Recherche appliquée

216 souris vont être utilisées, toutes tuées à huit semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, elles passent par des tests de force et de coordination, suspension à une grille retournée, tapis roulant et barre crantée, puis une mesure de la force musculaire sous anesthésie sans réveil. Le porteur cherche une "preuve de concept thérapeutique" par croisement génétique pour une maladie qu'il décrit comme incurable, bénéfice formulé au conditionnel. Il affirme qu'une étude sur cellules ne peut suffire car les effets sur la coordination et la force ne s'évaluent que sur l'organisme entier.

Objectifs

Le but de ce projet est de développer une preuve de concept thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles de souris. La maladie se manifeste dans l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par une faiblesse musculaire et des anomalies de gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression du gène impliqué dans la maladie pour tenter d'atténuer les symptômes musculaires et nerveux. Nous réaliserons cette modulation par des techniques de croisement génétique.

Bénéfices attendus

Cette étude va permettre une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques à l’origine de la maladie, causant des défauts à la fois dans le tissu musculaire et dans le tissu nerveux. Ce projet pourrait également conduire à une preuve de concept thérapeutique pour une maladie aujourd’hui incurable.

Procédures

Une partie des animaux (14) sera utilisée pour évaluer le phénotype des souris transgéniques (analyses purement observatoires de la naissance à 8 semaines). Une partie sera utilisée uniquement pour les croisements (21 ou 42). L’autre partie des animaux (entre 80 et 160 en fonction des résultats obtenus) seront soumis à une série de tests comportementaux pour évaluer la force musculaire et la coordination motrice. Pour évaluer leur force générale, leur durée de suspension à une grille retournée sera mesurée (durée 3x60s). Pour évaluer leur coordination motrice, les animaux se déplaceront sur un tapis roulant (max 60s) et une barre crantée (10x30s environ). Pour évaluer la force musculaire développée, la mesure des propriétés contractiles se fera sous anesthésie générale (procédure d’une heure, sans réveil).

Impact sur les animaux

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Pour les animaux transgéniques, la modulation d’expression du gène d’intérêt peut engendrer une faiblesse musculaire, nous effectuerons une étude de phénotype dommageable. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants : pour la mesure de force générale, le fait d’être suspendu à une grille engendre du stress physique chez l’animal.

Devenir

Les animaux de cette étude seront mis à mort à 8 semaines après caractérisation comportementale. Une étude histologique des tissus affectés sera ensuite effectuée.

Remplacement

Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.

Réduction

Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 10 souris par sexe et par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement quotidiennement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. Des nids seront disposés dans chaque cage et la litière sera changée hebdomadairement afin de maintenir les animaux au propre et au sec. La pesée des animaux sera réalisée 1 fois par semaine. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Si les animaux transgéniques sont très faibles, de la nourriture en gel leur sera procurée. La plupart des tests réalisés sur les animaux dans cette étude sont non invasifs, ce qui limite la probabilité d’apparition de douleur. Pour les mesures de force in situ, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, permettant d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. En cas de douleur observée au cours de l’étude, un analgésique sera administré (buprénorphine à différentes doses selon l'intensité de la douleur). L'étude sera stoppée prématurément si nécessaire pour éviter des douleurs aiguës pendant de longues périodes.

Choix des espèces

Afin de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’évaluer les effets d’une thérapie, nous avons besoin d’effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d’autres espèces évolutivement plus éloignées de l’Homme car la structure des muscles et des nerfs, les deux tissus principalement touchés, est trop différente. D’une part, une étude sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation des bénéfices sur la structure des fibres nerveuses et musculaires, sur le la coordination motrice et la force musculaire seraient impossible à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression du gène d’intérêt, nous ferons un croisement génétique de souris et nous étudierons les effets de ce croisement à 8 semaines, car à cet âge le phénotype de la maladie est exprimé (défauts moteurs et structurels), ainsi nous pourrons savoir assez tôt si la modulation de ce gène est bénéfique.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris immunodéprimées reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein humain dans la glande mammaire, puis une injection d'un peptide radiomarqué et une imagerie sous anesthésie, avant une ponction cardiaque qui les tue. L'objectif est de vérifier où se fixe ce traceur dans l'organisme, première étape avant une éventuelle application diagnostique ou thérapeutique laissée au conditionnel. Le porteur affirme que les résultats in vitro ne suffisent pas et juge le recours à des souris porteuses de tumeurs "indispensable".

Objectifs

Le ciblage de récepteurs de neuropeptides par des médicaments radiopharmaceutiques connait un réel engouement aujourd’hui pour l’imagerie et la thérapie des cancers. Il a été montré une forte expression du récepteur Y5 au neuropeptide Y dans 11 lignées cellulaires tumorales (dont le sein, ovaire, colon, prostate) quel que soit le grade et le phénotype. Un programme de recherche a été établi visant à caractériser le récepteur Y5 dans diverses lignées cellulaires tumorales humaines et à développer le premier agent de ciblage utilisable en imagerie nucléaire et en thérapie. Un premier analogue du NPY spécifique du récepteur Y5 pouvant être radiomarqué avec des radiométaux (nom de code du composé : tg3) a été développé. Les résultats in vitro obtenus jusqu’à présent démontrent la bonne affinité du composé pour le récepteur. Le présent projet de recherche préclinique vise à tester in vivo ce peptide radiomarqué à des fins diagnostiques sur des modèles murins de cancers du sein exprimant ces récepteurs Y5.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une avancée en recherche préclinique sur la thématique des radiothéranostiques (diagnostiques et thérapeutiques). Si ce premier analogue du neuropeptide Y donne de bons résultats in vivo en imagerie TEP, nous pourrons envisager une étude thérapeutique plus poussée (TRT : Targeted Radiotherapy) en utilisant ce même ligand radiomarqué avec un radionucléide thérapeutique.

Procédures

- xénogreffes orthotopiques de cellules tumorales (cancer du sein) dans les glandes mammaires sous anesthésie gazeuse (durée 10min) pour les 24 souris balb/c nude - 1 Injection intraveineuse au niveau de la queue contenant les radiotraceurs sous anesthésie gazeuse pour les 36 souris (durée 5 min) - 1 imagerie pour la moitié des effectifs (soit 18 souris) sous anesthésie gazeuse (durée 35 min) - 1 ponction cardiaque terminale pour les 36 souris sous anesthésie gazeuse 3% (durée 5min)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues seront : 1) l'inoculation des tumeurs au niveau des glandes mammaires pouvant engendrer un stress 2) une pousse de tumeur trop importante ou une nécrose potentielle de la tumeur peut entrainer une gêne localisée 3) les anesthésies répétées pour la mise en place du modèle et pour l'imagerie peuvent impactées la souris. 4) la mise à mort en fin d'étude.

Devenir

A la fin de la procédure, les 36 souris seront mises à mort. Le sang et les organes seront prélevés pour un comptage radioactif et analyses immunohistochimiques ultérieures.

Remplacement

Les résultats in vitro ne sont pas suffisants pour valider le devenir de l’analogue radiomarqué in vivo. L’utilisation de modèles animaux porteurs de tumeurs avec une forte expression du récepteur Y5 est indispensable pour déterminer la faisabilité d’un ciblage oncologique du peptide tg3.

Réduction

Les expérimentations ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possibles. Pour l'étude du peptide tg3 radiomarqué avec un radioisotope dédié au diagnostic TEP, il est nécessaire de visualiser leur biodistribution in vivo et d’identifier les organes présentant une forte expression des récepteurs Y5. Deux modèles murins de cancers du sein dont la présence du récepteur Y5 a été validée in vitro seront étudiés. Une étude préliminaire sur des souris saines (sans tumeur) permettra la comparaison de fixation du radiopeptide sur les différents organes. Pour chaque groupe, le ligand spécifique du récepteur Y5 est comparé à un peptide similaire dont la fixation à Y5 est nulle. Pour cette étude de validation de la biodistribution du radiopeptide, un t-test sera réalisé avec un nombre minimum de 6 souris par condition. Ce nombre permet de prendre en compte une pousse tumorale hétérogène.

Raffinement

Les souris sont placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour/nuit 12h/12h, enrichissement des cages) au sein d’une animalerie de recherche agréée. Les animaux sont nourris ad libitum et toute manipulation invasive sera précédée d’une anesthésie générale sous isoflurane 2%. Nous avons choisi des points limites clés qui permettent de prévenir une détérioration de l’état clinique générale de l’animal dans le but d’éviter une quelconque souffrance. Les points limites sélectionnés sont les suivants : perte de poids supérieure à 20%, déshydratation, immobilité de plus de 1h (signe d’une douleur aigüe), ulcération et limitation de la taille de la tumeur.

Choix des espèces

Le modèle souris est communément utilisée en oncologie. La Balb/c nude est une souris d’une souche consanguine immunodéprimée et sans poil qui en fait l’un des meilleurs modèles pour la greffe orthotopique de tumeur humaine au niveau de la glande mammaire. La souris Balb/c sera utilisée pour l’étude de biodistribution sans tumeur puisqu’elle présente le même fond génétique que la Balb/c nude. Les souris seront réceptionnées à 8 semaines et mises en quarantaines pendant 2 semaines. Les xénogreffes seront initiées à 10 semaines de développement. A ce stade, la souris est une jeune adulte. Les prises de greffe sont plus homogènes sur des individus jeunes. La pousse tumorale dure entre 2 et 4 semaines (volume minimum de 150 mm3). Les études in vivo par imagerie TEP suivi des biodistributions de l'analogue tg3 radiomarqué et de sa version "scrambled" sur les souris xénogreffées peuvent être réalisées. Pour les souris Balb/c, les biodistributions des peptides radiomarqués seront réalisées entre 12 et 14 semaines de développement pour pouvoir être comparables aux souris xénogreffées.

Âgés d'un jour, des ratons éveillés reçoivent une injection d'un vecteur viral dans la veine jugulaire, qui peut provoquer une insuffisance cardiaque dans les semaines suivantes, et leur manipulation peut conduire la mère à les rejeter ou à les mutiler. 206 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avec deux à quatre mois de régime riche en graisse, des gavages de glucose, des injections d'insuline et sept prises de sang par test de tolérance, à 20 et 60 jours. Le porteur écrit que certains rats ne supportent pas l'anesthésie des échocardiographies et "ne peuvent être réanimés", puis que les rats "se réveillent dès l'arrêt" de cette anesthésie. Tous sont mis à mort à la fin de l'étude pour des prélèvements post-mortem.

Objectifs

La fibrillation atriale (FA) est l'arythmie la plus fréquente en pratique clinique. Sa prévalence augmente avec le vieillissement et la sédentarisation accrue de la population, faisant craindre une véritable épidémie dans les 50 prochaines années. Un remodelage atrial et électrique est observé, favorisant l'apparition d'arythmies cardiaques. Par ailleurs, des études ont montré une association entre abondance du tissu adipeux épicardique et le risque de FA. Les maladies métaboliques comme l'obésité sont donc des facteurs de risque de la FA. Lors de la FA, le remodelage observé au niveau macroscopique (dilatation des cavités ventriculaires et atriales) se répercute au niveau cellulaire avec une désorganisation de la structure des cardiomyocytes. Ce remodelage cellulaire aura pour conséquence la perturbation des domaines membranaires caractéristiques du cardiomyocyte, lesquels sont nécessaires à une conduction optimale du potentiel d'action cardiaque (anisotropie cardiaque). La protéine CASK (Calcium Calmodulin Serine threonine kinase) est une protéine essentielle au développement et à la mise en place de la polarité cellulaire dans le système nerveux. Nous nous sommes donc intéressés au rôle de CASK dans la différenciation du cardiomyocyte, cellule qui acquiert sa polarité après la naissance.

Bénéfices attendus

Les projets portant sur la compréhesion du développement des cardiomyocytes et l'impact des pathologies métaboliques sur l'organisation des domaines membranaires en eux-mêmes permettrons de cibler le rôle de protéines partenaire du canal sodique comme CASK dans la survenue de pathologie structurales et électriques. Ces avancées seront amenées à permettre de développer des cibles thérapeutiques dans le traitement de différentes arythmies et cardiomyopthies.

Procédures

Les animaux seront soumis à 6 types d'interventions différentes. Ceux-ci sont d'abord mis sous régime riche en graisse, 4 mois pour les rates servant à la reproduction (2 mois anté et post-natal des ratons), et 2 mois pour les rats issus des portés. Afin de valider le modèle de rat obésogénique, des mesures métaboliques seront nécessaires. Celles-ci commencent par le gavage de glucose, qui est une procédure très rapide (quelques secondes). Un gavage sera réalisé à deux stades : 20 jours et 60 jours de développement pour tester la tolérance au glucose. Par la suite, le test de tolérance à l'insuline sera réalisé à partir d'une injection d'insuline : l'injection se fera à 2 stades de développement (20 jours et 60 jours) et dure quelques secondes. Le prélèvement d'une goutte de sang à la queue est effectué sur les animaux vigiles afin de mesurer l'évolution de la glycémie. Cet acte qui ne dure que quelques secondes est répété 7 fois pour un test de tolérance au glucose et à l'insuline. Les animaux seront soumis 2 fois à un test de tolérance au glucose et 2 fois à un test de tolérance à l'insuline, à 20 jours et 60 jours. Afin de valider l'implication de notre protéine d'intérêt CASK, son expression est modifiée par injection d'un vecteur viral dans la veine jugulaire des animaux vigiles. Les rats reçoivent une injection unique 1 jour après la naissance, qui est très rapide (quelques secondes).

Impact sur les animaux

L'obésité peut conduire à des difficultés de déplacement, un changement cutané et du pelage. L'injection du vecteur viral peut engendrer dans les semaines qui suivent une insuffisance cardiaque, en particulier lors du stress des manipulations. Les injections au stade nouveau-né et donc la manipulation des ratons par un tiers peut engendrer le refus de la mère de reprendre le petit dans la portée, tout comme des cas de mutilations. Il arrive également que des animaux ne supportent pas l'anésthésie lors des échocardiographies et ne peuvent être réanimés, et ce malgré l'intubation.

Devenir

A l'issu de cette étude, tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements post-mortem.

Remplacement

Les projets ont pour but de comprendre l'importance de l'organisation fonctionnelle du cardiomyocyte sur la fonction cardiaque, et en quoi un régime riche en graisse peu directement l'impacter. Comme nous travaillons à l'échelle de l'organisme, il est nécessaire d'utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Toutefois, certaines études seront réalisées in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux pour notre étude (n=206) est déterminé à la suite des études antérieures, relativement similaires dans la forme. Les paramètres échocardiographiques et métaboliques seront étudiés sur les mêmes lots d'animaux afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire à cette stratégie expérimentale. La taille de nos groupes expérimentaux est également déterminante au regard de la puissance statistique nécessaire à la réalisation de comparaisons entre groupes. Ceux-ci requièrent un minimum de 10 animaux par groupes pour être relativements fiables et robustes.

Raffinement

Les rates arrivent à l'animalerie et sont soumises à un temps d'acclimatation de 7 jours avant le début du régime. Les rats servants à la reproduction sont soumis au même temps d'acclimatation avant le début de la reproduction. Afin de prévenir le risque de rejet et mutilation par la mère après manipulation par l'expérimentateur, la contention des ratons est réalisée avec des gants préalablements frottés contre la litière de la cage au moment de l'injection. Les portées sont à une par cage, et ce jusqu'au moment du sevrage, c'est à dire 3 semaines après la naissance. Les rats sont ensuite séparés par sexe et laissés 2 par cage lorsqu'ils ont atteint l'âge adulte. Les cages sont aggrémentées avec du matériel d'enrichissement (jouets cartonnés, baton de bois, sciure de bois, ouate). Les animaux sont surveillés tous les jours par le personnel compétent de l'animalerie. Lors des enregistrements par échographie, les animaux reçoivent une anésthésie gazeuse légère pour les maintenir immobiles. Les animaux se réveillent dès l'arrêt de l'anéthésie. La surveillance par les techniciens de l'animalerie est accrue pendant une semaine après anésthésie. Toutes les évaluations de fonction et prélèvements réalisés (prélèvement de sang) sont indolores. Une anésthésie locale est utilisée pour les injections et prélèvements de sang. Un analgésique est également administré en cas de douleur. Les points limites sont différents en fonction de l'âge du rat: - Avant sevrage: mise à l'écart du reste de la portée, refus de la rate d'alimenter le petit donc perte de poids, deshydratation, prostré dans un coin de la cage, mutilation. - Après sevrage: Perte de poids de plus de 20%, deshydratation, poil hirsute, pelade, comportement inhabituel.

Choix des espèces

Le rat est l'animal le plus approprié pour nos études. Il permet de garantir l'homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. Comme nous n'utilisons pas la technologie des transgènes, nous pouvons nous permettre un modèle rat, chez qui les études écho-cardiographiques sont plus simples. Par ailleurs, l'isolement de cardiomyocytes nécessaire aux études d'électrophysiologie est le plus fiable et mis au point chez le rat. Les stades de développement utilisés pour notre étude sont nécessaires : - Afin d'étudier la mise en place des domaines membranaires du CM, qui se fait en post-natale (d'où les stades J1, J5, J20 et J60). - Afin d'étudier le rôle de la protéine CASK sur le développement myocardique (d'où l'injection à J1).

1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'ablation du nerf vague, d'ablation ou de dénervation de la rate, puis, après trois semaines, des injections déclenchant une inflammation auto-immune de l'œil, suivie d'une imagerie quotidienne du fond d'œil sous anesthésie. Le porteur indique attendre une douleur post-opératoire et une inflammation oculaire réversible en 24 à 48 heures. Il affirme que ces mécanismes auto-immuns impliquent une interaction complexe de types cellulaires qui ne peut être étudiée qu'au sein d'un organisme entier.

Objectifs

Les maladies auto-immunes sont liées à l’activation du système immunitaire. De récentes avancées en neurosciences et en immunologie ont révélé que les réflexes neuronaux régulent le système immunitaire. L'activation du nerf vague atténue les maladies auto-immunes. Notre projet vise à étudier les mécanismes impliqués dans la régulation de la réponse autoimmune par le système nerveux via le nerf vague, en particulier dans l’uvéite une pathologie inflammatoire intraocculaire.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mieux comprendre le rôle du système nerveux dans le contrôle de la réponse autoimmune et permettra de mettre en évidence de potentielles cibles thérapeutiques chez l’Homme pour réguler l’inflammation en particulier dans l’œil.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie une seule fois : vagotomie (ablation du nerf vague) ou splénectomie (ablation de la rate) ou dénervation de la rate ou contrôle. Chacune des interventions dure 15 à 20 minutes par animal. Les animaux recevront des injections d’anesthésique et d’analgésie en pré et post opératoire. Après 3 semaines de récupération, les souris recevront sous anesthésie 1 fois 3 injections sous-cutanées pour induire une uvéite autoimmune expérimentale (EAU) (inflammation dans l’œil) active ou bien une injection intraveineuse de lymphocytes T pour induire une EAU passive. Chaque injection se fait sous anesthésie en moins d’une minute. La rétine sera évaluée par imagerie du fond d’œil tous les jours pendant 1 à 2 semaines et par Tomographie à Cohérence Optique 1 ou 2 fois par animal (actes non invasifs mais sous anesthésie volatile pour éviter tout mouvement de l’animal, durant environ 5 minute par animal). Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de parcours.

Impact sur les animaux

Pour les chirurgies : -Risque de mauvaise réaction à l’anesthésie (stress physique) -Stress thermique lié à l’anesthésie -Problème post-opératoire : lésion comme réouverture de la plaie (rare) et saignement (rare) -Douleur Pour les injections intraoculaires : -Risque d’inflammation localisée de l’œil réversible au bout de 24 à 48h après injection

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Dans nos études nous nous intéressons aux mécanismes autoimmuns qui impliquent une interaction complexe de nombreux types cellulaires ne pouvant être étudiée qu’au sein d’un organisme entier car ne peut pas être reproduit en utilisant des cultures de cellules isolées provenant de différents tissus. Les études in vitro sur les animaux invertébrés ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie de l’œil en particulier ; la souris est donc une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude.

Réduction

Nous prévoyons 1500 animaux pour réaliser cette étude. Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables au regard de nos précédentes expériences d’autres projets de recherche (variabilité inter- animal/ inter - expériences). Le nombre de 10 animaux défini par groupe est le minimum requis pour obtenir des résultats interprétables et atteindre l’objectif scientifique défini dans ce projet, selon nos expériences antérieures.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées avec enrichissement, alimentation et abreuvement à volonté. Les animaux en provenance de l’extérieur auront une période d'acclimatation de 5 jours avant expérimentation. Si nécessaire et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Pour éviter toute souffrance ou détresse animale, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale lorsque nécessaire. Pour les expériences d’EAU (uvéite autoimmune expérimentale), des anesthésies gazeuses par inhalation seront établies pour chaque acte. La respiration de la souris sera surveillée et en cas de début de détresse respiratoire, le pourcentage d’anesthésique sera largement diminué jusqu’à la reprise d’une respiration normale. Il sera ensuite ajusté afin de n’être ni trop faible (réveil de la souris) ni trop fort (détresse respiratoire). Pour les chirurgies, les animaux bénéficieront d’une anesthésie. En prévention de la douleur, nous administrerons un analgésique le jour de la chirurgie ainsi que le lendemain. Un gel ophtalmologique est appliqué sur les yeux des animaux pour éviter l’assèchement de la cornée durant l'anesthésie. Application d’un antiseptique au niveau du champ opératoire. Pour éviter une hypothermie, l’opération se fait sur tapis chauffant à 37°C. Réveil en chambre thermostatée à 30°C. Les animaux ayant subi une chirurgie sont observés avec attention particulièrement les 3 premiers jours qui suivent la chirurgie par l’expérimentateur et par le personnel qualifié de l’animalerie. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Les animaux auront une période de récupération de 3 semaines entre la chirurgie et l’entrée en procédure d’induction d’uvéite.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour étudier la réponse inflammatoire participant de manière importante à la dégénérescence de la rétine. De plus, ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines minimum à leur entrée dans la procédure expérimentale. C’est l’âge à partir duquel le système immunitaire et vasculaire de la souris est mature et donc à partir duquel elle est susceptible de développer la maladie.

20 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis transférés vers l'établissement voisin où ils seront tués à la fin du protocole. Ces rats rendus diabétiques reçoivent une injection quotidienne pendant douze semaines, des prises de sang hebdomadaires, des tests de tolérance au glucose et un test de mémoire en piscine de Morris, cette partie du projet se limitant à une séance d'imagerie par rayons X sous anesthésie. Le porteur indique attendre perte de poids, hyperglycémie et lésions de la queue liées aux prélèvements répétés dans l'établissement principal. Il présente sa myokine comme une biothérapie innovante et curative du diabète, et affirme que l'étude in vivo est indispensable car la maladie implique plusieurs organes.

Objectifs

Le diabète est une maladie chronique qui se déclare lorsque le pancréas ne produit pas suffisamment d’insuline (diabète de type 1, DT1), ou lorsque l’organisme n’est pas capable d’utiliser correctement l’insuline qu’il produit (diabète de type 2, DT2). Ainsi, dans les 2 cas, il y a un trouble de l’utilisation et du stockage du glucose apporté lors des repas, entrainant une hyperglycémie. Cette dernière peut au fil du temps provoquer des maladies cardiovasculaires, des néphropathies, des altérations cognitives (perte de mémoire) … La régulation de la fonction sécrétoire des cellules à insuline et leur survie jouent un rôle central dans la progression du diabète. Le muscle squelettique constitue l’organe le plus sensible à l’insuline de l’organisme et joue donc un rôle majeur dans l'équilibre glycémique de l'organisme puisqu’il constitue le site majoritaire de stockage du glucose sous l'action de l'insuline. Nous avons mis en évidence l’existence d’une communication croisée entre le muscle squelettique et les cellules à insuline par le biais de facteurs appelés myokines. Nous avons montré in vitro et in vivo, dans un modèle de transplantation d’îlots chez le rat DT1, qu’une myokine, appelée myokine X, permettait d'améliorer la survie, la fonction des îlots pancréatiques et l’équilibre glycémique des animaux diabétiques transplantés. Par ailleurs, nous avons montré qu’une injection quotidienne de notre Myokine X chez un modèle de rat DT2, permettait de prévenir l’apparition de cette pathologie. En particulier, les premiers résultats montrent un impact intéressant de la myokine X sur le tissu adipeux brun. Ce dernier représente un intérêt important de par sa capacité thermogénique qui améliore l’homéostasie glucidique grâce à une importante consommation des substrats dont le glucose. Le nom de cette myokine, représentant un intérêt thérapeutique important pour le patient diabétique, reste anonyme car un brevet est en cours de dépôt. L'objectif de l'étude réalisée dans l'EU 2/2 est de mesurer l'absorption des rayons X par les différents tissus du rat afin de quantifier la masse maigre et grasse. Ceci sera réalisé lors d'une séance d'imagerie non invasive à rayons X chez le rat anesthésié en fin de protocole.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice de ce projet est d’obtenir un effet curatif du DT2 par la Myokine X. Contrairement au Liraglutide, largement utilisé chez le patient diabétique qui peut présenter un certain nombre d’effets indésirables tels que des désordres intestinaux pouvant amener le patient à vouloir arrêter son traitement, nos études précédentes in vivo menées chez le rat diabétique n’ont pas montré de tels désordres. Ainsi, notre traitement pourrait constituer une biothérapie innovante pour le DT2. L'impact de la Myokine X sur le muscle squelettique (masse maigre) qui joue un rôle central dans la régulation de la glycémie sera évaluée avec l'utilisation de l'imagerie par rayons X chez l'animal anesthésié en fin de protocole.

Procédures

Dans l’établissement 1/2, les animaux recevront une injection quotidienne en intrapéritonéale durant 12 semaines. De plus, différents tests seront effectués sur l’ensemble des animaux pour suivre la glycémie et ainsi évaluer l’évolution du diabète. Tout d’abord, celle-ci sera mesurée quotidiennement et l’acte ne durera que quelques secondes. Par ailleurs, nous complèterons ce suivi par une prise de sang hebdomadaire afin de mesurer des marqueurs en liens avec la glycémie. La durée de la contention pour la prise de sang est de moins de 2 minutes. Pour évaluer le fonctionnement de l’ensemble des organes impliqués dans la régulation de la glycémie, un test de sensibilité à l’insuline sera réalisé la moitié des animaux et sur l’autre moitié un test de tolérance au glucose sera effectué. Ces deux tests dureront chacun 2h et avant le test, les animaux seront mis à jeun 4h (accès à l’eau ad libitum). De plus, nous évaluerons les effets de notre traitement sur les altérations cognitives pouvant être induites par le diabète à l’aide du test de la piscine de Morris. Ce test durera 2 min et sera réalisé 3 fois de suite pendant 3 jours au cours de 3 sessions réparties au cours des 15 semaines de l’étude sur 64 animaux.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus dans l’établissement 1/2 sont : - Perte de poids lié au développement du diabète. - Stress lié aux injections quotidiennes de Myokine X. – Hyperglycémie lié au développement du diabète au cours de l’étude. - Hypoglycémie. - Hypothermie post test comportemental. - Détérioration (infection, nécrose) de l’extrémité de la queue suite aux prises de sang et aux mesures glycémiques répétées. - Hémorragie liée au prélèvement sanguin. – Inflammation au point d’injection due aux injections répétées. Les nuisances attendues sur les animaux sont une anesthésié à l'isoflurane et une séance d'imagerie par rayons X d'une durée de 2 minutes. Il n’y a pas d’effets indésirables attendus dans le protocole réalisé dans l’EU 2/2 ; la dose de rayons X reçue lors de la séance unique d’imagerie TDM-X est largement inférieure au seuil d’apparition d’effets délétères cellulaires.

Devenir

A la fin de la procédure réalisée dans l'EU 2/2, les animaux retournent dans l'EU 1/2 pour terminer le protocole (saisine 40266). La mise à mort à lieu dans l’établissement 1/2

Remplacement

Le diabète est une pathologie complexe où de nombreux organes sont impliqués (pancréas, muscles, tissu adipeux…) et communiquent entre eux, ce qui ne peut être modélisé in vitro. De plus, comme décrit précédemment, l’impact de la Myokine X ayant déjà été évalué in vitro, il est maintenant primordial d’évaluer ses effets dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostasie glucidique sont présents. Pour cela, le recours à une étude in vivo est donc indispensable.

Réduction

La tomodensitométrie est une technique d’imagerie qui nous permettra de déterminer l’impact de la Myokine X sur l’ensemble de la composition corporelle, en complément des pesée d’organes réalisées sur l’ensemble des animaux au moment du sacrifice. Cette méthode de quantification étant très précise, nous utiliserons 5 rats par groupe. En effet, ce nombre d’animaux est suffisant pour nous permettre de réaliser des analyses statistiques sur les données de masse grasse et masse maigre des animaux.. De plus, la stratégie d’expérimentation est établie en tenant compte la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Pour cela, afin de réduire le nombre d’animaux et le stress que pourrait engendrer cette procédure sur chaque animal, une attention particulière est portée sur le fait que tous les animaux ne réaliseront pas la procédure de tomodensitométrie car ils sont déjà impliqués dans des procédures réalisées précédemment..

Raffinement

Les rats seront transportés entre les 2 établissements dans des boites de transport adaptées avec des croquettes, de l’eau en gel et de l’enrichissement. Ils ne resteront dans l’établissement 2 que le temps nécessaire à la réalisation de l’imagerie. Avant et après la séance d’imagerie, ils seront placés au calme dans la zone de quarantaine de l’animalerie avec un contrôle régulier afin de vérifier leur bien-être.

Choix des espèces

Le rat ZDSD (Zucker Diabetic Sprague Dawley) est celui qui mime le mieux le syndrome métabolique, le diabète de type 2 et l'obésité trouvé chez l’Homme. Les autres modèles de rongeurs actuellement disponibles pour le diabète et le syndrome métabolique manquent de translationnalité à la condition humaine. Ainsi, nous utiliserons le modèle de rat ZDSD. L’utilisation en parallèle de rats SD (Sprague Dawley) servira de contrôle afin d’évaluer l’impact de notre molécule en situation non pathologique. Ceci nous permettra de comprendre les mécanismes d’action physiologique impliqué notamment dans la régulation de la glycémie de notre Myokine X, encore à élucider à ce jour. Nous utiliserons des rats SD et ZDSD âgés de 16 semaines au commencement du protocole. En effet, le DT2 apparaitra à partir de 16 semaines de vie chez les rats ZDSD. Ainsi, comme le projet consiste à étudier l'effet curatif de notre Myokine X sur le DT2, il faut que les animaux aient au moins 16 semaine de vie avec un statut diabétique établi avant le commencement des traitements.