Recherche appliquée

54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris nude subit une chirurgie de trente minutes créant une poche sous-cutanée dans le dos pour y implanter une racine de dent humaine de dix millimètres. Le porteur attend une douleur post-opératoire modérée et une gêne liée à la dent implantée. Il teste un dispositif de régénération de la pulpe dentaire, développe des cultures en bioréacteur mais affirme que le modèle animal reste le "seul" à permettre de vérifier la formation d'une pulpe vascularisée.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester un dispositif médical implantable pour permettre la régénération de la pulpe dentaire. Le dispositif est un cône qui peut être inséré dans la racine d'une dent à la fin d'un traitement de racine lorqu'un saignement aura été provoqué dans le canal par le chirurgien-dentiste pour former un caillot sanguin. Ce cône permettra la prolifération du tissu nouvellement formé, comme lors d'un processus de cicatrisation, sur la longueur totale du canal c'est-à-dire jusqu'à la couronne dentaire. Ce cône permet également la libération d'un agent antibactérien, l'acide tannique, pour assurer la désinfection totale du canal. Le projet a donc également pour objectif de vérifier l'innocuité de l'agent antimicrobien sur la régénération tissulaire.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet est la validation d'une nouvelle approche de traitement des nécroses pulpaires. Le traitement permettrait de ne plus utiliser de matériaux pour une obturation canalaire à la fin d'un traitement de racine qui a encore un taux d'échec de 10%. La régéneration du tissu permettra une réponse biologique à des agressions futures de la dent (carie ou fracture) et favorisera donc le maintien de la dent sur l'arcade sur une période plus prolongée.

Procédures

La procédure chirurgicale sous-cutanée est réalisée sous anesthésie générale et couverture antalgique et dure au maximum 30 minutes. Le geste proposé dans cette demande est la création d’une poche sous-cutanée dans le dos de la souris pour l’implantation d’une racine d’une dent humaine. L’idée ici est de permettre la mise en place de phénomènes de vascularisation pour étudier la mise en place d’un néo-tissu pulpaire dans le canal radiculaire de la racine implantée.

Impact sur les animaux

La procédure employée est peu invasive puisqu’il s’agit de réaliser une poche sous-cutanée dans le dos de l’animal. On peut donc s’attendre à une douleur post-chirurgicale d’intensité modérée. L’insertion d’une dent (longueur 10 mm) va générer une gène mais qui ne devrait pas avoir de retentissement sur l’activité de la souris. La procédure peut néanmoins générer un stress au moment de l’acte chirurgical.

Devenir

Les animaux utilisés sont des souris nude qui ont un phénotype dommageable. Ces animaux ne peuvent dont pas être adoptés. Aux vues du type d’expérience menée, la réutilisation des animaux n’est pas envisageable non plus. L’ensemble des animaux qui seront utilisés seront donc mis à mort. Ceci a été discuté avec le vétérinaire en charge de l’animalerie dans laquelle se passera l’expérimentation.

Remplacement

Nous développons actuellement des dispositifs de culture tridimensionnelle en bioréacteur pour permettre de recréer l’environnement du canal radiculaire d’une dent humaine. Mais les processus de formation du tissu ne peuvent être étudiés jusqu’au bout car le volume du tissu empêche l’oxygénation et l’élimination des déchets de l’activité métabolique cellulaire. Ceci n’est possible que dans un modèle animal. Le modèle choisi ici d’implantation ectopique d’une dent humaine est déjà très couramment utilisé dans le monde et est le seul qui permet à ce jour de vérifier la formation d’une pulpe dentaire vascularisée (Ling Lei et al. Mesenchymal stem cell characteristics of dental pulp and periodontal ligament stem cells after in vivo transplantation, Biomaterials 35(2014) 6332-6343; Qian Li et al. Multifunctional peptide-conjugated nanocarrieres for pulp regeneration in a full-length hman tooth root. Actac Biomaterialia 17 (2021) 252-265).

Réduction

Les premières étapes du projet ont été conçues pour permettre la réduction du nombre d'animaux utilisés. Elles doivent permettrent en effet d'affiner la formulation du dispositif médical pour n'avoir à en tester qu'un seul type, avec une dose d'acide tannique (agent antimicrobien) définie comme efficace et non toxique. Les premières phases de la régénération tissulaire (cicatrisation) induites par notre procédure ont été testées in vitro pour s'assurer du potentiel de réussite de cette expérimentation. Etant donné le nombre d'analyses nécessaires (études histologiques, immunohistologiques...) et afin de valider les résultats, le nombre maximum d'animaux a été évalué à 54 souris pour 2 ans. De plus, uniquement l'implant validé in vitro, sera testé en implantataion sous cutanée. Il n'y aura pas de tests statistiques, nous effectuerons des observations directes. Par exemple, pour la biocompatibilité, nous regarderons en priorité le recrutement et l'infiltration éventuelle de cellules inflammatoires. Le n a été déterminé pour avoir une triplicat par temps d'implantation.

Raffinement

Afin de nous assurer du bien-être des animaux au cours de ce protocole nous avons mis en place les mesures suivantes : - la chirurgie sera réalisée sous anesthésie/analgésie en prenant garde que la température de l'animal soit maintenue tout au long de la procédure. De plus un traitement analgésique pos-opératoire sera mise en place. - L'état de santé des animaux sera suivi quotidiennement en période post-opéraoire puis tous les 3 jours jusqu'à la fin de la procédure. - Des points limites pédictifs ont été mis en place pour interrompre la procédure et soulager les animaux. Enfin comme nous utilisons des animaux immunodéprimés, il est prévu que l'hébergement se fasse en portoirs ventilés permettant de préserver la qualité de l'air de la cage et ainsi d'éviter aux animaux d'être infectés par des pathogènes ambiants potentiels.

Choix des espèces

Le modèle utilisé est la souris. Le modèle murin d’implantation sous cutanée est lui très simple et favorise donc une diminution drastique de l’inconfort de l’animal (procédure rapide, avec peu de dommage tissulaire associé). De plus cela permet d’utiliser des modèles pour lesquels la réponse immunitaire a été altérée ce qui est essentiel dans notre cas puisque la source d’agent chimiotactique est humaine. Nous utiliserons des souris nude. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (après 8 semaines minimum) pour présenter des systèmes physiologiques (notamment immunitaire) matures.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées au polluant PFOS par gavage deux fois par semaine pendant vingt-huit jours, vaccinées contre la grippe, puis soumises à des prélèvements sanguins répétés en rétro-orbitaire. Le porteur les fait tuer pour prélever les organes cibles du système immunitaire. Il affirme que la souris est le "meilleur modèle" et qu'il n'existe "pas encore" de méthode alternative, tout en présentant l'objectif final du programme comme la mise au point de tests sans animaux.

Objectifs

De nombreuses substances chimiques produites par l’activité humaine polluent l’environnement. Ces polluants environnementaux sont multiples et leurs effets néfastes sur la santé humaine sont nombreux. Parmi les polluants environnementaux, certains sont des polluants organiques persistants, c’est-à-dire qu’ils s’accumulent dans l’environnement mais aussi dans les organismes, comme l’organisme humain, du fait d’une très lente élimination. Ils représentent une large famille de plusieurs milliers de composés produits intentionnellement par synthèse chimique pour leurs propriétés diverses. Ces substances se répandent dans l’environnement lors de leur production et de leur utilisation. La population humaine y est donc largement exposée, notamment, par ingestion ce qui peut entraîner de nombreux problèmes de santé comme la perturbation endocrinienne (maladies thyroïdiennes, problèmes de fertilité…), des lésions hépatiques et des cancers. L’agence sanitaire européenne a proposé une réévaluation de la toxicité de ces polluants organiques persistants en incluant leurs effets sur le système immunitaire. L’objectif de cette expérience pilote consiste à mettre au point un protocole adapté visant à analyser, chez la souris, les conséquences d’une exposition par ingestion (gavage) à un polluant organique persistant, sur la réponse immunitaire consécutive à une vaccination anti-grippale. L’administration par ingestion a été choisie afin de mimer le principal mode d’exposition de la population humaine. Le polluant choisi pour cette expérience est l'un des plus connus de sa catégorie.

Bénéfices attendus

Ce programme de recherche en immunotoxicologie englobe de nombreux laboratoires de recherche français et étrangers. Il s’agit d’une démarche de caractérisation des effets de polluants environnementaux sur l’organisme. Ces effets constituent un réel enjeu de santé publique. Ce projet d’immunotoxicologie dont fait parti cette première demande d'autorisation à projet, a pour objectif de développer des biomarqueurs d’exposition et des méthodes de mesures standardisées avec l'objectif à la fin de la réalisation complète du programme de mettre en place des tests réglementaires robustes ne faisant pas appel à l’expérimentation animale.

Procédures

Gavage : 2 fois par semaine pendant 28 jours. Le temps de gavages est de moins d'une minute. Injection intra-musculaire : 2 injections maximun sur 74 jours. Une injection dure environ 30 secondes. Prélèvements sanguins tous les 5 jours pendant 47 jours. Comme ce prélèvement se ferra au niveau sinus retro-orbitaire en tenant compte de la sédation par inhalation, de la contention et de la récupération du sang la durée est estimée à 3 minutes par prélèvement.

Impact sur les animaux

Le gavage peut induire une iritation de l'oesophage. La toxicité du polluant peut provoquer une réaction chez l'animal. La vaccination en intra musculaire peut provoquer une douleur localement. Les prises de sang répétés engendrent des contraintes aux animaux à cause de la contention et du renouvellement de leur volume sanguin induit par les prélèvements et pouvant avoir une influence sur leur état général.

Devenir

A l'issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes cibles pour étudier dans le détail le système immunitaire.

Remplacement

La souris est le meilleur modèle pour ce genre d’étude d’immunotoxicité sur la réponse vaccinale et il n’existe pas, encore à ce jour, de méthode alternative à ce modèle. Il permet d'étudier la réponse intégrée de l'organisme, cruciale dans la réponse immunitaire. Dans cette DAP nous prévoyons une première partie expérimentale afin de mettre au point nos techniques d'analyse et de valider le design expérimental post mortem prévu. Selon les résultats obtenus grâce à cette étude, un nouveau projet sera mis en oeuvre sur des souris mâles et femelles en testant différentes doses de polluant, probablement plus faibles que la dose utilisée dans cette présente expérience . Ceci permettra d’évaluer l’effet genre ainsi que la relation entre la dose de polluant et son effet sur la réponse vaccinale. Dans l’ensemble notre projet permettra de mieux comprendre l’impact des polluants environnementaux sur la réponse immunitaire consécutive à une vaccination dans un modèle in vivo. Les résultats obtenus in vivo seront comparés à ceux que nous obtiendrons en parallèle sur des modèles in vitro et ex vivo (cellules humaines) afin d’aider à la mise en place de tests réglementaires robustes ne faisant pas appel à l’expérimentation animale.

Réduction

Les procédures ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement exploitables. De plus, afin d’obtenir le maximum d’informations sans augmenter le nombre d’animaux utilisés, nous élargirons notre étude à d’autres tissus que ceux composant le système immunitaire (rate, sang), notamment le foie, qui joue un rôle crucial dans le métabolisme et la détoxication. Afin de rationaliser le recours aux animaux, le plan expérimental prévoit le prélèvement de plusieurs tissus sur une même souris (rate, foie, sang), la congélation de plusieurs échantillons d’un même tissu pour des analyses a posteriori (par notre laboratoire ou dans le cadre de collaborations), ainsi que l’analyse de plusieurs paramètres sur un même prélèvement (ARN, protéines). En particulier, nous travaillons en concertation avec différents laboratoires de recherche impliqués dans le programme et avons établi une procédure de partage des prélèvements biologiques murins afin d'optimiser l'utilisation des souris.

Raffinement

Les procédures ont été pensées afin de limiter la douleur, des points limites nous permettant d’estimer le degré de douleur ou d’inconfort ont été définis et une grille de scoring a été établie. Des actions d'enrichissement du milieu de vie sont proposées pour réduire les nuisances. Les animaux seront hébergés en portoir ventilé par groupe de 5 avec accès ad libitum à l’eau et à la nourriture et à de l’enrichissement comme des maisons type igloo en plastique ou en carton. Pour réaliser les prélévements de sang les animaux seront sédatés par une anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Le modèle est couramment utilisé dans le domaine de la toxicologie selon la bibliographie. Les animaux seront expérimentés à partir de 7 à 8 semaines d'âge, qui correspond à la fin de la phase exponentielle de croissance, selon la fiche référence de la souche du fournisseur et cet âge.

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Privées de système immunitaire, elles reçoivent sous la peau des fragments de tumeurs pancréatiques de patients, une série de 750 d'entre elles étant traitée par cinq molécules de chimiothérapie avant prélèvement des tumeurs. Le projet compare des tumeurs de patients à survie courte et longue pour chercher des cibles et des marqueurs prédictifs, les tumeurs pouvant provoquer inconfort et ulcérations. Le porteur affirme que les souris immunodéficientes forment un modèle "qui ne peut être remplacé" pour conserver les caractéristiques des tumeurs humaines.

Objectifs

L’adénocarcinome pancréatique (ACP) est l’un des cancers les plus graves. Avec plus de 12000 décès par an en France qui lui sont imputés, il pose un problème majeur de santé publique. En dépit des importants efforts de recherche consentis au cours des dix dernières années, les traitements conventionnels n’ont qu’un impact limité. La chirurgie reste la seule stratégie potentiellement curative, mais seuls 20% des patients peuvent en bénéficier car la plupart du temps, au moment du diagnostic, ce cancer est déjà à un stade très avancé, la médiane de survie de ces patients restant inférieure à 6 mois et la survie à 5 ans inférieure à 3%. Pratiquement tous les patients souffrant d’un ACP développent des métastases (cellules cancéreuses qui ont migrées dans d’autres organes) et décèdent des conséquences dévastatrices de leur développement. Le point de départ de ce projet est la constatation que très peu de patients atteints d’ACP survivent longtemps ; de plus nous manquons de nouvelles molécules thérapeutiques capables de s’attaquer spécifiquement aux cellules cancéreuses pancréatiques en épargnant autant que possible les cellules non cancéreuses. De nombreux travaux de recherche ont montré que les tumeurs pancréatiques sont très hétérogènes d’un patient à un autre et que cette hétérogénéité est associée au niveau de résistance aux chimiothérapies et au temps de survie du patient. Nous avons donc émis l’hypothèse que les tumeurs des patients de courtes ou de longues survies présentent des mécanismes et des caractéristiques moléculaires différentes entre elles, ce qui nous a déjà permis, dans des travaux antérieurs, d’identifier des marqueurs biologiques capables de prédire la survie des patients. Notre projet a donc pour objectif de déterminer les caractéristiques moléculaires des tumeurs de patients de courtes survies et celles des patients de longues survies associées ou non à des protocoles de chimiothérapies, puis de les comparer entre elles ceci dans le but de mieux comprendre la biologie de l’ACP, de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques spécifiques à chaque groupe de patients et d’identifier des marqueurs biologiques capables de prédire la réponse aux traitements des patients.

Bénéfices attendus

Le point de départ de ce projet est la constatation que très peu de patients atteint d'ACP survivent longtemps. Notre projet a donc pour objectif de comparer les caractéristiques moléculaires des tumeurs de patients de courtes et longues survies obtenues par des analyses biologiques et moléculaires, lesquelles sont associées au niveau de résistance aux chimiothérapies et au temps de survie du patient. Les bénéfices attendus de ce projet seront donc l'identification de nouveaux mécanismes moléculaires activés par la cellule tumorale permettant ainsi le développement de nouvelles molécules thérapeutiques, de nouveaux marqueurs biologiques capables de prédire la résistance / sensibilité aux chimiothérapies et/ou de permettre un diagnostic précoce des patients. Il nous permettra ainsi de mieux comprendre la biologie du cancer pancréatique ainsi que les raisons de son pronostic sombre et de la réponse limitée des patients aux différents traitements.

Procédures

Pour atteindre les objectifs de ce projet, 3 procédures seront réalisées : Pour les procédures 1 et 2 les tumeurs seront découpées en petits morceaux et injectées sous anesthésie chez la souris en sous-cutanée entre les omoplates avec une aiguille. Une fois que la tumeur aura atteint le volume souhaité, la souris sera mise à mort puis la tumeur sera prélevée pour réaliser les différents analyses biologiques. Une 3ème procédure nous permettra de déterminer l’efficacité anti-tumorale des différentes chimiothérapies actuellement utilisées en clinique sur les xénogreffes de tumeurs pancréatiques de patients, puis d’identifier des signatures moléculaires prédictives de la sensibilité aux traitements, recherchées sur les tumeurs prélevées. Une série de souris porteuses d’une xénogreffe de tumeur pancréatique de patient établit selon la procédure n°2, sera traitée avec 5 molécules thérapeutiques différentes composées de 3 injections maximum par souris par traitement. Les souris témoins recevront une solution de sérum physiologique. Les animaux seront pesés avant injection et les tumeurs mesurées au pied à coulisse (instrument de mesures).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sur les animaux comprennent les implantations de tumeurs faites en sous cutanée entre les omoplates sous anesthésie ; le développement de tumeurs sous-cutanées qui peuvent générer éventuellement un certain inconfort ou être la source d’ulcérations cutanées bien que ces effets n’ont jamais été observés dans nos expériences précédentes lors de notre vigilance quotidienne ; les injections de molécules chimiothérapeutiques qui peuvent générer une douleur, ces traitements peuvent être la source de différentes nuisances telles que la diminution du poids, l’absence d’activité bien que ces effets n’ont jamais été observés dans nos expériences précédentes ; la contention de l’animal vigile nécessaire pour les diverses injections ou les mesures des volumes tumoraux ou les manipulations de l’animal pour prise de poids corporel ou l’anesthésie peuvent être un facteur de stress éventuel.

Devenir

L'ensemble des animaux des 3 procédures seront mis à mort sous anesthésie afin de prélever les tumeurs qui serviront (1) à maintenir la bio-banque de tumeurs pancréatiques et à extraire le matériel biologique (ADN, ARN, protéines, …) de chaque tumeurs de patients pour des analyses moléculaires ultérieures, (2), à réaliser des coupes histologiques des tumeurs (anatomo-pathologie) afin d’identifier de nouveaux marqueurs biologiques prédictifs de la résistance / sensibilité aux chimiothérapies.

Remplacement

Au vu de la complexité du cancer du pancréas, l’utilisation des souris immunodéficientes, qui sont des modèles bien établis en cancérologie expérimentale, est justifiée et ne peut être remplacée car elles permettent d’une part la prise des xénogreffes de tumeurs pancréatiques dérivées de patients et éviter les phénomènes de rejets et d’autre part le maintien des caractéristiques moléculaires de la tumeur originelle du patient ; ces caractéristiques seront nécessaires pour identifier de nouvelles cibles diagnostiques et thérapeutiques et de nouveaux marqueurs biologiques capables de prédire la sensibilité aux différentes chimiothérapies spécifiques selon le profil « tumoral du patient ». Cependant, dans un souci de remplacement, les marqueurs biologiques qui seront identifiés et les informations de sensibilité /résistance aux chimiothérapies qui seront obtenues dans ce projet, auront pour avantage dans le futur de diminuer fortement l’utilisation d’animaux, en particulier en testant directement les marqueurs biologiques prédictifs de l’efficacité des traitements sur les tumeurs du patients. De plus, ce projet va nous permettre de cultiver les cellules tumorales pancréatiques de chaque tumeur de patients en 2 et 3 dimensions pour réaliser des études in vitro et ex vivo ce qui nous évitera l’utilisation d’animaux supplémentaires.

Réduction

Concernant les procédures 1 et 2, le nombre de souris nécessaires est fondé sur une estimation maximale du nombre de xénogreffes de tumeurs pancréatiques de patients à implanter et à la quantité de matériels biologiques nécessaires pour réaliser les différentes analyses moléculaires et biologique. Pour la procédure 3, nous n'utiliserons que le nombre d’animaux nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 750 animaux. Le nombre de souris de chaque groupe a été calculé avec un test statistique de puissance. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons aussi mis au point un système de congélation de tissu qui nous permet de congeler les xénogreffes de tumeurs pancréatiques pour les conserver en "dormance" dans l'azote liquide. Ce système permet de conserver des tissus vivants pour des études futurs en dehors de la souris et limitera considérablement l'utilisation des animaux.

Raffinement

Dès réception, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation de 7 à 10 jours pendant laquelle ils seront familiarisés à la manipulation par les expérimentateurs. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux. Dans chaque cage, nous mettons plusieurs types d’enrichissement ; les litières sont changées toutes les semaines ; de petits groupes sociaux sont constitués afin d'éviter le stress de l’isolement ; La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Les souris sont endormies sous anesthésie pour tous les actes qui pourraient générer de la douleur (implantation de tumeurs), puis mises sous une lampe chauffante et surveillées jusqu'à leur réveil. Un contrôle quotidien des souris sera effectué en plus d'un contrôle approfondis bihebdomadaire de l'état clinique de nos animaux sera réalisé́, d’avantage si leurs état le nécessite.

Choix des espèces

Pour mener à bien notre projet, nous avons besoin d'une espèce de mammifère dépourvu de système immunitaire pour éviter les phénomènes de rejets des xénogreffes de tumeurs humaines. Ces souris qui sont des modèles bien établies en cancérologie expérimentale et qui ont fait l’objet de plusieurs centaines de publications, permettent la prise des xénogreffes de tumeurs pancréatiques, le maintien des caractéristiques moléculaires des tumeurs, et d’étudier au sein d’un organisme entier la stabilité et l’efficacité des molécules chimiothérapeutiques. De plus, la souris est facilement manipulable, de par sa petite taille, d’une utilisation simple et peu coûteuse, ce qui en fait un modèle expérimental de choix pour notre projet. Les souris seront reçues à 4 semaines. Cela permettra aux animaux de récupérer du stress engendré par le transport et de s'adapter à leur nouvel environnement. Nous les laissons s'habituer et s'adapter pendant 1 à 2 semaines avant de commencer les expérimentations. De plus, cela nous permettra de travailler chez le jeune adulte et de garder nos animaux sur une durée plus longue, certaines tumeurs mettent plusieurs semaines avant d’atteindre une taille compatible avec les besoins en matériels biologiques nécessaires à nos projets.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Privées de système immunitaire, elles subissent des chirurgies abdominales pour implanter des tumeurs du côlon ou du pancréas, parfois une ablation de la rate, puis une seconde chirurgie de résection guidée par fluorescence, avec risque de douleur, de perte de poids et d'infection. Le projet fait la preuve de concept d'anticorps couplés à une sonde pour mieux repérer et retirer les tumeurs pendant l'opération. Le porteur affirme que cette démonstration ne peut se faire que sur des animaux porteurs de ces tumeurs, les tests in vitro ayant déjà été réalisés.

Objectifs

Malgré l'émergence des thérapies personnalisées, la chirurgie joue toujours un rôle essentiel dans le traitement de nombreux cancers comme les cancers colorectaux et pancréatiques. Un problème majeur réside dans la difficulté de détecter les tumeurs et de visualiser les marges tumorales. La chirurgie guidée par fluorescence (FGS) permet aux chirurgiens une meilleure visualisation des structures anatomiques en temps réel. De plus, la FGS peut être améliorée en associant une imagerie pré-opératoire par imagerie nucléaire (SPECT) pour localiser avec précision les tumeurs. Dans le projet, nous proposons de faire la preuve de concept de l’intérêt d’utiliser des anticorps ciblant les tumeurs, conjugués à une sonde (Ac bimodaux) permettant de réaliser de l'imagerie bimodale (radionucléide/fluorescence) afin d'améliorer la stadification pré-opératoire (SPECT), la détection per-opératoire des tumeurs et leur résection (FGS) mais aussi d'améliorer le suivi post-opératoire (SPECT). Nous avons déjà montré dans des modèles de tumeurs sous-cutanées que ces Ac bimodaux étaient visualisables par imagerie in vivo (SPECT et fluorescence) et qu’ils nous permettaient de réaliser de la FGS. Pour prouver le potentiel thérapeutique de l’utilisation de ces Ac bimodaux en chirurgie par fluorescence, il nous faut maintenant utiliser des modèles précliniques mimant la pathologie humaine, tels que des modèles orthotopiques de cancer du côlon et du pancréas, mais aussi des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales. L’objectif est d’optimiser la résection tumorale par l’utilisation de chirurgie assistée par fluorescence après injection de ces Acs bimodaux et de démontrer l’absence de reprise tumorale suite à l’acte chirurgicale. A terme nous nous attendons à démontrer que l’utilisation de ces Ac bimodaux permet une visualisation fine des tumeurs avant la chirurgie (imagerie SPECT) et une détection plus précise par fluorescence permettant de minimiser l'étendue de la résection. L'absence de récidive pourra être détectée en ré-injectant cet Ac bimodal quelques mois après la chirurgie pour visualiser l’absence de récidive (SPECT). Ce projet ce déroulera sur 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le but de ce travail est de pouvoir faire la preuve de concept de l’utilisation de la chirurgie assistée par fluorescence à l’aide d’Ac bimodaux afin d’éliminer les tumeurs primaires ou disséminées. Ce projet nécessite donc la mise au point des modèles précliniques mimant la pathologie humaine des cancers coliques et pancréatiques avec des tumeurs orthotopiques mimant des tumeurs primaires et des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales d’origine colique. Ce projet devrait permettre une meilleure prise en charge chirurgicale des patients atteints de cancers primaires ou métastatiques en permettant une meilleure détection des tumeurs, facilitant leur élimination en épargnant le tissu sain et évitant ainsi une récidive tumorale.

Procédures

Trois des modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (30 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules ou fragment de tumeur), la fermeture de la cavité abdominale. Dans le cas du modèle de métastases hépatiques, la rate de ces souris sera enlevée suite à l’injection des cellules tumorales. Pour le modèle de carcinomatose péritonéale, les cellules tumorales seront injectées en intrapéritonéale après anesthésie gazeuse des souris (1-2 min/souris). Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2. Les souris recevront 1 injection intrapéritonéale (1-2 min/souris) tous les 7 jours (sous anesthésie gazeuse) du composé permettant l’imagerie des tumeurs. Ces souris seront ensuite anesthésiées à l’isoflurane pour être imagées. Tous les animaux porteurs de tumeurs (orthotopiques ou métastases) subiront une chirurgie d’exérèse assistée par fluorescence après injection des Ac bimodaux (30 min/souris).

Impact sur les animaux

Les modèles animaux mimant la formation de tumeurs primaires coliques ou pancréatiques (modèles orthotopiques) et métastatiques d’origine colique nécessitent un acte chirurgical. L’ouverture de la cavité abdominale des souris, l’injection des cellules tumorales dans le pancréas, la réalisation d’une splénectomie ou encore la ligature d’un morceau de tumeur sur le caecum sont des interventions pouvant entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. Le développement des tumeurs primaires, ainsi que l’apparition des métastases peuvent également être à l’origine de souffrance et de gênes qui seront évaluées par observations fréquentes des animaux (3 fois par semaine) et estimation de la prise tumorale par imagerie de bioluminescence après injection I.P. de luciférine. Les séances d’imagerie courte étant réalisées sous anesthésie à l’isoflurane, cet acte n’induira pas de stress supplémentaires aux animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de pouvoir vérifier par autopsie l’absence de reprise tumorale.

Remplacement

La preuve de concept de l’utilisation de ces Acs bimodaux pour de la chirurgie assistée par fluorescence nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’Homme et donc d’avoir les tumeurs primaires sur les organes d’origine et les métastases se disséminant. Le but est de montrer que les tumeurs sont plus facilement détectables, qu’elles peuvent être éliminées plus finement et ainsi permettre une meilleure récupération post-chirurgie et enfin qu’il y a moins de récidive. Cette preuve de concept ne peut donc être faite que sur des animaux présentant ce type de tumeurs et sur lesquels sera fait la FGS. Tous les tests in vitro préalables ont déjà été faits, tout comme la preuve de concept sur des modèles plus artificiels d’animaux porteurs de tumeurs sous-cutanée.

Réduction

Pour chaque Ac bimodal à tester (5), deux groupes de 5 souris (contrôle vs Ac bimodal) seront constitués afin de générer des groupes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer l’efficacité de la chirurgie tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. La visualisation de la récidive par imagerie SPECT après injection du même Ac bimodal permet de réduire le nombre d’animaux qui sont leur propre contrôle. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées (formation de niveau concepteur de projet avec soit une formation chirurgie du petit animal soit être chirurgien) afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les prises tumorales peuvent être différentes d’une chirurgie à l’autre, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes.

Raffinement

Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Les souris étant immunodéprimées, elles seront hébergées sous couvercle filtrant et une antibiothérapie préventive sera utilisée avant chaque chirurgie. La totalité des procédures chirurgicales impliquant les animaux (injection sous-cutanée, intraveineuse, imagerie, chirurgie abdominale) est réalisée sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante ou couveuse, réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Tout au long des opérations, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tous le long de l’expérimentation. Les animaux bénéficieront d’une réhydratation per- et post-opératoire ainsi qu’une prise en charge antalgique adaptée. Un système facilitant la prise alimentaire ainsi que la prise de boisson sera mis en place (nourriture gélifiée). Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Les injections intrapéritonéales (cellules pour le modèle de carcinomatose péritonéale et luciférine) seront réalisées sous anesthésie. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie de la bioluminescence après injection de luciférine.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour tester facilement les nouveaux outils permettant de faire de la chirurgie assistée par fluorescence. Nous utiliserons des souris immunodéficientes Swiss Nude, nous permettant d’implanter des cellules tumorales humaines (HCT116-luc et PANC-1-luc). Ces souris ont déjà été utilisées lors des premiers travaux avec des tumeurs humaines xénogreffées. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).

792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent en intraveineuse une dose unique de candidats anticancéreux, subissent des prélèvements de sang répétés à la queue, puis un prélèvement terminal de grand volume par ponction cardiaque sous anesthésie "pouvant induire un arrêt cardiaque", les effets indésirables attendus allant de la perte d'appétit à la diarrhée. Le porteur précise que les souris écartées du protocole, trop légères ou mal injectées, servent d'abord à s'entraîner aux gestes techniques avant d'être tuées. Il affirme qu'un "organisme entier et vivant" est "nécessaire" pour ces analyses de tolérance.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer la tolérance lors de l’administration des candidats de thérapie ciblée anticancéreuse. Les données de tolérance sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats anticancéreux dans la circulation sanguine en dose unique. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de tolérance (projet actuel), seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, à définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Ils permettront également d’objectiver des évènements indésirables. La première dose de cette étude sera déterminée en se basant sur une dose de référence connue, efficace et bien tolérée.

Bénéfices attendus

Les données de tolérance seront nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats anticancéreux dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et ainsi, à terme, de déterminer les doses et les fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

# Une contention et des prélèvement(s) sur animal vigile seront prévues sur chaque animal : -lors de l’injection par voie intraveineuse dans le veine de la queue des candidats anticancéreux J(0) (5minutes) -lors de chacun des prélèvements sanguins (en éraflant la veine de la queue pour ne prélever qu'une goutte de sang) à chaque temps (J(-3) , J(3) et J(9) post-traitement - 5 minutes). Une anesthésie générale sans réveil sera effectuée sur chaque animal en fin d’expérimentation et/ou atteignant les critères éthiques pour effectuer un prélevement sanguin final de grand volume, suivie d’une mise à mort (10 minutes).

Impact sur les animaux

# Les animaux subirons un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions et (4) anesthésies. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de l’injection par voie intraveineuse des candidats anticancéreux (au temps J(0)), et (2) de chacun des prélèvements sanguins(en éraflant la veine de la queue pour ne prélever qu'une goutte de sang) à chaque temps (J(-3) , J(3) et J(9) post-traitement). # S’agissant d’une expérience de tolérance, les composés de la classe thérapeutique utilisée peuvent induire des évènements indésirables à haute dose (parmi les plus attendus : perte d’appétit, fatigue, diarrhées, perte de cheveux…), pouvant aller jusqu'à l'atteinte des critères ethiques. Il est à noter que ces effets sont généralement transitoires (environ une semaine pour les doses les plus fortes et culminant autour du 3ème jour post-traitement). # Un prélevement sanguin final de grand volume, pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil sur l’ensemble des animaux arrivant en fin d’expérience (à 28 jours post-traitement) ou en cas d'atteinte des critères éthiques.

Devenir

L’ensemble des animaux entrés en procédure seront euthanasié : - Tous les animaux ayant atteint les critères éthiques ainsi que les animaux arrivant en fin d’expérience à 28 jours post-traitement auront un prélèvement sanguin de grand volume (par piqure dans le coeur) effectuée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil. - Les animaux ayant atteint les critères éthiques et dont l’état ne permet pas de pratiquer ce prélèvement de grand volume , seront mises à mort par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse. - Les souris non entrées en protocole (problème à l'injection, poids inférieur à 24g...), seront reformées pour pouvoir pratiquer des entrainement aux geste techniques, puis mises à mort par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.

Remplacement

S’agissant d’analyses de tolérance, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse étudiés dans ce projet ayant une efficacité comparable entre humains/souris aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le procédé de micro-échantillonnage lors des prélèvements sanguins permet d’obtenir l’ensemble des valeurs pour un même animal en ne lui prenant que de très faibles quantités de sang. Le nombre d’animaux utilisés est ainsi considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus seront également mieux maîtrisées. En cas d’obtention de la dose maximum tolérée, les animaux prévus pour les doses suivantes seront annulés. Les animaux étant livrés chaque semaine pour les différents tests de dose, cela permettra de diminuer le nombre d’animaux entrés en protocole. Pas d’utilisation de groupe contrôle nécessaire par rapport aux échantillonnages de par l’utilisation d’un prélèvement sur les souris en expérience à J(-3) avant traitement par les candidats anticancéreux (permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux).

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Chaque essai de dose sera séparé du précédent d’une semaine, ce qui permettra d’ajuster au mieux les doses (ainsi que la souffrance résultant d’utilisation de doses trop élevées). Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et d’éviter au mieux toute souffrance animale. Les animaux seront observés sur critères physiques et comportementaux deux fois par jour pendant les trois premiers jours de traitement, puis une fois par jour jusqu’à la fin de l’expérience à J(28), et seront pesés une fois par jour pendant la première semaine, puis trois fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience à J(28). Un système de surveillance est mis en place au sein de l'établissement utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le week-end et les jours fériés. Les animaux inclus dans la grille de score n'atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement...). Une pommade antalgique/anesthésique pourra également être utilisée en cas d’inflammation au site d’injection. Le prélèvement sanguin final de grand volume (par piqure dans le coeur) sera effectuée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil et les prélèvements d’organes seront réalisés après la mort de l'animal.

Choix des espèces

S’agissant d’analyses de tolérance, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse étudiés dans ce projet ayant une efficacité comparable entre humains/souris, aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études. En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de pharmacocinétique (le devenir du médicament dans le sang au cours du temps) seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux les doses et les fréquences d'administration de ces candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse chez l'Homme.. Les animaux seront livrés à 7 semaines de développement et inclus en expérience à 8 semaines . A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une tolérance pertinente par rapport au type de thérapies utilisées dans ce projet.

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Privées de système immunitaire, elles reçoivent sous anesthésie un tatouage puis des injections intradermiques de mélanocytes humains, avant un suivi photographique de la pigmentation puis leur mise à mort à deux et quatre semaines pour prélever la peau. Cette étude pilote vise seulement à fixer le nombre de cellules à injecter en vue de futurs essais sur un modèle de vitiligo, maladie décrite comme "bénigne" mais lourde psychologiquement. Le porteur affirme que le remplacement "n'est pas envisageable" car aucun modèle in vitro ne suivrait la fonctionnalité des mélanocytes dans le temps.

Objectifs

Les objectifs de ce projet constituant une étude pilote, sont d’évaluer in vivo chez la souris l’évolution de la pigmentation cutanée au cours du temps suite à l’injection intradermique de différentes quantités de cellules responsables de la pigmentation cutanée appelées mélanocytes. Il s’agit d’un nouveau produit de thérapie innovante en cours de développement qui utilise des mélanocytes obtenus par différenciation de cellules souches humaines. Ce nouveau produit permettrait de repigmenter des zones cutanées dans le cadre d’une maladie appelée vitiligo au cours de laquelle des taches blanches, parfois des poils blancs, apparaissent sur la peau. Pour effectuer l’évaluation de ce nouveau produit de thérapie innovante, une suspension de mélanocytes à différentes concentrations, sera injectée en différents points dans une zone préalablement délimitée par tatouage sur des souris immunodéficientes, c’est à dire dépourvues d’un système immunitaire fonctionnel, afin d’éviter tout rejet. Un suivi de la pigmentation cutanée sera effectué de façon hebdomadaire à l’aide d'une caméra. Des prélèvements des sites d’injection des mélanocytes seront effectués à 2 temps différents mais relativement précoces après injection des mélanocytes humains afin de réaliser des analyses qui permettront de caractériser la présence et la fonctionnalité des mélanocytes. Cela permettra notamment de définir le nombre de mélanocytes à injecter dans le cadre d’études d’efficacité futures sur un modèle de vitiligo.

Bénéfices attendus

Le vitiligo est une maladie auto-immune, liée à un dysfonctionnement du système immunitaire, au cours de laquelle des taches blanches (parfois des poils blancs) apparaissent sur la peau. Elle concerne 0,5 à 1,0 % de la population mondiale selon des données de 2017. Ces dépigmentations peuvent survenir à n’importe quel moment de la vie, n’importe quel âge, et quelle que soit la couleur de la peau. Bien qu’il soit considéré comme une maladie bénigne, le vitiligo n’est pas anodin : il a des répercussions psychologiques importantes qui peuvent altérer la qualité de vie des personnes qui en souffrent (dépression, angoisse, isolement…). Des traitements existent, à base de crèmes, en association ou non avec un traitement par la lumière (photothérapie), traitements par voie orale ou sous-cutanée, mais la repigmentation est un phénomène long, 6 à 24 mois de traitement sont nécessaires pour obtenir des résultats satisfaisants, avec des effets secondaires plus ou moins importants, et une récidive dans 40 à 50% des cas. La greffe de mélanocytes provenant du patient lui-même est une solution mais elle nécessite de prélever de la peau dans une zone pigmentée, engendrant la création de cicatrices pouvant elles-mêmes être peu ou pas pigmentées. Il est donc important et nécessaire de développer de nouvelles thérapies permettant de traiter et de repigmenter plus rapidement les zones atteintes de dépigmentation, d’en évaluer la fonctionnalité et la stabilité au cours du temps par des approches simples et sur des modèles expérimentaux représentatifs de la pathologie humaine. Ces nouvelles thérapies pourront ainsi être évaluées par la suite chez l’Homme et elles permettront d’améliorer la prise en charge et la qualité de vie de personnes atteintes de vitiligo.

Procédures

Les 24 souris nécessaires à la réalisation de ce projet seront tout d’abord soumises à un tatouage de 4 points effectués sur le dos en arrière des omoplates, sous anesthésie générale, réalisés en 10 minutes environ. Une semaine plus tard, les 24 souris seront soumises chacune à 4 injections dans la peau de cellules responsables de la pigmentation cutanée ou du milieu dans lequel elles seront mises en suspension, à l’intérieur de la région délimitée par les 4 points de tatouage. Ces injections seront réalisées sous anesthésie générale, en 10 minutes environ. Pour chaque souris, les sites d’injection seront observés et photographiés chaque semaine afin de suivre l’évolution de la pigmentation cutanée au cours du temps. Ces observations et photographies seront effectuées sous anesthésie générale, en 5 à 10 minutes environ.

Impact sur les animaux

La douleur induite lors de la réalisation des points de tatouage puis des injections intradermiques des mélanocytes sera très limitée du fait de leur exécution sous anesthésie générale en un temps relativement court (moins de 10 minutes). Le suivi de l’évolution de la pigmentation cutanée effectué de façon hebdomadaire au cours de l’étude, nécessitant la mise sous anesthésie générale afin de positionner correctement la caméra au niveau de la région délimitée par les 4 points de tatouage, n’engendrera pas de douleur et sera réalisé en un temps très court (5 à 10 minutes environ). Un suivi quotidien du comportement des animaux et régulier de leur évolution pondérale sera effectué tout au long de l’étude mais aucune modification comportementale notoire et aucune perte de poids significative ne sont attendues.

Devenir

Les 24 souris seront euthanasiées pour moitié 2 semaines après injections dans la peau de cellules responsables de la pigmentation cutanée ou du milieu dans lequel elles seront mises en suspension, et pour l’autre moitié au bout de 4 semaines, avec 3 souris de chacun des 4 groupes expérimentaux par temps de prélèvement, par injection d’une surdose d’euthanasique sous anesthésie générale profonde. Un prélèvement sera effectué au large des sites d’injections pour la réalisation d’analyses qui permettront de caractériser la fonctionnalité des cellules injectées au cours du temps.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité de mélanocytes injectés, processus dépendant de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané et réaction immunitaire). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet constituant une étude pilote mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. La réalisation de 4 sites d’injection intradermique par souris permet de limiter le nombre d’animaux nécessaires mais de fournir suffisamment d’échantillons par temps de mesure pour la réalisation des analyses envisagées. Une analyse statistique sera réalisée à partir des résultats des analyses effectuées.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux suite à la réalisation des points de tatouage, des injections intradermiques et des prises de photos hebdomadaires avec la caméra, effectuées sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint est observée, ou si des signes d’infection des sites d’injection ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les souris seront placées par 2 dans des cages de 18.9x29.6x12.8 cm équipées d’un couvercle filtrant dans une animalerie dédiée au souris immunodéficientes. Elles seront maintenues en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie), des bâtonnets d’ouate étant placés dans leur cage comme enrichissement pour assurer leur bien-être, remplacés lors de chaque change de litière. De la nourriture irradiée et de l’eau filtrée seront mises à disposition pour chaque cage.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant la réalisation d’injections intradermiques. D’autre part, l’utilisation de souris immunodéficientes, très peu pigmentées, permettra d’éviter le rejet des mélanocytes humains injectés. Les animaux seront des souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris classiquement décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études de greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines), l’injection intradermique de mélanocytes humains étant considérée comme une greffe cutanée.