Recherche appliquée

Toutes tuées pour la collecte de leurs tissus, 320 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit sous anesthésie une injection de cellules de mélanome sous la peau, et certaines reçoivent un anticorps deux fois par semaine pendant quatre semaines, en injections faites sans anesthésie. Selon le porteur, la tumeur peut s'ulcérer et les injections répétées dans l'abdomen causer une douleur. Il écrit que l'anticorps a déjà freiné en partie le mélanome chez des souris dépourvues de système immunitaire, qu'il a passé des tests de toxicité et vient d'entrer en essai clinique pour d'autres pathologies. Il affirme que l'approche, validée in vitro, appelle maintenant "une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l'humain".

Objectifs

Le mélanome cutané est un cancer de la peau agressif et malgré le développement de thérapies ciblées et d'immunothérapies. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du mélanome. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du mélanome dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules issues de patients par notre anticorps permet d’activer les cellules immunitaires. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer de la peau. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Le cancer de la peau de type mélanome est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologies.

Procédures

Une partie des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses de mélanomes. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Pour les souris injectées sous la peau, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée. De même, les injections répétées intrapéritonéales peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8-10 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement

Pour décrire l'inflammation du cerveau liée aux lésions de la maladie d'Alzheimer et tester un anti-inflammatoire, 39 microcèbes, des primates prosimiens, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin du projet. Chacun subit une inoculation dans le cerveau, lors d'une intervention de deux heures, de composés qui induisent ces lésions ou de composés témoins, cinq IRM de trois heures sous anesthésie, cinq prises de sang et des tests de mémoire et de saut, et 13 d'entre eux reçoivent pendant six mois un anti-inflammatoire mêlé à de la compote. Le porteur écrit que ces tests peuvent entraîner "une angoisse pour un animal qui réalise que sa mémoire est déficiente". Il annonce des points limites "pour limiter la douleur" sans en décrire aucun.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer est la plus fréquente des maladies neurodégénératives. Elle est caractérisée par des pertes de mémoires suivies au cours des années par des troubles cognitifs plus généraux et handicapants. La mort des neurones est liée à l'accumulation dans le cerveau de protéines pathologiques (on les appelle lésions de la maladie d'Alzheimer). Elle est associée à une inflammation du cerveau. Cette dernière est désormais établie comme un régulateur clé de la maladie, mais la nature des interactions entre l'inflammation et la maladie d'Alzheimer n'est toujours pas claire. Il est possible d'induire les lésions de la maladie d'Alzheimer chez un modèle primate non-humain. Notre hypothèse de travail est que la description de l'inflammation en réaction aux lésions de la maladie d'Alzheimer chez un modèle primate non-humain fournira de nouvelles connaissances inestimables vers de futures thérapies contre la maladie d'Alzheimer. Ce projet vise à répondre à deux interrogations scientifiques. 1. Décrire le processus inflammatoire associé aux lésions d'Alzheimer induite chez un primate. 2. Évaluer l'impact sur la maladie d'Alzheimer d'un traitement anti-inflammatoire. Globalement, ce projet permettra de mieux comprendre la maladie d'Alzheimer et de proposer une thérapie adaptée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de 1. Mieux comprendre les interactions entre les lésions de la maladie d'Alzheimer et l'inflammation. 2. Evaluer une thérapie contre la maladie d'Alzheimer avec une approche innovante basée sur l’utilisation d’un anti-inflammatoire.

Procédures

Intervention 1 pour tous les animaux : Etude du comportement des animaux dans des tests qui évaluent leur mémoire et leurs capacités à sauter (animaux arboricoles). -Tests de mémoire : Une session d'accoutumance et 4 sessions d'une heure chacune -Tests de sauts : 4 sessions d'une heure chacune Intervention 2 pour tous les animaux : Réalisation d'examen IRM (imagerie par résonance magnétique) pour étudier la réduction de la taille du cerveau qui est un signe associé à la maladie d'Alzheimer (appelée atrophie cérébrale). -5 sessions de 3 heures chacune Intervention 3 pour tous les animaux : Réalisation de prise de sang pour étudier la santé des animaux. -5 sessions de 5 minutes chacune Intervention 4 pour tous les animaux: Inoculation intracérébrale de composés permettant d'induire la maladie d'Alzheimer ou de composés contrôles (qui n'induisent pas la maladie d'Alzheimer). -1 session de 2 heures. Intervention 5 pour un groupe appelé Alzheimer-Traité (13 animaux) : Thérapie par un inhibiteur de l'inflammation. Le médicament est donné pendant 6 mois, par voie alimentaire mélangé avec de la compote de pomme.

Impact sur les animaux

Intervention 1 (étude comportementale) : Ce test peut entrainer une angoisse pour un animal qui réalise que sa mémoire est déficiente. Intervention 2 (examen IRM) : Stress lié à l'anesthésie lors de la réalisation des examens IRM. Intervention 3 (prise de sang) : Douleur et stress liés à une piqure d'aiguille. Intervention 4 (chirurgie cérébrale) : Douleur post-chirurgie. Réduction des capacités cognitives (légère et en général uniquement détectable dans des tâches comportementales très élaborées). Intervention 5 (Thérapie par un inhibiteur de l'inflammation) : Goût modifié de la compote de pomme entrainant une diminution de l'appétence.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin du projet. Nous voulons étudier l'impact des lésions de la maladie d'Alzheimer et d'une thérapie contre l'inflammation sur les lésions de la maladie d'Alzheimer qui ne peuvent être étudiées qu'en post-mortem par des études histologiques, biochimiques ou transcriptomiques .

Remplacement

L'apparition des lésions de la maladie d'Alzheimer et leur diffusion dans le cerveau dépend de l'interaction entre les lésions, le système immunitaire et le cerveau de l'hôte. Il n'y a actuellement aucun modèle alternatif non animal disponible pour effectuer une analyse complète de la dynamique d'apparition des lésions sans utiliser des animaux. L'inflammation du cerveau est très différente chez les primates et les rongeurs. Nos études ne peuvent donc pas être menées chez des rongeurs. Les tests in vitro ne permettent que d'étudier des aspects non-intégratifs de la maladie d'Alzheimer.

Réduction

Nous avons calculé le nombre minimal d'animaux qui permettra d'obtenir un résultat statistiquement fiable. Le calcul de la taille de l'échantillon a été réalisé en utilisant la cognition (capacité d'apprentissage) comme critère principal et en nous basant sur des résultats expérimentaux obtenus au cours d'études précédentes. Ce calcul a permis de réduire le nombre d'animaux, car si nous n'avions pas fait cette estimation, le nombre d'animaux utilisés aurait été plus élevé.

Raffinement

Pendant toute l'étude, les animaux sont hébergés dans un environnement à température contrôlée, avec cycles jour-nuit optimisés. Eau et nourriture sont fournies à volonté. L'environnement est enrichi par un système de nidification périssable renouvelé lors du change hebdomadaire. Les animaux sont examinés quotidiennement par les techniciens animaliers, sous la supervision d'un vétérinaire. Tout examen par imagerie IRM et intervention chirurgicale sont effectués sous anesthésie générale. Des points limites sont mis en place pour limiter la douleur. Toute intervention chirurgicale est effectuée sous anesthésie générale associé à des traitements anti-douleur. En cas de manifestation de douleur, une analgésie sera discutée avec le vétérinaire. Ces mesures garantissent que les conditions de douleur et de souffrance inutile des animaux sont contrôlées.

Choix des espèces

Les travaux sont menés sur des microcèbes adultes car la maladie d'Alzheimer touche les adultes. Le microcèbe est un primate qui présente un vieillissement cérébral très proche de celui de l'homme. Il est possible d'induire artificiellement des lésions de la maladie d'Alzheimer chez cet animal. Il s'agit du seul modèle primate de la maladie d'Alzheimer qui ne repose pas sur une surexpression de protéines anormales. Les modèles rongeurs de la maladie d'Alzheimer reposent sur une surexpression de protéines mutées anormales et ne représentent que partiellement la pathologie humaine. Surtout, la réaction inflammatoire des rongeurs est très différente de celle des primates. Le microcèbe est donc idéal pour étudier les relations entre pathologie Alzheimer et inflammation.

90 souris et 80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie sous anesthésie pour une injection intrathécale ou intracérébrale d'un candidat médicament, avant d'être tué par surdose d'anesthésique et exsanguination. Le projet étudie la distribution d'oligonucléotides dans le système nerveux au stade préclinique. Le porteur affirme que ce degré de complexité ne peut être atteint qu'avec un modèle animal.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives sont causées par la mort de neurones, ce qui affecte le fonctionnement du système nerveux de manière chronique et progressive. Ces maladies sont fortement invalidantes et peuvent affecter la motricité, et les fonctions cognitives. Pour être efficace, un médicament doit pouvoir atteindre sa cible neuronale pour agir et ralentir les procéssus neurodégénératifs. Pour atteindre le système nerveux, les médicaments doivent traverser la barrière hématoencéphalique, ou, être directement injectés dans l'environnement neuronal. Cette dernière approche est particulièrement appropriée pour des composés tels que des peptides ou des nucléotides. L'objectif est d'étudier la distribution de candidats-médicaments, tels que les oligonucléotides antisens, dans le système nerveux de rongeurs après injections intra-thécales ou intra-cérébrales.

Bénéfices attendus

Le projet s'intégre dans la phase préclinique du développement de candidats médicaments pour des maladies neurodégénératives. En cas de résultats positifs, le développement du ou des candidats médicaments pourra se poursuivre.

Procédures

Les animaux subiront une seule opération chirurgicale (injection intrathécale ou injection intra-cérébrale), sous anesthésie. Les stratégies d'anesthésies et d'analgésies impliquent des injections intra-péritonéales et sous-cutanées, ce qui peut induire à stress, avant la chirurgie et juste avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un acte chirurgical, sous anesthésie et analgésie, pouvant causer de la souffrance post-opératoire. Les injections d'analgésiques et d'anesthésiques peuvent induire un stress lors de l'administration. La classe de composé utilisée ici n'est pas décrite comme toxique dans la littérature, cependant un effet indésirable des traitements ne peut pas être exclu.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par surdose d'anesthésique et par exsanguination.

Remplacement

La distribution de composés dans le système nerveux dépend de plusieurs facteurs, tels que la diffusion au sein du liquide qui entourne les neurones, et la capture par différents types de cellules. Ces variables impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé pour assurer l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les études publiées dans la littérature scientifique suggèrent qu'un nombre de 10 souris par groupe est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ainsi, pour ce projet, nous travaillerons avec 10 souris ou 10 rats par groupe.

Raffinement

Le raffinement sera basé sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement (papiers pour nids, tunnels en carton), (ii) des approches d'analgésies quand nécessaire, (iii) et le contrôle strict des paramètres physiologiques des animaux (poids, température corporelle). Les animaux seront hébergés par deux au minimum (rats et souris) et 4 au maximum (souris uniquement), avec accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrances. Le projet a défini des points limites. Si un de ces points limites est atteint, le responsable de l’étude sera informé et l’animal sera mis à mort. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique (buprénorphine, 0.1mg/kg) sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs, dont les souris et les rats, possèdent un système nerveux complexe, qui présente des similitudes avec le système nerveux humain. Les rongeurs sont donc des modèles appropriés permettant l'étude de la distribution des candidats-médicaments dans le système nerveux central. Nous avons le matériel chirurgical et les équipements dédiés aux études impliquant des souris ou des rats. Les procédures expérimentales utiliseront soit des souris, soit des rats. Le choix de l'espèce, pour chaque procédure, est motivée par les séquences des oligonucléotides, ainsi que par les analyses réalisées avec les échantillons biologiques.

120 macaques à longue queue et 30 macaques rhésus vont être utilisés, réutilisés d'un projet à l'autre, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements répétés de sang, d'urines, de biopsies cutanées ou d'organes et de liquide cérébrospinal, sous contention ou anesthésie, pour valider des méthodes d'analyse de laboratoire. Le porteur indique que ces prélèvements servent à qualifier des essais réglementaires sur des candidats médicaments, et que les animaux sont euthanasiés en fin de vie sur avis vétérinaire. Il revendique le primate comme seule espèce pertinente et qualifie ces prélèvements d'indispensables.

Objectifs

Aujourd’hui, de plus en plus de candidats médicaments sont des protéines thérapeutiques (ou molécules biologiques plus ou moins complexes), et le primate non humain est souvent la seule espèce adéquate pour évaluer la toxicité ou l’activité pharmacologique de ces composés, du fait des homologies génétiques, immunologiques et physiologiques avec l’homme. Ces études d’évaluations sont requises par les autorités réglementaires et des lignes directrices existent pour définir leur conduite. Elles comportent de nombreuses analyses de laboratoire pour évaluer la concentration plasmatique (ou autres matrices) du composé testé, et la corréler avec son activité pharmacologique ou toxique. Compte tenu des enjeux et de la réglementation, il est indispensable que les résultats générés soient fiables et robustes. Ceci ne peut être assuré qu’après avoir démontré les performances analytiques des essais au cours de leur qualification et/ou validation analytique. Cependant, la composition des échantillons analysés peut influencer les résultats d’analyse et la performance d’un essai, il est donc nécessaire que ces paramètres soient évalués dans le même type d’échantillons que ceux à analyser. Par conséquent, effectuer les prélèvements biologiques provenant de primates non humains, en amont ou en parallèle de la réalisation des études, est indispensable pour valider les essais utilisés lors des analyses d’échantillons d’études. Par ailleurs, le développement et la validation règlementaire de nouvelles méthodes et de techniques plus sensibles et précises dans les laboratoires contribuent aux 3R, notamment en limitant les quantités de matrice biologique nécessaire et en permettant des interprétations plus fines.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’obtenir des matrices (prélèvements sur animaux) nécessaires au développement et à la validation d’essais analytiques au sein de l’établissement utilisateur afin d’assurer la génération de données validées règlementairement, fiables et exploitables, nécessaires et indispensables au développement de candidats médicaments. Le bénéfice est d’une part scientifique et réglementaire (court et moyen terme) : le projet permet d’assurer l’accès pour les laboratoires aux matrices biologiques nécessaires pour les développements et validations, en appui aux études de toxicologie réglementaire et au développement de médicaments, et de bénéficier de prélèvements de qualité, notamment en évitant des contraintes de conservation ou de transport. D’autre part, il y a un bénéfice important sur les 3R (bénéfices à court, moyen et long terme) : les techniques et les méthodes de laboratoires deviennent de plus en plus sensibles et précises et le développement de nouvelles techniques de laboratoire permet de raffiner (ex : diminution des volumes de matrices prélevées, augmentation des paramètres pouvant être analysés et de ce fait amélioration des conclusions des études) et en conséquence de réduire le nombre d’animaux utilisés le cas échéant. Un exemple concret correspond au développement d’approches permettant de doser plusieurs analytes à partir d’un volume réduit de plasma (analyses Multiplex avec la technologie Luminex®, électrochimie luminescence ou PCR digitale).

Procédures

Les prélèvements seront réalisés en respectant les recommandations éthiques en vigueur adaptées au type de prélèvement et en respectant une période de récupération adaptée pour l’animal entre deux prélèvements. Les prélèvements réalisés chez l’animal vigile : sang (unique ou répété) par les voies veineuses périphériques), urines, selles, frottis vaginal, nécessitent une contention de courte durée, manuelle (moins de 5 minutes) et/ou en chaise de contention (jusqu’à 30 minutes ou 1 heure maximum). Les prélèvements réalisés chez l’animal vigile (ex jeune animal) ou sous sédation (ex cas des animaux matures) : salive, larmes, sécrétions nasales, récolte du sperme ; si une sédation est requise, elle sera de courte durée (environ 5-15 minutes) et l’animal sera surveillé jusqu’à son réveil complet. Les prélèvements réalisés sous anesthésie générale : biopsie cutanée ou d’organes, liquide cérébrospinal, liquide synovial, humeur aqueuse ; l’animal sera surveillé jusqu’à son réveil complet. Dans certains cas particuliers les prélèvements exigent des contraintes d’hébergement particulières : Mise à jeun (préalablement à une anesthésie, maximum 18 heures) ; Hébergement individuel (contacts olfactifs, visuels, sonores préservés, pour recueil d’urine/fèces en cage à diurèse, en vue d’une analyse individuelle, maximum 18 heures).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont minimes et correspondent essentiellement au stress et douleurs liés à la contention et aux types de prélèvements : -Prélèvements sur animaux vigiles : hématome transitoire sur le site de prélèvement sanguin, légère douleur provoquée par la ponction à l’aiguille, stress provoqué par la contention et/ou l’hébergement individuel (contacts olfactifs, visuels, sonores… préservés), le cas échéant -Sédation/Anesthésie générale : effets cardiorespiratoires, hypothermie, stress provoqué par les manipulations liées à l’anesthésie -Prélèvements plus invasifs comme les biopsies : douleurs au niveau du site de biopsie, stress provoqué par l’intervention post-opératoire comme la contention pour les soins post-opératoires et les injections répétées. -Stress lors de contrainte occasionnelle liée à l’hébergement, notamment lors d’hébergement individuel, et de contention à la main ou en chaise le cas échéant.

Devenir

Après avoir pris en compte les effets subis par l’animal notamment lors de la participation dans les projets précédents et en tenant compte d’autres questions sanitaires, selon l’avis vétérinaire si ces animaux ne peuvent plus être réutilisés, le vétérinaire peut donner l’autorisation d’euthanasie. Dans ce cas-là les différents organes et du sang peuvent être prélevés et mis à disposition des laboratoires à la fin de vie de ces animaux. Selon l’avis vétérinaire les animaux peuvent être gardés en vie sous la responsabilité de l’établissement. Le suivi des animaux est maintenu selon les procédures de l’établissement et conformément aux règlementations et recommandations en vigueur (Directive 2010/63, AAALAC et autres recommandations éthiques internes). Ils pourront possiblement être sélectionnés selon des critères bien définis et réutilisés dans un projet.

Remplacement

Les lignes directrices de validation de méthodes recommandent que les essais soient validés dans les mêmes matrices que les échantillons d’étude (même espèce), afin de s’assurer de la performance des essais dans leur utilisation réelle. A l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode in vitro permettant de synthétiser ces produits biologiques en raison de la complexité des matrices biologiques utilisés dans ce projet, et les matrices primates ne peuvent pas être remplacées par des matrices d’autres espèces du fait de la règlementation et de la nature des candidats testés (ex : protéines thérapeutiques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet sera déterminé strictement selon les besoins des laboratoires et la réglementation en vigueur en termes de validation d’essais. Les prélèvements seront effectués pour les analyses prévues en utilisant le nombre d’animaux minimum requis. Par ailleurs, le développement de nouvelles méthodes et de techniques plus sensibles dans les laboratoires permet de limiter la quantité de matrice biologique nécessaire, contribuant ainsi à la réduction (3R).

Raffinement

Les techniques et les méthodes de laboratoire deviennent de plus en plus sensibles et précises, ce qui renforce l’efficacité des analyses. Les essais ex vivo réalisés en amont des études précliniques in vivo s’inscrivent dans une stratégie 3R (réduction et raffinement) car ils permettent de caractériser le candidat médicament (sélection du meilleur candidat, connaissance du profil métabolique, pharmacologique et toxicologique) avant de démarrer les essais sur l’animal. Les méthodes développées et validées dans ce projet permettent en particulier d’optimiser les doses utilisées ensuite pour les études vivo, et de limiter la quantité de matrice biologique nécessaire, ex : approches permettant de doser plusieurs analytes à partir d’un volume réduit de plasma (analyses Multiplex avec la technologie Luminex®) et techniques plus sensibles et plus précises (électrochimie luminescence ou PCR digitale permettant des interprétations plus fines). Les actes pouvant engendrer du stress, de l’inconfort ou des douleurs importantes seront réduits au minimum nécessaire et seront réalisés sous sédation ou anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté le cas échéant. Dans le cas où l’anesthésie est jugée plus traumatisante pour l’animal et/ou si l’anesthésie est incompatible avec les prélèvements prévus, les prélèvements seront réalisés sur l’animal vigile, notamment les prélèvements sanguins et le recueil d’urine, par exemple. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites (ex : plaie, gonflement au niveau du site de prélèvement, amaigrissement) qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a un signe d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux.

Choix des espèces

Les lignes directrices rendent indispensable l’utilisation d’un non-rongeur pour chaque nouveau médicament avant tout essai clinique et mise sur le marché. L’espèce primate est parfois l’unique espèce pertinente pour le développement préclinique de composés biologiques (protéines thérapeutiques, anticorps monoclonaux, vaccins anticancer). Le choix du primate non humain est justifié par les homologies génétiques, immunologiques et physiologiques avec l’homme, nécessaires pour prévoir au mieux l’activité toxique ou pharmacologique de nouveaux candidats médicaments chez l’homme. Parmi ces composés, on peut citer les anticorps thérapeutiques (ou autres peptides ou protéines), qui présentent une spécificité importante pour leur cible et qui souvent ne se lient pas sur les cibles d’autres espèces plus éloignées sur le plan phylogénétique comme le chien ou les rongeurs. Par ailleurs, de nombreux composés jouent un rôle dans la modulation du système immunitaire, comme les immunosuppresseurs ou immuno-activateurs (cas des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires en immuno-oncologie). Dans ces conditions, il est indispensable d’administrer ces composés chez l’espèce dont le système immunitaire se rapproche le plus de celui de l’homme. D’autres classes de thérapies avancées, comme certains virus oncolytiques par exemple, n’infectent que l’homme et le primate non humain. Animaux juvéniles d’au moins 22 mois, soit l’âge moyen auquel les animaux sont reçus à l’établissement utilisateur et auquel les animaux sont inclus dans les études réglementaires. Pour certains prélèvements biologiques, des animaux matures (maturité sexuelle ou maturité du système immunitaire) doivent être utilisés en fonction des besoins scientifiques et selon la disponibilité des animaux non attribués dans un autre projet au moment du besoin.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux à trois injections d'un candidat vaccin contre Klebsiella pneumoniae, deux à trois prélèvements de sang par section d'une partie de la queue au scalpel sous anesthésie, puis une ponction cardiaque terminale. Le porteur indique tester différents protocoles d'immunisation pour comparer leur efficacité, les retombées pour des patients étant renvoyées au conditionnel et au long terme. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'est pas encore possible de se passer du modèle animal pour produire des anticorps.

Objectifs

S’appuyant sur les données communiquées par 87 pays en 2020, un nouveau rapport de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) met en évidence des niveaux élevés de résistance des bactéries aux antibiotiques (supérieurs à 50 %), en particulier chez des bactéries fréquemment retrouvées en milieu hospitalier, comme Klebsiella pneumoniae et Acinetobacter baumannii, responsables de septicémie (infection généralisée). Le traitement de ces infections requiert obligatoirement l’utilisation d’antibiotiques de dernière ligne, tels que les carbapénèmes. Cependant, 8% (jusqu’à 50% dans certains pays) des souches de Klebsiella pneumoniae responsables d’infections sanguines sont résistantes à ces mêmes carbapénèmes, ce qui augmente notoirement le risque de décès imputables à ces infections. D’autres alternatives, en particulier vaccinales, sont actuellement à l’étude. Un candidat vaccin a déjà montré une protection significative dans un modèle de septicémie à Klebsiella pneumoniae chez la souris. Une précédente étude a également testé la production d’anticorps chez le lapin en réponse à l’administration de ce candidat vaccin. L’objectif du présent projet est de poursuivre l’étude de ce vaccin chez la souris en testant différents protocoles d’immunisation et en comparant leur efficacité et également d’analyser la spécificité du vaccin.

Bénéfices attendus

Après la mise en évidence de l’efficacité du candidat vaccin chez la souris, et de sa capacité à entrainer la production d’anticorps chez la lapine ce projet vise à déterminer le meilleur protocole d’administration et à évaluer la variabilité de réponse à son administration ainsi que sa spécificité. A terme, l’idée est de pouvoir favoriser la vaccination de populations à risque, en l’absence de traitement antibiotiques efficaces.

Procédures

Les animaux vont être soumis à différentes interventions : - 2 à 3 administrations du candidat vaccin par voie intramusculaire à J0, J21 +/- J42 (une administration correspond à une injection par cuisse) sur animal vigile _ 3 secondes par injection - 2 à 3 prélèvements sanguins à la queue à J0, J7 +/- J28 par section d’une partie de la queue au scalpel après anesthésie gazeuse _ 5 minutes dans la cage à induction pour l’anesthésie puis 10 secondes pour le prélèvement - 1 anesthésie générale par injection intrapéritonéale (3 secondes) directement suivie d’une ponction intracardiaque de sang (30 secondes) qui se terminera par une dislocation cervicale (3 secondes) pour assurer la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur légère : - Jusqu’à 3 administrations intramusculaires à J0, J21 +/- J42 (chaque administration correspond à 2 injections : cuisse droite + cuisse gauche) _ Le candidat vaccin ainsi que l’adjuvant ont déjà été testés chez la souris et le lapin et n’ont montré aucun signe de toxicité. - 2 à 3 prélèvements sanguins par section d’une petite portion de la queue à J0, J7 +/- J28 réalisés sous anesthésie gazeuse _ Prélèvements réalisés sous anesthésie et uniquement sur 10 souris par groupe. - 1 anesthésie générale par injection intra péritonéale (IP) directement suivi d’une ponction intracardiaque de sang qui se terminera par une dislocation cervicale pour assurer la mise à mort. _ La ponction intracardiaque étant réalisée sous anesthésie générale, elle ne sera associée à aucune douleur particulière.

Devenir

Les 100 animaux du projet seront mis à mort à l’issue des 28 ou 49 jours d’expérience ou plus précocement s’ils montrent des signes de souffrance.

Remplacement

La production d’anticorps est un mécanisme complexe basé sur l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires. La première étape indispensable à cette production est l’immunisation chez l’animal. Il n’est pas encore possible aujourd’hui de se passer du modèle animal pour la production d’anticorps.

Réduction

Le nombre d’animaux de cette étude a été déterminé en fonction de la quantité de sérum souhaité en fin d’expérience. Un volume correspondant au prélèvement de 20 souris sera nécessaire afin de réaliser des expériences in vitro de l’activité bactéricide sur plusieurs souche de K.pneumoniae. L’efficacité de l’immunisation sera analysée après 2 et 3 administrations ce qui impose un nombre de 40 animaux pour les groupes recevant le vaccin ou les cellules porteuses. En revanche, pour le groupe témoin (adjuvant) pour qui aucune production d’anticorps spécifique à K.pneumoniae n’est attendue, l’analyse du sérum après 3 injections uniquement sera suffisante et permettra de réduire l’effectif de ce groupe à 20 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Ils seront suivis 2 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude. Un suivi accru sera réalisé durant les 6h suivant les administrations du candidat vaccin et la fréquence de surveillance sera augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux. L’administration du candidat vaccin n’est pas censée entrainer d’effet indésirable. Cependant des critères d’interruption de l’étude, supportés par une grille de score de douleur, ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance. Également, les prélèvements sanguins à la queue ont été limités à seulement une partie des animaux de chaque groupe.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris, proche de celui de l’homme, en fait un modèle de choix pour les études d’immunisation. Également, la suite du projet impliquera de tester ce vaccin dans un contexte d’infection pulmonaire à K.pneumoniae qui est un modèle infectieux que notre laboratoire a déjà développé chez la souris. Souris de 6 à 8 semaine de façon à avoir une maturité immunitaire suffisante, capable de produire une réponse IgG.