Recherche appliquée

10 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Anesthésiées, elles sont infectées par le virus de la rage par injection intracérébrale, développent une succession de signes cliniques, puis sont tuées pour prélever leur cerveau infecté. Ce matériel sert à fabriquer des panels distribués aux laboratoires de référence européens pour des évaluations de diagnostic de la rage tous les deux ans. Le porteur affirme qu'aucune culture in vitro ne produit assez de tissu cérébral et présente la souris comme seul moyen d'obtenir la quantité voulue, en soulignant avoir divisé par deux le nombre d'animaux par an.

Objectifs

Le projet vise à générer du matériel biologique qui entrera dans la composition de panels d’échantillons distribués aux Laboratoires Nationaux de Référence (LNR) qui prennent part à des évaluations interlaboratoires (EIL) de diagnostic de rage organisé tous les deux ans en Europe. Afin de mimer les conditions de réalisation d'un diagnostic de routine, les panels se doivent d'être constitués de matière cérébrale. La France étant indemne de rage vulpine, il est donc impossible d’avoir recours à des prélèvements de cerveaux issus d’animaux naturellement infectés. De plus, pour certaines souches de rage, telles que celles retrouvées chez les chauves-souris, il est difficilement envisageable d'obtenir assez de matériel cérébral pour la préparation d’une cinquantaine de panels. De ce fait, il est nécessaire d'obtenir expérimentalement ce matériel biologique en infectant des souris de laboratoire. Les EILs de diagnostic de rage permettent d’évaluer les LNRs sur 4 techniques de diagnostic différentes. Les panels sont constitués d’environ une dizaine d’échantillons dont 8 composés de matière cérébrale infectée par des souches de rage représentatives des souches classiquement isolées par les LNRs (souches renard, souches canines, souches isolées chez les chauves-souris etc.) Pour chaque EIL, 8 productions de virus sont donc effectuées afin d’obtenir les 8 stocks d'échantillons dits « positifs » qui entreront dans la composition du panel.

Bénéfices attendus

Le présent projet va permettre de constituer des panels de matières cérébrales infectées avec différents lyssavirus qui seront utilisés à l'échelle Européenne pour la réalisation d'EILs. Ces EILs visent 1/ à évaluer l'aptitude des LNRs européens aux techniques de diagnostic de rage, 2/ à harmoniser les modes opératoires techniques, 3/ et ainsi à contribuer à une meilleure surveillance de la rage en Europe.

Procédures

Les souris seront anesthésiées (injection dans le péritoine) avant d'être infectées par voir intra-cérébrale par une dose de virus. L'infection est une étape qui ne dure pas plus de 5 secondes.

Impact sur les animaux

Les souris infectées par les lyssavirus vont développer une succession de signes cliniques très bien caractérisés. Dès l'apparition des premiers signes cliniques imputables à la rage , les animaux seront mis à mort immédiatement tout en permettant d'atteindre les objectifs scientifiques du projet.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de collecter les cerveaux infectés.

Remplacement

La France étant indemne de rage, depuis les années 2000, il n'y a plus de mammifères sauvages (renards par exemple) naturellement infectés par le virus. Il est donc désormais impossible d’avoir recours à des prélèvements de cerveaux qui seraient issus d’animaux naturellement infectés. De plus, pour certaines souches rabiques, telles que celles retrouvées chez les chauves-souris, il est impossible d'obtenir assez de matériel cérébral infecté (un cerveau de chauve-souris pèse moins d'un gramme) pour la préparation d’une cinquantaine de panels. De ce fait, seule l'utilisation d'animaux de laboratoire nous permet de préparer la quantité de matière cérébrale nécessaire à la préparation des panels utilisés pour les EILs de diagnostic. Par ailleurs les méthodes actuelles de mise en culture in-vitro de neurones ne permettent de produire qu'une quantité très limitée de tissus rendant à ce jour ces techniques inapplicables pour le présent projet.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour chaque production virale (n=480) a été déterminé en intégrant 4 paramètres: la fréquence bisannuelle des EILS, le nombre de participants aux EILs (en moyenne 60), le nombre d'échantillons constitutif de chaque panel (10) et les contrôles qualité à effectuer sur chaque production virale tel que requis par la norme qualité pour l'organisation d'EILs. Chaque production sur 480 souris permet ainsi d'obtenir environ 120 échantillons de cerveaux (d'environ 1ml) dont 1/3 servira aux contrôles qualité et 2/3 qui servira à la constitution des panels. La fréquence des EILs de diagnostic de rage a été revu à la baisse avec l'organisation d'un EIL tous les deux ans (autrefois fréquence annuelle). Cela nous permet de réduire de moitié la quantité de souris utilisée dans le cadre de ces productions passant ainsi de l'utilisation d'environ 20000 à 10000 souris par an. L'organisation de tels EILs à l'échelle européenne permet l'évaluation d'un grand nombre de laboratoires en une seule session, et évite également l'organisation d'autres EILs rage par d'autres laboratoires et donc le recours à d'autres animaux d'expérimentation. Tout échantillon qui ne serait pas utilisé pour la réalisation d'EIL pourra être utilisé comme témoin positif pour les techniques de diagnostic de rage, comme échantillon test dans le cadre de stage technique, ou de validation de méthode.

Raffinement

Ces souris seront hébergées en groupe avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Des points limites précis et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis.

Choix des espèces

La souris est une espèce très largement utilisée pour les expérimentations dans le domaine de la rage. Elle présente une très bonne sensibilité aux différents génotypes du lyssavirus. Depuis qu’il a été démontré que l’injection intracérébrale à la souris blanche déterminait une infection constante et typique, celle-ci est devenue l’animal de laboratoire de choix comparé au cobaye et au lapin. La période d’incubation du virus rabique est relativement courte, et les signes cliniques liés à la rage sont très bien caractérisés. Les souris Swiss OF1 utilisées doivent avoir un poids d'environ 15 grammes lors de l’administration du virus d'épreuve à J0. Ce poids correspond à un stade où les souris sont très sensibles au virus de la rage.

144 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du sein leur sont greffées sous la peau du flanc, puis des anticorps anticancéreux sont injectés, avec suivi de la croissance de la tumeur jusqu'à un volume limite de 1600 mm³ déclenchant la mise à mort. Le porteur signale un stress à la contention, une douleur aux injections et une possible perte de poids liée à la tumeur. Il présente le passage in vivo comme nécessaire pour évaluer les anticorps sur un 'organisme entier', les bénéfices visant des cancers en 'impasse thérapeutique'.

Objectifs

Dans un contexte où de nombreux patients atteints de cancer résistant sont en manque de traitements efficaces, nous proposons dans un premier temps d’établir un modèle de greffe de cellules cancéreuses d'une lignée de cancer du sein présentant des caractéristiques récapitulant les cancers résistants retrouvé chez l'Homme. La mise en place de ce modèle va ensuite nous premettre dans un deuxième temps d'évaluer des anticorps ciblant une protéine impliquée dans le mécanisme de résistance ainsi que leurs versions couplés à des molécules cytotoxiques. Ces anticorps ont une activité anti-tumorale in vitro prometteuse que nous nous proposons de tester in vivo afin d'évaluer leur efficacité dans ce modèle de cancer en impasse thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. En effet, il n’y a pas aujourd’hui de stratégies thérapeutiques pour les patients atteintes de cancer du sein avec tumeurs difficiles à traiter. L’étude de nouvelles stratégies va permettre de développer en phase préclinique de nouvelles molécules qui permettront au mieux de guérir les patients atteints de ces cancers, ou au moins de ralentir la progression tumorale.

Procédures

Injection (unique) des cellules cancéreuses sur souris vigiles en sous-cutanée dans le flanc droit : contention et geste de quelques minutes - Pousse tumorale : gêne si le volume tumoral atteint le point limite - Injection intrapéritonéale (unique), durée du geste : quelques secondes de composés thérapeutiques non toxiques - Pesée et mesure de tumeur : contention et geste de quelques minutes

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir des injections sous cutanée qui vont générer du stress à la contention et une douleur courte à l’injection. Lors du traitement, les animaux vont subir un stress à la contention et une douleur courte lors de l’injection intrapéritonéale. La pousse tumorale peut engendrer de la perte de poids et des douleurs au niveau de la tumeur. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress lors de la contention et éventuellement de la douleur au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à l'issue de chaque procédure, pour cause de volume tumoral hors-éthique (supérieur à 1600mm3).

Remplacement

Avant le passage chez l’animal, de nombreuses manipulations de caractérisation des différents anticorps ont été réalisées qui ont permis de sélectionner les deux candidats les plus efficaces. Le passage vivo est maintenant nécessaire pour l’évaluation du candidat médicament sur un organisme entier. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur nécessite de travailler sur un organisme entier. Pour cette raison nous devons effectuer les études d’efficacité sur la souris.

Réduction

Les études pour l'établissement du modèle seront faites séquentiellement, ce qui donnera lieu à un GO/NO GO pour la mise en place de la deuxième phase impliquant l'étude des anticorps. Cette décision sera prise par le comité scientifique, les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été déterminé à l'aide d'un outil statistique et les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. En conséquence, les études statistiques nous ont permis de déterminer qu'il nous faudra 144 animaux au total pour cette étude.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures, les animaux seront habitués à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort au plus tard 56 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a pas été atteint avant ce délai. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux). Si l'état des animaux le nécessite, des analgésiques seront utilisés.

Choix des espèces

Nous souhaitons évaluer nos traitements anticancéreux in vivo. l'utilisation d'une souche murine fortement immunodéprimée est donc nécessaire pour éviter les phénomènes de rejet des cellules ou des tissus implantés et favoriser la prise des greffes. Après l’utilisation d'une souche moins immunodéprimée sans prise tumorale de ce modèle, nous allons utiliser une souche de souris plus immunodéprimée. La souris est l’espèce la plus adaptée pour cet objectif est un modèle qui permet une prise tumorale avec de nombreuses lignées humaines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie d'implantation sous-cutanée de biomatériaux destinés à la régénération osseuse, puis est tuée à deux ou quatre semaines pour analyse histologique de la vascularisation. Le porteur signale une gêne ou une douleur légère et de rares complications comme une infection ou une réouverture de suture, reprise sous anesthésie. Il indique que ces dispositifs destinés à l'humain doivent d'abord être testés chez un petit animal faute de méthode in vitro évaluant à la fois formation osseuse et vascularisation.

Objectifs

Les pertes de substances osseuses en chirurgies orale et orthopédique représentent un réel défi. Les moyens de reconstruction actuels font souvent appel à des greffes autologues qui sont disponibles en quantité limitée et peuvent être source de complications post-opératoires pour les patients. L’ingénierie tissulaire osseuse cherche à développer de nouveaux substituts osseux d'origine naturelle pour pallier aux inconvénients de l'autogreffe. A titre d'exemple, dans le cadre de la pose d’un implant dentaire, il est souvent nécessaire de régénérer l’os manquant pour stabiliser ce dernier. Cette régénération peut employer différents dispositifs médicaux tels que : (i) des matériaux de comblement qui remplacent l'os ou favorisent la régénération osseuse et/ou (ii) des membranes qui jouent un rôle barrière pour prévenir l’infiltration cellulaire des tissus mous et préserver les cellules osseuses pour régénérer l’os. L’objectif de ce projet est de synthétiser des substituts osseux d’origine naturelle qui vont favoriser la cicatrisation de l'os et par conséquent, favoriser la formation de nouveaux vaisseaux sanguins.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer de nouveaux dispositifs médicaux implantables favorisant la néovascularisation et la régénération osseuse.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une chirurgie d'implantation sous-cutanée (acte chirurgical unique d'une durée maximale de 10 minutes).

Impact sur les animaux

L'implantation en site sous-cutané peut entraîner une gêne voire une douleur légère. De rares complications post-opératoires sont à envisager : infection au site de l'incision ou ré-ouverture des points de suture. Pour toute complication, un nettoyage du site opératoire par l’application d’un antisesptique sera réalisé. La rupture d'un point de suture entraînera éventuellement une reprise de ce dernier en fonction de la cicatrisation de la plaie. Cette opération sera réalisée sous anesthésie et avec application d’un analgésique. L’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie.

Devenir

Après les temps pré-définis (T0, 2 et 4 semaines après la chirurgie), les animaux seront euthanasiés par les expérimentateurs formés à ce geste, afin de pouvoir réaliser des analyses histologiques sur ces animaux et poursuivre les examens post-mortem permettant de valider la biocompatibilité et le pouvoir angiogénique du biomatériau étudié.

Remplacement

La cytotoxicité des matériaux utilisés aura au préalable était évaluée in vitro selon les recommandations de la norme NF EN ISO 10993. Brièvement, les matériaux sont incubés dans du milieu de culture pendant 72h à 37°C. Deux tests sont employés pour évaluer la cytotoxicité des matériaux par contact indirect. Leur potentiel à favoriser la formation de vaisseau sanguins aura également était analysé. Les produits destinés à être implantés chez l'homme doivent au préalable être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche in vitro qui permettrait d’évaluer simultanément la formation osseuse et la vascularisation. Ces matériaux doivent au préalable être testés dans un modèle de petit animal (ici la souris). Si les résultats obtenus sont satisfaisants d'autres essais seront envisagés permettant de valider tous les aspects nécessaires à une future application chez l'Homme. Ces différentes phases ne peuvent être remplacées actuellement dans le processus de validation d'un nouveau dispositif médical.

Réduction

Ne seront testés in vivo que les matériaux ayant démontré in vitro une absence de cytotoxicité, et une seule lignée de souris sera utilisée. Trois temps expérimentaux sont envisagés pour récolter les données permettant la mise en évidence de l'inflammation aigüe, de la reconnaissance de corps étrangers, de la fibrose, et des différents processus de vascularisation et d’ostéo-induction. Pour chaque temps expérimental : - un groupe témoin négatif : poche sous-cutanée laissée vide, pour évaluer l’impact de la lésion seule ; - un groupe de référence : matériau sans principe actif, pour tester la capacité du matériau seul à induire et soutenir le processus d'ostéo-induction ; - 2 groupes expérimentaux : matériau avec le principe actif incorporé de différentes manières. Enfin, 6 échantillons par condition expérimentale doivent être analysés pour permettre une analyse statistique des données (avec le test de Kruskal-Wallis). Ces échantillons explantés à l'issue des temps expérimentaux seront utilisés pour plusieurs types de marquages et détections, permettant de collecter un maximum d'informations sur les animaux utilisés. Deux implantations seront réalisées par souris, en tenant compte de la taille du matériau et de la taille des animaux, ce qui permet de diviser par deux le nombre d'animaux à utiliser.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse des animaux, une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux (5 souris par cage). Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toute source de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. La chirurgie se déroulera sous anesthésie générale à l’isoflurane. Afin de réduire la souffrance des animaux, des analgésiques seront utilisés lors de l’opération, puis de nouveau en cas de douleur après l’opération. Les animaux seront surveillés par l'expérimentateur le temps de leur réveil. Après le réveil complet, la souris reviendra dans sa cage d’origine. Ensuite, un suivi hebdomadaire sera effectué pour chaque animal en complétant une grille de score pour évaluer son bien-être. Concernant les compétences des expérimentateurs, ceux-ci possèdent les qualifications nécessaires, la formation réglementaire et des formations continues (formation à l'expérimentation animale de niveau expérimentateur et/ou concepteur). La maîtrise de la contention et des différents types d'injections à appliquer sont également maîtrisés par les expérimentateurs. Le personnel de l'animalerie possède toutes les compétences pour s'assurer du bienêtre et du suivi des animaux au quotidien. Un raffinement est également mis en place lors de l'hébergement : les animaux sont avec leurs congénères, présence de litière en copeaux de peupliers et des jouets, ainsi que des bâtons à ronger sont mis régulièrement dans les cages.

Choix des espèces

L’espèce C57BL/6 est connue pour son fond génétique uniforme permettant une meilleure reproductibilité au sein d’une même condition. Ces souris sont courrament utilisées et décrites dans la littérature ce qui permettra de comparer les données obtenues avec celles de la littérature. Les souris seront utilisées à l'âge adulte entre 8 et 12 semaines (25-30 g) afin de faciliter leur manipulation pour l´implantation en sous-cutanée

300 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du sein triple-négatif humain leur sont injectées dans les tissus mammaires sous anesthésie, pour étudier le rôle du gène HLF dans l'infiltration des tumeurs par les cellules immunitaires. Le porteur annonce une douleur légère au réveil et une gêne liée à la croissance tumorale qu'il dit limitée, puis une mise à mort pour analyses post-mortem. Il affirme que seul 'un animal vivant, entier' permet d'étudier ces interactions et juge le recours à la souris 'indispensable', les applications thérapeutiques restant hypothétiques.

Objectifs

Le cancer du sein est devenu en 2020 le type de cancer le plus fréquent à l’échelle mondiale, avec plus de 2 millions de nouveaux cas diagnostiqués chez les femmes. Le cancer triple négatif (TNBC pour Triple-negative breast cancer) est l’une des formes les plus agressives et est associé à des rechutes plus précoces, plus fréquentes et à un mauvais pronostic vital. Il a été montré qu’un niveau élevé d’infiltrats lymphocytaires intra tumoraux après chimiothérapie chez les patients TNBC est corrélé à un excellent pronostic, suggérant que la surveillance immunitaire anti-tumorale joue un rôle crucial dans l’évolution des cancers TNBC. Grâce à des analyses bioinformatiques, nous avons identifié un gène dont l’expression pourrait inhiber l’attraction des cellules immunitaires dans les tumeurs et donc, potentiellement être utilisé comme cible thérapeutique dans le traitement de ce type de cancer. Nous avons supprimé ou diminué son expression et donc ses fonctions dans des lignées tumorales humaines TNBC. Des travaux réalisés in vitro nous ont confortés dans le rôle joué par notre gène d’intérêt dans l’infiltration des tumeurs par les cellules immunitaires et souhaitons maintenant déterminer son influence dans l'organisme. Pour se rapprocher du modèle humain, nous injecterons des cellules tumorales humaines TNBC parentales ou inactivées pour le gène étudié dans les lignées de souris immunodéficientes.

Bénéfices attendus

Ce projet transversal est issu d’observations cliniques indiquant que lorsque le gène HLF est surexprimé dans les cellules tumorales de patientes souffrant de cancer de type TNBC, une inhibition de la réponse immunitaire, en particulier de l’activation d'un sous-type de globules blancs est observée et corrélée à un mauvais pronostic. Des études in vitro en cours nous suggèrent que ce gène est bien impliqué dans la régulation de mécanismes moléculaires et cellulaires associés à l’attraction et la fonction de ces cellules blanches. L’étude dans l'organisme de l’infiltration des tumeurs TNBC exprimant ou non HLF est indispensable afin de confirmer le rôle joué par ce gène dans la réponse immunitaire anti-tumorale au sein du microenvironnement et en particulier dans la régulation des fonctions des cellules impliquées dans la lutte anti-tumorale. Ces connaissances fondamentales sont également essentielles pour passer à la phase suivante de recherche plus translationnelle et de déterminer si le gène HLF pourrait constituer une cible pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour ce type de cancer très agressif de mauvais pronostic. Des inhibiteurs de ce gène identifiés par criblage à haut débit sont actuellement en cours de caractérisation in vitro au laboratoire.

Procédures

Injection de cellules tumorales au niveau des tissus mammaires après anesthésie générale: une fois par animal, durée 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances seront liées aux injections: légère douleur au réveil après injection des cellules tumorales et à la gêne physique induite par la croissance des tumeurs: limitées car la taille des tumeurs sera très limitées. Ces tumeurs n'entraînent pas d'autres nuisances.

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour analyses post-mortem sur tissus et organes.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des tumeurs et leurs extensions éventuelles. Nous avons de solides résultats préliminaires in vitro qui suggèrent que notre gène d’intérêt joue un rôle important dans le recrutement et l’activation de certaines cellules blanches dans la lutte anti-tumorale dans les cancers du sein de type triple négatif. Il est indispensable pour notre projet de tester nos hypothèses in vivo dans un modèle de souris immunodéficientes greffées par des tumeurs humaines ayant conservé sa population de cellules blanches, ou dans un modèle murin humanisé pouvant être reconstitué avec des cellules humaines, et recevant des greffes de tumeurs humaines.

Réduction

Le nombre de souris par lot expérimental a été déterminé par calcul de puissance. Pour certaines expériences, une étape de sélection de lignées triple-négatif sauavges et déplétées pour le gène d'intérêt à étudier seront réalisées in vitro afin de réduire au maximum le nombre de souris. Les résultats obtenus seront exploités par des études statistiques.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un triatement. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. L'eau et la nourriture leurs sont proposés à volonté et lorsque les animaux présentent une faiblesse, un complément alimentaire adapté leur est proposé avec facilité d'accès.

Choix des espèces

Nous avons développé des lignées de cancer triple-négatif humaines inactivées ou non pour le gène d'intérêt qui seront injectées chez des souris immunodéficientes. Nous avons choisi l'espèce souris car ces souris immunodéficientes permettent d'étudier les tumeurs humaines sans rejet. Ces souris présentent également l’avantage d’avoir conservé la production des globules blancs sur lesquels nous avons centré notre projet. Le cancer étudié apparaissant chez les adultes, les animaux auront entre 7-15 semaines au début des procédures.

2 352 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce volet se déroule dans le premier des deux établissements du projet, où une tumeur humaine leur est greffée avant l'administration d'un anticorps couplé à un métal radioactif et une imagerie nucléaire. Le porteur reconnaît des douleurs post-chirurgicales, une déplétion des cellules sanguines et un "sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression" liés à l'hébergement individuel après l'injection radioactive. Il conclut que l'expérimentation animale est "requise", les données précliniques étant imposées par les autorités.

Objectifs

Malgré les efforts de la recherche et les nombreux traitements développés dans le cadre de la lutte contre le cancer, les cellules cancéreuses parviennent parfois à échapper aux thérapies de différentes façons. Afin de contourner ce problème, la mise au point de nouveaux outils ciblant des vulnérabilités tumorales clés couplés à la radioactivité est actuellement en plein essor. Cette technologie est appelée radiothérapie interne vectorisée (RIV). Elle consiste à lier un métal radioactif à un anticorps spécifique d'une cible biologique fortement exprimée dans la tumeur afin que l'anticorps puisse diriger et concentrer le métal dans les cellules cancéreuses. En fonction du métal choisi, il sera alors possible d'effectuer la détection de la tumeur ou bien de traiter les cellules tumorales via des rayonnements fortement énergétiques. Il a été démontré que la protéine N est fortement exprimée dans de nombreux cancers. Un anticorps spécifique de cette protéine a donc été développé afin de bloquer sa liaison avec ses récepteurs dans la cellule et ainsi conduire à leur mort. Cet anticorps est actuellement en cours d'investigation dans le cadre d'un essai clinique chez l'Homme. Dans le but de mieux sélectionner les patients exprimant fortement la protéine N, cet anticorps a été modifié par couplage à un métal radioactif émetteur de particules lumineuses afin de détecter sa présence par imagerie nucléaire. Ce nouvel outil devrait permettre d'inclure les patients sur la haute expression de la cible afin de les traiter avec l'anticorps seul (non radioactif) et ainsi déclencher la mort des cellules tumorales. Par ailleurs, les mécanismes d'échappement de la cellule tumorale concernant la protéine N étant déjà décrits, l'efficacité de l'anticorps non radioactif est donc limitée. C'est pourquoi l'ajout de la radioactivité est alors nécessaire afin de détruire les cellules cibles. Ce projet se déroulera au sein de deux établissements utilisateurs agréés (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les patients pris en charge en clinique ne sont généralement pas testés pour l'expression de la cible, limitant ainsi les chances de réponse aux traitements. Dans ce présent projet, il est proposé de valider l'utilisation d'un test compagnon basé sur l'imagerie chez différents modèles tumoraux hautement représentatifs de la pathologie humaine afin de n'inclure que des patients exprimant un fort taux de la cible et d'augmenter l'effet anti tumoral des thérapies ciblées. Le but final est de réaliser une phase I clinique chez l'Homme à la fin de l'étude.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Interventions chirurgicales : greffe de tissu tumoral humain (1 ou 2 par animal en fonction de la greffe unilatérale ou bilatérale, durée : 5 minutes maximum). -Injection de produit en intraveineuse dans la veine caudale : 2 injections chez les souris incluses lors des expérimentations d'imagerie et de traitement. -Injection de produit en sous-cutanée : 2 injections prévues au moment de la greffe (peropératoire et post-opératoire). Des injections supplémentaires de produit analgésiant pourront être réalisées en cas de nécessité seulement et selon les conditions définies dans chacune des manipulations expérimentales. -Anesthésie gazeuse à l'isoflurane réalisée lors de la greffe, lors de chaque injection ou au moment de la mise à mort. -Imagerie Nucléaire : imagerie SPECT/CT dans les procédures d'imagerie. -Mesures du poids ainsi que du volume tumoral dans toutes les procédures (deux fois par semaine). La greffe de tissu tumoral humain sera réalisée dans l'EU1 tandis que tous les autres actes (injections de produit non radioactif, radioactif, imagerie nucléaire) seront effectués dans l'EU2. Les anesthésies gazeuses ainsi que les merures de poids et de volume tumoral pourront être effectuées dans les deux établissements utilisateurs.

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, plusieurs nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus et cités ci-dessous : -douleurs générées post-intervention chirurgicale (incision réalisée sur la peau pour la mise en place du greffon), lors de la prise du greffon, lors de l'injection ou de l'application de produit d'analgésie ou d'antiseptsie, lors de l'injection des anticorps. -fatigue provoquée par la déplétion légère à modérée de cellules sanguines dans les jours suivants l'injection de l'anticorps radioactif, notamment lors de la détermination de la dose radioactive maximale tolérée par l'animal préalable à l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de notre composé. -stress généré par les contentions lors des pesées, lors des mesures de la taille de la tumeur à l'aide du pied à coulisse ou encore lors de l'anesthésie générale effectuée pour la greffe, les injections ou avant la mise à mort de l'animal. -sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression causés par l'hébergement individuel des animaux à partir de l'injection radioactive lors des expérimentations d'imagerie.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale à l'issue de l'ensemble des manipulations expérimentales qui constituent le présent projet. Cette méthode se justifie par la présence d'une greffe de tissu tumoral humain sur chacun des animaux ainsi que la réalisation d'une injection radioactive sur chaque souris inclue dans les expérimentations d'imagerie ou de thérapie. Les organes ainsi que le cadavre devront également être récupérés à la fin des procédures d'imagerie pour permettre un comptage de la radioactivité organe par organe. Un suivi de la courbe d'atteinte de points limites sera également nécessaire lors des études de l'efficicacité thérapeutique.

Remplacement

Les expérimentations in vitro sur cellules permettent de réaliser beaucoup d'études de mise au point de nouveaux traitements. Cependant, elles n'offrent pas la possibilité de prédire l'influence de l'environnement tumoral, l'éventuelle toxicité de la molécule sur l'organisme ou encore le devenir du candidat médicament après administration. Un remplacement par une approche entièrement réalisée sans animaux vivants n'est donc pas envisageable car il serait alors impossible d'évaluer l'ensemble de ces paramètres. De plus, l'acquisition de données précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments. L'expérimentation animale est donc requise pour le présent projet.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum. Le nombre de souris nécessaire à la réalisation de la greffe est réduit au minimum tout en prenant en compte le taux de reprise des modèles de tumeurs humaines lors de la décongélation. Lors de l'étape d'amplification du modèle tumoral humain, une greffe bilatérale sera effectuée sur les animaux afin de réduire leur effectif. Pour la détermination de l'efficacité thérapeutique de la molécule, les effectifs des animaux ont été calculés à partir d'un logiciel afin de tenir compte des analyses statistiques appliquées aux résultats expérimentaux. Les effectifs des animaux des autres procédures ne reposent sur aucune considération statistique mais seulement sur la prise en compte de la variabilité biologique possible entre les souris. Les expériences de ce présent projet ne seront pas répétées et chaque étape devra montrer de bons résultats avant le passage à l’étape suivante afin de limiter le nombre d'animaux strictement nécessaire.

Raffinement

Méthode utilisée pour réduire la douleur : -Anesthésie générale gazeuse. 1 anesthésie/animal lors de la greffe (5min). 1 anesthésie/ animal lors de chaque injection sous la peau ou dans la veine de la queue (5 min). 1 anesthésie/ animal lors de chaque acquisition d'imagerie nucléaire (45min) et 1 anesthésie lors de la mise à mort de l'animal. -Analgésie mise en place en cas de douleur chez l'animal, possibilité de renouvellement toutes les 24h. -Antisepsie : application cutanée en cas de blessure observée en zone d'hébergement ou en amont de l'incision de la peau lors de la greffe. Raffinement des conditions d'hébergement : afin d'atténuer l'effet de l'isolement causé par l'hébergement individuel suite à l'injection de la molécule d'imagerie, les cages seront obligatoirement transparentes et mises côte à côte dans le but de permettre un contact visuel des animaux et en enrichissement de la cage (jouet) sera ajouté.

Choix des espèces

Le taux de réussite du développement des modèles tumoraux établis à partir du tissu cancéreux de patients (PDX) est fortement lié au type de souris utilisé pour implanter le tissu tumoral. Les souris immunodéprimées sont couramment utilisées pour développer des modèles de PDX car celles-ci se caractérisent par l'absence de thymus, ce qui se traduit par un nombre considérablement réduit de cellules immunitaires fonctionnelles afin d'éviter que leur système immunitaire empêche le développement des cellules cancéreuses. Ces animaux présentent le meilleur taux de réussite pour la prise tumorale de tissu humain et seront donc utilisés dans ce projet. Les animaux ont entre 6 et 8 semaines lorsqu'ils sont inclus dans chacune des procédures car la prise tumorale est meilleure à cet âge.