Recherche appliquée

614 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines par voie rétro-orbitale sous anesthésie, puis une chimiothérapie ou un placebo, avant d'être tuées pour prélever moelle osseuse, rate et thymus. L'objectif déclaré est de comprendre les mécanismes de rechute et de chimiorésistance des leucémies aiguës lymphoblastiques T, dont les bénéfices pour les patients restent renvoyés au long terme. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" d'évaluer ces mécanismes dans des modèles vivants et que les cellules leucémiques ne survivent pas assez longtemps in vitro.

Objectifs

Les leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T) sont des hémopathies malignes agressives au pronostic réservé, notamment en cas de rechute. Elles représentent 15 à 30% des leucémies aiguës de l'enfant et de l'adulte. Les polychimiothérapies récentes ont permis d'améliorer le pronostic des leucémies aiguës, cependant 20 à 30% des patients atteints de LAL-T présentent une rechute le plus souvent réfractaire aux thérapeutiques conventionnelles et conduisent au décès des patients dans 60% des cas. Le statut mutationnel de certains gènes semble être un facteur important de ces rechutes résistantes aux thérapies. Les cellules souches leucémiques jouent également un rôle essentiel dans la progression et la rechute des leucémies. Par leur propriété d'auto-renouvellement et de quiescence, les LSC sont capables d'échapper à la chimiothérapie de 1è ligne et de régénérer le contingent leucémique, faisant le lit de la rechute. L'étude de ce compartiment cellulaire s'inscrit donc dans la continuité de ce projet, et fait l'objet ici de cet amendement. Identifier les mécanismes à l'origine de la rechute et l'acquisition d'une chimiorésistance est essentiel pour améliorer le pronostic de ces patients. Pour mener à bien ces objectifs il est dès lors indispensable d'évaluer leur impact dans des modèles vivants, seuls garants d'une reproductibilité dans ce contexte de pathologie maligne ou le micro environnement joue un rôle décisif. Dans cette perpsective, la souris immunodéprimée constitue le modèle animal le plus adapté. Par ailleurs, les cellules leucémiques de patients sont fragiles et ne peuvent être maintenues suffisamment longtemps in vitro pour y mener des tests thérapeutiques. Il est en revanche largement décrit dans la littérature scientifique que la souris est un bon modèle d'expansion des cellules leucémiques humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'étendre nos connaissances sur les mécanismes à l'origine de la rechute de LAL-T et comprendre les altérations moléculaires responsables de l'acquisition d'une chimiorésistance. A terme, ce projet contribuera à la mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques afin d'améliorer les chances de guérison des patients atteints de LAL-T.

Procédures

1/ Injection de cellules leucémiques ou pré-leucémiques par voie rétro-orbitale après anesthésie générale (temps estimé < 10min par souris). Surveillance clinique et/ou biologique au moins bi-hebdomadaire et adaptée à l'état clinique des souris. 2/ Traitement des souris immunodéprimées après prise de greffe par de la chimiothérapie conventionnelle classiquement utilisée dans le cadre du traitement des leucémies aiguës humaines et comparaison avec un groupe recevant un placebo (La durée et fréquence du traitement dépendra de la molécule utilisée : quotidien à hebdomadaire pendant une durée inférieure à 6 semaines).

Impact sur les animaux

Le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet est évalué à 450 souris sur 5 ans. Pour réduire ce nombre, nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique des résultats grâce aux données collectées au cours d'expériences précédentes. Un nombre de 64 souris supplémentaires seront nécessaires pour l'amendement de ce projet, sans extension de sa durée (soit 2 années restantes). Nous serons particulièrement attentifs au bien être des animaux. Afin de réduire au maximum le risque de souffrance, les souris seont traitées dès que le taux d'infiltration sanguin leucémique sera compris entre 2 et 20% (évaluation en cytométrie en flux de façon hebdomataire via un prélèvement mandibulaire). Un tel taux d'infiltration est habituellement atteint entre 4 et 12 semaines post-greffe. Durant les protocoles expérimentaux, un suivi quotidien la première semaine, puis bi-hebdomadaire des animaux sera mis en place afin de surveiller les signes évocateurs d'une douleur. Afin de préserver le bien-être animal, nous détecterons les points limites qui conduiront à leur mise à mort (CF Points limites adaptés détaillés dans les procédures expérimentales). Concernant l'amendement, le temps de prise de greffe attendu dans les souris syngéniques est similaire au modèle de xénogreffe faisant l'objet du projet initial. En revanche, les souris utilisées pour cet amendement sont moins immunodéprimées que les souris initiales et la greffe étant syngénique, le risque potentiel pour l'animal est moins élevé pour les procédures relatives à cet amendement. Par ailleurs, aucune prédisposition à une toxicité particulière de ce modèle pré leucémique pour l'animal n'est attendue dans des conditions d'hébergement. Nous serons particulièrement attentifs au bien-être des animaux et appliqueront les mêmes règles de surveillance et d'éthique que précédemment, avec une surveillance interne quotidienne du personnel de l'animalerie.

Devenir

Mise à mort de l'animal à l'issue de chaque procédure pour récupération des tissus biologiques (moelle osseuse, rate, thymus)

Remplacement

Les expérimentations ayant pour objectifs de déterminer les mécanismes de résistance à la chimiothérapie ne peuvent pas être réalisées in vitro du fait de la forte mortalité des cellules leucémiques et doivent nécessairement être conduits in vivo dans des leucémies xénogreffées et amplifiées chez l'animal. Par ailleurs le modèle des lignées cellulaires n'est pas un reflet exact de la biologie des leucémies aiguës et ne peut donc pas être considéré comme un équivalent moléculaire fiable dans ce contexte. Pour la même raison, dans cet amendement, l'étude de la transformation leucémique de cellules immatures transduites avec un oncogène humain (ici TLX3) ne peut être réalisé in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de ce projet est évalué à 450 souris sur 5 ans. Pour réduire ce nombre, nous avons estimé (par test paramétrique) la taille des échantillons permettant une analyse statistique des résultats grâce aux données collectées au cours d'expériences précédentes. Concernant l'amendement, un nombre de 64 souris RAG2-/-gc-/- supplémentaires seront nécessaires à ce projet, sans extension de sa durée (2 années restantes). Ce nombre a été calculé en prenant en compte une probabilité proche de 100% de prise de greffe (modèle syngénique), afin d'élaborer un nombre suffisant de tumeurs et 1è et 3è génération (8 souris d'une première génération puis 4 souris de seconde génération (par première génération) puis 2 souris de 3è génération (par seconde génération)).

Raffinement

Nous serons particulièrement attentifs au bienêtre des animaux. Les souris immunodéprimées seront élevées dans un environnement répondant à un statut sanitaire de type EOPS ou SOPF et ne présenteront donc pas de phénotype dommageable dans ces conditions. Les cages sont ventilées et enrichies à l'aide de cotons, bout de bois et tunnels, afin de répondre aux besoins des souris (nidification, entretien des dents, jeux). Celles-ci seront également maintenues en communauté (2 à 5 souris par cage), en accord avec leurs besoins sociaux. Nous avons défini des points limites précoces, évaluables à l’aide d’une grille de score que nous avons établie, dans le but de ne pas causer de souffrance animale. Un suivi visuel quotidien des animaux sera mis en place par un personnel qualifié de l'animalerie. La manifestation de tout signe évoquant une douleur définie par les points limites préalablement évoqués sera particulièrement surveillée. Le volume des injections et des prélèvements sera réduit au minimum possible. Afin de limiter la douleur, l'injection des cellules leucémiques se fera sous anesthésie gazeuse par isoflurane (induction 4,5%, entretien 2,5-3%, durée totale d'environ 2 minutes). Le suivi de la leucémie sera réalisé à partir de la 3ème semaine suivant l'injection des cellules leucémiques humaines par des prélèvements sanguins (

Choix des espèces

Les modèles de xénogreffe de leucémies chez la souris sont connus et bien décrits dans la littérature scientifique, ce qui permet de nous assurer une efficacité maximale dans la réalisation de ce projet. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes, âgées entre 7 et 15 semaines. C'est la fenêtre d'injection qui premet d'avoir un taux idéal de greffe d'après les données de la littérature, en permettant de réaliser la procédure d'injection dans de bonnes conditions. Ce modèle de xénogreffe est particulièrement applicable à notre étude, car il permet de récapituler l'éventail des signes cliniques de la maladie et de modéliser sa progression.

1500 souris et 450 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des administrations répétées de composés chimiques ou biologiques par diverses voies, avec des prélèvements sanguins pouvant atteindre 20 % du volume circulant et jusqu'à une vingtaine d'interventions par semaine, pour évaluer la toxicité de candidats médicaments sur des rongeurs génétiquement modifiés au niveau du système immunitaire. Le porteur indique que les effets attendus vont de la perte de poids aux atteintes rénales, hépatiques ou immunitaires liées à la souche et au produit testé. Il affirme que ces études réglementaires "nécessitent encore" l'animal et ne peuvent pas être réalisées in vitro.

Objectifs

Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier, en recherchant/vérifiant les homologies avec l'homme (par exemple vérification de la liaison du candidat médicament à sa cible pharmacologique dans cette espèce). Ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé, de bien choisir les doses dans les premières études règlementaires, et peuvent également être des études règlementaires. Elles peuvent permettre de comprendre grâce à des investigations perfectionnées les mécanismes de toxicité (toxicité rénale, hépatique, testiculaire...) ou les profils d’immunotoxicité, afin d'établir la pertinence de ces effets observés chez le rongeur en comparaison avec l'humain, avec pour objectif d'assurer la santé des patients humains. Elles permettent également de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans une espèce rongeur. L'efficacité d'un composé peut également être testée sur un modèle pathologique ou un animal transgénique, ici des animaux génétiquement altérés au niveau du système immunitaire. Il est attendu d'utiliser en moyenne 30 rats ou 50 souris par étude et de réaliser jusqu'à 15 études rat et 30 études souris sur la durée du projet (soit environ 3 études rat/an et 6 études souris/an).

Bénéfices attendus

Le développement de composés pharmaceutiques ou chimiques requiert des explorations in vivo chez le rongeur ainsi que des études réglementaires à proprement parler. Ces études peuvent être demandées par les autorités réglementaires, pour affiner ou mettre en place des conditions expérimentales, ou pour répondre à des questions de sécurité, ou pour explorer les mécanismes d’action. Ces études peuvent donc servir à affiner les expériences en amont des études réglementaires qui devront être réalisées par la suite, en permettant de limiter le nombre global d'animaux utilisés dans le développement d'un produit. Elles peuvent aussi directement contribuer à assurer la sécurité non-clinique des médicaments en comprenant mieux leurs mécanismes.

Procédures

Les animaux sont traités, par différentes voies (principalement orale et injection intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse) de façon journalière ou hebdomadaire (ex : composés biologiques), avec le produit d’intérêt. La durée des administrations est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 30 minutes maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses chez le rat. La durée des études peut être courte (un jour) ou longue [en général de 1, 3 ou 6 mois pour les études règlementaires].. Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur : -Prélèvements multiples: -jusqu’ à 7,5% du sang total circulant peut être prélevé en 24h sans récupération - jusqu’ à 10% du sang total circulant peut être prélevé en 24h avec 7 jours de récupération - jusqu’ à 15% du sang total circulant peut être prélevé en 24h avec 2 semaines de récupération - jusqu’ à 20% du sang total circulant peut être prélevé en 24h avec 3 semaines de récupération -Prélèvement unique: maximum 15% du volume sanguin circulant Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min).. Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse, n’excédant pas 18h est aussi possible.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent : - au phénotype dommageable de la souche utilisée (ex : sensibilité aux infections opportunistes...) ; - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), à l’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée) ; - aux effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) qui peuvent être observés.

Devenir

Les études de toxicologie incluent souvent une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus. De plus, les animaux ayant un phénotype dommageable pendant les études ou bien se développant avec l’âge, aucun animal ne sera gardé à l’issue de ces études.

Remplacement

L’évaluation de la toxicité de candidats médicaments selon les règlementations en vigueur nécessite encore l’utilisation d’animaux, et ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro. Il n’existe pas encore de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité des organismes vivants, et en particulier des réponses immunitaires. De plus, certaines études ne peuvent pas être réalisées dans des souches sauvages ou transgéniques à phénotype non- dommageable qui ne sont pas adaptées à la recherche de mécanismes d’action ou d’un effet toxique spécifique (ex : immunotoxicité…). Un animal transgénique ou exprimant certaines caractéristiques ou déficiences dans le système immunitaire représente parfois un meilleur modèle pour l’évaluation d’un produit.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude: un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses de toxico-/pharmacocinétique ou pharmacodynamie, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, nombre de doses testées, criblage de plusieurs produits, etc. Pour les études à objectif règlementaire, le nombre d’animaux est précisé dans les lignes directrices correspondantes. En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel et consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés...) et que la douleur ne peut pas être suffisamment limitée à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Prélèvements sanguins : Des techniques de prélèvement (ex : veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire...) sont utilisées quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements peuvent être réalisés sous anesthésie pour éviter stress, douleur ou inconfort, comme par exemple les administrations intramusculaire, intra-articulaire ou intra-vésicale Les animaux sont hébergés conformément à la Directive 2010/63 avec enrichissements. En général l’hébergement est groupé mais peut être individuel si un protocole expérimental particulier le requiert ou si des problèmes de comportements antisociaux sont anticipés chez certains animaux (notamment les souris mâles âgées de plus de 6 semaines); dans ce cas, ce choix devra être dûment argumenté. Des portoirs ventilés pourront être utilisés selon le phénotype dommageable, le cas échéant après avis du vétérinaire sanitaire.

Choix des espèces

Le choix du rongeur est justifié par : - les objectifs de l’étude : disponibilité d’un modèle de maladie, rongeurs utilisés pour d’autres études précliniques, présence du récepteur pour le composé, données de pharmacocinétique, pharmacodynamie, modèle de déficience dans un gène ou d’un mécanisme d’intérêt, - la comparaison possible avec d’autres études dans ces espèces, - la quantité de données disponibles sur la souche, - des aspects pratiques de manipulation, - sa place dans la phylogénie (l'utilisation de rongeurs sera privilégiée, en première intention, plutôt que celle du chien, du porc ou du primate). Les animaux ont en général 6 à 8 semaines d’âge en début de traitement, correspondant à un âge de croissance, selon les recommandations générales de la règlementation. L’âge peut varier en fonction des objectifs de l’étude (par exemple animaux juvéniles de moins de 6 semaines, matures de plus de 8 semaines, âgés...).

321 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation cérébrale sous anesthésie puis des administrations intranasales et des tests de mémoire et de locomotion sur six mois, pour évaluer des vésicules issues de cellules souches contre les troubles cognitifs de la radiothérapie. Le porteur indique que l'irradiation peut provoquer des difficultés à se déplacer et un amaigrissement, et l'administration nasale un écoulement et une tête penchée. Il présente ce modèle comme le plus utilisé en préclinique et renvoie les bénéfices pour les patients à une thérapie future.

Objectifs

La radiothérapie dans le traitement des tumeurs cérébrales peut conduire à la mort de cellules non tumorales comme les cellules des vaisseaux sanguins et les neurones. En effet, 50% à 90% des patients traités par radiothérapie pour des tumeurs du cerveau présentent dans les 6 mois après traitement des troubles neurologiques avec des troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes. De nouveaux traitements permettraient d’améliorer leur qualité de vie. Dans ce projet, nous allons évaluer l’efficacité thérapeutique des vésicules extracellulaires issues de cellules souches mésenchymateuses pour limiter les impacts de la radiothérapie. Les cellules souches mésenchymateuses sont un type de cellules souches très utilisé en médecine dite régénérative. Elles ont la capacité de se renouveler pour créer des cellules spécialisées capable de réparer la fonction d’un organe. Elles sont prélevées chez une personne à partir de la moelle osseuse ou de la graisse corporelle. Elles sont mises en culture puis administrées à l’Homme. Cependant, cette stratégie thérapeutique cellulaire a ses limites telles que la transplantation autologue (prélèvement et administration chez la même personne) des cellules souches mésenchymateuses. Cette technique limite le nombre de patients pris en charge en raison du temps nécessaire à la mise en culture des cellules souches mésenchymateuses. On note surtout une efficacité diminuée en fonction de l’âge et de facteurs de risques associés (hypertension, cholestérol). Les cellules peuvent être aussi inutilisables si elles ont été irradiées lors du traitement par radiothérapie. Des études ont démontré que l’effet thérapeutique des cellules souches mésenchymateuses serait majoritairement lié à des vésicules extracellulaires qu’elles sécrètent. Elles sont produites en grand nombre par les cellules souches mésenchymateuses suite à leur activation par des facteurs stimulants. Une production de vésicules extracellulaires in vitro permet de s’affranchir des limites liées à l’utilisation des cellules souches mésenchymateuses via le patient. Les vésicules extracellulaires sont stockées et conservées sous forme lyophilisée simplifiant leur administration. Les vésicules extracellulaires seront injectés par voie non-invasive intra-nasale et permettront de limiter la destruction des vaisseaux sanguins (qui est observée après exposition aux rayonnements ionisants) et pourraient donc limiter le développement des troubles cognitifs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices que ce projet pourrait apporter sont multiples tels que : - une nouvelle thérapie non-invasive (administration intranasale) - une réduction des troubles cognitifs (troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes) - une amélioration de la qualité de vie des patients vis-à-vis des troubles cognitifs

Procédures

- Irradiation cérébrale sous anesthésie générale : 10 min - Administration intranasale sous anesthésie générale : environ 5 min par administration - Tests comportementaux sur animal vigile (un test par jour pour une durée de 10 et 5 min pr évaluer la mémoire, 3 min pour évaluer la locomotion) réalisés 4 fois sur une période de 6 mois - Analyse échodoppler sous anesthésie générale : 10 min. - Prélèvement sanguin 1 fois sous anesthésie générale avant la mise à mort : 15 secondes. - Perfusion intracardiaque sous anesthésie générale : 15 minutes

Impact sur les animaux

Pour les irradiations, les animaux étant anesthésiés pour limiter les mouvements, il peut y avoir un effet des anesthésies répétées et les effets potentiels de l’anesthésie sur les variables physiologiques telles que l’hypothermie, l’hypotension, l’hypoxie. Pour les administrations, même si les animaux sont légèrement anesthésiés, il est possible de noter un inconfort transitoire après l’administration. Pour les transports, il peut être noté un stress chez les animaux suite aux changements des conditions environnantes. Après irradiation, un animal peut développer des difficultés à se déplacer et/ou une apparence extérieure piloérection, dos rond ou amaigri Après injection intranasale, les effets indésirables peuvent être un écoulement nasal important et/ou une tête penchée, difficultés à se déplacer, amaigrissement Le transport des animaux peut également conduire à du stress et de l’angoisse conduisant à un amaigrissement

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de réaliser les prélèvements des structures cérébrales.

Remplacement

Le nouveau développement de stratégie thérapeutique doit être validé sur des modèles précliniques (modèles animaux). De plus, les modèles in vitro (culture isolée de cellules en boîte de pétri) ne permettent pas d’évaluer le réseau vasculaire ni les troubles cognitifs. Par conséquent l’utilisation d’un modèle murin est indispensable pour valider notre approche thérapeutique.

Réduction

Les modèles d’expérimentation animale présentent une certaine variabilité de réponse. De plus le retour d’expérience des médecins, chercheurs et biostatisticiens déterminent qu’un nombre de 12 ou 15 animaux dans chaque groupe expérimental est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement robustes afin de valider notre nouvelle thérapie.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés minium 7 jours avant le début des manips. Les animaux seront hébergés par groupe de 4 animaux par cage, des maisons, du coton et du carton seront présents dans chaque cage. Les cages de transports seront autoclavées et des lingettes de produit désinfectant seront utilisées pour éviter la contamination des animaux. Le modèle murin d’irradiation cérébrale (15Gy, dose unique, collimateur variable, sarrp) étant un nouveau modèle développé et utilisé, nous n’avons pas de retour précis concernant les nuisances attendues. Cependant, les animaux seront observés quotidiennement sur leur comportement, leur aspect extérieur et pesés de façon hebdomadaire pendant toute la durée des expérimentations. Après irradiation, si un animal présente des difficultés à se déplacer et/ou une apparence extérieure piloérection, dos rond ou amaigri (pesée hebdomadaire) : des croquettes humidifiées ou du gel de transport seront déposés dans la cage. Transport: des frisottis et du gel de transport sont ajoutés dans les cages de transport des animaux si un animal montre des signes de souffrances (locomotion, isolement, apparence) lié au stress du transport, il sera euthanasié par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Le modèle murin (15Gy, dose unique, collimateur variable, sarrp) sélectionné pour ce travail est le plus pertinent puisqu’il est le plus utilisé dans les études précliniques. De plus, il a déjà été démontré après irradiation localisée du membre inférieur gauche que l’injection d’EV-CSM au niveau musculaire améliorait le processus de néovascularisation et la cicatrisation cutanée. Enfin, nous maîtrisons, chez la souris, les techniques et les équipements afin d’évaluer les paramètres vasculaires, inflammatoires (anticorps) et cognitifs indispensable pour démontrer l’efficacité de notre traitement. Le modèle murin permet de diminuer la quantité de CSM ou VE-CSM injectés en intranasal et réduire les couts expérimentaux. Les animaux seront utilisés entre 8/12 semaines, correspondant au stade adulte. Ce stade a été choisi afin d’éviter une hétérogénéité liée à l’âge qui pourrait modifier les paramètres étudiés.

50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quarante sont dystrophiques et dix sont des témoins, et toutes subissent des injections intraveineuses en contention vigile, des mesures de fonction cardiaque, des électromyogrammes et des mesures de force musculaire sous anesthésie, pour tester une molécule associée à une restauration de la dystrophine dans la myopathie de Duchenne. Le porteur affirme que le modèle murin est "indispensable", les modèles in vitro ne rendant pas compte selon lui de la dégénérescence progressive. Les bénéfices pour les patients sont renvoyés au long terme, en complément d'outils de thérapie génique en développement.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique à transmission récessive liée au chromosome X due à l’absence de la protéine dystrophine. Cette maladie entraîne une dégénérescence de l’ensemble des muscles (squelettique, cardiaque ou lisse), une inflammation, de la fibrose et une perte de masse et de force musculaire. Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique prometteuses sont en cours d’évaluation dans des essais cliniques. Parmi les approches de thérapie génique, la restauration de la protéine dystrophine est la plus prometteuse. Néanmoins, nous savons aujourd’hui que la restauration de dystrophine devra s’accompagner d’une stratégie permettant un meilleur maintien de l’intégrité musculaire. En effet, chez les patients DMD, les fibres dépourvues de dystrophine se cassent et dégénèrent. La force musculaire diminue et le tissu musculaire laisse la place aux tissus conjonctif et graisseux. Les stratégies thérapeutiques sont confrontées à des limites comme la dégénerescence des fibres musculaires dystrophiques et la perte du bénéfice thérapeutique. Dans cette optique, notre molécule représente un bon candidat car il a déjà été prouvé que ce traitement renforce l'intégrité musculaire. Nous proposons donc une thérapie combinée associant la restauration de dystrophine et notre molécule afin de maintenir un environnement musculaire plus propice à la réexpression de la dystrophine.

Bénéfices attendus

Nous attendons comme bénéfices à court terme, chez les souris dystrophiques, une amélioration du phénotype dystrophique lorsque les souris sont traitées avec la combinaison molécule d’intérêt et restauration de dystrophine comparé au traitement restauration de dystrophine seul. A long terme, nous projetons d’utiliser cette molécule comme traitement utilisable chez le patient atteint dystrophie musculaire de Duchenne en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d'interventions: - Injection intra veineuse (1 minute) (sans anesthésie) dans le laboratoire collaborateur. Prélèvements de sang (20 secondes) (1 fois en fin de procédure pour chaque animal) (avec anesthésie). Les animaux seront soumis à des mesures fonctionnelles : -Mesures de composition corporelle (2 minutes) (1 fois) (sans anesthésie). Evaluation de la fonction cardiaque (échocardiographie) (10 minutes) (1 fois) (avec anesthésie). Electromyogrammes (20 minutes) (1 fois) (avec anesthésie et analgésie). Mesures de contractilité musculaire (20 minutes) (1 fois) (avec anesthésie)

Impact sur les animaux

Lors de l’injection en intraveineuse par voie caudale, l’animal vigile placé dans un appareil à contention prévu à cet effet, ressentira un stress et une douleur/inconfort équivalent ou supérieur à l'introduction d'une aiguille. Lors du transport entre les deux laboratoires et à l’arrivée dans leur nouvel environnement, les animaux pourront subir un stress dû aux mouvements des cages de transport, lorsqu'ils seront transférés dans leur nouvelle cage, pendant les premiers jours après leur arrivée et si l’alimentation n’est pas identique. Lors des mesures de composition corporelle, l’animal subit un stress pendant l’immobilisation de 2 minutes dans le cylindre de contention. Au cours des procédures d’évaluation de la fonction cardiaque et des procédures de mesure de force, les animaux subissent un stress au moment de la contention et lors de l’administration de l’anesthésie (gazeuse ou piqure en intrapéritonéal).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour le maintien de l’intégrité musculaire dans le muscle dystrophique. L’utilisation d’un modèle murin de la dystrophie musculaire de Duchenne est indispensable car les modèles in vitro ne peuvent rendent compte de la dégénerescence progressive observée au cours de cette maladie. Ce modèle dystrophique est celui qui est signalé dans les directives pour l'étude de la dystrophie musculaire de Duchenne car il s’agit du modèle le plus approprié car bien caractérisé. La finalité de cette étude est de développer des stratégies thérapeutiques, ce qui ne peut se faire que sur un modèle animal. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.

Réduction

Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité. Pour tous les groupes expérimentaux et toutes les méthodes d'analyse, 5 à 10 animaux est le nombre d'échantillons nécessaire pour obtenir une analyse statistique fiable. Néanmoins, considérant une forte hétérogénéité chez les souris dystrophiques, des groupes de 10 souris par condition seront nécessaires pour permettre une analyse statistique fiable, pour éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo puisse empêcher la bonne exploitation des résultats. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et pour éviter de les répéter. De plus tous les muscles et une majorité des organes de la souris seront prélevés. Au total, nous prévoyons d'utiliser 40 souris dystrophiques et 10 souris contrôle. La taille des effectifs sera été établie grâce à un calcul de puissance et nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats

Raffinement

Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Elles consistent en un contrôle quotidien des cages, un changement régulier, un nombre réduit d’animaux par cage et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de laine de bois afin que les souris puissent faire un nid ainsi que de lanières de papier Kraft et des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage. Pour limiter la souffrance et l'angoisse, les procédures qui le nécessiteront seront réalisées sous anesthésie et sous analgésiques. Au cours des différentes procédures, la température des souris est maintenue constante à l’aide d’une plate-forme chauffante ou sous lampe radiante. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Nous mettrons en place des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum. Nous procèderons à l'euthanasie compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour la caractérisation de l’homéostasie musculaire. Cette espèce permet de combiner les études moléculaires et fonctionnelles du muscle squelettique. Le modèle de souris dystrophique utilisé dans ce projet combinent l’avantage du modèle murin dystrophique et l’avantage d’avoir les mitochondries marquées, ce qui sera très utilie pour mener à bien notre projet. Nous utiliserons des animaux âgés de 4 semaines en début de procédure et de 16 semaines en fin de procédure. L’intérêt est de traiter les animaux à un stade précoce de la maladie dès la fin du sevrage. Le démarrage du traitement dès que possible à 4 semaines permettra d’évaluer la capacité de notre molécule à ralentir la progression de la maladie.

Ce projet doit fournir aux organismes de sélection ovine des indicateurs de l'efficacité alimentaire et des émissions de méthane des agneaux, pour orienter la sélection de l'élevage ovin allaitant. 1 000 jeunes moutons de race Romane vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis rendus à ce que le porteur appelle leur "carrière de production". Sans anesthésie ni sédation, chacun subit une prise de sang à la jugulaire, un prélèvement de fèces à la main dans le rectum et l'aspiration d'environ 40 mL de liquide du rumen par une sonde de 12 mm de diamètre et d'un mètre de long descendue par la bouche, deux fois pour les mâles et une fois pour les femelles. Le régime 100 % concentré peut en outre les exposer à une acidose du rumen. Le porteur conclut que l'usage des agneaux "ne peut donc être évité", et vise une sélection qui limite l'impact environnemental de l'élevage tout en maintenant "la rentabilité économique pour les éleveurs".

Objectifs

Notre projet a pour objectif d’identifier des prédicteurs de l’impact environnemental de l’élevage d’ovins allaitants. Les impacts seront étudiés sous l’angle de l’ingestion (aliments et eau) et des émissions de gaz à effet de serre. Nous utilisons des agneaux mâles et femelles de race Romane, descendants de béliers sélectionnés pour valoriser efficacement (ou peu efficacement) ce qu’ils ingèrent, une valorisation efficace signifiant que les individus ingèrent moins que les autres tout en ayant le même niveau de production. Le projet portera sur l’étude des 5ème et 6ème génération de sélection. Après 4 générations de sélection, la divergence est bien marquée : les agneaux issus de béliers efficaces ingèrent 10% de moins de concentré que les agneaux issus de béliers peu efficaces, tout en ayant des performances de croissance identiques. Ces différences sont très réduites bien que significatives, avec un régime plus riche en fourrages. La connaissance des émissions de gaz à effet de serre dans chacune des lignées et sous deux régimes différents nous renseignera sur les liens génétiques entre l’efficacité alimentaire et l’impact environnemental. Chaque année, une centaine d’agneaux de chacun des deux sexes (50% issus de béliers efficaces et 50% issus de béliers peu efficaces) seront mesurés pour leurs émissions de gaz et leurs ingestions d’aliments et d’eau. Les différents outils de mesures reposent sur l’identification électronique des animaux qui sont ainsi mesurés tout en étant maintenus dans leurs lots d’élevage. L’impact environnemental sera évalué sous deux régimes alimentaires différents : un régime 100% concentré basse énergie quand les agneaux auront entre 3 et 5 mois d’âge, puis un régime plus riche en fourrages quand les agneaux auront entre 6 et 9 mois d’âge. Enfin, l’enregistrement en routine des émissions de gaz et des quantités ingérées est peu envisageable à grande échelle, à des fins de sélection. Nous rechercherons donc des prédicteurs de ces caractères dans différents tissus/fluides : le plasma sanguin, le fluide ruminal et les fèces. Les prélèvements de chacun de ces fluides seront réalisés au maximum 2 fois dans la vie de chaque animal, à l’issue de chacune des phases d’alimentation, avec un délai de 3 à 4 mois entre les deux prélèvements. Les émissions de gaz à effet de serre sont principalement dues aux fermentations ruminales, donc l’étude du microbiote ruminal sera central dans ce projet en lien avec le microbiote fécal.

Bénéfices attendus

Notre projet propose d’étudier des animaux sélectionnés sur leur efficacité alimentaire et de répondre à la question suivante : des animaux plus efficaces émettent-ils plus de gaz à effet de serre que des animaux moins efficaces ? La sélection sur chacun des caractères pourra alors être différente en fonction des résultats obtenus, de façon à ce que l’impact environnemental de l’élevage ovin soit limité, tout en maintenant la rentabilité économique pour les éleveurs. De plus, l’ensemble des prélèvements sera utilisé pour rechercher des prédicteurs des émissions de méthane, car ces dernières restent encore peu accessibles en élevage conventionnel. Ces prédicteurs pourront être utilisés par les organismes de sélection, pour inclure l’efficacité alimentaire et/ou les émissions de gaz à effet de serre dans leurs programmes de sélection

Procédures

Pour ce protocole, les agneaux mâles auront chacun deux séries de prélèvements, espacées de 3 mois minimum. Les femelles ne seront prélevées qu’un seule fois, après la phase d’alimentation fourragère. Pour ces prélèvements, les animaux ne seront ni anesthésiés ni sédatés. Chaque année, les 200 animaux étudiés seront prélevés. Sur la totalité du projet, ce seront ainsi 1000 animaux qui seront échantillonnés. Ces prélèvements correspondent à une prise de sang à la jugulaire, un prélèvement de fèces au niveau rectal, et un prélèvement de fluide ruminal par sondage gastro-oesophagien. L’ensemble de ces 3 prélèvements est réalisé en moins de 10 minutes, sans isoler l’animal de ses congénères. Chaque mâle aura donc 2 prises de sang, 2 prélèvements de fèces et 2 prélèvements de fluide ruminal. Les prélèvements sont faits à 5 mois et 8 mois d’âge, pour les mâles. Les femelles n’auront qu’une prise de sang, un prélèvement de fèces et un prélèvement de fluide ruminal, lorsqu’elles auront environ 8 mois d’âge. Pour le prélèvement à la jugulaire et le prélèvement rectal, l’animal sera en attente dans un couloir. Un animalier lui soutiendra la tête pendant qu’un autre animalier fera le prélèvement de sang à la jugulaire. Suite à la prise de sang, un baume antiseptique et cicatrisant pourra être appliqué en massage sur les veines. Ensuite, environ 5g de fèces seront prélevés directement dans le rectum par un animalier dont le gant sera enduit de lubrifiant, un second animalier soutenant toujours la tête de l’animal. Enfin, l’animal passera du couloir au restrainer, matériel de contention adapté aux ovins. Celui-ci portera l’animal jusqu’au poste de prélèvement du fluide ruminal. La tête de l’animal sera maintenue par un animalier, pendant qu’un second animalier fera descendre la sonde gastro oesophagienne souple (12 mm de diamètre et 100 cm de longueur) par la bouche jusqu’au rumen. Une fois la sonde placée, la pompe à vide (reliée à l’autre extrémité de la sonde) sera activée et environ 40 mL de fluide ruminal sera prélevé. La pompe sera ensuite éteinte et la sonde retirée avec précaution. L’ensemble de ce prélèvement (de l’introduction de la sonde à son retrait) n’excède pas deux minutes. Un renforcement positif par distribution manuelle de concentré sera réalisé à la fin du prélèvement de fluide ruminal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pendant la première phase de contrôle pourraient être liés à l’alimentation 100% concentrés (à base de céréales) à volonté lors du premier contrôle, avec des risques d’acidification importante du milieu ruminal. L’aliment concentré a été formulé pour respecter des recommandations élevées en fibres et il a été enrichi en bicarbonate, pour prévenir cette acidose ruminale. Les soigneurs sont habitués à l’élevage de ruminants et connaissent ce trouble digestif et ses symptômes. En cas d’acidose aigüe, ils ont à leur disposition des traitements à administrer par voie orale. Ils sont formés à ce geste. Lors des phases d’adaptation prévues dans le projet, les animaux qui auraient du mal à se familiariser avec les automates d’ingestion sont entraînés par les animaliers, avec un renforcement positif par distribution manuelle de concentré. Tout animal qui ne parvient pas à s’adapter aux automates n’est pas conservé pour le protocole. Durant toute la phase d’élevage et d’expérimentation, en cas de signes de maladie (fièvre >40°C, problèmes respiratoires, décubitus prolongé, anorexie, perte de poids…), ou d’impact sur l’état général des animaux, une intervention vétérinaire aura lieu et un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place (l’animal sortira du protocole si nécessaire). En cas de non réponse aux traitements et sur décision vétérinaire, l’animal sera euthanasié.

Devenir

Les agneaux poursuivront leur carrière de production suite à la procédure expérimentale.

Remplacement

Notre projet porte sur l’impact environnemental de la sélection sur l’efficacité alimentaire. Les principales émissions de gaz à effet de serre proviennent de la digestion des fibres dans le rumen, par les ruminants. Ces émissions de gaz poduits dans le rumen ont des origines génétiques et alimentaires complexes. Cette variabilité individuelle ne peut être étudiée en dehors des animaux eux-mêmes. De plus, nous cherchons des prédicteurs biologiques de ces émissions de gaz, donc il est indispensable de prélever des échantillons sur les animaux mesurés afin d’avoir le lien direct entre les mesures et les prédicteurs testés. Le recours à l’animal ne peut donc être évité.

Réduction

Notre projet repose sur le phénotypage de 200 agneaux par an, soit 1000 agneaux sur 5 ans. Ces effectifs ont été calculés pour nous permettre d’observer des différences faibles entre nos deux lignées d’animaux, sur des caractères autres que la consommation résiduelle. Nous avons choisi de travailler sur les deux sexes, afin d’appliquer le modèle de transmissibilité aux caractères que nous étudions. Ce modèles nécessite des trios (parents-descendants) phénotypés à un âge identique entre les générations. L’estimation des paramètres génétiques repose sur l’analyse de nombreux animaux (au moins 700). Les enregistrements issus de ce projet viendront compléter des bases de données issues de projets antérieurs de façon à avoir les effectifs suffisants nous permettant les analyses génétiques des nouveaux caractères.

Raffinement

Durant notre projet, les animaux sont élevés en lots pour exprimer leurs comportements sociaux. Les mesures réalisées reposent sur l’utilisation d’automates que les animaux fréquentent selon leurs besoins. Toutes les données sont gérées en temps réel et intégrées par un logiciel dédié. Le suivi des animaux est quotidien, par cet outil informatique, par des caméras, mais aussi par les nombreux passages des animaliers pour un suivi visuel. Les temps d’occupation des automates sont régulièrement contrôlés pour s’assurer que chaque animal se nourrisse à volonté. Tout animal qui ne parvient pas à s’adapter aux automates n’est pas conservé pour le protocole. Les animaux sont logés sur des aires de copeaux de bois, pour nous assurer qu’ils ne mangent pas leur litière, ce qui fausserait l’étude. Des disques à mordiller seront suspendus dans les parcs. Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge au contact humain, et en particulier à être manipulés. Afin de limiter le stress de contention, les prélèvements sont réalisés par du personnel qualifié à l’aide de matériel de contention adapté aux ovins et auquel les animaux sont habitués. Les prélèvements de fèces, sang et de contenu ruminal se font successivement lors de la même contention, afin de réduire au maximum le temps de contention. Les prélèvements de sang et de fèces sont similaires à ceux qui peuvent être réalisés en élevage classique pour du génotypage, de la prophylaxie ou du diagnostic de parasitisme gastro-intestinal. Pour les prises de sang, les agneaux pouront être tondus au niveau du coup pour faciliter la visualisation de la veine jugulaire. Un baume antiseptique et cicatrisant pourra être appliqué en massage sur les veines. Une attention particulière sera portée aux veines jugulaires pour repérer tout signe éventuel de phlébite. Les prélèvements de contenu ruminal ne sont pas des prélèvements habituels en élevage ovin. Néanmoins, le personnel de l’établissement utilisateur a été formé et pratique ce type de prélèvement depuis plusieurs années. A la fin des prélèvements, une poignée de granulés est donnée à l’animal pour un renforcement positif. Ils font l’objet d’une surveillance visuelle toute particulière au moment des prélèvements et après ceux-ci. Les ingestions et les poids sont encore enregistrés sur les deux jours suivants les prélèvements, pour avoir une indication de leur état de santé.

Choix des espèces

L’étude des émissions de gaz à effets de serre est primordiale pour l’espèce bovine qui en est la principale responsable. Néanmoins, l’espèce ovine présente 2 avantages au sein des ruminants pour l’étude de l’impact environnemental des ruminants : des troupeaux avec de grands effectifs (mêmes conditions d’élevage), une sélection génétique opérationnelle. Le rumen est l’élément central de notre projet, donc l’espèce ovine est toute indiquée pour être support de ce travail. Notre projet porte ainsi sur l’utilisation d’ovins allaitants de race Romane sélectionnés sur leur efficacité alimentaire. Cette efficacité alimentaire est évaluée lors de la phase de croissance dans un premier temps. Les agneaux entrent en halle de phénotypage entre 10 et 12 semaines d’âge, afin de débuter la phase de contrôle autour de 90 jours d’âge, et ont 8 à 9 mois d’âge en fin de projet.

90 souris et 30 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie réutilisée d'une étude à l'autre, le reste tué. Ils reçoivent jusqu'à cinq administrations de composés chimiques ou biologiques par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée, pour déterminer les doses toxiques avant de futurs tests d'efficacité. Le porteur indique que les effets peuvent aller de la perte de poids aux stéréotypies, à la prostration et à la détresse respiratoire, l'atteinte d'un point limite déclenchant la mise à mort. Il affirme que l'étude est "indispensable" et ne peut pas se faire autrement que sur des animaux vivants, les tests in vitro étant jugés insuffisants.

Objectifs

L’objectif du projet est de collecter des données de tolérance et de toxicité pour des nouveaux composés chimiques et biologiques dont la bibliographie est insuffisante ou inexistante. La réalisation de cette étude pour chaque nouveau composé, est indispensable pour connaître les doses à utiliser pour les futures études d’efficacité in vivo sans risquer de tester des doses toxiques.

Bénéfices attendus

La réalisation de cette étude pour chaque nouveau composé, est indispensable pour connaître les doses à utiliser pour les futures études d’efficacité in vivo sans risquer de tester des doses toxiques. Elle permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisés dans la phase de test d’efficacité biologique.

Procédures

Administration de composés par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse, ou sous cutanée ;10 secondes par administration ; maximum 5 administrations / animal.

Impact sur les animaux

Nous cherchons à déterminer si les produits testés induisent de réactions toxiques pour l’animal à certaines doses. Si c’est le cas, ces nuisances s’exprimeront par : - une perte de poids - des modifications du comportement: . des comportements stéréotypés marqués (animal tournant en rond, se cabrant, agressif) . diminution de la mobilité, prostration . diminution de l’alimentation et du toilettage, voire de l’aspect général de l’animal (pelage sale autour face/ région urogénitale, hirsute) - des effets sur l’activité respiratoire

Devenir

Si une autre étude sur un nouveau composé chimique est prévue dans les 3 semaines suivantes, les animaux pourront être réutilisés, et considérés comme en utilisation continue étant donné qu’ils seront utilisés dans les mêmes procédures. Si une autre étude sur un nouveau biologique est prévue dans les 5 semaines suivantes, les animaux pourront être réutilisés. Si aucune étude n’est planifiée, les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude.

Remplacement

Le but de cette étude est de déterminer une activité toxique in vivo et ne peut donc pas être réalisée par d’autres moyens que d’utiliser des animaux vivants. En effet les études de toxicité in vitro sont insuffisantes et un composé peut se révéler toxique chez l’animal à des doses non toxiques in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est basé sur les recommandations OCDE, considéré comme suffisant pour conclure (3 animaux par groupe); moins de 3 animaux par étude serait insuffisant. Un animal pourra être utilisé pour une deuxième étude dans les cas suivants : Si une autre étude sur un nouveau composé chimique est prévue dans les 3 semaines suivantes, les animaux pourront être réutilisés. Si une autre étude sur un nouveau composé biologique est prévue dans les 5 semaines suivantes, les animaux pourront être réutilisés.

Raffinement

Voici la liste des points limités : Perte de poids > 15% Changements majeurs : - Diminution marquée de la motilité - Absence d’alimentation et de toilettage - Prostration - Comportements stéréotypés marqués (tourne en rond, se cabre, agressivité) - Recroquevillé - Effets marqués sur la respiration avec détresse respiratoire - Décoloration et fourrure sale autour de la bouche et de la région urogénitale Pour l’administration par voie Intra péritonéale, surveillance au point d’injection. Si un des points limites est observé, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

L’OCDE recommande d’utiliser des rongeurs pour ce type d’étude. Nous avons choisi les souriscar cela est suffisant dans le cadre de notre projet, les tests d’activité biologique des composés étant réalisés chez la souris. La souris est par ailleurs l'espèce la plus utilisée sur le campus. Nous avons complété cette demande pour le hamster car c'est à priori une autre espèce pour laquelle nous pourrions être sollicité (études SRAS-CoV-2 ou virus de la même famille). Si nous sommes sollicités pour tester des molécules qui vont être étudiées chez d'autres espèces, nous discuterons avec le scientifique de la nécessité de définir la DMT chez cette espèce. Des animaux adultes seront utilisés si les études d’activité biologique seront réalisées chez les adultes ; des jeunes animaux ou des animaux âgés seront utilisés si les études d’activité biologique seront réalisées chez les jeunes ou les animaux âgés respectivement.