Recherche appliquée
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Caractérisation de la lignée Pde2a2 +/-
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 48 dans des procédures classées sévères. Cette lignée modifiée pour réduire une protéine liée à l'autisme et à la déficience intellectuelle subit des tests sociaux et cognitifs, dont certains précédés de deux heures d'isolement, avant l'euthanasie et le prélèvement du cerveau, de la moelle épinière, des surrénales, des testicules et des ovaires, 120 animaux mourant au cours d'une perfusion intracardiaque. Le porteur qualifie les tests comportementaux de classiques et indolores et signale une anxiété possible liée au nouvel environnement et à l'isolement. Il indique avoir d'abord travaillé sur des lignées cellulaires et poursuivre directement chez la souris pour étudier les comportements.
Objectifs
Des mutations du gène PDE2A ont été découvertes chez des patients atteints d’autisme et de déficience intellectuelle, qui sont des maladies du développement du cerveau . La protéine PDE2A est très fortement présente dans le cerveau et a un rôle clé dans le développement des neurones, leur morphologie et fonctionnement. Ceci explique que des altérations de sa quantité puissent avoir un impact négatif sur le fonctionnement neuronal et induire des maladies du cerveau. La PDE2A regroupe trois protéines variantes qui se retrouvent à des emplacements distincts dans les neurones, dont la PDE2A2 que l’on retrouve spécifiquement dans la mitochondrie. Les mitochondries sont des petites unités présentes dans les cellules qui produisent de l'énergie sous forme d'ATP grâce au processus de respiration cellulaire. Des altérations de la mitochondrie sont d’ailleurs retrouvés chez les patients ayant des mutations sur le gène PDE2A ainsi que chez d'autres patients atteints de trouble du spectre de l'autisme. Nous avons récemment étudié la souris Pde2a+/- qui, comme les patients, a une quantité diminuée de tout les variants PDE2A. Nos récentes données montrent que cette souris est un bon modèle de maladie du cerveau, et qui présente des troubles socio-cognitifs similaires aux patients. Nous voulons à présent commencer l’étude de la souris Pde2a2+/- qui aura uniquement une quantité diminuée de PDE2A2, donc seulement au niveau de la mitochondrie. En effet, cela nous permettra de savoir si une atteinte unique au niveau de la mitochondrie est suffisante pour induire des troubles comportementaux.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre le rôle spécifique de la PDE2A2 au cours du développement du cerveau, et le lien entre la dérégulation de l'activité de cette enzyme au niveau de la mitochondrie et les troubles du neuro-développement comme la déficience intellectuelle, l'autisme et les troubles moteurs. Finalement, l'évaluation de la pertinence de ce modèle par rapport aux patients atteints d'une mutation permettra de mettre à disposition de la communauté scientifique un potentiel nouveau modèle de maladie du neurodeveloppement.
Procédures
Différents tests sociaux et cognitifs seront réalisés ponctuellement et qui dureront, selon les tests, de 3 minutes à 2 heures. Ces tests se feront chez les souriceaux, à l'adolescence (un mois) et à l'âge adulte (dès deux mois). Certains animaux seront soumis à une perfusion intra-cardiaque, et une injection d'anesthésique et une d'antalgique seront effectuées sur chaque animal.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une contention plusieurs fois au cours de leur vie, que ce soit pour des pesées ou pendant les différents tests. Les tests comportementaux réalisés sont classiques et indolores. De l'anxiété peut être attendue lors des différents tests liée à un nouvel environnement notamment pour les tests d'anxiété ou lors de l'isolement dans l'actimètre ou pendant le test d'interaction sociale avec 2h d'isolement auparavant.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue des procédures expérimentales. Nous récupérerons différents organes (cerveau, moelle épinière, surrénales, testicules et ovaires) afin de réaliser des études moléculaires. 120 de ces animaux subiront une perfusion intra-cardiaque, sous anesthésie générale, au cours de laquelle ils décèderont afin de pouvoir réaliser une étude sur les coupes de cerveau.
Remplacement
Avant de réaliser cette étude, nous avons préalablement travaillé sur des lignées cellulaires, ce qui nous a permis de confirmer le rôle de PDE2A2. Notre étude portant globalement sur des maladies du neurodéveloppement et sur le déficit intellectuel et les troubles du spectre de l'autisme, nous devons poursuivre ce projet directement chez la souris pour étudier les différents comportements associés à ces maladies afin de valider le rôle de la forme mitochondriale de PDE2A.
Réduction
Dans un objectif de réduction, nous analyserons nos résultats après chaque groupe expérimental. Si les résultats des 2 premiers groupes expérimentaux sont significatifs et identiques, nous n'utiliserons pas le 3ème groupe. De plus, les organes de tous les animaux utilisés au cours de ce projet seront récupérés pour réaliser des études moléculaires, ce qui évitera l'emploi d'animaux supplémentaires. Pour garantir une puissance statistique (t test) suffisante à cette étude tout en minimisant le nombre d’animaux à utiliser, nous prévoyons un minimum de n=10 animaux par groupe, avec 3 expériences indépendantes. Chaque expérience sera réalisée 3 fois afin de garantir la reproductibilité des résultats, et pour chaque répétition, nous avons besoin d'un minimum de 10 animaux par groupe afin d'obtenir un résultat significatif.
Raffinement
Lors des procédures chirurgicales, les animaux seront au préalable anesthésiés, accompagné d'un analgésique et d'un antalgique afin de réduire la douleur de l'animal.
Choix des espèces
Travailler avec des souris permet de comparer un phénotype "sauvage" avec des modèles transgéniques disponibles, comme les souris Pde2a+/-. De plus, le modèle murin permet d'étudier à la fois les comportements sociaux, cognitifs, anxieux ou sensorimoteurs que l'on peut retrouver chez les patients atteints de troubles du neuro-développement. Des tests seront réalisés au 7ème, 10ème et 14ème jour après la naissance, ce qui correspond à l'enfance chez l'humain. Puis nous réaliserons d'autres tests à 1 mois, ce qui correspond à l'adolescence. Enfin, nous réaliserons des tests à l'âge adulte d'une souris (à partir de 8 semaines). Cela permettra d'évaluer l'impact de l'extinction partielle du gène Pde2a2 au cours du développement, et d'identifier les moments clefs où la protéine PDE2A2 est impliquée dans la pathologie.
Evaluation pharmacologique de composés naturels ou de synthèse pour le traitement des maladies infectieuses
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
8 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 7 300 dans des procédures classées sévères. Elles sont infectées par diverses voies, nasale, intrapéritonéale, urétrale, intradermique et intramusculaire, puis traitées avec des composés candidats, la plupart des études se terminant par un prélèvement d'organes après mise à mort. Le porteur indique que les animaux peuvent perdre du poids et présenter posture voûtée, difficultés respiratoires et prostration, une perte de plus de 20 pour cent du poids servant de point limite. Il affirme qu'il n'existe aucun modèle in vitro reproduisant les interactions entre agent pathogène et système immunitaire, et revendique un besoin de santé publique majeur.
Objectifs
Nous avons pour objectif le développement de thérapies innovantes dans le domaine de l'infectiologie afin de répondre à un problème majeur qu’est la résistance aux antibiotiques.
Bénéfices attendus
Le nombre croissant d’antibiorésistances et d’infections nosocomiales sont clairement identifiés comme un besoin de santé public majeur. Il est indispensable de combattre la résistance aux antimicrobiens et de préserver la capacité de prévenir et traiter les maladies infectieuses à l’aide de nouveaux médicaments sûrs et efficaces
Procédures
Voie d’administration (traitement) : - Per os : 5 secondes, Sous cutané : 5 secondes , Intrapéritonéal : 5 secondes, Intramusculaire : 5 secondes, Intraveineuse : 5 secondes Voie d’administration (infection): - Intra-nasale: 5 secondes, Intra-peritoneale : 5 secondes, Intra-urétrale: 30 secondes, Intra-peritoneale : 5 secondes, Intra-dermique: 5 secondes, Intramusculaire: 5 secondes. Le nombre d'interventions est spécifique de chaque étude et est dépendant du régime de traitement qui lui même est corrélé à la pharmacocinétique de chaque molécule en développement. Néanmoins les fréquences d'intervention (traitement uniquement) peuvent etre uid ou bid.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont une potentielle perte de poids (qui sera considérée comme un point limite si excédant 20%). D'autres effets potentiels sont une apparition de signes cliniques : posture courbée, pelage en piloérection, respiration difficile, prostration ou perte d’activité, perte de réponse à un stimulus.
Devenir
Le sort prévu de tous les animaux à l'issue de chaque procédure est la mise à mort. En effet les études se finissent pour la plupart par des prélèvements d'organes qui sont réalisés après mise à mort des animaux. Les animaux survivants ne peuvent resservir à d'autres expérimentations en raison du développement de défenses immunitaires au cours de l'établissement des pathologies infectieuses.
Remplacement
L’apparition de résistance aux traitements antibiotiques de référence rend urgente la découverte de nouvelles solutions thérapeutiques innovantes. Le recours à l’animal de laboratoire s’inscrit dans le cadre de la résistance de certains agents pathogènes aux antibiotiques. En effet l’efficacité in vivo d’un composé sur une infection résulte non seulement de l’effet de ce dernier sur les micro-organismes mais également de la réponse du système immunitaire de l’hôte sur ces agents pathogènes. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. Afin d’évaluer l’activité thérapeutique de nouvelles substances, des modèles pharmacologiques in vivo mimant les pathologies telles que la septicémie, les infections pulmonaires, les infections urinaires etc… sont utilisés. De plus les mécanismes de réaction de l’hôte peuvent être mis en évidence en utilisant ces modèles sur animaux immunocompétents versus immunodéprimés. Une veille scientifique est mise en oeuvre pour étudier toute méthode scientifique alternative à l’expérimentation animale dans le domaine.
Réduction
Le nombre estimé est entre 1000 et 1600 animaux / an sur 5 ans. 12 procédures expérimentales sont prévues dans ce projet et le nombre d'étude varie en fonction de la demande client. Le nombre d’animaux inclus dans chaque étude peut varier de 20 à 100, en fonction du nombre de groupes différents à générer dans chaque étude (nombre de souches bactériennes différentes à tester, nombre de molécules antibactériennes à tester, doses différentes de la molécule antibactérienne). Cet écart dans le nombre d’animaux par étude justifie la fourchette d’évaluation du nombre à l’année. . Des études in vitro sont réalisées si possible en amont afin de ne pas avoir à tester des produits potentiellement dangereux ou non efficaces sur des animaux. Des analyses statistiques visant à déterminer le nombre d’animaux optimal pour produire des résultats robustes sont effectués. Des études pilotes sont conduites afin de s'assurer de la fiabilité du modèle.
Raffinement
Le bien-être de l’animal sera en permanence au centre de nos préoccupations. Les souris sont hébergées dans des cages à 22 ± 2 °C et 50 ± 10% d’hygrométrie, en portoirs ventilés ou isolateurs, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé chaque semaine. Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que les procédures ne débutent. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’un suivi attentif du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement par la structure en charge du bien-être animal Pour les protocoles où la douleur ne peut pas être prise en charge par des analgésiques, une observation accrue et des critères d’arrêt stricts sont mis en place. Les points limites utilisés sont: Le suivi du poids (le critère d'arret est une perte de plus de 20%), L'accumulation de signes cliniques : posture courbée, pelage en piloérection, respiration laborieuse, prostration ou perte d’activité, perte de réponse à un stimulus. Pour le confort de l'animal la prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse (isoflurane) au préalable des gestes douleureux (injection intraveineuse, injection intra-uretrale, injection intra-musculaire,...).
Choix des espèces
L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus). Les modèles souris sont largement utilisés par les équipes de Recherche publique et privée dans le traitement des maladies infectieuses Les souris se prêtent aux analyses immunologiques en raison d'un large panel d'outils d'analyses permettant de disséquer les mécanismes du développement de la physiopathologie
Etude de l’effet du Givinostat et du Bortezomib sur des modèles de myopathies chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
254 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles transgéniques de myopathies, elles subissent jusqu'à quatre prélèvements sanguins, des gavages quotidiens pendant quinze semaines et des tests d'effort et d'agrippement, pour évaluer deux molécules candidates. Le porteur indique que ces modèles développent faiblesse et lésions musculaires dès les premières semaines de vie, et que les gavages et tests peuvent provoquer inconfort et fatigue. Il décrit des essais préalables sur cellules et affirme que l'étape animale reste indispensable pour confirmer les résultats sur des organismes entiers.
Objectifs
Les myopathies des ceintures se caractérisent par une dégénérescence progressive des muscles du bassin et des muscles des épaules conduisant à une perte de motricité des membres supérieurs et inférieurs. Elles évoluent de façon extrêmement variable. L'atteinte musculaire s'étend progressivement vers les muscles du tronc et les muscles distaux qui s'affaiblissent. Une atteinte cardiaque et/ou respiratoire affecte l'espérance de vie. Il n’existe aucun traitement spécifique. Ces pathologies sont dues à des anomalies sur certaines protéines qui assurent la contraction du muscle. Chez des souris modélisant la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), un traitement pharmacologique (molécule 1) a réduit les symptômes. Ici, nous souhaitons évaluer l’efficacité de ce traitement sur des modèles murins de myopathies des ceintures, car les patients ont un tableau clinique similaire aux patients DMD. Le but étant que cette molécule réduise l’atteinte musculaire chez les patients. Dans un second temps, nous allons évaluer la possibilité de stopper la dégradation des protéines anormales présentes dans ces modèles. Nous souhaitons ici sélectionner la dose efficace d'un traitement (molécule 2) engendrant le moins d’effets toxiques/secondaires. L’étape suivante sera de combiner les deux molécules (molécules 1 et 2) pour restaurer les protéines fonctionnelles dans le muscle dans les modèles de myopathies (demande d’autorisation de projet à part).
Bénéfices attendus
Nous pensons que le traitement avec la molécule 1 aura un effet bénéfique sur les souris atteintes de myopathies des ceintures, en améliorant l’état des muscles squelettiques, aussi bien au niveau de l’architecture des muscles que de la force musculaire. La combinaison avec la molécule 2 pourrait plus tard permettre la restauration des protéines dans le muscle. De tels résultats ouvriraient la porte à des essais cliniques sur des patients souffrant de ces maladies, pour lesquelles il n’existe actuellement aucun traitement.
Procédures
Les animaux subiront : - au maximum 4 prélèvements sanguins chacun durant environ 20 minutes - des gavages 1 fois par jour pendant 15 semaines (durée : quelques minutes) - 2 tests d'effort (durée cumulée maximale 110 min) et 2 tests d'agrippement (durée : 3x 60 secondes)
Impact sur les animaux
Le test d'effort peut entrainer une fatigue de l'animal (musculaire et/ou cardiaque). Les gavages quotidiens avec la molécule 1 peuvent entrainer un inconfort. A partir de trois semaines d’âge les souris MDX (modèle DMD) présentent une faiblesse musculaire et des lésions musculaires. Concernant les souris alpha sarcoglygane, les muscles squelettiques sont fonctionnellement altérés à partir de l'âge de 2 mois et un schéma dystrophique modéré est présent à partir de l'âge de 6 mois. Les souris gamma sarcoglygane développent une dégénérescence et régénération du muscle squelettique dès 4 semaines et une fibrose précoce.
Devenir
A l'issue des procédures, les animaux seront euthanasiés et les muscles seront prélevés pour des analyses histologiques.
Remplacement
Des premières études avec les deux molécules ont été préalablement réalisées sur des modèles cellulaires. Cela a permis d’étudier leurs effets et leur mécanisme d’action. Néanmoins, notre étude préclinique est indispensable pour confirmer les résultats préalablement observés et les confirmer sur des organismes entiers (mammifères comme la souris). Cela permettra d’ouvrir la porte à des essais cliniques chez l’humain.
Réduction
Pour la première étude avec la moléculé 1 nous utiliserons 8 souris par groupe. Ce nombre nous confère une force statistique suffisante afin de comparer les résultats obtenus dans chaque groupe et condition de traitement. Par ailleurs, dans la suite de notre stratégie de réduction, les groupes témoins (non porteurs du gène de la maladie) ne seront pas exposés aux doses croissantes du traitement expérimental. Pour la deuxième étude avec la molécule 2, nous utiliserons 6 souris saines par dose. Les résultats des études sur les groupes d’animaux traités ou non avec la molécule d’intérêt seront analysés au moyen de tests statistiques paramétriques ou non en fonction de la distribution des données. Ceci permettra de déterminer si le traitement induit des différences significatives.
Raffinement
Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel.
Choix des espèces
Dans le cadre des 2 études, le choix s’est porté sur la souris principalement car il s’agit d’une part d’un modèle mammifère vivant qui présente beaucoup de similitudes avec l’être humain notamment au niveau de la composition et la structure du muscle squelettique. D’autre part, la disponibilité de certains modèles murins de maladies musculaires commerciaux particulièrement d’intérêt dans cette étude ont participé à orienter le choix sur la souris pour ces études précliniques. Par ailleurs, les modèles utilisés sont des modèles transgénique et la souris est un modèle de choix pour la génération de ces derniers. Les animaux seront reçus à l’âge de 4 semaines, ils seront habitués au nouvel environnement pendant une semaine et les premiers tests (comportementaux) commenceront à 5 semaines d’âge. Le traitement quant à lui sera initié à 6 semaines d’âge. Au vue de la physiopathologie étudiée et des études préliminaires avec ces modèles et les drogues choisies, il est important de faire ces études à un âge ou les symptômes sont réversibles et sur des animaux qui sont dans un développement qui sera proche des populations ciblés chez l’humain (adolescent/adulte).
Etude des lésions inflammatoires du cervelet après traumatisme crânien chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
1 182 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures classées sévères et l'autre modérées. Des souriceaux de 7 jours subissent un traumatisme crânien par lâcher de poids sous anesthésie, puis certains une chirurgie crânienne pour imagerie, avant une perfusion intracardiaque mortelle et le prélèvement du cerveau. Le porteur décrit un modèle de traumatisme crânien pédiatrique visant à comprendre l'atteinte du cervelet, et indique que les effets sur la croissance des souriceaux ne sont pas encore décrits ni connus. Il justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de reproduire in vitro les interactions entre cellules du cerveau.
Objectifs
Le traumatisme crânien (TC) correspond aux lésions cérébrales traumatiques et aux altérations des fonctions cérébrales qui en résultent. Les TC sont fréquents chez les enfants et sous-diagnostiqués. Le traumatisme crânien pédiatrique est pourtant un enjeu de santé publique et social majeur. En effet, il est potentiellement responsable de troubles cognitifs et comportementaux, d’échecs scolaires puis de désinsertion sociale à l’âge adulte. Alors que le cervelet est rarement touché directement (3,3% des TC), des lésions indirectes provenant de la zone lésée dans le reste du cerveau peuvent être observées, notamment chez l’enfant. Ces atteintes participent aux handicaps moteur et cognitif. En revanche, les mécanismes mis en cause dans la génération de ces lésions sont mal connus et semblent reposer sur l’inflammation qui survient dans le cerveau lors du TC. Notre hypothèse est que le TC, même isolé, peut être à l’origine de lésions du cervelet, à cause de l’inflammation. Nous utiliserons un modèle de TC modéré par lâcher de poids d'une faible hauteur chez le souriceau 7 jours, sous anesthésie générale, pour étudier les phénomènes inflammatoires potentiellement impliqués dans les lésions du cervelet dans les suites de l'impact.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de compendre de manière plus précise comment le traumatisme crânien chez l’enfant peut conduire à des troubles à long terme, et quel rôle le cervelet joue dans ce phénomène. La fonction du cervelet est de plus en plus étudiée, mais la manière dont il participe à certaines maladies neurologiques, ou neurodégénératives, n’est pas encore totalement élucidée.
Procédures
Les souriceaux subiront un traumatisme crânien sous anesthésie générale. Après ce traumatisme, un groupe d’animaux de 10 jours de vie sera anesthésié, et une perfusion intra-cardiaque sera réalisée post-mortem pour éliminer le sang des vaisseaux des organes qui seront prélevés et étudiés post-mortem. Cette perfusion sera également réalisée chez des animaux à 45 jours de vie et à 6 mois, sous anesthésie générale et avec analgésie. Deux groupes de souris, l’un à 45 jours de vie et l’autre à 6 mois subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie pour réaliser des mesures d’imagerie sur le cerveau (durée : une heure maximum). Ces animaux seront ensuite euthanasiés sans réveil.
Impact sur les animaux
Les effets de cette procédure de traumatisme crânien sont partiellement connus . On rapporte ainsi une mortalité́ estimée à moins de 4%, principalement due à un éventuel rejet du souriceau par la mère, ainsi que dans quelques cas par le traumatisme lui-même. La chirurgie crânienne pour l’imagerie peut entraîner dans de rares cas la mort de l’animal. Les effets sur la croissance et le développement des souriceau ne sont pas encore décrits ni connus.
Devenir
L'euthanasie des animaux après imagerie répond à une nécessité d'ordre éthique puisque celle-ci impose une chirurgie au niveau du crane de l'animal, et rend l’utilisation du cerveau impossible pour toute autre analyse. Tous les autres animaux seront euthanasiés et les cerveaux prélevés pour analyses.
Remplacement
L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'implication du cervelet dans l’inflammation du cerveau après traumatisme, et dans le développement de lésions plus tardives. Cela suppose des interactions complexes entre les différents types de cellules qui constituent le cerveau, à savoir les neurones (qui transmettent les informations nerveuses), les microglies (cellules immunitaires du cerveau), les astrocytes (qui contrôlent le métabolisme), et les oligodendrocytes (qui produisent une gaine de protéine autour des neurones). Il y a également une rupture de la barrière hémato-encéphalique, qui filtre habituellement le sang avant qu’il entre dans le cerveau. Cette lésion secondaire au traumatisme est à l’origine d’une communication entre le système immunitaire périphérique (c’est-à-dire les globules blancs qui circulent dans le sang) et le système immunitaire du cerveau. Il n'est pas possible de reproduire ces interactions in vitro, et il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal présentant un cerveau fonctionnel, dont la structure est proche de celle de l'homme pour reproduire ce système.
Réduction
Le nombre d'animaux estimé et les tests statistiques utilisés sont basés sur notre expérience pour ce type d'étude. Ce nombre minimum nous permettra d'être certains de répondre aux questions scientifiques de ce projet. L'analyse statistique de nos données peut nécessiter plus ou moins d'animaux en fonction du type d’analyse réalisé. Pour autant, les tests étant organisés en plusieurs séries, si une différence assez importante pour conclure à un effet réel est observée avant la fin de toutes les séries, les expérimentations seront interrompues.
Raffinement
Hébergement : Les animaux seront hébergés en groupe, en milieu enrichi (sopalin , maisons en plexiglas) pour minimiser leur stress. Dans les jours suivant le traumatisme crânien, on veillera quotidiennement au bien-être des animaux et on surveillera que leur retour au sein du nid se fait bien. Des arbres décisionnels cliniques seront proposés en fonction de l'âge des animaux. Avant sevrage, sur les très jeunes animaux, les soins maternels constituent la meilleure prise en charge de la souffrance chez le souriceau. Après le 15ème jour de vie, une réhydratation sera réalisée si l’animal présente des signes d’inconfort ou de douleur. A partir du sevrage, les douleurs éventuelles seront traitées à l’aide d’un analgésique. En cas d’atteinte des points limites l’animal sera euthanasié. Tous les gestes invasifs (trauma et imagerie) seront réalisés sous anesthésie générale. A la fin de l'étude les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires.
Choix des espèces
Afin d'étudier les interactions entre les cellules du cerveau sur un modèle de traumatisme, il est nécessaire d'utiliser une espèce animale qui présente un système nerveux central proche de celui de l'homme. La souris remplit très bien cette condition. Le modèle de traumatisme crânien utilisé est bien connu développé et étudié au sein de notre laboratoire. Notre objectif étant l'étude du rôle du cervelet dans les lésions induites par un trauma crânien, nous nous intéresserons à 3 temps de vie plus tardifs de nos animaux : 10 jours (petit enfant), 45 jours (jeune adulte) et 6 mois de vie (adulte).
Caractérisation des lésions vasculaires induites par l’infection de SARS-CoV-2 dans un modèle murin humanisé et nouvelles approches thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour exprimer le récepteur humain ACE2, elles sont infectées par le SARS-CoV-2 par voie nasale ou intraveineuse, reçoivent des injections intrapéritonéales et subissent des prélèvements de sang au sinus rétro-orbital, pour étudier les atteintes vasculaires de la Covid-19. Le porteur indique que l'infection peut provoquer microthromboses, perte de poids de 10 à 20 pour cent et anomalies de comportement, les souris perdant plus de 20 pour cent de leur poids étant mises à mort. Il présente les retombées thérapeutiques comme des pistes et reconnaît utiliser en parallèle des cultures de cellules humaines, tout en affirmant que l'étude ne peut être menée sans administration du virus à l'animal vivant.
Objectifs
La COVID-19 est une maladie virale aiguë causée par le coronavirus de type 2 du syndrome aigu respiratoire sévère (SARS-CoV-2). Le premier site d'infection chez les patients atteints de la COVID-19 est l'appareil respiratoire. Le SARS-CoV-2 infecte les cellules de la muqueuse nasale en se liant à une enzyme appelée ACE2. Outre le poumon, une atteinte multi-organes a été décrite dans les formes graves de la COVID-19, témoignant d’une diffusion du virus dans l’ensemble de l’organisme. Les examens anatomiques après le décès des patients atteints de la COVID-19 ont mis en évidence une atteinte isolée ou prédominante des cellules endothéliales (cellules qui tapissent l’intérieur des vaisseaux en contact avec le sang). Cette atteinte se caractérise par l’apparition de petits caillots sanguins, perturbant l’apport sanguin dans les tissus en aval. Bien que mal comprises, ces observations impliquent fortement les cellules endothéliales dans les atteintes multi-organes sévères de la COVID-19. Plusieurs études scientifiques attestent de la pertinence et de l’intérêt des modèles rongeurs pour l’étude de l’infection SARS-CoV-2, la compréhension des mécanismes responsables de la COVID-19 et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. La souris n’est naturellement pas sensible à l’infection SARS-CoV-2 car l’ACE2 murine ne reconnait pas le SARS-CoV-2. Afin d’étudier l’infection SARS-CoV-2 chez la souris, un modèle murin de souris humanisée pour l’ACE2 humaine a été développé permettant d’exprimer l’ACE2 humaine en lieu et place de l’ACE2 murine dans un tissu que nous choisissons. Deux modèles de souris transgéniques ACE2 humanisées ont ainsi été générées : 1. une souris humanisée exprimant l’ACE2 humaine dans toutes les cellules de l’organisme et 2. une souris humanisée exprimant l’ACE2 humaine uniquement dans les cellules endothéliales vasculaires de la souris. En utilisant ces deux modèles, notre projet a pour objectifs : 1) d’établir les conditions expérimentales de l’infection au SARS-CoV-2 en utilisant des doses croissantes de virus à court terme, 2) de caractériser les atteintes des petits et gros vaisseaux par le SARS-CoV-2 à long terme, et 3) d’évaluer l’efficacité d’un traitement visant à diminuer les atteintes vasculaires liées à l’infection SARS-CoV-2 à long terme.
Bénéfices attendus
L’étude chez le rongeur des infections à SARS-CoV-2 est déterminante pour l’élaboration de stratégies de lutte contre la COVID-19 et de ses formes graves. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt d’urgence et de priorité nationale du gouvernement et des organismes publiques de recherche en regard de la pandémie mondiale de la COVID-19. Ce travail offrira une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels l’infection SARS-CoV-2 altère la fonction endothéliale, conduit à une atteinte vasculaire multi-organes et offrira de nouvelles pistes de traitements pour lutter contre les atteintes vasculaires graves de l’infection SARS-CoV-2.
Procédures
Pour la réalisation des infections virales, les animaux seront anesthesiés sous anesthesie générale et soumis à des injections intranasales ou intraveineuses du SARS-CoV-2. Les administrations des molécules pharmacologiques à visée thérapeutique seront réalisées par voie intrapéritonéale chez la souris vigile. Les prélèvements sanguins seront réalisés au sinus rétroorbital sous anesthésie générale et collyre anesthésique. La durée de chaque intervention décrite est inférieure à 1 minute.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : 1. Anesthésie à l'isoflurane pour l'infection SARS-CoV2 (variant français du Wuah, D614G ou variant Omicron B.1.1.529) = stress léger de la contention et de l'anesthésie (dont le reveil) 2. Administration du virus par voie intranasale = stress et inconfort légers de l'animal 3. Administration du virus par voie intraveineuse = stress et douleur légère de la piqure de l'aiguille 4. Prélèvement de sang au niveau du sinus rétro-orbital de l'animal anesthésié sous isoflurane = stress léger de la contention et de l'anesthésie (dont le réveil), douleur légère possible au reveil 5. Atteintes macro- et micro-vasculaire du SARS-CoV-2 = douleur legère à modérée notamment en cas de microthrombose vasculaire et d'altérations locales de l'apport sanguin pouvant conduire à une perte de poids (de 10 à 20%), une altération de l'apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) ou un comportement anormal (mobilité réduite, agressivité) de l'animal.
Devenir
La mise à mort des animaux à la fin de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques et moléculaires nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude.
Remplacement
L’étude de l’infection SARS-CoV-2 ne peut être menée sans avoir recours à l’administration du virus à l’animal vivant. De plus notre projet s’intéresse à l'évolution des atteintes tissulaires sur le long terme (2 mois post-infection) de la COVID-19 et aux variations de sensibilité de l’infection SARS-CoV-2 avec l’âge (souris jeunes vs âgées) qui ne peuvent être mimées in vitro. En revanche, des résultats préliminaires de notre laboratoire montrent que le récepteur ACE2 (porte d'entrée du virus dans l'organisme) est fortement exprimé à la surface des cellules endothéliales qui bordent l'intérieur des vaisseaux à l'échelle des petits et des gros vaisseaux chez la souris. La culture cellulaire de cellules endothéliales humaines restera un outil que nous utiliserons au cours de ce projet pour des tests viraux et fonctionnels préliminaires et complémentaires à l’utilisation des souris.
Réduction
Dans le but de suivre le principe des 3R et de réduire l’utilisation excessive d’animaux, le nombre d’animaux par groupe a été calculé sur la base de notre expérience acquise précédemment et de protocoles publiés. Un des enjeux est de pouvoir obtenir suffisamment de matériels biologiques pour réaliser l’ensemble des analyses prévues. Dans notre expérience, des groupes infectés de 6 animaux pour les études virologiques à court terme et de 10 animaux pour les études histologiques et moléculaires à long terme sont suffisants pour répondre à nos questions scientifiques. De le même façon, un nombre d’animaux de n=4 est amplement suffisant pour les groupes non infectés contrôles.
Raffinement
Pour minimiser le stress des animaux, l'inoculation intranasale ou intraveineuse du virus sera réalisée sur des souris anesthésiées. Après l'infection, une surveillance quotidienne effectuée par une personne compétente sur le projet nous permet de savoir si un animal souffre et ainsi de pouvoir envisager une mort anticipée. La mort anticipée sera envisagée sur l'animal a une perte de poids de plus de 20% et présente également une altération de son apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) et/ou un comportement anomal (mobilité réduite, agressivité). Dans notre expérience, passées les premières 72h post-infection, il est rare d’observer des signes de souffrance chez l’animal.
Choix des espèces
La souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation de lignées génétiquement modifiées afin d'identifier les mécanismes responsables des effets délétères de l’infection SARS-CoV-2. Elle constitue également un outil essentiel pour la recherche par sa facilité de manipulation, sa petite taille et ses cycles de reproduction courts. Les souris transgéniques humanisées pour l'ACE2 humaine développées pour ce projet seront sensibles à l’infection SARS-CoV-2 du fait de l’expression du récepteur humain du SARS-CoV-2 et permettront de mieux comprendre les atteintes vasculaires multi-organes de l’infection SARS-CoV-2. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris mâles agées de 6 semaines ou de 8 mois pour répondre à la question de l’influence de l’âge sur le risque accru d’atteintes vasculaires de l’infection SARS-CoV-2.
Formation des professionnels de santé à l’utilisation des dispositifs médicaux innovants.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Cochons : 100
Moutons : 200
Bovins : 10
325 animaux non-humains, 200 moutons, 100 cochons, 15 chiens et 10 bovins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures que le porteur classe en gravité légère. Chaque animal subit sous anesthésie générale l'implantation chirurgicale d'un dispositif médical et des examens d'imagerie pouvant durer plusieurs heures, avant une euthanasie destinée à parachever la formation par l'examen de l'organe et du dispositif implanté. L'objet déclaré est de former des professionnels de santé à l'usage de dispositifs implantables, pas de produire des connaissances. Le porteur affirme que ces gestes ne s'apprennent que sur un animal vivant aux organes de taille humaine, tout en mentionnant l'existence de simulateurs et d'organes explantés.
Objectifs
Chaque année de nouveaux dispositifs implantables issus de la recherche sont disponibles pour les professionnels de santé (en cardiologie, en gastro-entérologie, en neurologie et urologie par exemple) et permettent de compenser, compléter/remplacer les fonctions vitales d’un organe défaillant pour prolonger la survie des patients et leur confort de vie. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. Les professionnels de santé ont l’obligation de se former à l’utilisation de ces nouveaux dispositifs. L’utilisation d’un dispositif médical par un professionnel de santé ou un patient ne peut se faire sans une information de l’utilisateur, voire une formation préalable, elle requiert un apprentissage permettant d’utiliser le matériel, afin d’optimiser ses performances et de s’approprier les gestes permettant d’assurer à l’utilisateur une sécurité maximale d’utilisation. Un même produit, s’il est utilisé ou non conformément aux recommandations du fabricant, aura ou non la performance validée lors de son évaluation. Les dispositifs médicaux sont définis comme des produits «utilisateur-dépendant». La directive 93/42/CE modifiée relative à l’évaluation de ces dispositifs en vue de leur accès au marché européen, soumet les industriels à des obligations en matière de gestion des risques pour le produit mais également son environnement, prend en compte ce caractère «utilisateur-dépendant». Les industriels sont, à ce titre, responsables du recueil, de l’évaluation, de la mesure et du développement de tout élément susceptible de permettre une utilisation optimale des produits qu’ils commercialisent et d’assurer leur sécurité. Performances et sécurité des dispositifs médicaux sont corrélées à la formation et à l’expérience de l’utilisateur. De plus, les conditions d’utilisation des dispositifs ne peuvent se réduire à des questions d’observance. Sur tous ces points, le dispositif médical doit être différencié du médicament, y compris pour son utilisation par un professionnel de santé ou un patient. Ce projet vise à former les professionnels de santé à l’utilisation des dispositifs médicaux innovants en situation réelle sur un animal anesthésié.
Bénéfices attendus
Répondre à l’obligation de formation des professionnels de santé à la technique d’implantation d’un nouveau dispositif médical, à sa bonne utilisation et à son évaluation fonctionnelle pour la sécurité pour les futurs patients.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie. Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - La douleur durant l'intervention en fonction de l’invasivité de la technique, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour la réduire au maximum comme par exemple la mise en oeuvre systématique d'un protocole d'anesthésie générale et d'un protocole d'analgésie avec l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur morphiniques.
Devenir
Pour répondre à l’obligation de formation des professionnels de santé à la technique d’implantation d’un nouveau dispositif médical, à sa bonne utilisation et à son évaluation fonctionnelle pour la sécurité des futurs patients, il est nécessaire de procéder à l'euthanasie de tous les animaux du projet en fin de procédure pour parachever la formation en réalisant les prélèvements et analyses ex-vivo et permettre aux professionnels d’évaluer macroscopiquement l’organe et le dispositif juste implantés.
Remplacement
La formation des professionnels de santé aux méthodes d’implantation des dispositifs médicaux regroupe les notions de maîtrise du geste chirurgical mais aussi d’évaluation fonctionnelle en temps réel au moment de l’implantation grâce à l’imagerie. La réponse de l’organisme lors des différentes phases de l’implantation du dispositif et son suivi simultané par des méthodes d’imagerie pour en permettre l’évaluation fonctionnelle nécessite une formation sur un animal vivant. Les implantations doivent se faire sur des organes animaux de taille identique aux organes de l’homme dans des conditions fonctionnelles qui reproduisent la fonction de l’organe vivant dans l’organisme afin de mimer au mieux la réalité d’une intervention.
Réduction
Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques du projet et aux besoins de formation. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie peu invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les professionnels de santé en formation reçoivent généralement une formation théorique en amont de cette formation pratique. Pour répondre à ce même objectif de réduction, les partenaires qui développent les dispositifs médicaux ont également développés des outils d’apprentissage avec simulateurs ainsi que des procédures permettant de travailler sur des organes explantés. La précision croissante des outils d’imagerie fonctionnelle permet également de gagner en précision dans les techniques d’implantation et d’évaluation des dispositifs, ce qui augmente le raffinement des procédure et limite le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble de la procédure est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant la procédure, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (AINS et/ou opioïdes). Pendant les phases d’acclimatation, les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation).
Choix des espèces
Les implantations doivent se faire sur des organes animaux de taille identique aux organes de l’homme dans les conditions fonctionnelles de l’organe vivant dans l’organisme pour mimer au mieux la réalité d’une intervention. Pour répondre à l’obligation de formation, le modèle animal utilisé sera fonction du dispositif et de son indication. Les différences interspécifiques de nature tissulaire, de forme, de taille anatomique et de fonction requièrent l’emploi de différentes espèces de grande taille. Pour chaque formation le modèle animal retenu sera identifié préalablement en fonction de ces spécificités et similitudes avec l’Homme et sera la brebis pour les formations intéressant les domaines de la cardiologie, de la chirurgie vasculaire et de la neurologie principalement, le porc pour les formations intéressant les domaines de la gastro-entérologie, de l'ophtalmologie et de la cardiologie principalement, plus spécifiquement le chien pour la chirurgie des auricules cardiaques et les veaux pour les dispositifs d'assistance cardiaque. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou des adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.
Évaluation de l’efficacité de candidats vaccins recombinants contre le COVID-19, la grippe et la rage, basés sur le vaccin vivant contre la rougeole
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
3 930 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales, intramusculaires, intranasales ou intracérébrales de candidats vaccins ou de virus d'épreuve, dont la grippe et la rage qui peuvent provoquer une pneumonie et une perte de poids jusqu'à 25 %, voire la mort. Le projet évalue chez la souris des vaccins recombinants contre le COVID-19, la grippe et la rage, dérivés du vaccin contre la rougeole. Le porteur indique qu'aucun animal ne peut être réutilisé ou sorti de l'animalerie confinée, et affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit l'interaction hôte-pathogène.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de réaliser l’évaluation préclinique chez la souris de candidats vaccins élaborés dans notre laboratoire. Ces candidats vaccins sont dérivés du vaccin vivant atténué contre la rougeole, qui est l’un des vaccins humains les plus sûrs et efficaces. Pour bénéficier des grands avantages de ce vaccin, nous développons des nouveaux vaccins recombinants ou chimériques construits à partir du génome de la souche Schwarz du virus vaccinal de la rougeole (MV) qui est modifiée pour exprimer un ou plusieurs antigènes des agents pathogènes ciblés. Ces antigènes sont exprimés à partir d’unités additionnelles de transcription (stratégie vaccin recombinant) ou à la place d’antigènes du vaccin contre la rougeole (stratégie vaccin chimère). Ces stratégies ont déjà fait l’objet de nombreuses publications scientifiques par notre équipe et par d’autres. Plusieurs programmes sont poursuivis en parallèle dans le laboratoire. Dans ce projet, nous développons des vaccins recombinants ou chimériques MV-COVID, MV-grippe et MV-rage. Pour chacun des agents pathogènes ciblées, une série de plusieurs candidats vaccins sont construits, produits et caractérisés en faisant varier le choix et la forme des antigènes vaccinaux, la conception du/des transgènes et leur insertion dans le génome de la souche Schwarz avant l’étude in vivo. Les candidats vaccins sont évalués pour leurs capacités immunogènes et protectrice chez des souris de laboratoire ou des souris génétiquement modifiées qui présentent une meilleure susceptibilité aux faibles doses à l’infection par les souches atténuées du virus de la rougeole. En fonction des résultats obtenus chez la souris, des séries successives de candidats vaccins sont produites afin d’aboutir à la sélection d’un ou deux candidats par pathogène ciblé. Cette sélection réduite fera l’objet d’une validation préclinique complémentaire chez le primate non humain puis d’études cliniques chez l’homme.
Bénéfices attendus
Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins prophylactiques efficaces et améliorés contre plusieurs pathologies infectieuses graves.
Procédures
Une identification par marquage à l’oreille (quelques secondes) en début d’expérimentation. Une à trois administrations de substance par injection intrapéritonéale / intramusculaire sur animaux vigiles (20 secondes) ou instillation intranasale (60 secondes) sur animaux préalablement anesthésiés par injection intrapéritonéale (20 secondes), avec des intervalles de 1 mois. Alternativement, une à deux administrations de substance par injection intrapéritonéale / intramusculaire sur animaux vigiles (20 secondes) puis une seule injection intracérébrale (20 secondes) sur animaux préalablement anesthésiés par injection intrapéritonéale (20 secondes), avec des intervalles de 1 mois. Une à trois prises de sang (10 secondes), avec des intervalles de 1 mois.
Impact sur les animaux
Selon notre expérience antérieure, l'injection de vecteurs dérivés du vaccin vivant atténué contre la rougeole n’induit aucun signe clinique chez les souris. Il en est de même pour l’inoculation par voie intranasale du vecteur Ad5-hACE2 suivie de celle du SARS-CoV-2. A l’opposé, l’inoculation de virus grippaux H1N1/H3N2 adaptés à la souris, du virus H1N1 pandémique (2009) ou du virus de la rage (souche CVS) peuvent provoquer une maladie symptomatique, entraînant potentiellement la souffrance. Les virus grippaux induisent une pneumonie virale primaire de symptômes modérés à sévères selon la souche et la dose d’épreuve utilisée, dont les manifestations cliniques vont d’une gêne respiratoire / mobilité réduite / perte de poids transitoire à la mort. La perte de poids peut être importante, jusqu’à 25% du poids d’une souris mâle adulte, tout en restant transitoire et en l’absence de toute autre manifestation clinique chez des souris vaccinées. Le virus de la rage est fortement neurotrope et induit une encéphalite létale après inoculation intracérébrale à la souris, dont les premières manifestations cliniques peuvent être la perte de poids, l’ataxie, un comportement agité et rotatoire, un manque de coordination des pattes et la paralysie. L’inoculation intramusculaire périphérique (membre inférieur) peut provoquer une neuropathie et/ou une paralysie progressive à mesure que le virus progresse vers le système nerveux central (SNC), puis une encéphalite ultimement létale. Pour éviter que les animaux souffrent, des points limites seront établis préalablement à la réalisation des expériences et les animaux seront mis à mort immédiatement après avoir atteint ces points.
Devenir
Une grande partie des animaux seront mis à mort afin d’être prélevés de multiples organes nécessaires pour l’évaluation de l’efficacité des candidats vaccins. Tous les autres animaux survivants seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils auront été immunisés par des vaccins vivants recombinants ou infectés par des virus d’épreuve pathogènes pour l’homme dans une animalerie confinée (A3) : il n’est donc pas possible de les réutiliser dans d’autres projets ou de les transférer en dehors de l’animalerie.
Remplacement
Ce programme préclinique est au centre de l’activité de notre équipe. Il est primordial car il produit les premières preuves de concept de l’immunogénicité et de l’efficacité des candidats vaccins qui déterminent les phases ultérieures du développement, susceptibles de produire des nouveaux vaccins humains. Aucun système in vitro ne permet à ce jour d'englober tous les aspects de l'interaction hôte-pathogène qui aboutissent à l’induction d’une réponse immunitaire par les candidats vaccins vivants puis à la protection contre l’infection pulmonaire par les coronavirus ou les virus grippaux ou contre l’infection du système nerveux central par le virus rabique. En particulier, l'évaluation de l'impact vaccinal sur le contrôle de la charge virale et l’appréciation de l’histopathologie des organes cibles ne peuvent se réaliser que dans des modèles in vivo pertinents qu’il n’est à l’heure actuelle pas possible de remplacer par des essais in vitro. Par ailleurs, avant d’entreprendre des études cliniques de phase 1 permettant de cerner l’éventuelle toxicité d’un produit vaccinal administré à l’homme ou de phase 2 permettant d’évaluer son efficacité, c’est une obligation des agences règlementaires de procéder à des études précliniques chez l’animal. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme.
Réduction
Sur la base de discussion avec un biostatisticien, et des tests statistiques appropriés, nous avons planifié d’inclure le nombre minimal d’individus par groupe expérimental qui permette une analyse statistique pertinente et concluante. Pour calculer la taille des groupes de souris injectées par les candidats vaccins, nous avons utilisé les moyennes et écart-types géométriques d’expériences antérieures obtenues dans un projet précédent. Les tests considérés sont un test de comparaison de deux moyennes indépendantes pour comparer 2 groupes et un test Anova à un facteur suivis de tests multi-comparaisons pour comparer plusieurs groupes. Grâce à ces données, un logiciel statistique a déterminé la taille optimale des groupes pour un risque alpha de 5% et une puissance de 80-90% : le nombre d’animaux sera ainsi réduit à 6 pour les études d’immunogénicité et 7 pour les études de protection. Par ailleurs, nous utiliserons un modèle d’épreuve par le SARS-CoV-2 déjà mis au point qui ne nécessitera pas de mise au point supplémentaire pour le choix des doses.
Raffinement
Les opérations de vaccination, d’infection, de prélèvement de sang, ainsi que la mise à mort et le prélèvement d’organes seront réalisés par des expérimentateurs formés. La cage des animaux comportera, comme élément d’enrichissement, du coton dentaire, pour que les animaux puissent construire un nid et, dans le cas des animaux infectés, du Diet Gel pour faciliter la prise de nourriture et l’hydratation. La température dans la cage d’animaux infectés sera améliorée au début des symptômes cliniques. Une évaluation clinique sera mise en place à raison de 2 fois par semaine dans le cas des animaux immunisés avec les vaccins rougeole recombinants et une évaluation quotidienne dans le cas des animaux infectés. Si les animaux deviennent cliniquement malades, leur souffrance sera abrégée par leur mise à mort. Selon notre expérience antérieure, l'injection de vecteurs dérivés du vaccin vivant atténué contre la rougeole n’induit aucun signe clinique chez les souris. Il en est de même pour l’inoculation par voie intranasale du SARS-CoV-2 jusqu’au 4ème jour après l’épreuve où les animaux seront mis à mort pour le prélèvement des organes. Pour les procédures d’épreuve de classe sévère (virus grippaux, virus de la rage), nous prendrons soin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux : tout en respectant les conditions qui permettent au projet de recherche d’atteindre ses objectifs, nous définirons à l’avance des points limites spécifiques de chaque agent infectieux et les animaux seront mis à mort dès que les points limites seront atteints.
Choix des espèces
Le virus de la rougeole (sauvage ou vaccinal) n’infecte efficacement que les primates. Un modèle rongeur pertinent a donc été développé. Les souris déficientes pour le gène du récepteur d’un médiateur de l’inflammation, les interférons de type I (IFNAR) sont susceptibles à l’infection par les souches vaccinales du virus de la rougeole. Elles peuvent également exprimer le récepteur humain de ce virus, améliorant encore leur susceptibilité aux faibles doses. Nous pensons que certains candidats vaccins basés sur le vaccin contre la rougeole seront capables de se multiplier chez la souris non génétiquement modifiée . Dans ce cas, nous aurons principalement recours à plusieurs lignées de souris de laboratoires qui sont des modèles reconnus pour le SARS-CoV-2, les virus grippaux et le virus rabique. Des souris de 5-7 semaines d’âge seront commandées. Après une semaine de stabulation, les souris seront immunisées pour l’étude de l’immunogénicité des vecteurs vaccinaux ou immunisées et infectées pour l’évaluation de l’efficacité vaccinale. Il est admis qu’à partir de l’âge de 6 à 7 semaines, le système immunitaire de ces petits rongeurs est considéré comme mature et que les réponses immunitaires induites peuvent être considérées comme comparables à celles induites pendant leur vie d’adulte.
EU1/2: Evaluation immunopathologique de l’impact de la comorbidité cardiovasculaire sur le développement d’une forme grave de la Covid-19.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
180 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent l'implantation chirurgicale d'une mini-pompe qui induit une hypertension et une insuffisance cardiaque, puis une infection au SARS-CoV-2 par voie intranasale, avec échographies et prélèvements sanguins. Le porteur indique que les souris sont transférées vivantes à des partenaires avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Il présente ce modèle comme une future plateforme d'évaluation préclinique à proposer aux laboratoires académiques et industriels.
Objectifs
Les coronavirus constituent une grande famille de virus à l'origine de maladies allant du simple rhume à des maladies plus graves comme le MERS ou le SRAS. La pandémie du coronavirus 2019 (COVID-19), causée par le coronavirus 2 (SARS-CoV-2) a touché des millions de personnes dans le monde entier, déclenchant un effort sans précédent de la part de la communauté scientifique pour comprendre le fondement biologique de la physiopathologie du SARS-CoV-2. Au 2 février 2022, sur un total de plus de 376 millions d'infections liées au coronavirus (COVID-19) dans le monde, 5,6 millions sont décédées à ce jour, dont plus de 128 000 en France. 73% des victimes du coronavirus en France étaient âgées de 75 ans ou plus. Dans le contexte d'une infection au SARS-CoV-2, une association d'une maladie grave avec l'âge et/ou les comorbidités préexistantes comme l'hypertension, les maladies cardiaques mais aussi le diabète/obésité et les maladies respiratoires chroniques associée peut entraîner le décès. En outre, près d'un quart des personnes décédées du COVID-19 souffraient d'hypertension artérielle, et un tiers de maladies cardiovasculaires, parmi lesquelles l'insuffisance cardiaque était majoritaire. Dans ce contexte, l'objectif du projet est de profiter de la complémentarité des centres de recherches nationaux pour évaluer les effets des comorbidités liées aux maladies cardiovasculaires (MCV) sur la sévérité de l'infection par COVID-19 et l'efficacité des thérapies antivirales dans ces condition en utilisant un modèle préclinique de souris humanisé par le récepteur aux virus du COVID-19. Ce modèle animal de souris humanisés sera fourni par nos partenaires à Marseille et ils nous aidera à mieux comprendre l’évolution de cette pathologie et les facteurs influençant sa gravité du point de vue des réponses immunitaires innées et adaptatives suscitées par l'infection par le SARS-CoV-2 afin de connaitre les réponses conduisant à une amélioration des symptômes mais aussi celles susceptibles de contribuer à la maladie, la gravité et la mort.
Bénéfices attendus
Les modèles de souris fourniront non seulement des informations clés sur les mécanismes pathogènes de la maladie COVID-19 chez les malades atteints de maladies cardiovasculaires et d'hypertension, mais pourront également servir de plateformes d'évaluation préclinique à haut débit pour identifier des antiviraux et des vaccins performants, essentiels pour les essais humains en aval. Ces modèles seront proposés aux laboratoires académiques et industriels comme modèle d’étude préclinique en vue de mise en place de prestation de service.
Procédures
Les animaux subiront 2 échographies de 10 à 15 minutes, une avant et une après challenge pharmacologique sous anesthésie gazeux pour étudier leurs fonctions cardiaques. Des prélèvements sanguins de 2 minutes seront réalisés à la veine temporale superficielle sur animaux vigiles après chaque echographie. Une implantation de mini pompe sera réalisée sous la peau lors d'un geste chirurgical pour diffuser le traitement pharmacologique, cette procédure peut prendre jusqu'à 20 minutes par animal. Celui-ci sera couplé à l'utilisation d'antalgiques avant, pendant et après l'incision pour éviter toute souffrance aux souris. Après l'envoie des animaux à Marseille, ils subiront une infection au SARS-CoV-2 par injection intra-nasal pour chaque animal, c'est une procédure qui peut prendre jusqu'à 30 min car elle sera couplé à l'utilisation de l'anesthésie et la manipulation dans la plateforme BSL3 dédié à l'utilisation des virus de ce type. A la fin du protocole, le sang et les organes des animaux seront perfusés et prélevés pour réaliser un immunophenotypage complet.
Impact sur les animaux
Les souris subiront des injections intrapéritonéales et des incisions sur la peau pour l'implantation de mini pompes en sous cutanée. Ce traitement induira de l'hypertension artérielle et une insuffisance cardiaque et peut causer des symptômes d'hyperthermie et de gêne respiratoire. Les souris subiront par la suite une infection avec le virus SarsCov2 et des symptômes de la maladie peuvent apparaitre. En fin d'expérimentation et selon les protocoles mis en place, elles peuvent subir une perfusion intracardiaque afin de récupérer des tissus sans globules rouges (poumons, cœur, cerveau) pour réaliser des immunomarquages et visualiser spécifiquement dans la cellule en microscopie optique.
Devenir
Toutes les souris seront transférées en vie à nos partenaires, les souris seront mises à mort après pour prélèvements d'organes et de tissus afin d'étudier le profil de leur système immunitaire.
Remplacement
Outre la production d'un modèle préclinique de souris pour le Sars-CoV-2, nous voulons tester l'impact de la comorbidité cardiovasculaire sur la gravité de la maladie après infection. Ce modèle murin donnera non seulement des informations clés sur la physiopathologie du COVID19 et l'impact de la comorbidité, mais servira également de plateforme d'évaluation préclinique à haut débit pour identifier des antiviraux et des vaccins performants, essentiels pour les essais humains en aval. À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans un procès d’infection de l’initiation au développement de la pathologie et au suivie de la réponse immunitaire. Ces différents arguments soulignent la nécessité de réaliser notre étude in vivo avec des modèles animaux.
Réduction
Dans la mesure du possible les témoins infectés sans traitement seront utilisés pour plusieurs prestations. Cela permettra de diminuer le nombre d'animaux utilisés. Dans ce protocole, nous avons planifié d'utiliser 45 animaux par groupes expérimentaux. En effet, nos études précédentes nous ont montré que l'effectif idéal se situe entre 40 et 50 animaux par groupe expérimental selon la variabilité de la réponse au mélange pharmacologique observée. De ce fait, nous prévoyons un total de 180 animaux (90 souris hétérozygote K18-hACE2 et 90 WT) dans chaque groupe on aura 45 souris mâles et 45 souris femelles, recevant une mini pompe, pour obtenir des conclusions statistiques tout en anticipant une variabilité possible. Les données générées seront analysées par des tests paramétriques (analyse de variance et test de Student).
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe de 5 pour éviter le stress de l’isolement et les cages seront systématiquement enrichies par l’ajout de plusieurs éléments : un dôme en carton pour leur procurer un abri, de la nourriture hydratée dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids et/ou déshydratation durant leur hébergement. Comme notre objectif final est d'étudier la réponse immunitaire, aucun anti-inflammatoire ne pourra être administré aux souris. En effet, ces molécules pourraient interférer avec nos résultats et masquer l’expression des marqueurs d’intérêt. Avant l'expérimentations les souris seront traités avec un morphinique antidouleur et les expérimentations seront réalisée sous anesthésie. Après la mise en place des mini pompes et tout au long de l'expérience, un antalgique sera mis dans l'eau de boisson et les animaux seront observées quotidiennement par le personnel formé et qualifié en charge de l’expérimentation et selon les recommandations vétérinaires. Chaque semaine, les souris seront pesées et évaluées pour constater leur état général et s'assurer qu'aucune dégradation de celui-ci n'est constatée. Si ce cas se présentait, un protocole spécifique et une grille de score serait mis en place avec une surveillance quotidienne approfondie. En cas de perte de poids supérieure à 10% sur une semaine, prostration avec vocalisation, lésion du site d'implantation, hypothermie, et/ou un score à partir de 12 sur la grille de score entrainera une mise à mort immédiate de l'animale.
Choix des espèces
Nous utilisons le modèle souris car il nous offre un accès à de nombreuses lignées génétiquement modifiées et que le système cardiaque peut être étudié et est suffisamment proche de l'humain pour offrir une valeur prédictive dans notre approche translationnelle. Les animaux seront âgés de 9 semaines, afin d'être dans des conditions similaires à notre étude précédente sur le même modèle
Thérapie ciblant le récepteur de haute affinité pour l’immunoglobuline E pour traiter l’asthme allergique chez la souris 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
768 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. On leur induit un asthme par inhalation d'acariens, on leur administre une molécule antisens par voie sous-cutanée ou par inhalation, puis on ouvre leur trachée sous anesthésie pour mesurer leur capacité pulmonaire avant un lavage bronchoalvéolaire. Le projet vise à tester une stratégie ciblant un récepteur de l'immunoglobuline E pour traiter l'asthme allergique. Le porteur indique avoir validé ces molécules in vitro sur des mastocytes, et retient la souris parce que le modèle d'asthme induit par les acariens y est bien décrit.
Objectifs
Les manifestations allergiques, qui peuvent être cutanées (dermatite), respiratoire (asthme), digestives (allergies alimentaires) ou généralisées (anaphylaxie), sont causées par l’activation d’un certain type de cellules appelées « mastocytes » qui relarguent des médiateurs de l’inflammation responsable de ces pathologies. Cette activation du mastocyte nécessite l’agrégation du récepteur récepteur immunitaire allergique. Notre objectif est de tester une nouvelle stratégie thérapeutique qui utilise une petite séquence d’ADN modifiée ciblant ce récepteur pour diminuer son expression et traiter les réactions allergiques. Une fois le mode d’administration et leur modification chimique choisis, l’efficacité de ces molécules sera testée sur un modèle d’asthme allergique induit par les acariens en prophylactique et en thérapeutique. Ce projet sera réalisé dans deux établissements.
Bénéfices attendus
Les allergies touchent actuellement plus de 13% de la population mondiale et 20 à 30% de la population des pays développés. Au cours des trente prochaines années, les allergies devraient toucher jusqu’à quatre milliards de personnes. Au vu de ces chiffres astronomiques, le développement de nouvelles approches thérapeutiques innovantes dont fait partie la stratégie antisens permettra de développer une médecine de précision en diversifiant les modes d’action des médicaments utilisés pour réduire l’inflammation causées par les allergies conduisant à une meilleure prise en charge des patients. Notre stratégie thérapeutique propose de cibler le récepteur des cellules impliquées dans les allergies. Ce travail permettra de comprendre si la stratégie antisens ciblant ce récepteur peut être utilisée pour traiter l’asthme sévère allergique chez la souris constituant une première preuve de concept pour la mise en place de futurs essais cliniques chez l’homme.
Procédures
Les animaux subissent une administration du médicament en sous cutanée (240 souris) ou par inhalation (240 souris) d’une durée de 30 secondes. L’asthme est induit par inhalation d’acariens (288 souris). Un abord et ouverture de la trachée est réalisé pour mesurer la capacité pulmonaire grace à un appareil scientifique sur souris anesthésiées (d’une durée de 20 minutes), suivi d’un lavage bronchoalvéolaire (d’une durée de 50 secondes) (288 souris).
Impact sur les animaux
Les injections du médicament ou des acariens sont réalisées sous anesthésie. Des nuisances suite aux injections peuvent être envisagées entrainant une variation du poids corporel, un changement dans le comportement et/ou une modification de la ventillation.
Devenir
La mise à mort à la fin de la procédure est nécessaire pour réaliser le prélèvement des organes et leurs analyses.
Remplacement
Des approches alternatives ont été réalisées dans la première partie de ce projet. Elles ont consisté à valider in vitro sur des mastocytes primaires murins et humains l’efficacité de ces molécules sur la diminution d’expression du récepteur à la surface cellulaire, la diminution de l’activation mastocytaire suite à l’engagement du récepteur et la diminution de la dégranulation mastocytaire. Afin de comprendre si cette stratégie peut être proposée comme nouvelle stratégie thérapeutique pour traiter l’asthme sévère allergique chez l’homme, il nous faut démontrer son efficaté sur un modèle d’asthme allergique induit par les acariens chez la souris très bien décrit dans la littérature. Cette étude réalisée chez la souris constitue une étude pré-clinique nécessaire à la validation d’une preuve de concept qui pourrait par la suite déboucher sur des essais cliniques chez l’homme. .
Réduction
La première partie de ce projet va nous permettre de comprendre la biodistribution (diffusion et persistance dans l’organisme, effet sur la diminution de l’expression de la cible, immunogénécité des antisens) des 3 stratégies antisens utlilisés suite à une administration cutanée ou par inhalation. Les meilleures combinaisons (mode d’administration et antisens utilisé en fonction de ses modifications chimiques) seront utilisées pour le modèle d’asthme permettant ainsi de réduire le nombre de souris qui seront utilisées dans cette étude.
Raffinement
Toutes les souris incluent dans ces différentes procédures seront suivies quotidiennement par les animaliers pour des signes de souffrance, de toxicités ou de difficultées respiratoires. La surveillance de la perte de poids et le scoring sera fait 2 à 3 fois/semaine par l’expérimentateur. Si au cours de l’expérience une souris atteint un point limite, elle sera mise à mort par dislocation cervicale. Les animaux ne sont pas gardés en isolement. Des groupes de 5 souris sont regroupés dans une cage. Un enrichissement des cages composé de maisonettes en carton et de cotons d’enrichissement est prévu afin de diminuer le stress des animaux. Des seringues adaptées sont utilisées pour les injections sous cutanées et intrapéritonéales pour l’anesthésie. Pour des raisons sanitaires et expérimentales, les animaux seront transférés d'un établissement à un autre après passage à l'IVIS Spectrum. Les animaux seront transférés avec des boites de transport adaptées contenant des croquettes et de l'hydrogel.
Choix des espèces
Les modèles d’asthme induit par les acariens chez la souris sont très bien décrits dans la littérature et miment certains symptômes de la pathologie humaine. L’approche in vivo ne peut donc être considérée que chez la souris. Des femelles de 8 à 10 semaines seront utilisées dans ces protocoles.
Cancer du foie et environnement tumoral – efficacité d’une approche thérapeutique par combinaison d’anticorps dans un modèle de souris
- Recherche appliquée
- Cancers
800 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses sous la peau ou directement dans le foie sous échographie, un traitement par anticorps deux fois par semaine pendant quatre semaines et des échographies répétées sous anesthésie. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer une ulcération cutanée ou des douleurs, et que tous les animaux sont tués pour prélever tumeurs et foies. Il décrit des travaux in vitro et ex vivo déjà menés mais conclut à la nécessité d'une validation sur "animal entier".
Objectifs
Le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules issues de patients par notre anticorps permet d’activer les cellules immunitaires. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer du foie. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire.
Bénéfices attendus
Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologie du foie.
Procédures
Une partie des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses du foie. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Une autre partie des animaux recevra une injection unique de cellules cancéreuses directement dans le foie grâce à un système échographique, réalisée sous anesthésie générale, sans subir de procédure chirurgicale. Cette procédure prend environ 15 minutes à être réaliser. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Certains animaux subiront une échographie de 20-30 minutes, sous anesthésie générale, 2 fois par semaine, afin de suivre la croissance tumorale dans le foie des animaux. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sont très limités. Pour les souris injectées sous la peau, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée. Pour les souris injectées dans le foie, la tumeur peut entrainer une gêne et des douleurs au cas où la tumeur dépasse une certaine taille. De même, les injections répétées intrapéritonéales peuvent parfois engendrer une inflammation, une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.
Réduction
Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement
Amendement projet 2019111322052993 : Développement préclinique chez le souriceau d’une thérapie par ARNm pour la leucinose
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
1 320 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux reçoivent dès la naissance des injections intraveineuses sur animal vigile et des prélèvements d'urine quotidiens, puis des prélèvements de sang à la veine maxillaire, pour tester une thérapie par ARNm contre la leucinose. Le porteur indique qu'un quart des souris, porteuses de la maladie, ont un risque de mort de 50 % dans les trois premiers jours et de 100 % avant deux semaines, et que toutes sont tuées pour analyse des tissus. Il affirme que la démonstration ne peut se faire complètement que dans un "organisme entier".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de développer des stratégies thérapeutiques pour traiter une maladie métabolique rare d’origine génétique, causée par la dysfonction d’une enzyme. La forme classique de cette maladie se caractérise par un coma en période néonatale pouvant conduire au décès en l’absence de traitement en urgence. Il existe également des formes moins sévères, chroniques, sans épisode aigu néonatal sévère et des formes se révélant par des troubles neurologiques lors d’épisodes aigus de stress métabolique (fièvre...). A ce jour, le principal traitement repose sur un régime alimentaire extrêmement strict, limité en protéines. Ce régime est très efficace mais il doit être poursuivi à vie et ne permet pas de prévenir le risque de complications graves, parfois mortelles. Un tel régime altère de façon significative la qualité de vie. Certains patients peuvent bénéficier d’une transplantation hépatique qui certes guérit la maladie, mais demeure associée à un risque propre de rejet et de décès. L’efficacité de la transplantation hépatique dans cette maladie nous a conduit à proposer le projet ici présenté. Notre objectif est de développer une stratégie de traitement de cette maladie métabolique par une approche de thérapie innovante basée sur l’utilisation d’ARN messagers, non-pathogènes, qui ont montré qu’ils pouvaient corriger de manière stable des maladies où d’autres protéines sont manquantes après une seule administration. La spécificité de cette étude est d’étudier l’efficacité à court terme de cette thérapie après injection unique dans des modèles murins de cette maladie métabolique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de faire la preuve de concept de l’efficacité de court terme de cette thérapie innovante chez la souris, ouvrant la voie du développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique chez l’homme.
Procédures
Tous les animaux de cette étude (N = 360 + 960 dans amendement) seront soumis à des injections par voie intraveineuse dans la veine temporale le jour de la naissance sur souris vigile et à des prélèvements d'urine quotidiens la première semaine de vie puis deux fois par semaine. Les animaux de l’étude de survie (N = 90 + 160 dans amendement) seront soumis à des prélèvements de sang au niveau de la veine maxillaire à partir d’une semaine de vie sur souris vigile. Les animaux de l’étude pharmacocinétique (N = 270 + 800 dans amendement) seront soumis à un prélèvement de sang unique au niveau de la veine maxillaire au moment de la mise à mort sur souris vigile. Ces différents actes seront le plus brefs possibles (1 min pour les injections néonatales, 1 min pour les prélèvements d’urine, 1 min pour les prélèvements de sang) et pratiqués par du personnel entrainé.
Impact sur les animaux
Les souris KO malades (25% des souris comptées dans le projet) présentent un phénotype grave : risque de 50% de décès au cours des 3 premiers jours et 100% au cours des 14 premiers jours. Les nuisances que subiront les souris seront : une douleur associée à une injection IV sur souris vigile (injection initiale unique sur souriceau), un stress lié à un prélèvement d’urine sur souris vigile réalisé quotidiennement la première semaine de vie puis deux fois par semaine et une douleur associée à un prélèvement sanguin sur souris vigile, à partir d’une semaine de vie, de façon hebdomadaire pour les souris de l’étude de survie ou au moment de la mise mort pour les souris de l’étude pharmacocinétique.
Devenir
Mise à mort pour analyse des tissus.
Remplacement
Afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux dans ce projet, nos collaborateurs ont déjà testé différentes formulations d’ARNm in vitro. sur des cellules de foie cultivées en laboratoire. Ceci leur a permis de sélectionner des traitements candidats. Cependant la capacité des nanoparticules à franchir les défenses immunitaires ne peut être démontrée complètement que dans un organisme physiologique "entier".
Réduction
Toutefois, la seule utilisation de la souche « malade » pose certains inconvénients : en sachant qu’un animal sur 4 est affecté par cette maladie à la naissance et compte-tenu du nombre de souris nécessaires pour notre projet, le nombre de souris en élevage serait trop important pour répondre à l’ensemble des questions posées. Aussi, dans l’optique de réduire au maximum l’utilisation de ces souris malades, les meilleures formulations sélectionnées in vitro ont été testées par nos collaborateurs dans un organisme physiologique entier, chez des souris saines, afin de sélectionner les plus efficaces et la plus apte à franchir les défenses immunitaires. Le nombre d'animaux nécessaire par lot a été déterminé grâce aux études publiées précédemment développant une approche similaire. Nous étudierons les réponses à nos traitements à la fois pour les mâles et les femelles ce qui permettra de réduire le nombre d’accouplements et aussi le nombre de souris atteintes non utilisées. Afin de déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires à la détection de l’effet de nos traitements, nous avons établi le paramètre le plus important (concentration plasmatique de leucine) et nous avons utilisé un test bilatéral standard de comparaison des moyennes (t-test) afin d’avoir 90% de chance de détecter une diminution des concentrations de leucine dans le plasma de souris traitées avec l’ARNm comparées aux contrôles, avec un risque d’erreur de 1%.
Raffinement
Nous allons utiliser des procédures de raffinement pour éviter la souffrance des souris lors de prélèvements sanguins et pendant l'injection du vecteur thérapeutique. Au moment de l’injection chez les nouveaux-nés ; la mère sera éloignée afin de minimiser son stress. Les souriceaux seront recouverts de sciure de la cage de la mère et replacés rapidement dans la cage. Au niveau expérimental, les quantités minimales de sang et d'urine seront prélevées par du personnel expérimenté en veillant à réaliser les prélèvements sur les zones les moins sensibles possibles. Une surveillance régulière sera mise en place et des points limites adaptés ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l'animal si nécessaire. Les souris seront gardées dans des portoirs ventilées dans lesquels nous ajouterons du coton, une maisonnette et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti en évitant tout isolement prolongé.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal pertinent qui permet de reproduire la maladie humaine avec son phénotype clinique et biochimique sévère. Le modèle souris, facile à produire par comparaison aux autres modèles disponibles (bovins), permet d’étudier les différents organes, types cellulaires et mécanismes de défense immunitaire, pertinents pour notre étude et inaccessibles in vitro. Amendement : Deux modèles murins pertinents et complémentaires de la maladie seront utilisés. Nouveau-nés de 0 à 2 jours de vie car la maladie présente un phénotype très sévère entrainant un décès de la souris dans les 15 premiers jours de vie ; souriceaux et souris adultes jusqu’à 2 mois pour l’étude de survie.
Mise au point de la mesure de la vitesse de conduction nerveuse chez le primate non humain
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
6 macaques à longue queue vont être utilisé·es, gardés en vie pour une réutilisation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit cinq sessions de mesure de la conduction nerveuse sous anesthésie générale, avec insertion d'électrodes et stimulation des nerfs périphériques, espacées d'au moins trois jours. Le projet vise à valider cette mesure chez le primate non-humain pour l'intégrer aux études réglementaires de toxicologie. Le porteur indique que l'évaluation de la toxicité chez une à deux espèces animales reste une exigence réglementaire et retient le primate pour son homologie avec l'humain.
Objectifs
L’objectif du projet est de développer et valider la mesure de la conduction nerveuse chez le primate non humain. Cette méthode permettra l’obtention d’enregistrement fonctionnels de l’activité du système nerveux périphériques dans les études réglementaires d’évaluation de la sécurité des produits pharmaceutiques. La validation permettra de s’assurer que l’appareil d’enregistrement et le test mis en place permettent de mesurer la conduction nerveuse de façon fiable et reproductible chez le primate non-humain avant l’intégration dans les études de toxicologie réglementaire.
Bénéfices attendus
La validation de cette technique permettra d’effectuer la mesure de la conduction nerveuse et ainsi d’évaluer une possible atteinte du système nerveux périphérique lors de la réalisation d’études de toxicologie règlementaire (notamment pour des candidats médicaments appartenant à des classes pour lesquelles des neuropathies ont déjà été mise en évidence chez l’homme ou ayant une indication en lien avec le système nerveux). Cette technique sera aussi utilisé pour l’évaluation du fonctionnement du système nerveux pendant les études réglementaire pour les thérapies innovantes telle que la thérapie génique (pour lesquels les vecteurs employés présentent un tropisme pour le système nerveux) . La surveillance de l’état du système nerveux périphérique par la mesure de la conduction nerveuse lors des études réglementaires permettra une meilleure anticipation des effets adverses pouvant survenir chez l’homme notamment lors des essais cliniques. Cette méthode étant translationnelle, elle pourra aussi être utilisée chez l’homme lors des essais cliniques en se basant sur les résultats obtenus chez l’animal afin de monitorer le développement potentiel de neuropathies. A terme, ce projet contribuera aussi à la réduction du nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques en permettant l’enregistrement de paramètres additionnels (mesure de la conduction nerveuse) chez des animaux déjà inclus dans les études de toxicologie réglementaire au lieu de réaliser des études spécifiquement pour évaluer ce point (étude standalone).
Procédures
Chaque session de mesure de conduction nerveuse sera réalisée sous anesthésie générale. 5 sessions d’enregistrement par animal seront réalisées. Une mise à jeun sera prévu avant chaque anesthésie. Les sessions d’enregistrement seront espacées d’au moins 3 jours.
Impact sur les animaux
La procédure étant réalisée sous anesthésie générale, il n’y pas d’effets négatifs attendus liés à l’insertion d’électrodes et à la stimulation des nerfs périphériques chez l’animal (celle-ci étant réalisée en routine sans anesthésie ou analgésie chez l’homme vigile dans le cadre des examens cliniques d’enregistrement de vitesse de conduction nerveuse). Chez l’animal, les procédures d’enregistrement (durant environ 15 minutes et jusqu’à 45 minutes maximum) se font sur des animaux anesthésiés (afin que ceux-ci soient immobiles et ne ressentent pas l‘introduction des électrodes ni le spasme ou le pincement potentiellement induit par le courant électrique) mis à jeun au minimum 6 heures avant la procédure . La fréquence respiratoire sera monitorée au cours de l’anesthésie. Lors du réveil anesthésique, des pertes d’équilibres et une hypothermie légère peuvent être observée temporairement. En cas d’hypothermie, une prise en charge par lampe chauffante et par air chaud pulsé si nécessaire sera mise en place.
Devenir
Le degré de sévérité de la procédure étant classé à priori comme léger les animaux seront gardés en vie pour une éventuelle réutilisation après une période de repos.
Remplacement
Bien que des alternatives in vitro et in silico à l’usage d’animaux afin d’évaluer la sécurité et la toxicité des candidats médicaments soient en développement, l’évaluation non-clinique de la toxicité des médicaments chez une à deux espèces animales reste une exigence réglementaire en Europe à ce jour car il n’existe pas actuellement d’alternatives qui permettent de déterminer la toxicité de substances suite à une exposition systémique sans le tester dans l’animal. La technique de mesure de la conduction nerveuse doit donc être validée dans les espèces chez lesquelles elle sera par la suite utilisée dans le cadre des études réglementaires.
Réduction
Le nombre d’animaux dans ce projet a été défini sur la base du nombre minimum d’animaux requis pour pouvoir conclure à la validation de la technique. La sensibilité du test de conduction nerveuse a également été prise en compte pour déterminer le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront observés au minimum une fois par jour afin de détecter rapidement tout signe clinique. La procédure d’enregistrement sera réalisée sous anesthésie avec un agent ayant des propriétés analgésique avec une surveillance anesthésique (au minimum fréquence respiratoire et température corporelle de l’animal). Si la température corporelle centrale est en dessous de 36°C, des mesures pour réchauffer l’animal seront prises (mise sous lampe chauffante ; utilisation de cage de réveil avec air chaud pulsé, couverture de l’animal, air chaud compulsé...). Si l’animal ne répond pas aux mesures de réchauffement, l’euthanasie sera considérée. L’anesthésie sera réversée par l’utilisation d’un antagoniste médicamenteux pour faciliter le réveil.
Choix des espèces
De nombreux traitements innovants nécessitent une homologie importante avec l’homme afin d’évaluer les potentiels effets toxiques. Dans ce cas, les études de toxicologie réglementaire doivent être conduites chez le primate non-humain. Or, ces thérapies sont à risque de causer des neuropathies chez l’homme. L’intégration de la mesure de la conduction nerveuse dans les études de toxicologie règlementaire sera donc essentielle pour évaluer ces risques. La technique de mesure de la conduction nerveuse, ayant vocation à être incorporée à des études de toxicologie règlementaire, doit être conduite chez les espèces qui seront utilisées dans ces études. Cette intégration nécessite donc la validation préalable du test de mesure de la conduction nerveuse chez le primate non humain. La validation du test de conduction nerveuse se fera sur jeunes adultes/adultes comme pour les études de toxicologie réglementaire.