Recherche appliquée

744 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans les coussinets des pattes des injections de cellules dendritiques activées, puis une seconde injection dans le flanc, pour mesurer une réponse immunitaire contre des peptides issus du génome silencieux. Le porteur indique que les injections dans les coussinets peuvent provoquer une douleur de plusieurs jours empêchant l'animal de marcher, de boire et de manger normalement. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les flux de cellules entre organes et juge cette étape "indispensable" pour tester le pouvoir immunisant des peptides.

Objectifs

Le système immunitaire dispose de plusieurs possibilités pour identifier et cibler les cellules tumorales. Parmi les cellules du système immunitaire, les lymphocytes T constituent un mécanisme clef pour cibler les cellules tumorales, mais c’est aussi un des mécanismes responsables des dommages dans les maladies auto-immunes. Cette reconnaissance de ses propres cellules (tumorales ou pas) s’effectue par le biais de molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). En effet, ces molécules, exprimées par la plupart des cellules, ont la capacité de capturer et d’exposer des peptides (fragments de protéines), reflétant la composition protéique de la cellule à un moment donné. Dans une situation normale, lorsqu’il s’agit de protéines du « soi », présentes normalement dans la cellule, le système immunitaire les ignore. En revanche, lorsqu’il s’agit de peptides dérivés de virus ou des bactéries (« non-soi »), le système immunitaire est activé, et est alors capable d’éliminer les cellules qui expriment ces peptides du non-soi. L’activation des lymphocytes T est faite par les cellules dendritiques. Ces cellules forment un réseau de cellules « sentinelles » capables de détecter des menaces. Après reconnaissance des menaces pour l’organisme, qu’il s’agisse de pathogènes ou de cellules tumorales, ces cellules peuvent capturer des peptides dérivés de pathogènes ; elles migrent ensuite dans les organes lymphoïdes secondaires où elles initient la réponse immunitaire en présentant ces peptides aux lymphocytes T. Une question majeure restant ouverte est celle de la nature des peptides exprimés par les cellules du « soi » visibles par le système immunitaire pendant les réponses auto-immunitaires ou dans le cadre de la tumeur. L’identification de ces peptides permettrait le développement des thérapies ciblés. Ce que nous voulons tester dans ce projet, c’est l’hypothèse selon laquelle les cellules du « soi » pourraient être vues par le système immunitaire par le biais de peptides dérivés de rétroéléments endogènes, éléments de la partie silencieuse du génome ayant la capacité de se répliquer et de se déplacer au sein du génome entier. L’expression de ces éléments est normalement inhibée, mais dans certaines situations, notamment dans des cellules cancéreuses, ils peuvent être réactivés.

Bénéfices attendus

Il est essentiel de noter que la très grande majorité des cancers développent des mécanismes très efficaces qui inhibent la réponse immunitaire. Les dernières années ont vu l’entrée en clinique des inhibiteurs de checkpoint, molécules utilisées dans le traitement de plusieurs cancers chez l’homme dans le cadre d’une approche appelée immunothérapie. Le développement de ces molécules constitue une avancée majeure dans le traitement de cancers chez l’homme. En effet, elles démontrent une efficacité chez des patients résistants à d’autres types de traitement. Cependant, les inhibiteurs de checkpoint ne fonctionnent que chez 20 à 25% des patients qui sont traités de cette manière. La compréhension des mécanismes expliquant cette efficacité variable fait actuellement l’objet d’efforts considérables de la communauté scientifique. Tout comme l’identification de molécules avec lesquelles les inhibiteurs de checkpoint pourraient être combinés pour augmenter leur efficacité. D’autre part, les traitements pour les maladies auto-immunes sont en général très peu spécifiques et impliquent la suppression plus ou moins généralisée du système immunitaire, ce qui entraîne plusieurs effets indésirables. Tant dans le cas des réponses immunitaires contre le cancer que dans celui des réponses auto-immunes, une question majeure restant ouverte est celle de la nature des peptides exprimés par les cellules du soi (tumoraux ou pas) visibles par le système immunitaire. L’identification de ces peptides permettra le développement des thérapies ciblés, soit contre les cellules cancéreuses, soit pour éviter les réponses auto-immunitaires. Ce projet permettra d’ouvrir de nouvelles pistes pour améliorer l’efficacité des thérapeutiques contre ces deux types de maladies.

Procédures

Pour ce projet, nous injecterons des cellules dendritiques, préalablement activées par une molécule dérivée de la paroi des certaines bactéries : le LipoPolySaccharide ou LPS (qui augmente la capacité des cellules dendritiques à activer les lymphocytes T) et incubées en présence des peptides candidats, dans la plante de pied de souris afin d’étudier leur capacité d’induction des réponses immunitaires in vivo. Les cellules dendritiques activées seront injectées dans chacun des coussinets des pattes arrière (1 ou 2 fois au cours de l’expérience) chez des souris anesthésiées (durée de l’anesthésie : 5 minutes). Les antigènes de soi, comme les peptides que nous allons tester dans ce projet, induisent des réponses immunitaires très faibles. Ces réponses ne sont pas détectables dans le sang de la souris, cependant, les cellules spécifiques seront concentrées dans les ganglions des pattes. Pour obtenir ces ganglions, certaines souris seront mises à mort 7-10 jours après ces injections. Les autres souris seront gardées et injectées 15-20 jours après la première injection avec une solution de peptides ou avec des cellules dendritiques activées par du LPS dans le flanc de la souris vigile (durée du geste inférieure à 10 secondes). 2-3 jours après la deuxième injection, les souris seront mises à mort pour évaluer l’ampleur de la réponse immunitaire contre les peptides après une deuxième immunisation.

Impact sur les animaux

Les injections dans les coussinets plantaires de la souris peuvent induire la douleur pour un temps limité après l’injection. Nous n’attendons pas une induction de l’inflammation dans les coussinets après l’injection des cellules dendritiques activées. Néanmoins, il est possible que les souris aient un peu de douleur pendant quelques jours dans les coussinets, ce qui pourrait les empêcher de marcher et de boire et manger normalement. Les injections dans le flanc de la souris peuvent induire un stress lié à la manipulation et une légère douleur pendant l’injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Ce projet découle de résultats obtenus in vitro et in silico où on a constaté l’expression et la présentation des peptides dérivés de rétroélements endogènes dans des molécules MHC de cellules dendritiques lors de leur activation par LPS. Cependant, le fonctionnement du système immunitaire repose sur des interactions tridimensionnelles et des flux de cellules finement régulés entre organes. De plus, la réponse immunitaire anti-tumorale ainsi que les réponses auto-immunitaires, entraînent la réaction de différentes sous-populations cellulaires qui interagissent entre elles dans des localisations tissulaires spécifiques. C’est pourquoi ces phénomènes ne peuvent être encore aujourd’hui reproduits in vitro. Cette étape est indispensable pour tester la capacité des peptides trouvés à induire des réponses immunitaires aussi bien antitumorales qu’auto-immunes.

Réduction

Le nombre de souris par groupe est de 4 afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. D’après notre expertise, ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives dans des modèles expérimentaux semblables. Un minimum de 2 expériences indépendantes sur des groupes de 4 animaux est réalisé afin d'assurer la robustesse des résultats.

Raffinement

Les injections de cellules dendritiques dans les coussinets de la souris seront réalisées par du personnel entrainé sous anesthésie gazeuse afin de minimiser le stress causé à l’animal. Le volume injecté correspond à un volume réduit (par rapport au volume maximal de recommandations internationales ) afin de diminuer l’inconfort causé à l’animal. Les injections dans les coussinets plantaires de la souris peuvent induire la douleur pour un temps limité après l’injection. Nous examinerons les pattes et la démarche de la souris pour évaluer une possible gêne à la locomotion. En cas de douleur, celle-ci sera prise en charge par des anesthésiques locaux et des aliments gélifiés seront mis à disposition en cas de difficulté de locomotion. Une grille de score permettra d’évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d'atteinte des points-limite, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. D’autre part, la connaissance complète du génome murin nous a permis d’identifier des peptides derivés de rétroélements endogènes par séquençage à haut débit. Les souris seront utilisées à l'âge adulte afin qu’elles aient fini leur croissance et que les résultats ne soient pas affectés par des modifications dues à un âge trop avancé des animaux. Enfin, l'âge adulte permet d'étudier un système immunitaire mature.

4 576 rongeurs, 2 288 souris et 2 288 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour induire une infertilité, une partie des animaux subit une hyperthermie du scrotum par immersion de l'arrière-train dans une eau à 43 °C pendant vingt minutes, jusqu'à quinze fois, sous anesthésies répétées, tandis que d'autres reçoivent de l'acyline, puis tous des candidats médicaments et des prises de sang. Le porteur reconnaît tester des molécules de clients dont il ignore la nature et les effets secondaires, et signale des bagarres entre mâles pouvant les blesser. Il conclut que ces modèles d'infertilité rendent le recours à l'animal "incontournable", aucune méthode in vitro ne reproduisant la production de sperme et son contrôle hormonal.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur des modèles d’infertilité masculine chez le rongeur. L’infertilité masculine joue un rôle très important dans le couple infertile, car environ 30% des problèmes liés à la grossesse correspondent à un facteur masculin. La plupart du temps, l'homme infertile présente une faible qualité séminale, ce qui signifie que son sperme n'a pas la capacité suffisante pour féconder l'ovule. L’azoospermie, caractérisée par une absence totale de spermatozoïdes dans l’éjaculat ou l’oligospermie, caractérisée, quant à elle, par une concentration en spermatozoïdes insuffisante dans le sperme conduisent à une infertilité masculine. Pour mimer une infertilité masculine en jouant sur la spermatogénèse, le modèle d’hyperthermie scrotale est décrit dans la littérature chez la souris. Ce modèle consiste à tremper dans le l’eau chaude la partie basse de l’animal (pattes arrières, queue, scrotum) pour créer une hyperthermie scrotale et ainsi altérer la spermatogénèse. Une administration hormonale sera réalisée afin de réverser l’infertilité et induire une réactivation de la spermatogénèse. L'hypogonadisme, autre pathologie provoquant une infertilité masculine, est défini par une synthèse insuffisante des hormones sexuelles (d'origine testiculaire telle que la testostérone). Pour mimer cette pathologie, l’administration d’acyline est décrite dans la littérature chez le rat.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints d’infertilité.

Procédures

Les animaux du modèle hyperthermie seront anesthésiés et la partie basse de leur corps (pattes arrière, queue et scrotum) sera trempée dans le l’eau chaude à 43°C pendant 20 min, et ce plusieurs fois par semaine (15 fois au maximum en tout). Ils recevront également des traitements de candidats médicaments et d’hormones pour restimuler la spermatogénèse (voie d’administration et fréquence dépendantes de chaque protocole). Les animaux du modèle acyline recevront uniquement des traitements de candidats médicaments et d’hormones (voie d’administration et fréquence dépendantes de chaque protocole). Tous ces animaux pourront également avoir des prélèvements sanguins (en terminal ou prélèvements intermédiaires). De plus, des animaux utilisés uniquement pour des études de pharmacocinétique recevront des administrations de candidats médicament, d’hormones et auront des prélèvements sanguins à des temps précis dépendants du protocole expérimental.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possible, il nous ait, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux liées à ces produits. Toutefois, des manipulations, administrations répétées sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille), un hématome possible selon la voie d’administration. De plus, les animaux vont subir plusieurs anesthésies répétitives pour le modèle d’hyperthermie scrotale (procédure 1) et être en partie immergés dans de l’eau à 43°C. Toutes ces séries successives peuvent provoquer un stress à l’animal, une nuisance physiologique respiratoire ou cardiaque dues aux successions d’anesthésies. De ce fait, une attention particulière des animaux sera observée lors des sessions d’hyperthermie scrotale et pendant les phases d’endormissement et de réveil. Les animaux étant des mâles, des bagarres peuvent facilement intervenir selon la hiérarchie dans les cages, pouvant stresser, voire blesser certains d’entre eux. Les plaies possibles seront désinfectées avec de la vétédine et les animaux seront séparés si nécessaire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de l’infertilité masculine. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. En effet, aucun de ces modèles ne peuvent mimer la fertilité masculine (production de sperme, viabilité des spermatozoïdes) en tenant compte des différents organes intervenants et des différentes hormones pouvant intervenir sur les différents paramètres observés, sachant que le paramètre hormonal est primordial pour cette pathologie. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Le modèle d’infertilité par hyperthermie scrotale se faisant sous anesthésie, cela permet de réduire la douleur et le stress chez l’animal. D’après notre expérience sur les modèles in vivo, un nombre minimum de 8 animaux par groupe est le minimum nécessaire pour avoir des résultats statistiquement différents. Un premier test sur quelques animaux (8 maximum) pourra être réalisé comme « étude pilote » afin d’évaluer la faisabilité technique du modèle (surtout pour l’hyperthermie scrotale et le prélèvement de sperme). De plus, ce premier test pourrait être fait sur des animaux issus d’autres projets et non euthanasiés à la fin, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Ce projet étant nouveau, il nous semble que 3 études par an soit une estimation raisonnable par rapport à nos autres modèles et aux demandes de nos clients.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Après chaque anesthésie, une attention particulière sera apportée lors du réveil de l’animal. Un contrôle de la température de l’eau (utilisation de matériel type bain-marie thermostaté) sera effectué lors de chaque expérimentation. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris ou du rat dans les modèles d’infertilité sont très bien décrits dans la littérature. Chaque modèle peut être extrapolé aux deux espèces. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 7-8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.

100 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des approches anti-inflammatoires sur le cerveau par microscopie à deux photons. Chaque animal subit une chirurgie crânienne de deux heures puis trois séances d'imagerie sous anesthésie, certaines recevant une lésion inflammatoire au cortex, un implant délivrant du dihydrogène ou une stimulation magnétique transcrânienne. Le porteur indique que la stimulation peut causer de petites hémorragies cérébrales, que les chirurgies présentent un risque infectieux et que les souris peuvent aggraver leurs plaies, avant d'être tuées pour les analyses. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro d'un "cerveau complexe vivant" pour ces mécanismes.

Objectifs

Objectif 1 : Analyser les effets anti-inflammatoires du dihydrogène sur la neuro-inflammation. Objectif 2 : Valider un ciblage spécifique sur les sites de neuro-inflammation. Objectif 3 : Analyser les effets de la stimulation magnétique transcrânienne sur le cerveau.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus des projets sont multiples : objectif 1, valider ou pas l'effet du dihydrogène sur la diminution de la neuro-inflammation. La neuro-inflammation est associée a beaucoup de neuropatologies neurodégénératives comme Alzheimer et Parkinson. Pour cette derniere , il a déjà été observé une ameliorations de symptomes chez les rats Parkinsoniens. Objectif 2 ,valider un ciblage spécifique sur les sites de neuro-inflammation. Objectif 3: analyser les effets de la stimulation magnétique transcrânienne sur le cerveau. Ces effets sont à eviter chez l'homme, sauf dans le cas ou nous avons besoin transitoirement du passage d'un médicament.

Procédures

Toutes les souris subiront une chirurgie cérébrale sous anesthésie générale pendant 2 heures. Et, également sous anesthésie générale, 3 séances d'imagerie cérébrale sous microscope précédées d'une injection intra-veineuse d'agent de contraste, durant un maximum de 3 heures. Lors de leur chirurgie, pendant quelques secondes, certaines souris subiront une induction inflammatoire à l'aide d'une aiguille de biopsie à la surface du cortex cérébral. Certaines souris se verront implanter en sous-cutané dans le dos d'un électrolyseur délivrant du dihydrogène (chirurgie implantatoire de quelques minutes sous anesthésie générale). Enfin, quelques souris seront soumises pendant 30 minutes à un champ magnétique en disposant une bobine électrique au-dessus de leur tête.

Impact sur les animaux

Nous pouvons causer des petites hemoragies cérébrales lors de la stimulation magnétique transcrânienne. Les chirurgies présentent un risque infectieux. Les souris peuvent agraver leurs plaies en se blessant.

Devenir

La mise à mort des animaux est necessaire pour faire les analyses immunohistochimiques quantitatives de la neuroinflammation.

Remplacement

Il n'y a pas de remplacement possible avec des modèles in vitro ou in silico. La complexité des reactions neuro-inflammatoires in vivo ne permet pas de les étudier in vitro . Il n'existe pas de modèle in vitro d'un cerveau complexe avec les interactions intercellulaires et cellulaires-vasculaires en place. De ce fait, les mécanismes étudiés dans un cerveau vivant ne peuvent être analysés que dans un organisme complexe vivant.

Réduction

Les animaux sont suivis dans le temps par imagerie pour reduire leur nombre par groupe expérimental. Les nombres d’animaux par groupe ont été fixés en tenant compte d'une part de la complexité de la chirurgie et des implantations et d'autre part de la variabilité inter-individuelle. On utilisera les tests statistiques pour le calcul du nombre d'animaux minimum permettant l'obtention de résultats significatifs.

Raffinement

Le projet est mis en oeuvre en suivant toutes les règlementations en vigueur : animalerie agréée, personnel formé et autorisation de projet validée. Les animaux seront hébergés individuellement dans un environnement enrichi et contrôlé et observés régulièrement afin d'anticiper l'apparition des points limites fixés. La fréquence de surveillance des animaux sera adaptée à la temporalité de l'expérience, impliquant si nécessaire l'arrêt des expérimentations. Si les points limites sont atteints : 1) Perte de poids , Perte de poids 5% > 10%> 20%, score 1/2/3 2) Etat du pelage, de la peau et des yeux, manque de soins / lesions, score 1/2, Grattage/ infection/ Ulcération / inflammation chronique, score 1/2/3/, adminstration d'une crême apaisante. 3) Mobilité anormale: claudication/ inactivité/ prostration , score 1/2/3. 4) Fèces liquides, score 1 5) respiration , anomalies, score 2. Score limit = 3, adminstration d'un antalgique dans le biberon systématique en post-chirurgie. S'il n'y a pas d'amélioration de l'état de la souris en 24h , elle sera sacrifiée sans demande d'autorisation au responsable scientifique du projet. Les différents gestes chirurgicaux et toutes les séances d'imagerie sont réalisés sous anesthésie et analgésie générale et locale. La méthode chirurgicale la moins invasive sera retenue pour le bien-être animal, comprenant la sévérité des suites opératoires. Il y a un traitement antalgique (Carprofène) suite aux chirurgies dans toutes les procédures expérimentales selon les conseils de notre vétérinaire référent. Les animaux pourront être vidéosurveillés en continue si nécessaire (surtout en post-opératoire) grâce à la mise au point d'une caméra infra-rouge. Bien que génétiquement modifiée, le transgène étant transmis de façon systématique et stable, les souris seront identifiées par tatouage sans geste plus invasif.

Choix des espèces

L'espèce animale retenue correspond au modèle le plus pertinent pour la modalité d'imagerie utilisée : la microscopie intra-vitale. De plus, nous avons besoin d'un modèle in vivo qui exprime des cellules immunitaires rendues fluorescentes telles que chez une souris transgénique existante. Nous utilisons les souris adultes (> 6 mois ) pour faire une chirurgie osseuse sur la boîte cranienne. Ces operations ne sont pas possibles sur une souris en croissance pour laquelle la bôite cranienne n'est pas à sa taille definitive.

6 950 souris immunodéprimées vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer des immunothérapies cellulaires associées à d'autres traitements contre le cancer. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales humaines, la thérapie à tester et des injections répétées, avec un suivi de la tumeur au pied à coulisse et par bioluminescence. Le porteur indique que la tumeur peut rendre les souris cachectiques et douloureuses, applique un point limite au volume tumoral, et tue les animaux en fin d'étude, une partie des surnuméraires étant réutilisée pour entraîner les expérimentateurs à leurs gestes. Il affirme que l'étude dans un "organisme vivant complet" reste "indispensable" après les tests in vitro.

Objectifs

L’immunothérapie est une avancée scientifique majeure dans la lutte contre le cancer. Elle utilise les caractéristiques du système immunitaire et de ses lymphocytes T, qui détectent et éliminent les attaques extérieures (microbes, virus, bactérie) ainsi que les cellules tumorales de l’organisme. Or, ces dernières envoient des signaux qui modulent l’activité de ces lymphocytes T les rendant moins efficaces. Les traitements d'immunothérapie visent à favoriser l’infiltration de cellules immunitaires dans les tumeurs afin de lutter contre, et de les aider à contourner les mécanismes de protection pour les détruire. Plusieurs stratégies existent : L’immunothérapie active basée sur le principe de la vaccination stimule les défenses immunitaires du patient pour prévenir les récidives ou traiter les cancers métastatiques. De petites molécules sont utilisées pour cibler directement les voies de signalisation impliquées dans l’activation et la prolifération des cellules immunitaires. L’immunothérapie adoptive consiste à injecter au patient des cellules "éduquées" qui agissent contre les cellules cancéreuses. Des cellules immunitaires sur lesquelles a été ajouté un attribut (type anticorps) ou dont le récepteur a été modifié, vont reconnaitre spécifiquement la cellule tumorale et enclencher sa destruction. L’administration de molécules agissant sur des points de contrôle immunologique : des protéines présentes à la surface des cellules saines de l’organisme qui régulent la réponse immunitaire en freinant ou boostant la stimulation des lymphocytes T. Les tumeurs peuvent exprimer certaines de ces protéines, leur permettant de passer inaperçues vis-à-vis du système immunitaire. Ces approches représentent des succès en clinique, mais certains cancers présentent malgré tout des résistances aux traitement et imposent de poursuivre la recherche et le développement de nouvelles thérapies. L’objectif de ce projet est de sélectionner les modifications des cellules immunitaires permettant de les rendre plus efficaces face à une croissance tumorale puis leur associer un traitement type petite molécule et/ou biologique afin de permettre une régression tumorale. Ces modèles sont développés sur souris immunodéprimées porteuses de tumeurs humaines. Ce projet vise également à identifier des biomarqueurs montrant l’engagement de la cible et de grande importance dans le diagnostic en clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet comporte plusieurs phases, destinées à déterminer les conditions expérimentales optimales puis à effectuer l’évaluation de l’efficacité de nouvelles thérapies combinant des entités chimiques et biologiques ciblant des cellules tumorales injectées soit en sous-cutanée soit en intraveineuse à la souris. Dans un premier temps, il est nécessaire de déterminer la concentration suboptimale de cellules immunitaires modifiées à injecter induisant une régression tumorale. Si besoin, le suivi des biomarqueurs d’activité soit au niveau de la tumeur, soit dans la circulation sanguine soit dans des organes d’intérêts peut être fait. Dans un second temps, nous évaluerons l’activité des cellules immunitaires modifiées sur la régression tumorale en combinaison avec des traitements d’entités biologiques et/ou chimiques. Ces traitements permettent de lever l’inhibition que portent les cellules tumorales sur les cellules immunitaires modifiées et de stimuler ces dernières. Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche en immunothérapie ciblée et personnalisée. En effet, connaissant les caractéristiques des tumeurs, la modification des cellules immunitaires du patient ou d’un sujet sain permet une reconnaissance ciblée de la tumeur et donc de s’affranchir des effets indésirables dus à la non-spécificité des traitements. L’association de ces cellules avec des entités chimiques ou biologiques permet de lever l’inhibition de la tumeur et de booster les cellules immunitaires.

Procédures

Injection en sous cutané ou en intraveineuse des cellules tumorales sur animal vigile (moins de 30 secondes) Injection en intraveineuse des cellules immunitaires modifiées sur animal vigile (moins de 30 secondes) Traitement intra-péritonéal ou per-os d’entité biologique ou chimique (moins de 30 secondes par administration) mesures du volume tumoral par pied à coulisse sur souris vigile (2 à 3 fois par semaine) (moins d’une minute à chaque mesure). Injection en intra-péritonéal de la luciférine, 2 à 3 fois par semaine (moins de 30 secondes par geste) Un maximum de 6 prélèvements de sang sur 24 h peut être envisagé sur animal vigile (moins de 30 secondes par prélèvement).

Impact sur les animaux

La potentielle souffrance peut être liée à la tumeur inoculée (qui peut rendre cachectique) ou à la croissance tumorale, voire à la convergence des deux. Mais compte tenu de la localisation de la greffe en sous-cutanée et des points limites prédéfinis, cette souffrance semble plutôt de nature modérée. Une potentielle source de stress peut également provenir : De la greffe de cellules immunitaire en intraveineuse. La contention d’une durée maximale de 30s peut générer du stress ainsi que l’injection (moins de 10s). De l’injection en intra-péritonéale de la luciférine pour les mesures d’imagerie par bioluminescence : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress ainsi que l’injection (moins de 10s). De l’administration d’entité biologique ou chimique en intra-péritonéal ou Per-os : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress Pour les prélèvements de sang, il est nécessaire de raser les pattes arrière de l’animal. La contention ainsi que le rasage de la patte d’une durée maximale de 30s peut générer du stress. Du prélèvement de sang au niveau de la veine marginale de la patte. La contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress De l’induction de l’anesthésie pour la mesure d’imagerie : l’induction qui est rapide peut générer du stress

Devenir

Les souris greffées en sous cutanée et non incluses surnuméraires ou dont la tumeur n’a pas suffisamment poussé peuvent être réutilisées pour l’entrainement des expérimentateurs à différentes techniques en lien avec ce projet ou d’autres projets (administration sous-cutanée, intra-veineuse, intra-péritonéale, per os, prélèvements de sang, apprentissage des mesures, puçage, etc…). Elles peuvent également être réutilisées dans d’autres études de pharmacologie (pharmacodynamie, pharmacocinétique) ou servir à l’évaluation de la tolérance d’un produit provenant d’une série chimique connue. En revanche, en cas de non-réutilisation possible, elles seront automatiquement euthanasiées. Pour cela le volume tumoral doit respecter les consignes de l'autorisation de projet dédiée à l'entrainement. Les souris incluses dans les études sont euthanasiées si des points limites sont atteints ou en fin d’étude Pour les souris ayant reçu des greffes de cellules tumorales en intraveineuse : les souris non incluses surnuméraires sont euthanasiées. Les souris incluses dans les études sont euthanasiées si des points limites sont atteints ou en fin d’étude.

Remplacement

Aujourd’hui, de plus en plus de tests in silico et in vitro sont mis en place pour caractériser autant que possible les candidats médicaments, de façon à n’investiguer in vivo que les meilleurs candidats issus de ces sélections. Ce projet est mis en œuvre après la validation in vitro des différentes nouvelles entités biologiques et chimiques. L’absence d’efficacité in vitro ne permet pas de justifier l’utilisation d’un modèle animal par conséquent ce projet s’inscrit en dernier lieu dans le processus de recherche d’un candidat médicament. C’est seulement sur la base de ces données que les études d’efficacité antitumorale sont ensuite réalisées : uniquement les candidats les plus prometteurs vont être testés, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Cependant, cette étape chez l’animal reste aujourd’hui encore indispensable : en effet, même avec les limitations inévitablement liées à n’importe quel modèle, c’est dans un organisme vivant complet que l’on peut vraiment étudier les effets pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse. Son comportement dans un système complexe est plus relevant d’un point de vue physiologique.

Réduction

Les conditions et taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester ont été déterminés au préalable dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires avant le début de l’expérimentation. Les cellules immunitaires issues de donneurs sains sont modifiées puis évaluées sur des tests in vitro dit de « killing ». Les cellules immunitaires modifiées sont mises en présence de cellules tumorales selon des ratios définis. Le choix du donneur pour une étude in vivo sera donc fait en fonction des résultats de ce test. Le design expérimental a été revu avec le biostatisticien/pharmacocinéticien afin d’identifier notamment le nombre de groupes et de souris dans chaque groupe et par étude au cas par cas, de façon à tirer des conclusions significatives tout en utilisant le nombre minimal d’animaux nécessaires. En cas d’animaux greffés en sous-cutané surnuméraires après randomisation, une ré-utilisation dans un autre projet peut être envisagé après l’aval de la SBEA (structure chargée du bien-être animal). Les tumeurs sont mesurées au moyen d’un pied à coulisse ou par imagerie optique : 2 techniques non invasives pour l’animal qui permettent un suivi de la tumeur dans le temps et une réduction du nombre d’animaux. Dans la mesure du possible, nous réaliserons au cours d’une même étude : •Un suivi de la croissance tumorale (étude d’efficacité) •L’évaluation de biomarqueur (étude de pharmacodynamie) •L’évaluation de la biodisponibilité des produits testés (pharmacocinétique) Ainsi nous contribuons à diminuer le nombre d’animaux car 3 études peuvent être réalisées en une seule étude.

Raffinement

La progression des tumeurs est mesurée via le pied à coulisse (sous cutanée) ou par bioluminescence (intraveineuse) : 2 techniques non invasives pour l’animal. Dans le cas d’un protocole avec traitement chronique, les tumeurs sont mesurées au moins 2 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais également pour limiter la souffrance et appliquer les points limites si nécessaire. Au-delà de 1500 mm3 (pour les tumeurs greffées en sous-cutanée), une surveillance accrue et une réduction de l’intervalle de temps entre les mesures sont mises en place afin d’anticiper efficacement l’atteinte du point limite attaché au volume tumoral. Pour les études de suivi par imagerie de bioluminescence, la surveillance se fait sur la perte de poids des animaux. Une surveillance accrue sera réalisée si les souris présentent un fort signal de bioluminescence. les doses de produits à administrer à l’animal sont sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) (faisant l’objet d’un autre projet) afin de limiter les risques d’une potentielle toxicité des composés testés. Les souris immunodéprimées seront hébergées et manipulées dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulations strictes appliquées par tout le personnel et intervenants, et ce afin de prévenir tout risque d’infection et/ou contamination. des prélèvements de sang à la veine saphène latérale peuvent être mis en œuvre afin d’obtenir des informations sur des possibles biomarqueurs ou sur le profil d’exposition du composé (évitant ainsi des études de pharmacocinétique dédiées) et pour exploiter au mieux les données d’activité antitumorale. Si des prélèvements répétés sont prévus, le volume maximal prélevé n’excède pas 15% de volume de sang total sur 28 jours. Cette technique de prélèvement, peu invasive et rapide, permet de prélever plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux, tout en respectant les limites de volémie physiologiques. Les souris sont hébergées en groupes sociaux. Un enrichissement de milieu adapté va également permettre de surveiller leur état général par l’observation de leur comportement vis-à-vis de celui-ci.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique: ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat. Le modèle murin est à l’heure actuelle le modèle le plus couramment utilisé pour ce type de recherche en immuno-oncologie Les souris sont utilisées à partir de 6 semaines soit un poids corporel d’environ 18-20g en début d’expérimentation. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments. Afin de ne pas avoir d’interférence avec les signes de vieillissement nous essayerons dans la mesure du possible de ne pas excéder 6 mois d’âge à la fin des études.

1 664 ombles chevaliers vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier les effets d'un toxique issu des particules d'usure de pneu et d'une hausse de température. Les poissons sont exposés dès les premiers stades de vie à la molécule 6PPD-quinone par balnéation, puis filmés par groupes de cinq pour mesurer leur activité et leur vitesse de nage. Le porteur indique attendre une mortalité d'environ 10 % liée à la température et une hausse supplémentaire liée au toxique, et tue tous les individus, ces stades précoces étant jugés les plus sensibles. Il affirme que le modèle poisson n'est "pas remplaçable ni substituable" pour cette question.

Objectifs

Les lacs péri-alpins tiennent une place particulière en raison de leur réserve en eau douce, et des nombreux services écosystémiques rendus. Néanmoins, ces derniers constituent également une zone importante de stockage des micro-plastiques, dont la majorité serait des résidus de pneus dus à un intense trafic routier. Une étude a mis en évidence une forte contamination du lac Léman aux micro-plastiques dont 60% sont des particules de pneus (TWP pour tire wear particles). La connaissance des impacts de ces micro-plastiques sur la faune aquatique reste encore parcellaire, en particulier sur les poissons. Quelques études ont porté sur les produits issus de la dégradation de la gomme des pneus et de ses additifs, dont beaucoup sont toxiques pour les poissons. En effet, les 2/3 des TWP et autres débris déposés sur la route peuvent ruisseler avec la pluie. La molécule 6PPD-quinone (6PPD-Q), dont la source principale dans les milieux aquatiques provient du lessivage des particules de pneus à partir des routes, est connue pour sa forte toxicité pour les organismes piscicoles et sa présence en quantité non négligeable (jusqu’au mg/L) dans l’eau de ruissellement de chaussée. Elle a récemment été identifiée comme responsable du « syndrome de mortalité par ruissellement urbain » chez le saumon coho adulte et semble particulièrement toxique pour les salmonidés. Le mode d'action précis de la 6PPD-Q est toutefois encore inconnu sur les stade embryo-larvaire, même s’il semble être lié à une perturbation de la barrière hémato-encéphalique. Les effets de la 6 PPD-Q sur les premiers stades de vie de ces salmonidés sont encore indéterminés à notre connaissance. Les effets sont connus chez les larves de zebra fish, ou cette molécule n’entraine pas d’augmentation de la mortalité mais à des effets neurotoxiques et entraine de nombreuses malformations cardiaques. A ce titre, nous nous proposons d’explorer les effets de cette molécule sur les premiers stades de vie de l’omble chevalier qui est un salmonidé vivant dans les lacs péri-alpins. De plus, l’omble chevalier est un bon candidat pour ce projet car il possède un temps de vie embryolarvaire long (4-5 mois), connu et maitrisé par le laboratoire. De plus, l’étude de l'impact d'une molécule toxique est classiquement analysée au stade juvénile, stade qui permet plus facilement de mettre en évidence des effets sur la mortalité, le développement, effets tératogènes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise donc à produire des connaissances et un seuil de toxicité des effets de la contamination à la 6PPD-Q durant premiers stades de vie de l’Omble Chevalier, salmonidé vivant dans les lacs peri-alpins dans un contexte de réchauffement climatique.

Procédures

Les animaux feront l’objet de prise vidéos pour l’observation de leur comportement lors des stades d’alimentation exogéne (750 DPF) et juvénile (840 DPF). Ainsi, les animaux seront testés par groupe de 5, ils seront acclimatés durant 2h dans le système expérimental et seront filmés à l’aide d’une webcam connectée à un ordinateur placé hors de la salle de test (afin de ne pas déranger les poissons durant le test) durant 10 minutes. Ces tests permettent d’évaluer différents comportements, tels que l’activité, la vitesse de nage, grâce à un logiciel de suivi vidéo. Ainsi, la prise de vidéo ne devrait impliquer qu’un léger stress du au changement de bac.

Impact sur les animaux

Compte tenu du peu de connaissance de l’impact de la 6PPD-Q sur les poissons non modèle aux stades embryolarvaires, nous pouvons supposer que les effets devraient être modérés car les doses de 6PPD-Q testées sont des doses environnementales. La seule étude à notre connaissance portant sur les premiers stades de vie a été réalisée sur les larves de zebra fish, où peu de mortalité (2.26% de mortalité à 1ng/L et 7.5% de mortalité à 10ng/L) pour les concentrations testées dans ce projet. De plus, pour les animaux incubés à 8,5°C nous pouvons nous attendre, au vue de la littérature, à une hausse de la mortalité de 10%.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation car d’après la littérature, les premiers stades de vie sont les plus sensibles aux molécules toxiques ainsi il sera inutile de poursuivre les expérimentations au-delà des stades de développements cruciaux choisis.

Remplacement

Le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à la problématique posée (règle des 3 R : Remplacement) étant donné le peu de connaissance sur les premiers stades de vie de poisson et en particulier sur les salmonidés qui semble particulièrement sensible à la 6PPDQ. Ainsi, le modèle poisson est pertinent pour cette étude car il n’est pas remplaçable ni substituable.

Réduction

mixtes (GLM). L’effectif de 60 individus par temps de prélèvement est un minimum pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses, mais également pour prendre en compte la variabilité interindividuelle, tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction). 1 440 individus seront utilisés et mis à mort (60 individus prélevés par temps de prélèvement * 2 conditions thermiques) * 6 conditionnements (témoin eau 0ng/l, témoin éthanol 1.5ng/l stade 200 DPF puis eau claire, 1.5ng/l avec balnéation de la 6PPD-Q durant le développement embryo-larvaire, 3ng/l stade 200 DPF puis eau claire ; 3ng/l avec balnéation de la 6PPD-Q durant le stade embryo-larvaire) * 2 stades de développement (740 DPF et 820 DPF) = 1 440 individus. Au total pour l’expérimentation, nous aurons besoins de 1 440 individus pour les mesures morphologiques et comportementales. Nous pouvons prévoir une mortalité maximum au cours de l’expérimentation d’environ 10% dû à la hausse de température durant le développement embryo-larvaire . Ainsi, 1584 (1440+1440*0,1) individus seront utilisés pour l’effet température. Si nous nous basons sur la seule étude de toxicité de la 6 PPD-Q réalisée au stade larvaire sur les larves de zébra fish à nos concentrations nous pouvons nous attendre à avoir de faible hausse de mortalité (2.26% de mortalité à 1ng/L et 7.5% de mortalité à 10ng/L) , les expérimentations sur l’omble chevalier adultes à nos doses ne montrent pas de mortalité , nous pouvons nous attendre à une hausse de 5% en raison de son affinité présumé pour les salmonidés. Ainsi, 1664 (1584+1584*0,05) individus seront utilisés au cours de l’étude

Raffinement

L’eau sera renouvelée au 2/5 (soit 16 L) tous les 2 jours à partir du commencement du nourrissage soit à 700 DPF pour éviter une accumulation de déchets métaboliques, favorable aux pics azotés et à la survenue de pathogènes. Les animaux seront visités au minimum 1 fois par jour durant la semaine et une fois durant les weekends, une surveillance rapprochée sera mise en place en cas de perturbation (hausse de la mortalité, sous-alimentation). De plus, dans chaque bassin, des galets seront installées pour permettre aux alevins de se cacher (règle des 3 R : Raffinement). Un couvercle sera également mis sur les bacs afin d’éviter tout stress dû à la lumière, les stades embryo-larvaire vivant dans des gravières à 50m de fond. Les animaux seront nourris ad libitum pendant toute la durée de l’expérience à partir de 700 DPF.

Choix des espèces

L'omble chevalier est une espèce sentinelle du changement climatique des lacs alpins qui sont concernés par une forte pollution aux particules de pneu (responsable de 60% de molécules plastiques présente dans le lac léman). Ainsi, cette espéce est à la fois exposé aux particules plastiques et à la hausse des températures dans nos lacs alpins et péri-alpins. De plus, les stades embryonaires choisis pour cette étude sont connus pour être plus sensibles aux polluants.