Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
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- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
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- Troubles immunitaires
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Évaluation du potentiel thérapeutique d’antagonistes du récepteur NOP de la nociceptine dans des modèles de stress chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Elles subissent un conditionnement de peur par chocs électriques, un confinement avec sons intenses, un jeûne de vingt-quatre heures et jusqu'à quatre injections, développant une anxiété et une hypervigilance pendant les quatre semaines suivantes. L'objectif est de tester si des antagonistes de la nociceptine préviennent les symptômes de stress post-traumatique, une partie des souris étant tuée pour prélever des tissus cérébraux. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur un modèle animal pour étudier ces comportements complexes.
Objectifs
Les troubles du stress post-traumatique se développent chez les individus exposés à un événement traumatisant et altèrent de façon significative la vie personnelle, sociale et/ou professionnelle. A l’heure actuelle le traitement de ces troubles est très insuffisant. Ainsi il est primordial d’identifier de nouvelles cibles pour permettre notamment de prévenir l’apparition de la pathologie dans les populations à risque ou d’empêcher son développement de façon précoce après le trauma. La nociceptine est un neuromédiateur impliqué dans la réponse au stress. Des études antérieures nous ont permis de montrer que le blocage des effets de la nociceptine améliorait les symptomes cognitifs et émotionnels dans des modèles de stress chronique. Des données suggèrent également que cette stratégie pourraient aussi empêcher le développement des symptomes de stress post-traumatique. C'est cette hypothèse que nous souhaitons tester dans ce projet. Les deux objectifs principaux sont donc: 1) Déterminer si le blocage du système nociceptine par des molécules antagonistes empêche le développement des symptômes de type stress post-traumatique dans un modèle souris; 2) Identifier les circuits cérébraux modulés par le système nociceptine lors du stress qui pourraient expliquer ces effets bénéfiques.
Bénéfices attendus
Les études comportementales permettront de valider le potentiel des antagonistes nociceptine pour prévenir le développement ou traiter les symptômes du TSPT dans un modèle préclinique. L'étude des circuits cérébraux associés fournira des données fondamentales sur le mécanisme d’action de cette nouvelle classe de régulateurs de la réponse au stress. Des antagonistes nociceptine sont déjà en développement clinique, notamment pour le traitement de la dépression. S'ils sont positifs, nos résultats fourniront une preuve de concept pour étendre leur utilisation et évaluer leur capacité à soulager les symtômes du TSPT chez l'humain. Ils permettront aussi de savoir si des différences d'effet liées au sexe sont à prévoir.
Procédures
Exposition à 2 stimulations électriques de 2 secondes d'intensité faible à modérée. 1 à 4 injections intra-péritonéales (10 secondes). Confinement dans un compartiment de petite taille et exposition à des sons brefs et intenses pendant environ 15 minutes. Jeûne de 24 heures avant un test comportemental.
Impact sur les animaux
Le conditionnement de peur classique produit un stress aigu chez les animaux au moment des stimulations électriques (2 chocs de 2 secondes) ainsi qu'une anxiété lorsque le son est de nouveau présenté lors des premières séances d'extinction. Le modèle TSPT produit également un stress aigu chez les animaux au moment des stimulations électriques (2 chocs de 2 secondes), une anxiété lorsque le son est de nouveau présenté lors des premières séances d'extinction, ainsi qu'une anxiété et une hypervigilance modérées pendant les 4 semaines qui suivent le conditionnement. Le test de réflexe de sursaut implique un stress modéré associé au confinement dans le compartiment de test. Les animaux recevront aussi de une à quatre injections qui impliquent un stress d'environ 10 secondes.
Devenir
Les animaux seront mis à mort car les procédures auxquelles ils ont été exposés peuvent modifier leur comportement ultérieur. Pour une partie des animaux, des tissus doivent être prélevés pour étudier les circuits cérébraux impliqués dans les comportements observés.
Remplacement
L’objectif du projet étant l’étude de comportements complexes, le conditionnement de peur et les symptômes associés, il est indispensable de travailler sur un modèle animal. Il s’agit de valider une stratégie thérapeutique dans un modèle préclinique.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé sur la base de nos études antérieures et est réduit au minimum nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante et donc des conclusions valides : 16 animaux pour les études comportementales et 10 pour les analyses post-mortem. Afin de limiter le nombre d'animaux, les symptômes d'anxiété et d'hypervigilance seront étudiés sur les mêmes individus en prenant soin de respecter des pauses d'au moins 5 jours entre les tests. Le nombre total d'animaux utilisés pourra être réduit si certaines étapes du projet ne donnent pas de résultats positifs: 1) la deuxième molécule sera testée uniquement dans les conditions pour lesquelles la première aura montré un effet positif, 2) l'étude n'utilisera le modèle TSPT que si celui-ci est validé préalablement, 3) l'activité des neurones ne sera étudiée que dans les conditions pour lesquelles les molécules testées auront montré des effets positifs sur le comportement.
Raffinement
Les souris sont hébergées à 4 dans des cages contenant du matériel de nidification ainsi qu'une buchette pour l'enrichissement. Après réception, un temps d'habituation d'une semaine est respecté avant le début des expériences. Les animaux sont ensuite habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation. Les animaux ayant subi un stress aigu développent un phénotype anxieux mais celui-ci est relativement subtil. Il est révélé lors des différents tests comportementaux mais ne se traduit pas par des symptômes spontanés dans la cage d'hébergement. Les animaux sont cependant suivis de manière quotidienne par du personnel formé au soin. Si une altération de l'état est observée (isolement, baisse du comportement exploratoire, attitude prostrée, expression faciale modifiée, défense à la manipulation), une grille de scoring est utilisée pour déterminer la conduite à tenir en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Les modèles de conditionnement de peur et de TSPT sont bien caractérisés chez la souris et reproduisent une partie des symptômes observés chez l'humain. Le système nociceptine a également été très étudié chez la souris et présente de fortes similitudes avec celui de l'humain. L'objectif de l'étude est d'étudier l'effet des antagonistes NOP chez l’adulte. Les expériences débuteront sur des animaux âgés de 8 semaines dont on considère que le système nerveux est mature.
Utilisation du comportement alimentaire comme indicateur de la performance technique et environnementale des vaches laitières au pâturage
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
28 vaches laitières vont être utilisées, gardées en vie et remises au troupeau à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent sept prises de sang et quatre prélèvements de liquide ruminal par sondage gastro-œsophagien sur douze semaines, ce sondage pouvant irriter l'œsophage. L'objectif est d'utiliser leur comportement alimentaire comme indicateur de performance technique et environnementale au pâturage, notamment des émissions de méthane. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la réponse de l'animal et situe l'étude dans le contexte des "controverses liées à l'élevage bovin".
Objectifs
L’objectif du projet est d’évaluer finement l’impact du comportement alimentaire, tel qu’enregistré par des colliers d’activité du commerce, sur la physiologie digestive (pH et paramètres fermentaires du rumen, digestibilité de l’ingéré, métabolites sanguins…) les performances techniques (production, qualité du lait, efficience alimentaire…) et environnementales (émissions de CH4 entérique…) des vaches laitières au pâturage, en lien avec la biodiversité des prairies. In fine, les résultats pourraient permettre d’utiliser le comportement alimentaire, combiné à d’autres prédicteurs, pour améliorer le phénotypage de l’efficience alimentaire et environnementale des animaux.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d'améliorer la connaissance de l'impact du tri alimentaire sur la physiologie digestive, les performances techniques et les performances environnementales des vaches laitières. Ce travail permettra également d'étudier au pâturage les émissions de méthane entérique, qui ne sont habituellement mesurées qu'en bâtiment, via le développement matériel d'un appareil spécifique. In fine, le comportement pourrait être utilisé comme un proxy permettant de se passer de certaines mesures, qui peuvent parfois être invasives, pour étudier les effets de l'alimentation des vaches laitières au pâturage sur leurs émissions de gaz à effet de serre ou leur efficience alimentaire.
Procédures
Au cours des 12 semaines d'expérimentation, les animaux seront soumis à des prélèvements de sang et de fèces à 7 reprises et à des prélèvements de liquide ruminal à 4 reprises. L'ensemble des prélèvements sur un animal durera moins de 10min (sang/fèces < 5min, liquide ruminal environ 5 min)
Impact sur les animaux
Différents prélèvements sont prévues tout au long de l'expérimentation pour caractériser la réponse physiologique, métabolique et digestive des vaches laitières. Il s'agit notamment de prises de sang, effectuée à la veine caudale, de prélèvements de fèces par fouille rectale et de prélèvements de liquide ruminal par sondage gastro-oesophagien. Ces prélèvements seront réalisés au cornadis et sont susceptibles d'induire de l'inconfort pendant la manipulation, qui sera toutefois effectuée par du personnel compétent et habitué à ces procédures. L'intubation des animaux pour les prélèvements de liquide ruminal est notamment susceptible d'induire une irritation temporaire de l'oesophage
Devenir
Les procédures mises en oeuvre sur les aimaux étant de classe légère, les animaux seront gardés en vie et replacés dans le troupeau à la fin de l'expérimentation.
Remplacement
L'expérimentation porte sur la réponse zootechnique, physiologique et métabolique du comportement alimentaire de vaches laitières en lactation conduites au pâturage. Aucun modèle in vitro ou in sillico ne permet actuellement de reproduire la réponse de l'animal à l'ingestion de différents types de prairies sur l'ensemble de ces composantes et leurs interactions.
Réduction
D'un point de vue statistique, un calcul de puissance sur la base de données acquises dans de précédentes expérimentations portant sur l'impact zootechnique de la biodiversité des prairie ou sur les émissions de méthane entérique a permis de calculer un nombre minimum d'animaux nécessaire pour pouvoir mettre en avant des différences de réponses zootechniques d'une part et en terme d'émissions de méthane entérique. Afin de ne pas remettre en cause la validité statistique des tests prévus, un effectif de minimum 12 vaches par lot est nécessaire. Pour pallier quelque éventuel problème pouvant affecter le nombre d'animaux (impossibilité de réaliser un prélèvement, maladie...) à inclure dans les analyses qui suivront l'expérimentation, nous recruterons deux lots de 14 vaches.
Raffinement
Les conditions de logement des animaux en stabulation répond aux exigences réglementaires et va même au-delà grâce à des équipements pemettant un confort optimum des vaches (matelas, brosses) et un suivi fin de leur santé et de leur bien-être (outils d'élevage de précision). Lors de la saison de pâturage, les animaux seront logés en extrieur, ce qui correspond à leur besoin "normal", tout en leur assurant un confort optimal. Le recours a des procédures faiblement invasives, mises en oeuvre par du personnel formé et habitué à ces prélèvements, assure que ceux-ci se feront dans les meilleures conditions possibles pour les animaux. En cas de souffrance ou de douleur prolongée à l'issue des prélèvements, les animaux concernés recevront un analgésique en vue d'en atténuer l'intensité.
Choix des espèces
Les ruminants, et notamment les bovins, sont les principaux consommateurs d'herbe pâturée. La connaissance des mécanismes digestifs en jeu dans la valorisation de l'herbe par les bovins sont un enjeu important au regard des controverses liés à l'élevage bovins (conditions de logement dans les bâtiment, utilisation de surface hors prairies qui pourraient être destinées à laproduction d'alimentation pour l'homme, rejet de gaz à effet de serre). Les vaches laitières utilisées seront en lactatction, puisqu'une partie des mesures nécessaires sera effectuée dans le lait.
Développement et optimisation de vaccins thérapeutiques anti-tumoraux basés sur des vecteurs lentiviraux
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
6296 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont immunisées avec des candidats vaccins puis reçoivent une injection sous-cutanée de cellules tumorales, la croissance des tumeurs étant suivie plusieurs semaines avant la mise à mort. L'objectif est d'optimiser des vaccins thérapeutiques anticancéreux à base de vecteurs lentiviraux, en vue d'un essai clinique. Le porteur affirme qu'aucun système cellulaire isolé ne peut remplacer l'animal et que les souris ne peuvent être ni réutilisées, ni adoptées après vaccination.
Objectifs
Les cancers sont caractérisés par la prolifération incontrôlée de cellules. Le système immunitaire a un rôle majeur dans le contrôle de cette prolifération et plus particulièrement les lymphocytes T. L’utilisation d’une vaccination thérapeutique avec des vecteur lentiviraux (VL) ayant pour cible des antigènes tumoraux pourrait être particulièrement efficace pour permettre l’activation des lymphocytes T spécifiques de ces antigènes et le contrôle de la prolifération tumorale. L’objectif du projet est d’étudier les mécanismes d’actions des vecteurs lentiviraux afin d’optimiser leur potentiel. Pour cela, l’effet d’une vaccination thérapeutique avec nos vecteurs lentiviraux candidats sur la croissance tumorale et la mise en place de la réponse immune sera étudiée. Les vaccins candidats ayant une activité anti-tumorale seront développés en vue d’un essai clinique chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme sont la preuve du concept d'utilisation des vecteurs lentiviraux dans la vaccination contre le cancer. De fait, les VL génétiquement modifiés se sont révélés sûrs et efficaces comme vaccin contre la Covid-19 et d'autres agents pathologiques. Nous espérons prouver que les vaccins à base de lentivirus pourraient être plus efficaces que les vaccins à base de peptides ou d'ARN messager. Les avantages à long terme sont l'utilisation de ces vaccins en clinique pour guérir les cancers présentant un certain type de mutation.
Procédures
Dans une procédure de sévérité légère, environ 160 souris seront immunisées avec un candidat vaccin (quelques secondes), et euthanasiées au bout de 30 jours afin d'analyser leur réponse immunitaire. Les autres procédures de sévérité moyenne comprennent la vaccination intramusculaire (quelques secondes), l'injection sous-cutanée de cellules tumorales (quelques secondes) et la surveillance de la croissance tumorale pendant 3 à 4 semaines.
Impact sur les animaux
Les souris ressentiront une légère douleur au moment de l'injection intramusculaire du petit volume de vaccin. L'injection de cellules tumorales sera effectuée sous anesthésie. Normalement, la croissance de la tumeur est bien tolérée par les souris, mais peut dans certains cas s’associer à une perte de poids, une perte d'activité normale, en particulier si la tumeur atteint une taille de 1500mm3. La période maximale de nuisance sera de 1 à 2 jours.
Devenir
Les souris présentant des tumeurs seront euthanasiées pour des raisons éthiques (pour éviter les souffrances). Si les souris ne présentent plus de tumeur grâce au traitement, elles seront suivies pendant deux mois, puis seront à nouveau exposées à des cellules tumorales. Même les souris sans tumeur ne peuvent être réutilisées car leur système immunitaire a été modifié par la vaccination. Par conséquent, tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de candidats vaccins destinés à l’homme. Ces études impliquent nécessairement une phase d’expérimentation animale du fait de la complexité de la réponse vaccinale et anti-tumorale au niveau d’un organisme entier. Cette étape constitue une preuve de concept requise par les agences réglementaires de santé en vue d’une application chez l’homme, en complément des études réalisées in vitro. C'est pourquoi aucun système cellulaire isolé ne peut être utilisé pour remplacer la recherche sur les animaux.
Réduction
Sur les conseils d’un biostatisticien, les groupes seront constitués de 10 animaux du fait de la variabilité de la croissance tumorale de façon à obtenir des différences statistiquement significatives entre les groupes, et pourra être réduit si la variabilité observée est moins élevée. Des études précédentes ont permis d’optimiser le protocole de vaccination avec des VL et de définir la cinétique de vaccination permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les VL seront préalablement validés par des études d’immunogénicité chez la souris afin de déterminer la dose à utiliser et de s’assurer qu’ils permettent la mise en place de réponses cellulaires T spécifiques dans les souris. Avant chaque procédure, le résultat des procédures précédentes sera pris en considération. Si un vaccin n'a aucun effet sur la croissance de la tumeur, les procédures suivantes, qui devraient permettre de comprendre le mécanisme d'action d'un vaccin, seront abandonnées.
Raffinement
Selon notre expérience antérieure, l’injection de LV n’induit aucun signe clinique chez les souris mais l’implantation de tumeurs peut induire une gêne modérée, qui sera contrôlée au cours des expériences. Les tumeurs seront implantées au niveau du flanc des animaux afin de limiter à minima la gêne occasionnée par la tumeur. Les animaux seront contrôlés pour détecter tout signe d’inconfort ou de souffrance, si un point limite (nécrose ou la taille de tumeur supérieur de 1500mm3) est atteint, la souffrance des animaux sera abrégée par leur mise à mort. Si les signes cliniques de souffrance sont légers, mais néanmoins présents (perte de poids inférieur à 20%, poils hérissés, inactivité), plusieurs mesures seront prises : ajout de Dietgel, réhydratation sous cutanée, chauffage des cages, amélioration de l’enrichissement.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est proche du système immunitaire humain. Il existe de nombreux modèles de tumeurs qui peuvent être utilisés chez la souris pour tester nos candidats vaccins. De plus, des études précédentes montrent que les VL sont immunogènes chez la souris et de nombreux outils sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire. Les expériences envisagées requièrent des animaux avec un système immunitaire fonctionnel. Elles seront donc menées sur les souris adultes âgées de 6 semaines au minimum.
Développement d’un modèle de migraine chronique à l’aide d’injections répétées d’une préparation inflammatoire chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
1836 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'un cathéter crânien, puis des injections répétées d'une préparation inflammatoire sur la dure-mère pour induire une migraine chronique, avec des tests de sensibilité douloureuse de la face et des pattes. Le porteur indique que les rats restent douloureux et les tue en fin d'expérience pour cette raison. Il annonce que le modèle mis au point "pourra être proposé à la commercialisation" pour tester des candidats médicaments.
Objectifs
La migraine est un trouble de la douleur neurologique. Elle a un impact sur la santé mais aussi socio-économique. Selon des rapports épidémiologiques, la migraine touche 1 personne sur 10 dans le monde et son incidence continue d'augmenter (2017). Dans le Global Burden of Diseases 2016, la migraine était la sixième maladie la plus courante parmi 328 maladies et méfaits. En plus des céphalées, les migraineux présentent d’autres symptômes comme des nausées, de la fatigue, une photo et/ou phonophobie et des allodynies mécaniques et thermiques. L’allodynie est un stimulus normalement non douloureux ressentie comme douloureux. Il est particulièrement ressenti au niveau de la face des patients. Les traitements médicamenteux actuelles sont des triptans, des corticoïdes et plus récemment des anti-CGRP (CGRP est un peptide impliqué dans la migraine). Malheureusement ces traitements ne sont pas sans effets secondaires. De plus, certains patients répondent mal à ces traitements. Il est donc important de développer de nouveaux traitements. Pour cela, nous souhaitons mettre au point un modèle de douleur migraineuse induit par injection répétée d’une préparation inflammatoire au niveau de la dure mère. Ce modèle, décrit largement dans la littérature, permet de montrer les mêmes symptômes qu’une personne migraineuse (baisse de l’activité, douleur spontanée, allodynie thermique et mécanique). De plus, la physiologie de l’animal est impactée de la même manière que chez l’homme. Ce modèle semble être le plus proche de l’homme et donc permettre des translations rapides. Dans le cadre de ce travail, nous souhaitons donc mettre au point ce modèle et tester la détection d’allodynie mécanique et thermique. Dans un second temps, nous testerons la réversion de l’allodynie par une molécule de référence (Triptan/antagoniste CGRP).
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est la mise au point d’un modèle fiable et reproductible. Ce modèle pourra être proposer à la commercialisation. Ainsi, de nouveaux candidats médicaments pour l’homme pourront être testé. La caractérisation de ce modèle par de nombreux tests pourra donner lieu à un poster dans le cadre d’un congrès.
Procédures
Les animaux subissent une chirurgie implantatoire d’un cathéter au niveau du crâne (une chirurgie d’environ 20-40min). Selon les procédures ils peuvent être soumis à des mesures de sensibilité douloureuse tactile (face, patte), de mesure de sensibilité thermique (patte). Ces tests durent moins d’une minute chacun et sont répétés durant une cinétique de 5 points de mesures (15 min minimum de repos entre chaque). Ces animaux pourront recevoir une molécule de références selon une voie d’administration courantes afin de tester la réversion de la sensibilité à la douleur (moins d'une minute).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables que vont subir les animaux sont les chirurgies pour réaliser l’implantation de la canule au niveau de la duremère. Ceci peut entrainer une douleur. Ce modèle est un modèle de migraine les animaux peuvent développer des mgraines spontannées. Les animaux auront des tests de douleur mécanique ou thermique. Cette opération est réalisée tous les jours de D2-D16 sauf les week-ends dans une procédure. Ensuite, les tests ne seront réalisés que à D2, et le jour où les animaux seront considérés comme migraineux. Une cinétique de test pourra être réalisée allant jusqu’à 5 points de mesures espacés de 15min minimum.
Devenir
L’ensemble des animaux sont mis à mort. Le développement du modèle agit sur les mécanismes inflammatoires. Il est donc difficile de connaitre l’impact neurophysiologique sur d’autres modèles utilisés au sein du laboratoire. De plus, les animaux ont un modèle de migraine chronique. Ils restent donc douloureux. Pour l’ensemble de ces raisons, ils sont mis à mort dès la fin de l’expérience.
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP (International Association for the study of pain), la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données bibliographiques disponibles. Cet effectif par groupe sera confirmé lors des stades initiaux de développement du modèle par la réalisation d’un calcul de puissance. En fonction du design de chaque étude (groupes appariés ou indépendants, mesures répétées ou non) et de la distribution des valeurs (conformité à la loi normale), un test paramétrique ou non paramétrique sera réalisé (test-t, analyse de variance à une ou deux voie(s)) suivi si nécessaire d’un test post-hoc approprié. A la fin de la procédure 1, le nombre d’animaux pourra être réajusté en fonction des résultats.
Raffinement
De l’enrichissement est présent dans les cages afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux (Tunnel en plastique, papier kraft et briquettes en bois à ronger). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise du laboratoire (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour. Pour les tests, des cut-off ont été fixé afin de limiter la douleur. De l’habituation aux tests/contention est faite afin de limiter le stress. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie isoflurane et un traitement antibiotique sera réalisé afin d’éviter les risques d’infections.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP (International Association for the study of pain) Ass est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés seront des rats pré-adolescent. Nous garderons les animaux environ un mois. Nous ne souhaitons pas avoir des animaux trop gros afin de pouvoir réaliser les tests sereinement. De plus, les crises de migraines chez l’homme sont souvent intensifiées à la période de l’adolescence avec les changements hormonaux.
Renforcer l’immunité innée dans les poumons des porcs pour lutter contre la grippe porcine
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Des porcelets arrivés à l'âge de 4 semaines reçoivent sous anesthésie une nébulisation, de flagelline pour les groupes traités, et une partie d'entre eux est inoculée avec le virus de la grippe porcine, dont les symptômes typiques sont la fièvre, la toux, l'écoulement nasal et les éternuements. 20 porcs vont être utilisés, avec jusqu'à cinq prises de sang et quatre écouvillons sous sédation. Une partie des procédures est déclarée d'un niveau de souffrance sévère, le reste modéré, et le porteur écrit que l'infection grippale chez le porc "n'est pas très grave" et que la fièvre attendue n'est "pas trop sévère". Tous sont tués à l'issue pour des lavages broncho-alvéolaires et des prélèvements de poumons. Le porteur présente le projet comme une réponse aux "besoins de la société" en matière de production de viande "responsable, durable et rentable".
Objectifs
La filière porcine est confrontée à un nombre croissant de défis, dans la perspective d'une production alimentaire durable et sûre. La lutte contre la grippe porcine est très difficile car les vaccins contre la grippe ne parviennent pas à conférer une immunité protectrice. La stimulation par la flagelline, un agoniste spécifique du système immunitaire inné respiratoire, est apparue comme une stratégie alternative pour favoriser la résistance aux maladies. Nous avons précédemment montré que l'administration de flagelline par voie systémique stimule les défenses immunitaires innées antibactériennes et antivirales de l'hôte dans les voies respiratoires. De plus, nous avons montré un effet protecteur de la flagelline dans un modèle d'infection de la grippe chez la souris, ce qui suggère que la flagelline pourrait également être efficace contre la grippe chez le porc. Cet effet bénéfique pourrait être attribué à son activité pro-inflammatoire et à un effet positif sur la maturation des cellules immunitaires résidentes. Nous proposons une approche de biologie systémique dans laquelle nous combinerons plusieurs nouvelles techniques (séquençage, imagerie confocale...) pour déchiffrer la complexité des réponses du porc aux infections par la grippe et les mécanismes de protection induits par la flagelline. Nous apporterons d'abord la preuve de concept que l'administration de flagelline protège contre la grippe porcine. Ensuite, nous identifierons les déterminants génétiques impliqués dans la réponse de l'hôte à la grippe et responsables de l’effet de la flagelline, et nous utiliserons des approches de machine learning pour produire un algorithme prédisant la susceptibilité des cellules à l'infection. Cette approche servira à développer des thérapies plus sûres et plus efficaces pour combattre la grippe porcine. Les résultats seront partagés avec les acteurs industriels pour assurer un transfert efficace.
Bénéfices attendus
Notre projet utilise une nouvelle stratégie pour stimuler le système immunitaire des porcs afin de lutter contre la grippe porcine. Cela répond aux besoins de la société en terme d'avoir une production de viande responsable, durable et rentable. Nous allons: • Montrer que la flagelline peut protéger les porcs contre la grippe porcine. • Étudier comment la grippe porcine affecte les cellules des poumons des porcs et comment la flagelline peut aider à renforcer leur immunité. • Trouver de nouvelles façons de combattre la grippe porcine en identifiant des voies moléculaires qui pourraient être ciblées par de nouveaux médicaments. • Développer des outils informatiques pour mieux comprendre comment les porcs réagissent à la grippe porcine et pour prédire leur susceptibilité à l'infection. Cette approche permettra de mieux prévenir la propagation de la grippe porcine et d'améliorer la santé des porcs, ce qui est important pour une production de viande durable et responsable. De plus, il est important de noter que la grippe porcine est une maladie zoonotique, ce qui signifie qu'elle peut se transmettre des animaux aux humains. En étudiant la grippe porcine et en développant de nouvelles méthodes pour la combattre, nous serons mieux préparés à faire face à une éventuelle vague de grippe porcine. Cela peut aider à prévenir une épidémie et à protéger la santé publique. En fin de compte, en améliorant la santé des porcs, nous améliorons également la santé des humains.
Procédures
Pendant la première expérimentation, nous utiliserons 8 animaux qui subiront : 2 prélèvements sanguins, sur animaux vigiles sédatés, 2 tubes de 5 mL, 2 min et 1 Nébulisation sur animaux anesthésiés, 30 minutes. Dans la deuxième expérience, nous utiliserons un total de 12 animaux qui subiront : 1 Nébulisation sur animaux anesthésiés, 30 minutes ; 1 administration en intranasale sur animaux anesthésiés, 15 min ; 5 prélèvements sanguins sur animaux sédatés, 2 tubes de 5 mL, 2 min et 4 Ecouvillons sur animaux sédatés, 2 min
Impact sur les animaux
Des expériences antérieures suggèrent que les animaux peuvent avoir une légère baisse de température après avoir récupéré de l'anesthésie et de la nébulisation de flagelline. Les prises de sang seront faites sous anesthésie. Pour les animaux inoculés avec de la grippe ; on s'attend à ce que les animaux développent de la fièvre (mais pas trop sévère) pendant quelques jours, elle peut persister jusqu'à la fin de l'expérience (3 jours). Les symptômes typiques de la grippe porcine sont de la fièvre, de la toux, de l'écoulement nasal et des éternuements.
Devenir
Les animaux à la fin de la procédure seront tous euthanasiés pour réaliser des lavages broncho-alvéolaires et différents prélèvements des poumons.
Remplacement
L'étude de l'effet de la flagelline comme thérapie dans le cas d’une infection grippale ne peut être effectuée en utilisant uniquement des lignées cellulaires in vitro. La réponse immunitaire présente un comportement complexe et dynamique qui dépend non seulement de la réponse des cellules épithéliales des voies aériennes, mais aussi de son interaction avec un grand nombre de cellules immunitaires (neutrophiles, macrophages, cellules dendritiques, cellules T ...). En outre, la clairance de l'agent pathogène dans les voies aériennes dépend de cette réponse immunitaire, mais aussi du transport mucociliaire. Cette complexité rend presque impossible d'imiter la réponse à la flagelline in vitro. Pour ces raisons, l’utilisation des lignées cellulaires ne peuvent pas reproduire la complexité de la réponse immunitaire in vivo qu’implique une interaction entre différents types de cellules.
Réduction
Nous utilisons le nombre minimum d'animaux qui peut nous donner un résultat scientifiquement valable. Pour la première expérimentation qui implique l'étude de l'effet pro-inflammatoire de la flagelline dans les poumons, nous utiliserons 4 porcs pour le groupe traité et 4 porcs pour le groupe de contrôle. Bien que le nombre d'animaux ne soit pas très élevé pour montrer l'effet de la flagelline, nous utiliserons une technologie qui peut être utilisée pour étudier la réponse immunitaire des cellules des voies respiratoires des porcs à l'infection par la grippe, en analysant l'expression de gènes dans chaque cellule individuelle. Cette technique permet de recueillir une grande quantité de données à partir d'un seul porc, ce qui peut réduire le nombre total d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Pour la deuxième expérimentation, des expériences précédentes réalisées chez les souris ont montré que 6 animaux par groupe expérimental suffisent pour observer un effet significatif de la flagelline sur la charge virale. Pour cette raison, nous utiliserons 6 porcs par groupe.
Raffinement
Des expériences et des publications antérieures utilisant des modèles expérimentaux porcins d'infection grippale montrent que l'infection grippale chez le porc n'est pas très grave. On s'attend à une légère hyperthermie quipeut être ou non associée à une toux et à des éternuements. La stimulation de la flagelline provoque une réaction inflammatoire transitoire dans les poumons (moins de 24 heures). Les porcelets seront sédatés ou sous anesthésie pour tous les actes techniques ; sous la supervision de personnel qualifié et formé. Les 8 animaux de la première expérimentation seront hébergés en groupe de 4 dans une cage de 2 m². Les 12 animaux de la seconde seront hébergés en groupe de 6 dans une cage de 4 m². Ils seront hébergés en groupe tout au long des 2 procédures. Dans chaque cage, il y aura un ballon, un nunchaku ou/et chaînes. Ils auront accès à la nourriture à volonté. Une semaine d’acclimatation est prévue dans chaque expérimentation pour que les porcelets s’habituent à leur nouvel environnement. Un renforcement positif sera mis en place avec des fraises tagada ou du pop-corn. Toutes les prises de sang et écouvillons seront réalisés sur animaux sédatés.
Choix des espèces
La grippe porcine est un pathogène du porc, ce qui fait du porc l'espèce animale la plus pertinente. D'autres modèles animaux existent, comme les souris, mais pourraient produire des réponses immunitaires différentes. Les porcs seront âgés de 4 semaines à l’arrivée. A ce stade, les animaux pèsent entre 8 à 10 kg, ce qui facilite la manipulation et les anesthésies.
Utilisation d’un modèle de souris pour comprendre les bases cellulaires des troubles du spectre de l’autisme liés au gène Tshz3 et tester un traitement pharmacologique visant à réduire les stéréotypies
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation du gène Tshz3 présentée comme un modèle d'autisme, elles reçoivent une injection quotidienne pendant dix jours et passent trois tests comportementaux censés mesurer des stéréotypies, dont le RNT ne précise pas le protocole. L'objectif est de tester si un médicament utilisé dans la maladie d'Alzheimer réduit ces comportements répétitifs. Le porteur affirme que les troubles du spectre autistique "ne peuvent être étudiés qu'in vivo" et que des souris génétiquement modifiées sont "indispensables".
Objectifs
Les troubles du spectre de l’autisme (TSA) sont diagnostiqués sur la base de troubles du comportement, notamment des déficits de la communication et des interactions sociales, ainsi que des comportements répétitifs (stéréotypies) avec des champs d’intérêts restreints. Les causes des TSA sont encore mal connues, mais plusieurs recherches ont établi que de mutations dans certains gènes sont impliquées. Plusieurs de ces gènes participent, d’ailleurs, au développement et au fonctionnement du cerveau. Nos travaux apportent un faisceau d’arguments convergents, à partir d’études menées chez l’homme et sur des modèles de souris, en faveur de l’existence d’un lien direct entre des mutations d’un gène et les TSA. En particulier, nos souris avec des mutations de ce gène montrent des comportements répétitifs (stéréotypies) qui miment ceux typiques des TSA. Notre hypothèse, basée aussi sur nos travaux précédents, est que ces comportements répétitifs soient dus à une réduction des niveaux d’une substance chimique sécrétée par les neurones d’une zone du cerveau nommée striatum, comme dans d’autres cas de comportements stéréotypés. A l’heure actuelle il n’existe pas des traitements médicamenteux généralisés pour les TSA, cependant certains des symptômes peuvent être pris en charge spécifiquement. Dans ce contexte, nous proposons d’utiliser nos souris afin tester si leurs comportements répétitifs peuvent être améliorés par un traitement qui vise à augmenter les niveaux de cette substance dans le cerveau. Dans ce cadre, nos objectifs principaux sont : 1. Effectuer des tests comportementaux permettant de mettre en évidence des stéréotypies et des comportements de type persévérant chez les souris mutantes, par rapport à leurs contrôles. 2. Tester si un traitement pharmacologique qui augmente les niveaux de cette substance est capable d’améliorer ces déficits comportementaux. Cela pourrait fournir des indications thérapeutiques pour le traitement des comportements stéréotypés, associés ou pas aux TSA.
Bénéfices attendus
Cette demande s’inscrit dans la suite de travaux précédents du demandeur et des autres responsables du projet. Nous avons identifié un gène dont la mutation est impliquée dans les troubles du spectre de l’autisme (TSA). Dan ce contexte, ce projet a pour objectif de tester des traitements pharmacologiques permettant de corriger des comportements stéréotypés chez la souris modèle des TSA dus à la mutation de ce gène.
Procédures
Ce projet comprend 2 types d’intervention : un traitement qui consiste en une injection une fois par jour sur une période de 10 jours ; 3 tests comportementaux (qui ne comportement pas de souffrances pour les animaux) pour détecter des comportements stéréotypés typiques des TSA : chaque test dure entre 15 et 20 min et sera effectué au 3ème et au 10ème jour de traitement.
Impact sur les animaux
Nuisances attendues : injections quotidiennes sur 10 jours, qui peuvent entrainer de la douleur au point de piqure ; tests de comportement répétés qui peuvent engendrer du stress ou de la fatigue.
Devenir
A la fin de la procédure, les souris ne seront pas utilisés pour d’autres expériences dans le cadre de ce projet ou d’autres projets de recherche. Par conséquent, toutes les 40 souris seront mises à mort.
Remplacement
Les méthodes in vitro ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de l’isolement des neurones du contexte physiologique. De plus, l’utilisation de souris vivantes est nécessaire pour tester l’efficacité du traitement pharmacologique visant à améliorer les stéréotypies.
Réduction
Nous nous efforçons d’utiliser le moins d’animaux possible (optimisation des conditions d’élevage, des croisements etc.), tout en veillant à ce que le nombre d’animaux utilisé soit représentatif. Cela a été estimé sur la base d’expériences antérieures, et grâce à des outils statistiques permettant de calculer le nombre de sujets nécessaires. Cela nous a fourni un nombre total de sujets = 18 (9 par groupe). Afin d’héberger les souris par groupes homogènes de 5 et compenser à une possible augmentation des écarts types due au traitement et à l’utilisation des deux sexes, nous avons choisi d’utiliser 10 animaux par groupe : 10 mâles mutantes et 10 mâles contrôle, ainsi que 10 femelles mutantes et 10 femelles contrôle, pour un total de 40 souris.
Raffinement
Les souris sont élevées en groupes sociaux de 5 animaux, dans des environnements enrichis par la présence d’objets (igloos en carton, « Nestlets » déchiquetables en fibre, briques en bois), au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques (température, humidité) et sanitaires sont strictement contrôlés. Les animaux sont examinés quotidiennement afin de vérifier l’apparition éventuelle de douleur/mal être et veiller à ne pas dépasser des points limites. Etant donné l’absence de procédures chirurgicales ou d’autres sources de douleur dans ce projet, nous n’utiliserons pas d’anesthésiques ou d’analgésiques.
Choix des espèces
Les troubles du spectre de l’autisme (TSA) ne peuvent être étudiés qu’in vivo, car ils sont définis par des comportements caractéristiques (déficits dans les interactions sociales et mouvements répétitifs ou stéréotypés) qui nécessitent d’animaux vivants pour être mis en évidence. La possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées est indispensable pour reproduire les symptômes des TSA dus à la délétion d’un gène. Nous utiliserons donc ces souris pour des expériences visant à mettre en évidence des comportements stéréotypés, afin de tester l’effet d’un traitement pharmacologique, utilisé en clinique pour le traitement de la maladie d’Alzheimer. Notre hypothèse est que ce traitement peut restaurer la fonction d’une région du cerveau impliquée dans les TSA, le striatum, et ainsi améliorer les comportements stéréotypés qui caractérisent ces souris. L’âge des souris utilisées sera de 6 à 8 semaines au début de la procédure : cela a l’avantage d’avoir des animaux capables d’effectuer les tâches comportementales prévues dans la procédure expérimentale, tout en minimisant la durée de leur stabulation.
Développement d’un modèle d’inflammation standard chez le poulet de chair en vue d’évaluer un additif alimentaire comme stratégie de modulation de la réponse immunitaire innée
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
48 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent par voie orale une surdose de vaccin coccidien destinée à provoquer une inflammation intestinale, puis des prélèvements sanguins, avant d'être tués pour le prélèvement d'organes. L'objectif est de mettre au point un modèle standard d'inflammation servant à évaluer un additif alimentaire immunomodulateur. Le porteur indique s'appuyer d'abord sur des lignées cellulaires mais affirme devoir confirmer in vivo le mode d'action de l'additif chez le poulet.
Objectifs
Le projet présenté ici a pour objectif de développer un modèle d’inflammation standardisé chez le poulet de chair pour évaluer de nouvelles propriétés fonctionnelles d'un additif alimentaire permettant de moduler la réponse immunitaire innée. L'objectif étant de faire face aux infections retrouvées en élevage. Une attention croissante est accordée par les consommateurs à la qualité des produits qu’ils achètent, aux conditions d’élevage, aux pratiques agricoles et à l’impact sur le bien-être animal et l’environnement. Cependant, des maladies dont les origines sont multifactorielles peuvent parfois survenir en élevage. Pour exprimer tout leur potentiel génétique, les volailles doivent être maintenues en parfaite santé particulièrement sur le plan immunitaire. Le système immunitaire joue un rôle essentiel dans la prévention des maladies et la croissance optimale des volailles. Les principales maladies aviaires sont caractérisées par un important processus inflammatoire dont l’étude constitue un intérêt en aviculture. En effet, la réduction de l'utilisation d'antibiotique au profit d'alternatives durables pour optimiser la croissance du jeune poussin tout en préservant sa santé digestive et une bonne mise en place de son système immunitaire sont en cours d'investigation. Parmi les stratégies utilisables, la nutrition joue un rôle important avec notamment l’incorporation dans les rations alimentaires d’additif pouvant moduler la réponse immunitaire non spécifique (innée), réponse prédominante chez le poussin. La nutrition animale s’intéresse de plus en plus aux propriétés spécifiques des divers substances comme les vitamines, les probiotiques, les plantes, les acides aminés ou autres pour soutenir les fonctions immunitaires des volailles dans un objectif de gestion intégrée de la santé. 70% de la capacité du système immunitaire des oiseaux se situe dans le tube digestif, aussi il est primordial de démontrer l'efficacité des additifs à moduler la réponse innée au travers de l’intégrité intestinale. Chez le poulet, les modèles d’inflammation sont le plus souvent réalisés in vivo afin d’évaluer les effets biologiques de l’incorporation des additifs dont l’activité immunomodulatrice aura été démontrée in vitro et ou ex vivo. La surdose de vaccin coccidien constitue un des moyens pour générer un modèle spécifique de réponse inflammatoire in vivo.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra (1) d’établir un modèle d’inflammation intestinal standard chez le poulet de chair afin de (2) pouvoir l’utiliser dans le but d’évaluer tous les additifs alimentaires dont l’effet immunomodulateur aura été montré soit dans la littérature, in vitro et ou ex vivo et (3) de confirmer l’effet en prenant en compte toutes les interactions cellulaires complexes qui ont lieu in vivo et qui peuvent influer sur la réponse inflammatoire. Ce projet permettra également de cibler les paramètres les plus pertinents pour évaluer la réponse inflammatoire dans des conditions expérimentales standardisées et d’optimiser le nombre d’animaux nécessaires et suffisant pour répondre à l’hypothèse de l’étude en maitrisant mieux les écarts types de nos paramètres d’intérêt et raffiner les tests statistiques utilisés.
Procédures
Les animaux seront élevés avec un aliment répondant à leur besoins nutritionels pendant 21 jours. A 15 jours d'age, une seule administration par voie orale à l’aide d’une seringue sans aiguille de 1 ml de vaccin sera réalisée sur chaque animal de deux groupes sur trois. Pour chaque administration, le temps de contrainte pour maintenir chaque animal ne dépassera pas 30 secondes et se fera progressivement en fonction de la déglutition de l'animal. Une partie des animaux seront soumis à un prélèvement sanguin 24 heures (1jour) post administration et l'autre partie 144 heures après (6 jours). A chaque temps de prélèvement, un volume de 2ml de sang nécessaire et suffisant à l'analyse des différents paramètres sanguins sera prélevé sur chaque animal. Pour chaque prise de sang, le temps de contention de l'animal ne dépassera pas 1 min.
Impact sur les animaux
La durée de la période de vaccination est trop courte (3 jours) pour enregsitrer une perte de poids quotidienne suite à la surdose de vaccination, inconfort et stress du au gavage et aux prises de sang.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux impliqués dans la procédure pour réaliser les prélèvements d’échantillons biologiques.
Remplacement
Pour réduire le recours à l’expérimentation animale le développement de méthodologies alternatives comme les lignées cellulaires sont largement utilisées en biologie cellulaire aviaire pour évaluer les mécanismes de la réponse immunitaire innée et l’effet immunostimulant de tout additif d’intérêt. Ces méthodes alternatives utilisées en première intention doivent cependant être confirmer in vivo afin de prendre en compte toutes les interactions cellulaires complexes qui ont lieu in vivo lors de l’ingestion des additifs chez le poulet. Sur la base des connaissances acquises in vitro, le développement d’un additif alimentaire avec une activité immunostimulante supposée implique de connaitre son mode d’action chez l’animal auquel il est destiné.
Réduction
Des calculs statistiques détaillés ont été réalisés afin de déterminer le nombre d'animaux adéquat pour ce projet. Les calculs ont été faits sur la base de résultats significatifs obtenus dans d'autres études sur l’expression des gènes d’inflammation entre un groupe d’animaux non vacciné et vacciné. Le nombre d'animaux à utiliser permettra d’apporter de bonnes conditions d’élevage en favorisant une hiérarchie sociale essentiel au bien-être des animaux et d'obtenir des données scientifiquement robustes. Des analyses post-mortem seront réalisées sur les tissus de chaque animal afin de générer le maximum d'informations possible par animal.
Raffinement
Gavage :inconfort, stress de la contrainte lors du maintien des animaux, sont réduits par une manipulation empathique, délicate et compétente des animaux par les applicateurs de la procédure, un gavage unitaire de la substance par voie orale à l’aide d’une seringue à un volume approprié à la taille de l’animal soit 1 mL Prises de sang : inconfort et le stress dus à la contention de courte durée et la douleur légère liée à l’introduction de l’aiguille sont réduits par une manipulation délicate des animaux maintenus en décubitus latérale, un prélèvement de faibles volumes de sang en fonction de la volémie, en piquant le plus haut possible dans la veine jugulaire et par l’application d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans la procédure interne « Geste technique sur animaux vivants : prises de sang » qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires Pas d'utilisation d'anesthésique local en vue du prélèvement de sang car cela nécessiterait de capturer deux fois les animaux (application du produit et réalisation du geste) entrainant un stress et un inconfort supplémentaire. Le raffinement des conditions d’hébergement consiste en la mise en place au démarrage de papier filtre à l’intérieur de la cage pour éviter que les animaux ne se coincent pas les pattes dans les mailles de la grille et en favorisant l’accès facile à l’eau et à la nourriture.L’accès à l’eau est facilité par la mise en place de coupelle d’eau en plus des pipettes et des godets récupérateurs d’eau. L’accès à la nourriture est affiné en mettant directement dans la cage sur le papier filtre un tas d’aliment. En plus, ajustement régulier de la hauteur des lignes d’eau ainsi que les ouvertures d’accès aux mangeoires en fonction de l’âge des animaux L’état de santé des animaux est suivi quotidiennement. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que l’enrichissement des cages (grelots scintillants), la densité des animaux par cage, ou encore les paramètres environnementaux (température et hygrométrie…) procurent le maximum de confort aux animaux, et restent supérieurs ou égaux à la législation en vigueur. Aucun animal ne reste isolé, en cage individuelle sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux.
Choix des espèces
Les additifs alimentaires dont l’activité immunomodulatrice veut être confirmée au moyen de ce modèle d’inflammation, sont destinés à être incorporés dans les rations alimentaires distribuées aux volailles (poulets de chair). Les animaux livrés seront des poussins de 1 jour (poids moyen 40 g). Ils seront mis en stabulation en cages en batterie et seront élevés jusqu’à l’âge de 21 jours. Des poulets juvéniles seront utilisés dans cette étude car à cet age le système immuitaire n'est pas totalment développé et il sera donc plus facile de mesurer la réponse inflammatoire.
Evaluation de l’impact d’une toxicité de relais (mère-poussin) suite à une exposition séquentielle de poules reproductrices à un aliment contaminé en mycotoxines
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Maladies animales
544 poules reproductrices vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont nourries d'un aliment contaminé par des mycotoxines pendant plusieurs semaines et subissent des prises de sang, pour mesurer les effets de ces toxines sur leur santé et sur leur descendance. Le porteur indique que l'exposition peut provoquer une nécrose du bec, des atteintes du foie, de l'intestin et de l'appareil reproducteur, ainsi qu'une mortalité accrue des poussins. Il affirme qu'aucune technique in vitro ne peut répondre à ces objectifs et que l'espèce aviaire ne peut être remplacée.
Objectifs
Les mycotoxines peuvent contaminer les céréales. Les volailles peuvent être exposées à ces toxines via leur alimentation. En volailles de chair, une accumulation des toxines et métabolites dans le foie, a été démontrée lors d’une multi-exposition aux fusariotoxines (fumonisines - FBs et zéaralénone - Zea) mimant une situation de « pire cas terrain ». Ceci suggère la possibilité d’effets toxiques à moyen terme, variable entre espèces avicoles, même à faible dose. Par ailleurs, la décontamination des tissus est lente. Sur le terrain, en cas de nécrose du bec, de chutes de ponte ou du taux d’éclosion, de problème de qualité de poussins, la contamination alimentaire en mycotoxines est souvent mise en avant, bien que très peu de données scientifiques existent sur l’impact chez les volailles reproductrices. La poule reproductrice de lignée chair pourrait révéler des symptômes plus marqués que la volaille de chair, en raison de sa durée de vie plus longue, de l’importante mobilisation hépatique pour la production d’œufs et de l’effet reprotoxique des mycotoxines. L’objectif général du projet est d’évaluer l’impact des FBs et Zea sur les performances et la santé des poules reproductrices de lignée chair (effets directs) et de leur descendance (effets indirects). Les objectifs opérationnels sont 1/ d’identifier des situations d’exposition à risque (moment et récurrence de l’exposition) qui induisent l’apparition de troubles chez les reproducteurs, au couvoir ou chez les poussins, 2/ d’identifier les effets par des indicateurs de performance/santé en élevage ou au couvoir et des marqueurs biologiques sensibles et 3/ de comprendre les modes d’action : valider (ou non) la réalité d'une bioaccumulation de mycotoxines et valider (ou non) la possibilité d'une toxicité de relais (mère -> œuf -> poussins).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence les effets chez les poules reproductrices de lignée chair, les œufs et les poussins, de différentes situations de multi-exposition des poules aux mycotoxines, qui n’ont encore jamais été évaluées. Les situations d’exposition reproduites pour les groupes 1 à 5 représentent des situations (dose, période et récurrence) d’exposition aux mycotoxines possibles sur le terrain en élevages de poules reproductrices de chair, afin d’en déterminer les effets zootechniques et sanitaires. Les situations d’exposition reproduites pour les groupes 6 et 7 représentent des situations de pire cas terrain (exposition longue et concentration en fumonisine élevée) afin d’évaluer la toxicité d’une multicontamination. Ces essais permettront de mieux comprendre les mécanismes d’action des mycotoxines sur le fonctionnement du foie, de l’intestin et l’appareil reproducteur et la toxicité de relai mère -> œufs -> poussins.
Procédures
412 animaux seront exposés aux mycotoxines à savoir 2 expositions de 15 jours pour les groupes 2 et 5, une exposition de 15 jours pour le groupe 3, 4 expositions de 15 jours pour le groupe 4. Le groupe 6 sera exposé 6 semaines et le groupe 7 sera exposé 4 semaines avec une concentration plus élevée de fumonisines (20 ppm). De plus, certains animaux recevront une prise de sang qui ne dure que quelques secondes.
Impact sur les animaux
Le prélèvement au niveau du sinus occipital peut provoquer une réaction de stress au maintien de l’animal et un éventuel hématome local. Les poules ayant consommées des mycotoxines pourraient avoir des anatomie et fonctionnement des appareils digestif et reproducteur perturbés. Sur la santé des poules, l’exposition aux mycotoxines peut provoquée une nécrose du bec, une diminution de l’immunité rendant les animaux plus sensibles aux infections, des troubles digestifs, une altération de la fonction hépatique. Sur la reproduction, les mycotoxines peuvent provoquer une dégradation de l’oviducte ou des ovaires. De plus, la mortalité peut être plus élevée chez les poussins au démarrage.
Devenir
Les animaux mis à mort après la prise de sang seront prélevés pour récupérer l’intestin, le foie, le cœur, la rate, le pancréas, les reins et les ovaires. Tous ces organes seront pesés et les éventuelles anomalies anatomiques et lésions seront relevées. Le foie et la grappe ovarienne feront l’objet d’analyses plus approfondies. A la fin de l’essai, les animaux restants seront mis à mort, cela correspond à l’âge de réforme classique en élevage commercial.
Remplacement
Compte tenu des objectifs finaux du projet (évaluation des effets zootechniques, sanitaires et de la toxicité relai mère-> oeufs -> poussins dans différentes situation d’exposition alimentaires aux mycotoxies) et de l’absence de techniques in vitro permettant de répondre à ces objectifs, l’espèce aviaire ne peut être substituée.
Réduction
A 8 semaines d’âge, un effectif de 576 poules reproductrices de lignée chair nous permet de constituer 48 groupes de 12 animaux. Ce design permet d’évaluer, en même temps, 7 situations différentes d’exposition aux mycotoxines. Les groupes 1 à 5 sont représentatifs de situations possibles en élevage qui varient par les périodes et récurrence d’exposition tandis que les groupes 6 et 7 représentent des situations de pire cas possibles (exposition plus longue et concentration plus élevée de fumonisines). Pour les groupes 1 à 5, pour observer une différence significative de 2% sur le taux de ponte, entre les lots exposés et non exposés, un effectif de 8 parquets/groupe est nécessaire. Pour les groupes 6 et 7 dont la durée d’exposition et la concentration en mycotoxines sont plus élevées, nous attendons des effets plus marqués, par conséquent, un effectif de 4 parquets/groupe est suffisant pour observer une différence significative de 4% sur le taux de ponte, entre les différents groupes. Dans le sang, les marqueurs recherchés seront des marqueurs hormonaux (progestérone et oestradiol) et des marqueurs du métabolisme lipidique. Pour les marqueurs sanguins, des tests statistiques estiment le nombre de poules nécessaires à 12/groupe. Au regard de la variabilité de réponse, de la bibliographie et d’expériences précédentes, le nombre d’animaux/groupe et de répétitions/groupe que nous avons définis, sont nécessaires et suffisants pour mettre en évidence des différences de performances et de fonctionnement hormonal, hépatique et digestif. L’effectif d’animaux restants à la fin des prélèvements sera suffisant pour évaluer les performances de ponte jusqu’à la fin de l’essai.
Raffinement
La mise en lot peut perturber les animaux, donc ils disposeront de 2 semaines d’habituation dans les parquets avant le début de la phase expérimentale à la 10ème semaine. Les poules seront hébergées dans des parquets au sol sur des copeaux à une densité (2 animaux/m²) inférieure au maximum autorisé. Cette densité permet d’éviter la compétition à la mangeoire. Les animaux auront la possibilité d’explorer, se percher et auront à disposition des nids. Un enrichissement non consommable sera présenté aux animaux (chaines ou ficelles colorées). En cas de picage, les poules identifiées comme piqueuses seront retirées de l’essai et les animaux piqués seront hébergés dans une infirmerie, localisée juste en dessous des nids au sein de son parquet d’origine. Toute manifestation de symptômes comportementaux persistants (animal prostré pendant plus de 24h et ayant cessé de s’alimenter et de s’abreuver) entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation. Les prises de sang seront effectuées dans un lieu à part des espaces d’hébergement et seront faites dans le calme et par le personnel compétent.
Choix des espèces
La poule a été choisi comme modèle car c’est l’espèce agronomique cible du projet. Les poules seront mises en élevage à 1 jour d’âge sur l’unité expérimentale. A la 8ème semaine, elles seront réparties en 48 parquets de poids homogènes et auront une période d’habituation de 2 semaines avant les premières expositions aux mycotoxines qui démarrent au stade poulette. Les animaux seront élevés jusqu’à 54 semaines d’âge afin d’évaluer l’impact des mycotoxines sur la qualité des oeufs du début de ponte (23 semaines d’âge) à la fin de ponte mais également sur les poussins.
Evaluation d’agents de contraste pour l’aide à la chirurgie par imagerie optique NIR-I – NIR-II et photo acoustique.
- Recherche appliquée
- Cancers
198 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses de tumeurs dans le péritoine, elles reçoivent des injections d'agents fluorescents et sont soumises à des séances répétées d'imagerie sous anesthésie, puis tuées pour l'analyse de leurs organes. L'objectif est d'évaluer des agents de contraste destinés à aider les chirurgiens à distinguer le tissu cancéreux du tissu sain par fluorescence. Le porteur indique avoir écarté une partie des composés par des tests in vitro mais affirme ne plus pouvoir se passer de l'animal pour analyser la biodistribution.
Objectifs
L'objectif de cette étude est de tester de nouveaux produits pour leur potentiel en tant qu'agents d'imagerie optique (utilisant la fluorescence). Nous avons d'abord vérifié en laboratoire si ces nouveaux produits étaient toxiques pour les cellules et s'ils pouvaient être absorbés par ces dernières. Ensuite, nous avons examiné les propriétés optiques de ces produits en utilisant différents systèmes. Les produits les plus prometteurs ont été testés sur des animaux porteurs de tumeurs cancéreuses dans le péritoine. Nous avons évalué les conditions optimales d'utilisation de ces produits, leur distribution dans l'organisme et leur pharmacocinétique. Maintenant, nous souhaitons tester ces produits pour l'imagerie de lésions plus petites dans le péritoine et comparer l'imagerie bioluminescente avec l'imagerie de fluorescence.
Bénéfices attendus
Nous voulons permettre et valider la détection en profondeur de lésions de faible taille dans le cadre de l'aide à la chirurgie par imagerie de fluorescence. L'aide à la chirurgie par imagerie de fluorescence est une méthode permettant au chirurgien de séparer le tissu cancéreux du tissu sain.
Procédures
Après le 7eme jour post-implantation tumorale, chaque souris sera imagée 2 fois par semaine par bioluminescence (injection de luciférine) pour une durée maximum de 15 min d’intervention. Ceci jusqu’à atteindre le 1.10e9 photons/pixel/seconde. Une fois le signal voulu atteint, pour chaque souris, il y a 3 types d’imageries différentes ante-injection et 3 imageries post-injection du composé. Les imageries durent au maximum 15mn sous anesthésie. Par exemple, la souris au temps 5h sera imagée par les 3 types d’imagerie avant l’injection du composé (imagerie contrôle) puis sera à nouveau imagée de la même manière au temps 5h. Ensuite, elle sera mise à mort afin d’effectuer des tests.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus sont : immunodéficience des souris, douleurs et conséquences des injections péritonéales et intraveineuses, stress de la contention et des anesthésies
Devenir
Dans chaque procédure, tous les animaux impliqués seront mis à mort car pour chaque temps, des mesures ex-vivo sont nécessaires. Ainsi pour le même animal, nous ferons des analyses in vivo et ex vivo (analyse des organes) afin de multiplier le nombre de tests sur le même animal et ainsi réduire le nombre d’animaux nécessaires.
Remplacement
Les alternatives non animales pour ce projet ont été utilisées dans le cadre de la caractérisation optique et photo acoustique des composés fluorescents ainsi que de la cytotoxicité potentielle. Afin de réduire le nombre de composés à évaluer, beaucoup d'essais visant à évaluer les propriétés optiques des composés ont été réalisés par imagerie de gouttes de solution En effet, nous avons réalisé des investigations in vitro afin d’observer le comportement biologique des molécules d’intérêt sur des cellules normales et cancéreuses, leur internalisation dans les cellules, leur cinétique, leur localisation sub-cellulaire ainsi que leur cytotoxicité. Ceci nous a permis de remplacer un certain nombre d’animaux A ce stade de nos recherches nous ne pouvons plus nous passer de l’utilisation de modèles animaux car aucun moyen in vitro ne nous permet d’analyser la biodistribution.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, un criblage a été fait sur les fluorophores afin d’en sélectionner seulement 3 parmi une vingtaine. Nous avons rélisé un design d’expérimentation qui utilise juste le bon nombre de souris, tout en ayant assez d’animaux pour effectuer les tests statistiques adéquats lors de nos anlalyses. Nous plafonnons le nombre d’animaux grâce à la multiplication des tests/analyses sur un seul animal (analyses ex-vivo après expérimentation animale d’imagerie). L’approche statistique et notre expérience nous permettent de réduire le nombre d’animaux au minimum afin d’obtenir des résultats exploitables. 5 animaux par conditions en biodistribution permettent une analyse fiable prenant en compte les variabilités inter individu.
Raffinement
Le projet est mis en oeuvre dans un établissement agréé. Des tests préliminaires ont déjà été effectués sur des modèles sous-cutanés, nous permettant d’affiner de manière précise la mise en œuvre de cette expérimentation. Nous tenons compte des meilleures conditions d'hébergement pour nos modèles murins et nous veillerons au bien-être animal de nos souris. Tous les personnels impliqués dans ce projet ont des compétences validées pour les manipulations des souris. Nous utilisons des souris permettant le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux, dans un environnement contrôlé dépourvu de pathogènes, enrichi avec des tunnels en carton et morceaux de papier pour y faire un nid. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le niveau de sévérité de ces expérimentations est modéré. Les différentes interventions sont réalisées sous anesthésie générale. Nous utilisons des points limites spécifiques et des critères d'arrêt de souffrance. Le suivi quotidien des animaux garantira leur bien-être, et nous permettront d’intervenir immédiatement de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Enfin, la mise à mort des individus est réalisée de manière règlementaire (dislocation cervicale).
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l’homme, notamment dans le cadre d’études visant à comprendre le développement de cancers, la mise au point de nouveaux agents de contraste et de nouvelles thérapies avant d’entreprendre des études cliniques. La souris Nude permet le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. La méthode utilisée pour induire une tumeur est rapide, reproductible, et la bonne connaissance de ce modèle murin fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont connues (taille de la tumeur par exemple). C’est également un modèle expérimental robuste et adapté à l’étude de la biodistribution de fluorophores et de radiotraceur par imagerie du petit animal. De plus, la majeure partie des études expérimentales sur le cancer utilisent les modèles murins, ce qui permettra une comparaison et confrontation des résultats obtenus avec la littérature. Nous utiliserons des souris (athymic c'est à dire "sans thymus") de 6 semaines. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes avec une prise tumorale optimale avant le pic de production de globules blancs et la mise en place d'un système immunitaire innée à l’âge de 8 semaines.
Caractérisation d’une thérapie génique sur modèle murin de myopathie liée au gène Mtm1.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Modèles d'une myopathie liée au gène Mtm1, elles reçoivent des injections intramusculaires ou intrapéritonéales dès le premier jour après la naissance, subissent des tests de suspension et d'actimétrie et une mesure de force musculaire sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur signale que l'injection chez le nouveau-né peut déclencher le cannibalisme des parents et que la maladie provoque un phénotype sévère à partir de huit semaines. Il affirme que ces analyses ne peuvent être menées sur cellules en culture, seul l'"organisme entier" permettant d'étudier la maladie dans sa globalité.
Objectifs
Les myopathies centronucléaires sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints et aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Le principal objectif de ce projet est de mettre au point une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires. En parallèle nous souhaitons également étudier plus en détail les fonctions des différentes régions d’une protéine impliquée dans certaines myopathies ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.
Bénéfices attendus
Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires. Ce projet permettra également de faire avancer les connaissances scientifiques relatives aux fonctions des différentes régions de la protéine étudiée ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.
Procédures
Les 240 souris de la cohorte « Injections intra-musculaires » seront soumises aux procédures suivantes : - Injections intra-musculaires sous anesthésie générale, non-invasive, unique à 3 semaines d’âge, 5min par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 8 semaines d’âge. Les 390 souris de la cohorte « Injections Intra-péritonéale » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intra-péritonéale, animal vigile, unique au premier jour post-natal, 1min par animal. - Test de suspension, animal vigile, non-invasif, hebdomadaire de 3 à 8 semaines d’âge, 5min par animal. - Test d’actimétrie, animal vigile, non-invasif, unique à 8 semaines d’âge, 24h par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 8 semaines d’âge.
Impact sur les animaux
La souris atteinte de myopathie myotubulaire présente un phénotype sévère. Les premiers signes du phénotype dommageable n’apparaissent qu’à l’âge de 4-5 semaines pour atteindre un maximum à environ 8 semaines. A noter qu’il existe une certaine variabilité phénotypique entre les animaux mutants et que tous ne développeront pas l’ensemble des signes de la maladie. A notre connaissance il n’y a pas de douleurs associées au phénotype myopathique. L'injection intrapéritonéale effectuée au premier jour post-natal peut causer une douleur modérée au moment de l'injection, cependant, elle n'a pas d'incidence sur la prise de poids ultérieure. Il est à noter que cette manipulation peut, dans de rares cas, déclencher le cannibalisme des parents envers leur portée. L’injection intramusculaire de la patte sous anesthésie occasionne une douleur modérée au réveil mais qui n’empêche pas la mobilité ni l’accès à la nourriture.
Devenir
Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures car notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire.
Remplacement
Ces analyses ne peuvent pas être effectuées sur des cellules en culture car celles-ci ne reproduisent pas la fonction d’un organe et encore moins d’un organisme entier. En effet seul le modèle animal permet d’étudier d’une part la maladie dans sa globalité et d’autre part l’évolution des symptômes, ce qui est essentiel dans le cadre d’une mise au point de thérapie.
Réduction
Le nombre d’animaux a été basé sur les résultats de précédentes études sur ces mêmes animaux. Il nous permet d’assurer la robustesse statistique des différences entre animaux sains et malades et ainsi d’évaluer correctement l’effet de notre traitement. Afin de limiter le nombre d’animaux de la cohorte d’injections intra-musculaires nous injecterons les deux pattes (muscle tibial antérieur) de chaque animal, l’une avec la solution contrôle et l’autre avec un des traitements. L’utilisation d’un contrôle interne à chaque souris plutôt qu’un groupe de souris contrôles permet de renforcer la puissance statistique en s’affranchissant de la variation inter-groupes et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Toutes les souris passeront des tests phénotypiques et leurs tissus seront collectés pour compléter l’analyse histologique et moléculaire, nous permettant ainsi de nous affranchir de la création d’une deuxième cohorte pour la collection de tissus.
Raffinement
Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement après l’injection intramusculaire afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance éventuels comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et les difficultés ambulatoires. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole et la mise à mort des animaux par dislocation cervicale. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir toute douleur lors de l’opération chirurgicale. Durant la procédure les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur homéostasie thermique et elles seront monitorées en permanence.
Choix des espèces
Pour tester l'éventuelle amélioration thérapeutique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo sur modèle animal. Nous disposons déjà de plusieurs modèles murins de myopathies avec lesquelles nous avons publié plusieurs études sur les myopathies centronucléaires. Conserver la même espèce animale pour ce projet s’inscrit dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Nous prévoyons ainsi de réaliser cette étude sur des lignées de souris déjà disponibles dans nos laboratoires, ces modèles présentent des phénotypes comparables aux symptômes observés chez les patients humains. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. Nous traiterons ces animaux à des stades très précoces (premier jour post natal) pour étudier l’effet de notre traitement avant l’apparition des symptômes mais également au stade adulte (4 semaines) pour étudier l’effet après l’apparition des symptômes.
Thérapie métabolique cardioprotectrice par le nicotinamide riboside en transplantation
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
26 porcs vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacun subit une intervention unique de 90 minutes reproduisant un état de mort encéphalique par hypertension intracrânienne ou un arrêt circulatoire, avant le prélèvement du cœur pour une perfusion ex vivo. L'objectif est de tester si le nicotinamide riboside protège les greffons cardiaques en transplantation, la perspective clinique étant renvoyée à un éventuel essai chez l'humain. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit ces conditions et qu'un "gros animal" est requis pour l'instrumentation chirurgicale.
Objectifs
Le cœur est un organe très sensible aux lésions causées par l’arrêt et la reprise de la circulation sanguine (ischémie-reperfusion). En transplantation cardiaque, ces lésions peuvent se compliquer d’une défaillance primaire du greffon dans plus de 20% des cas. Or il s’agit de la première cause de mortalité précoce chez les patients transplantés. Le prélèvement d’organe puis son transport exposent le cœur à une période inéluctable d’ischémie. La reperfusion du cœur au moment de la transplantation entraîne un redémarrage brutal du métabolisme avec une carence en substrats énergétiques. Notre étude a pour objectif de développer une nouvelle approche pharmacologique métabolique de cardioprotection en transplantation en restaurant les réserves cellulaires de nicotinamide adénine dinucléot (NAD), un élément indispensable pour la synthèse de substrat énergétique, après exposition à un stress ischémique. La restauration des taux de NAD (via son précurseur le nicotinamide riboside –NR) a récemment émergé comme une cible thérapeutique dans différentes pathologies cardiovasculaires chroniques. Nos résultats préliminaires sur modèle murin d’infarctus du myocarde montrent, que le maintien du niveau normal de NAD dans le cœur préserve la fonction mitochondriale des cardiomyocytes ce qui permettrait de limiter les conséquences de l’ischémie-reperfusion en optimisant la fonction myocardique. La perspective clinique à court terme est d’appliquer cet agent pharmacologique en transplantation cardiaque chez l’homme pour diminuer l’incidence et la sévérité de la défaillance primaire du greffon, non seulement pour les cœurs prélevés sur donneur en état de mort encéphalique, mais également sur donneur décédé après arrêt circulatoire contrôlé. Dans ces deux situations, le cœur est exposé à une succession ischémie chaude, puis ischémie froide, puis reperfusion, autant de séquences à risque d’induire une carence profonde en substrats énergétiques pour le myocarde. Notre projet vise à établir si la restauration des pools de NAD pourrait constituer une nouvelle approche pharmacologique de cardioprotection en transplantation cardiaque afin d'améliorer la survie précoce des patients.
Bénéfices attendus
Les effets de l’administration du NR n’ont jamais été rapportés à ce jour dans un modèle aigu d’ischémie-reperfusion tel que la transplantation cardiaque. Notre projet vise à évaluer l’effet cardioprotecteur du NR pour limiter les conséquences fonctionnelles de l’ischémie-reperfusion du greffon en transplantation cardiaque. Les bénéfices attendus sont une meilleure protection des greffons cardiaques destinés à la transplantation, et par conséquent une diminution de l’incidence et de la sévérité de la défaillance primaire du greffon, première cause d’échec et de mortalité précoce en transplantation cardiaque. Notre étude pourrait également ouvrir à moyen terme la voie aux thérapies pharmacologiques de réhabilitation cardiaque ex vivo afin de pouvoir proposer des greffons jusqu’alors récusés pour la transplantation car à haut risque d’engendrer une défaillance primaire du greffon.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule intervention de 90 minutes, réalisée sous anesthésie générale, consistant en la modélisation d’un état de mort encéphalique par hypertension intracrânienne aiguë ou d’un arrêt circulatoire contrôlé. Aucun animal ne sera par définition réveillé à l'issue de de ces procédures. Il n'y a aucune intervention prévue sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Toutes les procédures expérimentales seront réalisées sous anesthésie générale avec traitement hypnotique et analgésique. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur. Aucun effet indésirable ni nuisances ne sont attendus pour l'animal puisqu’il s’agira de procédures sans réveil avec euthanasie de l’animal en fin de procédure. La seule nuisance sera l'injection intra musculaire permettant d’obtenir une sédation vigile et une tranquiliation avant de réaliser l'anesthésie générale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort au terme de chaque procédure, le cœur étant prélevé pour être analysé durant une perfusion d’organe ex vivo. La finalité de l'étude est de d’étudier l’impact d’un agent thérapeutique ciblant le métabolisme énergétique afin d’optimiser à très court terme la fonction cardiaque en prévision d’une transplantation.
Remplacement
Il n’existe pas, à notre connaissance, de modèle expérimental alternatif, in silico ou in vitro, permettant de reproduire les conditions du métabolisme myocardique sur un cœur soumis à une séquence d’ischémie-reperfusion. Il ne peut s’agir que d’un cœur provenant d’un système vivant reproduisant des conditions anatomiques et physiologiques proches de celles d’un cœur humain. L’évaluation de l’agent pharmacologique que nous étudierons (Nicotinamide Ribonucléotide, NR) ne peut se faire que sur un organe d’une espèce animale dont le métabolisme énergétique consomme du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD). Enfin seul un modèle sur gros animal permettra une instrumentation chirurgicale adaptée pour réaliser la perfusion cardiaque isolée ex vivo sur machine pour évaluer la fonction cardiaque par échographie de surface et cathétérisme intracardiaque.
Réduction
Une échographie cardiaque sera réalisée chez tous les animaux au moment de leur inclusion dans l’étude afin de dépister toute malformation cardiaque ou toute défaut de contractilité qui pourrait compromettre le bon déroulement du protocole expérimental. En cas d’anomalie anatomique ou fonctionnelle constatée à l’échographie cardiaque (moins de 2 % des cas dans notre expérience), l’animal sera sorti de l’étude et ne sera donc pas mis à mort pour les fins de ce protocole dans un principe de réduction du nombre des animaux. Le nombre d’animaux par groupe sera fixé à 6 afin de pouvoir réaliser des tests de comparaison statistique entre les groupes. Nous utiliserons des modèles d’analyse de la variance pour nos analyses statistiques. Nous prévoyons 2 animaux supplémentaires en cas de sortie prématurée d’étude d’un animal en cas d’échec de réanimation du cœur sur machine de perfusion ex vivo. Ce qui risque est de l’ordre de 5% dans notre expérience portant sur 64 cœurs porcins et 10 cœurs humains perfusés ex vivo par notre équipe depuis 2019. Les expérimentations seront réalisées par des chirurgiens cardiaques expérimentés formés au prélèvement cardiaque et à la perfusion d’organe isolé sur machine afin de réduire le risque d’échec de procédure par défaillance technique des expérimentateurs. Au total 26 animaux au maximum (4 groupes de 6 + 2 animaux supplémentaires) seront utilisés pour cette étude. Dès que le nombre de 6 animaux par groupe sera atteint, aucune autre inclusion ne sera nécessaire.
Raffinement
Dans un principe de raffinement, nous appliquerons les points suivants : - Respect d’une période d’acclimatation d’une semaine minimum entre l’arrivée à l’animalerie du laboratoire et l’inclusion dans le protocole de recherche - Hébergement en groupe de deux pour favoriser le contact régulier entre congénères - Environnement adapté à chaque phase de l’expérimentation pour réduire l’angoisse des animaux (accompagnement et anxiolyse durant le transfert depuis l’animalerie jusqu’en salle d’intervention) - Procédures expérimentales réalisées par du personnel qualifié et expérimenté (chirurgiens séniors, techniciens anesthésistes) permettant un temps interventionnel réduit au maximum - Privilégier les ponctions vasculaires percutanées échoguidées artérielles et veineuses, pour mise en place des cathéters de surveillance hémodynamique continue : moins de souffrance, moins de saignement. Avant l'anesthésie générale, les animaux auront une injection intra musculaire afin d’obtenir une sédation vigile et une anxiolyse. S'agissant de procédures expérimentales réalisées sous anesthésie générale balancée (narcose, analgésie et curarisation) sans réveil, aucun effet indésirable ni nuisances ne sont attendus pour l'animal qui sera euthanasié en fin de procédure ou en cas d'échec de l'anesthésie.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi est le porc. Le porc présente une physiologie circulatoire proche de celle de l’homme : fréquence cardiaque proche de 100/min, débit cardiaque entre 3,5 et 4 L/min pour un poids de 50 kg. Par ailleurs son anatomie cardiovasculaire facilite la modélisation chirurgicale des procédures avec une applicabilité rapide des résultats à la pratique clinique. Cette convergence permet une adaptation optimale de l’espèce aux expérimentations et limitera au minimum le nombre d’animaux tests, ce d’autant que notre équipe a une expérience de ce modèle avec plus de 60 procédures réalisées depuis 2019. Enfin notre protocole prévoit des prélèvements sanguins et des biopsies myocardiques répétées sur le cœur perfusé ex vivo avec respectivement un volume (10 mL) et un poids (20 mg) de prélèvement minimum afin de pouvoir réaliser les analyses métabolomiques. L’expérimentation sur le porc se prête à ce type de prélèvements répétés, contrairement à un modèle rongeur qui permettrait un recueil plasmatique et tissulaire de plus faible quantité. Les animaux de ce protocole sont des porcs de 50kg (environ 90 jours) afin d’avoir un gabarit proche de celui d’un homme. A ce stade, ils ont une anatomie cardiovasculaire semblable à l’Homme avec des diamètres d’aorte et d’artère pulmonaire compatible avec l’instrumentation du cœur sur module de perfusion isolé ex vivo.
Étude d’approches thérapeutiques pour corriger la locomotion et la force musculaire de souris modèle pour une maladie neurodégénérative, la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de sclérose latérale amyotrophique, elles reçoivent des injections intraveineuses et intracrâniennes de molécules, puis passent chaque mois pendant dix-huit mois une batterie de tests locomoteurs (rotarod, grip test, marche sur planche à trous, open field) et une mesure de force musculaire sous anesthésie. L'objectif est de tester la correction de la faiblesse musculaire, aucun traitement n'existant pour cette maladie. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de disposer d'un modèle animal car aucun système cellulaire ne reproduit les troubles de la locomotion à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier la correction des altérations locomotrices et de la force musculaire chez des souris modèles d’une maladie humaine musculaire, la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA, ou maladie de Charcot), pour laquelle il n’existe pas de traitement. Cette pathologie est due à une anomalie de l’ADN qui entraine une perte des neurone moteurs, aboutissant in fine à un affaiblissement des muscles squelettiques. Ayant précédemment identifié le mécanisme de cette mort neuronale, nous souhaitons désormais développer une approche thérapeutique pour cette maladie. Plus précisément, nous souhaitons injecter en intraveineux différentes molécules thérapeutiques, que nous avons précédemment validées en modèle cellulaire, dans des souris adultes modèle de cette maladie, et ceci afin d’étudier la correction du phénotype neuromusculaire de ces animaux. Pour cela nous effectueront une batterie de test non invasif de la locomotion et une mesure de la force musculaire de ces animaux chaque mois sur une période d’environ un an. Nous espérons que cette approche nous permettra d’ouvrir une piste thérapeutique pour cette maladie.
Bénéfices attendus
Nous avons besoin de modèles animaux pour développer une approche thérapeutique pour la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), car il n’existe pas de modèle in vitro ou de système cellulaire pour étudier la correction de la neurodégénérescence, de la faiblesse musculaire et les altérations de la locomotion caractéristiques de ces pathologies. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour étudier cette maladie. Enfin, l’analyse de la correction de la faiblesse musculaire dans ce modèle murin a un véritable intérêt pré-clinique pour développer et tester des pistes thérapeutiques pour cette maladie neurodégénérative.
Procédures
1 – Les injections en intrapéritonéale, notamment d’agents anesthésiques, requièrent moins d'une minute. 2 - Les injections en sous cutané, notamment d’agents analgésiques, requièrent moins d'une minute. 3 – Une injection intraveineuse de virus adéno associé (AAV) requiert entre 30 secondes et 1 minute par animal. 4 - Une injection stéréotaxique intra-crâniales d’une molécule thérapeutique requiert entre 5 et 7 minutes par animal. 5 – L’analyse de la locomotion se fait par une batterie de tests non invasifs réalisés chaque mois et ceci sur une période de 18 mois. Ces tests s’étalent sur une durée de 10 à 15 jours selon un protocole classique : pour le rotarod, 3 tests de 5 min sont réalisés par souris ; le grip test et la marche en équilibre sur planche à trou sont aussi réalisés trois fois (environ 5 min) par souris et l’open field est un test de 30 minutes par animal. 6 – La mesure de la force musculaire est réalisée en 4 à 8 minutes sous anesthésie gazeuse. Cette mesure est répétée chaque mois (mais en décalage de 10 à 15 jours avec les tests locomoteurs) et ceci sur une période de 18 mois. En conclusion, chaque animal recevra à l’âge de deux mois une injection intraveineuse rétro-orbitale sous anesthésie gazeuse (entre 30 secondes et une minute), puis trois semaines plus tard une injection sous cutanée d’un analgésique et une injection intrapéritonéale d’anesthésiques suivie d’une injection stéréotaxique intra-crâniales d’une molécule thérapeutique (d’une durée de 5 à 7 minutes). Un mois après cette injection intra-crâniale, le phénotype de cet animal sera suivi par une batterie de tests locomoteurs non invasifs (rotarod, grip test, bar test puis rotarod) répartis sur 10 à 15 jours, puis deux semaines après le dernier test, nous effectuerons une mesure de leur force musculaire sous anesthésie gazeuse en 4 à 8 minutes. Ces tests locomoteurs et mesure de force seront répétées environ chaque mois sur une période de 18 mois.
Impact sur les animaux
Nous souhaitons étudier une maladie neurodégénérative et neuromusculaire touchant les adultes, et ceci en utilisant un modèle animal ; nous nous attendons donc à l’éventuelle apparition d’altérations locomotrices et/ou d’une faiblesse musculaire chez ces souris. Il est à noter que les tests locomoteurs que nous utiliserons pour évaluer l’apparition de ces altérations sont classiques, non invasifs et sans douleur. De même, il est à noter que la mesure de la force musculaire se fait sous anesthésie. Concernant le nombre d’animaux étudié, des travaux précédents et l’étude de la littérature nous ont permis d’établir que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le facteur de comparaison sera la dose et la nature de molécule thérapeutique. Ainsi, compte tenu de notre projet d’analyser 3 doses de traitements de 5 molécules (4 thérapeutiques et une molécule contrôle), sous deux conditions (contrôle ou pathologique), nous estimons que l’étude de 360 animaux sur 3 à 5 ans est nécessaire.
Devenir
Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs tissus (muscle, cerveaux, etc.) pour des analyses histopathologiques et moléculaires.
Remplacement
Cette étude a pour but de tester des approches thérapeutiques dans un modèle d’une maladie neurodégénérative et neuromusculaire causée par une mutation génétique, la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme entier ; en effet des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire des troubles de la locomotion ou de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. De plus, nous avons établi précédemment que le modèle souris est un bon modèle animal d'étude de cette maladie.
Réduction
L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents et l’étude de la littérature nous ont permis d’établir les doses de molécules thérapeutiques à injecter, les temps d'analyses et que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le facteur de comparaison sera la dose et la nature de molécule thérapeutique et compte tenu de notre projet d’analyser 3 doses de traitements de 5 molécules (4 thérapeutiques et un contrôle), sous deux conditions (contrôle ou pathologique), nous estimons que l’étude de 360 animaux sur 3 à 5 ans est nécessaire.
Raffinement
Afin de diminuer le stress et la douleur liées à la mesure de la force musculaire par stimulation électrique et aux injections intraveineuses et intracérébrales ; ces procédures expérimentales se font toutes sous anesthésie. Les point limites seront alors déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après l'injection de l'animal (changement du comportement (akinésie, prostration, paralysie), réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure d'injection seront arrêtés si ces points limites sont atteints.
Choix des espèces
Cette étude a pour but de tester des approches thérapeutiques dans un modèle d’une maladie neurodégénérative et neuromusculaire causée par une mutation génétique, la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme entier ; en effet des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire des troubles de la locomotion ou de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. Enfin, nous allons étudier des approches thérapeutiques sur le comportement locomoteur et la force musculaire chez des souris adultes, en effet la maladie que nous étudions touche les adultes. Enfin, nous suivrons le comportement locomoteur et la force musculaire de ces animaux sur une période de 18 mois. Ce protocole a été choisi d’après nos expériences précédentes et par l’étude de la littérature et ceci afin de reproduire l’aspect progressif de la maladie étudiée.