. En effet, les lignées utilisées sont d’origine humaine et les mesures en imagerie in vivo sont similaires à celle obtenues chez les patients. Ainsi, notre projet permet l’étude comparée des phénomènes physiopathologiques étudiés, et constitue un élément essentiel pour la recherche future de biomarqueurs et de thérapies utilisables chez l’humain.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux est réalisée grâce au suivi longitudinal, en imagerie non invasive IRM, de la taille de la tumeur. Ce type de suivi augmente la puissance statistique et les tests statistiques permettent de réduire de 51 à 34 le nombre souris. Ce projet permettra de contrôler le bien-être des souris en rapport avec le volume de la tumeur cérébrale. Cette étude pilote guidera les étapes suivantes qui seront adaptées en fonction des résultats observés. L’ensemble du projet nécessite 196 souris. Les expérimentations se dérouleront en sous-groupes expérimentaux : l’ensemble de l’étude étant constitué de 2 groupes (un groupe contrôle et un groupe test), chaque groupe sera divisé en sous-groupes (de 5 à 7 souris) ce qui permettra d’analyser par des tests statistiques les résultats après les données obtenues sur chaque sous-groupe. Si les analyses montrent des données significatives, les blocs suivants ne seront pas utilisés, participant ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille d’évaluation neurologique et des points limites adaptés. La mutation portant sur le gène IDH n’apportera pas de changement majeur par rapport à la lignée sauvage, dite wild-type "wt", (si ce n’est une vitesse de croissance diminuée), les points limites seront les mêmes pour tous les animaux. Il a été démontré que la lignée utilisée dans ce protocole ne provoque pas de déficits moteurs chez les souris avant le jour 27 après injection intracérébrale en comparaison des souris contrôles. Les actes chirurgicaux (injection stéréotaxique) seront réalisés sous anesthésie générale avec analgésie adaptée (anti-inflammatoires), thermorégulation continue, et hydratation intra-péritonéale. La douleur sera réduite au maximum par l’administration répétées d’analgésiques en cas d’apparition de signes de souffrances. En cas de signes de détresse, la procédure sera interrompue et si nécessaire, l’euthanasie sera effectuée. Les séances d’imagerie avec ultra-sons seront réalisées avec une sonde de taille adapté aux crânes des souris.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris est optimale car l’organisation neurochimique du cerveau de la souris est proche de celle de l’humain. Ce modèle est aussi pertinent car le model de greffe de glioblastome humain chez la souris est très bien décrit. Enfin, l’imagerie par ultra-sons fonctionnels peut être réalisée chez la souris à travers le crâne directement car les os du crâne sont suffisamment fins pour ne pas provoquer d’atténuation du signal. De la même façon que l’échographie, le signal ultrasonor est atténué grandement par les os. Souris adultes de 2 mois afin de modéliser les gliomes diffus de l’adulte.