Recherche appliquée

Pour savoir si des cellules stromales issues du tissu adipeux peuvent traiter la sclérodermie systémique, 154 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement du sang, des poumons, de la rate et de la peau. Elles reçoivent des injections dans le derme cinq jours par semaine pendant quatre ou six semaines, soit jusqu'à trente, et une seule injection de ces cellules dans la veine de la queue. La bléomycine ou l'acide hypochloreux injectés peuvent provoquer des démangeaisons, parfois des plaies ou des irritations de la peau, et les souris développent une fibrose de la peau et des poumons. Le porteur affirme que cette fibrose pulmonaire n'entraîne "pas de signes de difficulté ou de souffrance respiratoires", ne mentionne aucun point limite, et prévoit seulement que des sédatifs ou des antidouleurs "pourront" être donnés si des signes de souffrance apparaissent.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer la possibilité d’utiliser des cellules stromales mésenchymateuses d'origine adipocytaire (ASCs) en clinique (traiter des patients atteints de sclérodermie systémique). Ainsi, nous évaluerons leurs effets thérapeutiques (réduction de l’inflammation et de la fibrose cutanée et /ou pulmonaire), leurs interactions avec différents types de cellules immunitaires et le(s) mécanisme(s) impliqué(s) dans leurs effets thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet sera de valider si la thérapie cellulaire de cellules stromales et en particulier d'origine adipocytaire (ASCs) est efficace pour contrer les troubles majeurs de la sclérodermie systémique que sont la fibrose cutanée et pulmonaire et, dans une moindre mesure, la production d’anticorps et d’apporter de nouvelles connaissances sur leurs effets thérapeutiques.

Procédures

Les souris seront soumises à une injection intra-dermique (5 jours/semaine) pendant 4 semaines ou pendant 6 semaines et à une seule injection intraveineuse dans la veine caudale de cellules souches stromales d'origine adipocytaire (ASCs).

Impact sur les animaux

L'injection intra-dermique de Bléomycine ou d'acide hypochloreux peut entrainer une gène (démangeaisons) dans les 2-3 minutes post-injection et aussi parfois des petites plaies ou des irritations cutanées au point d'injection. Ces souris développent une fibrose cutanée au point d'injection et une fibrose pulmonaire modérée, limitée à la région sous-pleurale qui n'entraine pas de signes de difficulté ou de souffrance respiratoires.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de tissus et d'organes (sang, poumons, rate et peau)

Remplacement

Il est important de voir les effets thérapeutiques des cellules mésenchymateuses stromales au niveau de l’animal entier portant une maladie surtout quand celle-ci touche plusieurs tissus ou organes et qu’elle est caractérisée par une autoimmunité (présence d’auto-anticorps dans la circulation sanguine), impossible à reproduire in vitro. La souris possède de nombreuses caractéristiques physiopathologiques communes avec l’homme, indispensables à l’extrapolation des résultats.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux pour ce projet, nous testerons la tolérance des souris à l'injection des cellules souches stromales adipocytaires (ASCs) uniquement dans la procédure N°1 et sur un nombre réduit de souris c'est à dire 5 souris/groupe au lieu de 10 pour les groupes de souris malades.

Raffinement

Les procédures ont été travaillées pour limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront au maximum 5 dans des cages enrichies. Une observation quotidienne des souris sera réalisée (apparence physique, comportement), une pesée sera réalisée une fois par semaine et, si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux, des sédatifs ou anti-douleurs adaptés (après avis du vétérinaire) pourront être leur être administré.

Choix des espèces

Parmi les rongeurs, il n'existe pas d'autres modèles de sclérodermie systémique que le modèle murin. Par ailleurs, le modèle murin est indispensable pour suivre l'apparition des effets systémiques et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps. Les souris seront adultes car la sclérodermie systémique est une pathologie qui affecte les adultes

Une injection intrapéritonéale par jour pendant deux jours, sous anesthésie locale, puis une anesthésie générale sans réveil attendent la moitié des 162 souris de ce projet, l'autre moitié étant seulement endormie avant d'être tuée. Toutes sont mises à mort pour des prélèvements d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'équipe veut préciser le rôle du métabolisme dans l'altération de l'immunité des patients atteints de syndrome de détresse respiratoire aiguë, une insuffisance respiratoire mortelle dans 30 à 40 % des cas. Le porteur affirme avoir choisi "le modèle le plus pertinent" parmi dix qui reproduisent ce syndrome, sans dire lequel ni ce que contiennent les injections, et ne décrit comme effets qu'une "douleur légère de courte durée" et un "léger stress".

Objectifs

Le syndrome de détresse respiratoire aigüe (SDRA) est une forme gravissime d'insuffisance respiratoire avec une mortalité élevée (30-40%) sans traitement curatif disponible. Les patients atteints de SDRA présentent une altération des réponses immunitaires qui participent à la gravité de ce syndrome et donc au taux de mortalité. Nous avons pu mettre en évidence chez ces patients que l’altération de leur réponse immunitaire pourrait être liée à des anomalies métaboliques. Nos objectifs sont donc de préciser le rôle du métabolisme dans l’altération des réponses immunitaires afin d’identifier des cibles thérapeutiques pertinentes visant à corriger ces anomalies. Ce syndrome complexe et sévère fait intervenir plusieurs types cellulaires et seule l'expérimentation animale nous permettra de retrouver l'ensemble des acteurs au sein d'un même modèle.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels le métabolisme pourrait influencer la dysimmunité dans le SDRA pourrait aider à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et/ou permettre de développer des outils pour la prise en charge et le suivi de l'évolution clinique des patients.

Procédures

La moitié des animaux (9 groupes) subira 2 interventions, chacune de très courte durée (

Impact sur les animaux

Les injections induisent une douleur légère de courte durée limitée par l'application d'un anesthésique local. La contention nécessaire pour effectuer l'injection induit un stress de courte durée. L'induction de l'anesthésie nécessite une légère contention de l'animal pour le placer dans une cage d'induction et n'induit pas de douleur hormis un léger stress de courte durée.

Devenir

Euthanasies pour prélèvement d'organes à l'issue de la procédure pour des études de biologie moléculaire.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux dans l’étude du syndrome de détresse respiratoire aigüe est nécessaire pour reproduire au mieux ce syndrome. Il n'existe à ce jour aucune méthode alternative ou substitutive qui permette un remplacement in vitro car le métabolisme et la réponse inflammatoire et immunitaire représentent des systèmes intégrés qui ne peuvent être étudiés qu’in vivo. En effet, l’utilisation d’animaux permettra d’étudier de manière simultanée les interactions de plusieurs organes et types cellulaires : d’un côté le poumon, en particulier les cellules endothéliales pulmonaires, le parenchyme pulmonaire, les cellules immunes résidentes au niveau du poumon; de l’autre côté, les facteurs circulants, les médiateurs inflammatoires, les adipokines, les hormones et les cellules immunes circulantes ; enfin, le tissu adipeux.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en utilisant un test statistique de puissance qui permet de garantir l’observation de résultats exploitables. Grâce à ce test, nous obtenons n = 7 animaux par groupe.

Raffinement

Les souris bénéficieront d'un enrichissement de milieu avec du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois, raffinant ainsi leurs conditions de vie. Ces animaux ne seront jamais hébergés seuls dans des cages séparées et feront l'objet d'une période d'adaptation d'une semaine après leur arrivée avant de débuter une procédure. Les injections seront précédées d'une anesthésie locale afin de diminuer au maximum la douleur pouvant être engendrée. Pour la réalisation de la procédure, des points limites précoces ont été établis au moyen d'un score et seront appliqués si nécessaire, comme défini dans la description de la procédure. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de veiller à leur bien-être.

Choix des espèces

En ce qui concerne le modèle, nous avons choisi avec attention le modèle le plus pertinent pour notre projet parmi les 10 modèles qui miment le syndrome de détresse respiratoire aigu chez l’Homme. En ce qui concerne l’espèce, nous avons choisi la souris car nous prévoyons d’utiliser des animaux transgéniques. Afin que nos résultats soient comparés aux travaux de la littérature dans ce domaine, des souris âgées de 5 semaines et pesant 20 grammes chacune seront utilisées.

52 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'anticorps humains anti-contactine 1, des prélèvements de sang et d'urine et un isolement de quatre heures pour la collecte d'urine, avant prélèvement des reins et des nerfs, pour reproduire une maladie rénale auto-immune. Le porteur indique que les injections peuvent déclencher une atteinte rénale ou neurologique mimant la maladie humaine. Il justifie le choix du hamster par le fait qu'il exprime la contactine dans le rein, à la différence des souris, rats, lapins et cobayes testés, et qu'il est plus facile à élever que le porc.

Objectifs

La polyneuropathie démyélinisante chronique (PIDC) est une maladie auto-immune du système nerveux. Plusieurs cibles de ces anticorps dirigés contre soi ont été découvertes, parmi lesquelles des protéines présentes sur les neurones comme la contactine 1. La survenue concomitante chez certains patients d’une PIDC et d'une maladie auto-immune du rein (GEM : glomérulopathie extramembraneuse), dont l’évolution clinique est variable et peut aller jusqu’à la perte totale de la fonction rénale, est connue de longue date. Ces deux maladies concomitantes ont souvent été décrites mais leur lien n'a jamais été établi dans la bibliographie. Ainsi, la contactine 1 a été identifiée dans des petits amas de vaisseaux sanguins participant à la filtration rénale, puis la présence simultanée des anticorps anti-contactine dans le nerf et dans le rein a été mise en évidence. L’objectif principal de ce projet est de confirmer dans un modèle hamster l'implication des anticorps anti-contactine 1 dans cette maladie rénale via la reproduction de la maladie chez le Hamster mais aussi, à analyser les dysfonctionnements aux niveaux clinique et tissulaire provoqués par les anticorps anti-contactine humains afin de mieux connaitre cette maladie pour pouvoir ensuite adapter le diagnostic et les traitements de cette maladie chez l'homme.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de confirmer l'implication des anticorps anti-contactine et leur lien avec le développement d’une atteinte rénale induisant des modifications biochimiques et histologiques. Ce travail de recherche ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques dans la prise en charge de la glomérulopathie extramembraneuse ainsi que dans le développement de tests de dépistage et d’évaluation de la maladie si le rôle pathogène des anticorps est confirmé et si leur concentration a une valeur pronostique.

Procédures

Les animaux seront impliqués dans deux procédures distinctes de sévérité modérée qui se dérouleront en plusieurs étapes et sur une durée de 11 jours pour la première procédure et 11 semaines pour la seconde. Concernant la première procédure, une injection d'anticorps dans la circulation sanguine des animaux aura lieu au tout début de l'expérimentation. Des prélèvements sanguin et urinaire auront lieu 3 fois sur la durée des 11 jours d'expérimentation afin de suivre la fonction rénale des animaux. Concernant la seconde procédure, 4 injections d'anticorps sont prévu sur une durée totale d'expérimentation de 11 semaines. Des prélèvements sanguins et urinaires seront réalisés en moyenne deux fois par semaine. Pour les prélèvement urinaires, les animaux seront isolés en moyenne deux fois par semaines pendant 4 heures afin de prélever leurs urines, cela pouvant provoquer du stress et de l'angoisse chez les animaux. Les animaux seront systématiquement anesthésiés avant chaque intervention afin de diminuer leur angoisse et leurs stress. Les injections et prélèvements réalisés ne dureront pas plus de 10 min. Au bout des 11 jours pour la première procédure ou 11 semaines pour la seconde, ou si les animaux montrent des signes de souffrance, les reins et nerfs seront prélevés dans le but d'étudier l'impact que les anticorps ont eu sur les hamsters. Ces prélèvement seront réalisés sous anesthésie et juste avant l'euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Ppour les prélèvements sanguins les animaux seront anesthésiés donc ils auront un leger stress du à l'injection IP d'anesthésique. Pour les Hamsters ayant reçu des injections d'anticorps anti-contactine1, des nuisances liées à l'apparition d'une maladie rénale et/ou neurologique qui mime la pathologie humaine, peuvent apparaitre.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure puisque leurs organes sont nécessaires à l'étude de la pathogénicité des anticorps anti-contactine1.

Remplacement

L’objectif principal de cette étude est de démontrer que l’injection des anticorps anti-contactine1 humains induit chez le Hamster des altérations neurologiques et de la fonction des reins similaires à celles observées chez l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif.

Réduction

52 animaux seront utilisés pendant 1 an pour cette étude. Le modèle hamster visant à recréer une maladie auto-immune rénale avec des injections d’anti-contactine1 étant unique, il est difficile de prévoir le juste nombre d’animaux nécessaire à cette étude. Le nombre d’animaux a été réduit en veillant toutefois à travailler sur un nombre suffisant pour obtenir une différence statistiquement significative entre les groupes en cas de comparaison. Ainsi, le nombre d’animaux par groupe a été fixé à 4 pour l'étude préliminaire visant à visant à confirmer que les immunoglobulines humaines contenant l’anticorps anti-contactine pourront se fixer sur les reins des hamsters et induire des dépôts immuns. Il y a deux groupe d'animaux pour cette analyse soit 8 animaux. Concernant la seconde partie de l'étude, si l'étude préliminaire est concluante, 4 animaux par groupe seront nécessaires, avec également deux groupes d'animaux, afin de déterminer les doses adéquate d'anticorps à injecter aux animaux. Enfin, 36 animaux seront nécessaire pour l'étude principale qui vise à induire la maladie cliniquement et à évaluer l’atteinte rénale. Les 36 animaux seront réparties dans 3 groupes de 12 animaux qui recevront des injections d'anticorps issues de patients ayant des pathologies nephrotiques et/ou neurologiques différentes.

Raffinement

Nous attachons une importance majeure sur les conditions d’hébergement et la qualité de vie des animaux. C’est pourquoi, une période d'acclimatation d'une semaine sera mise en place à l’arrivée des animaux. Ils seront hébergés en groupe afin de limiter leur stress. Pour les phases d'injections de substances et de prélèvements, une anesthésie sera réalisée afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal. Lors des quelques gestes possiblement douloureux, un antidouleur sera administré à l’animal. Dans le but de préserver le bien-être des animaux, nous avons prévu de mettre en place des critères d’interruption des interventions expérimentales basées sur des paramètres mesurables non invasifs.

Choix des espèces

Nous avons préalablement recherché in vitro la contactine dans les reins des animaux utilisés en routine dans les animaleries souris, rats, lapins et cochons d’Inde mais aucun d’entre eux n’exprime la contactine dans le rein. Seul le Hamster et le porc expriment cette protéine dans leur reins. Notre choix s'est ensuite porté sur le modèle Hamster car plus facile à élever. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 10-14 semaines, pour des raisons techniques (poids entre 100-120g), permettant des groupes homogènes.

1 032 souris et 600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une parodontite par ligature ou injections répétées dans la gencive, certains subissant une chirurgie stéréotaxique avec injections intracérébrales, un hébergement isolé en cage métabolique et des prélèvements de sang et de liquide céphalorachidien, pour tester le lien entre infection buccale et maladies neurodégénératives. Le porteur indique n'attendre qu'un inconfort léger et des saignements gingivaux, sans effet secondaire notable. Sur le remplacement, il affirme que l'usage d'animaux vivants revêt un caractère de "stricte nécessité" et que ces évaluations ne peuvent se faire sans modèle animal.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives regroupent un ensemble de pathologies affectant le système nerveux, dont la plus prévalente est la maladie d’Alzheimer (MA) faisant partie des tauopathies. Dans les tauopathies, la protéine Tau est hyperphosphorylée et présente un repliement anormal, provoquant une perte de sa fonction physiologique et un gain de fonction toxique. La protéine Tau anormale est délocalisée vers le soma puis les dendrites où elle s’accumule, générant une dysfonction synaptique. Ces dernières années, est apparue l’hypothèse qu’une inflammation, progressive et auto-entretenue, du système nerveux central (SNC), peut constituer un terrain favorable à une neurodégénérescence. Les infections périphériques, en agissant sur les processus neuro-inflammatoires, contribueraient au déclenchement et/ou à l’évolution péjorative de ces pathologies. Les parodontites, pathologies buccales infectieuses figurant parmi les affections humaines les plus fréquentes, sont caractérisées par des lésions inflammatoires chroniques des tissus de soutien des dents. Elles sont reconnues comme associées à la progression négatives de diverses pathologies systémiques dont les pathologies neurodégénératives. Cependant le schéma spatio-temporel pouvant lier tauopathies et pathologie infectieuse/inflammatoire périphérique comme la parodontite est encore mal connu. Dans ce contexte général, notre projet vise a investiguer de manière large le schéma spatio-temporel liant infections et inflammation périphériques, neuroinflammation et tauopathie pour mieux définir dans quelle mesure l’immunité innée/adaptative dans le système nerveux central (SNC) mais également les processus immunitaires périphériques sont impliqués dans le développement de la tauopathie. Notre hypothèse est que les infections et/ou inflammations périphériques aggravent voire induisent les signes biologiques et cliniques des tauopathies.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l’obtention de données satisfaisantes permettant : - D’identifier les conséquences d’une infection périphérique buccale ou d’une inflammation systémique sur l’initiation ou la progression des tauopathies. - D’élucider des voies mécanistiques liant les tauopathies et les parodontites afin de mettre en évidence des cibles thérapeutiques ou des marqueurs diagnostiques. En effet, l’induction d’une parodontite expérimentale sur un terrain avéré de prédisposition à une pathologie neurodégénérative permettra de vérifier le rôle potentiel de la parodontite dans l’exacerbation, l’entretien voire le déclenchement de la neuroinflammation et de la neurodégénérescence chez un individu susceptible. Si la parodontite est un facteur aggravant les tauopathies, alors cliniquement les patients atteints de tauopathies devraient bénéficier d’un examen parodontal et d’une prise en charge parodontale en cas de pathologie détectée. Les données que nous obtiendrons avec ce projet sont importantes pour améliorer à moyen terme la prise en charge globale des patients atteints de tauopathies dont la maladie d’Alzheimer et à long terme la santé orale de ces patients. D’autre part, l’induction d’une parodontite expérimentale chez un animal sans prédisposition permettra de vérifier le rôle potentiel de la parodontite dans l’induction de la neuroinflammation et de la neurodégénérescence. Si ce rôle est vérifié, alors cliniquement les patients atteints de parodontite pourrait faire l’objet de dépistage de troubles cognitifs de manière préventive. Il serait alors interessant de pousser la recherche vers des études cliniques en fonction des stades et grades de la parodontite pour déterminer si une catégorie de patient atteint de parodontite serait plus à risque (parodontite sévère de stade III ou IV, à progression rapide grade C par exemple). Compte tenu de la charge mondiale des troubles du déclin cognitif due aux changements démographiques, la recherche et l’identification de facteurs de risque potentiellement modifiables de tauopathies comme proposé dans notre projet fait partie intégrante des efforts de recherche multidisciplinaires. De plus, l’emploi de différents modèles dans notre projet, devrait permettre d’identifier le modèle le plus optimal pour l’analyse des mécanismes et du schéma spatio-temporel des liens entre pathologies neurodégénératives et parodontite et donc raffiner la modélisation pour les études futures.

Procédures

Ce projet comporte 2 procédures chirurgicales (induction de la parodontite, injection par stéréotaxie). L’induction de la parodontite se fera par 2 techniques différentes, l’une nécessitant une seule intervention et un suivi pendant 4 semaines, l’autre nécessitant des injections répétées trois fois par semaine pendant 24 jours. L’emploi de ces deux techniques permet de reproduire des aspects différents de la parodontite (évolution lente ou évolution rapide) pour des groupes d’animaux différents. Pendant cette période, 540 rongeurs bénéficieront d’un suivi à l’aide de cages métaboliques où les animaux seront hébergés seuls afin de déterminer leur balance énergétique. Pour ces deux techniques il sera attendu 10 jours avant de placer les animaux dans les cages métaboliques et une période d’acclimatation d’au moins 48 heures avec de la litière identique à leur cage d’hébergement et dans un espace suffisant au regard de leur poids. La stéréotaxie sera effectuée une seule fois avec pose de canule permettant des injections intracérébrales une fois par jour pendant 6 jours. L’intégralité des animaux seront suivis d’un point de vue comportemental ayant pour objectif de tester les capacités cognitives des animaux. Au cours des deux procédures, des prélèvements sanguins seront effectués une fois par semaine et juste avant la mise à mort sur animaux vigiles pour lesquels la douleur sera prévenue par application d’un anesthésique local. Au cours de la procédure faisant appel à la stéréotaxie, du liquide céphalo-rachidien sera prélevé une fois sur les animaux anesthésiés, avant leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Les procédures chirugicales (induction de parodontite, perfusion ou stéréotaxie) seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Le suivi post-opératoire sera réalisé par du personnel formé au bien-être animal. Les procédures comme la stéréotaxie ou la pose de perfusion sont des procédures courantes dans le laboratoire. Les conséquences attendues sont minimes sur le bien-être animal. Aucun effet secondaire n'est attendu sur les animaux du fait de l’induction de la parodontite. Les procédures exécutées ne provoqueront qu'un inconfort léger (pose d'une ligature à la base d'une dent, et injections dans la gencive). Une absence de perte de poids consécutive à la pose de ligature est attendue comme dans une étude précédente. Les injections au niveau gingival peuvent entrainer des saignements au point d’injection sans nuisance sur le comportement de l’animal. Les injections seront effectuées de manière lente pour éviter l’apparition de grosseurs/nodules au niveau de la gencive. Dans le cas où certains animaux rencontreraient tout de même des difficultés à l’alimentation, de la nourriture en gel sera mise en place.

Devenir

A l'issue des procédures (P1) et (P2), tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour permettre des analyses des tissus parodontaux et cérébraux.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer différents aspects de la physiopathologie des tauopathies en lien avec les performances cognitives et des pathologies induites au niveau périphérique. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité. En effet, nos travaux visent à mettre en lien les atteintes périphériques infectieuses et inflammatoires avec des altérations comportementales, histologiques, biochimiques et moléculaires neuronaux et d’en étudier les facteurs modulateurs au cours du vieillissement. Cela nécessite donc le développement d’approches neurobiologiques intégrées. De plus les modèles expérimentaux sont largement utilisés pour vérifier les hypothèses biologiques de la relation entre la parodontite et d’autres maladies systémiques pour permettre le contrôle de facteurs étiologiques supposés. Ces évaluations particulières ne peuvent pas être réalisées en utilisant des alternatives aux modèles animaux.

Réduction

Le nombre total d’animaux concernant les procédures de notre protocole sur les 5 ans à venir est donc estimé à 1632 (1032 souris et 600 rats). Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui peut limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Pour chacun des groupes constitués, le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant l'obtention de résultats satisfaisant (différences statistiquement observables). Pour limiter le nombre d’animaux, une réutilisation des animaux des animaleries employés pour la formation sera effectuée pour la mise au point des modèles de parodontite. Un calcul du nombre d’animaux total nécessaire par groupe a été effectué pour respecter le principe des 3R. De plus les animaux seront utilisés pour plusieurs interventions au sein des procédures expérimentales afin de réduire leur nombre. Pour l’étude statistique, une comparaison des groupes d’animaux deux à deux entre les animaux contrôles et les animaux tests sera effectuée.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours, et pesés au moins 1 fois par semaine, par du personnel spécialement formé. Durant l'étude, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Les animaux seront hébergés en groupe, et des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition: blocs à ronger pour les rats, coton pour la confection de nids... Les animaux seront suivis précisément pour chaque protocole, pour lesquels des points limites adaptés ont été définis. Toute souffrance, angoisse ou comportement inhabituel sera pris en charge par des approches appropriées. Les procédures expérimentales de chirurgies seront réalisées, après une prémédication analgésique, sous anesthésie générale par voie intrapéritonéale. En cas de douleur, un analgésique complémentaire sera administré. Les animaux présentant un des points limites spécifiés pour chaque approche expérimentale seront sacrifiés dans une salle dédiée; le tout en lien avec le responsable du bien être animal.

Choix des espèces

Ces espèces sont utilisées parce que rats et souris peuvent être évalués par des méthodes comportementales et être génétiquement modifiés par injections de vecteurs viraux ou transgénèse. Les souris transgéniques utilisées dans notre protocole reproduisent un certain nombre d’altérations retrouvées dans la Maladie d’Alzheimer et les tauopathies (lésions amyloïdes : APP/PS1dE9, APPP KI, hyperphosphorylation/troncation, agrégation/altération d’épissage/perte de fonction de la protéine Tau : THY-Tau22, THY-Tau30, TauKO, Tau-KI, MiniTau. Le parodonte des rongeurs et notamment du rat est assez similaire à celui de l'homme notamment d’un point de vue anatomique dans la région molaire. L’avantage de ce modèle animal est aussi de pouvoir mener une étude sur des groupes homogènes et alors minimiser les effets de la variabilité biologique. Dans la plupart des expérimentations, les souris et les rats seront utilisées à l’âge adulte : entre 2 mois à 12 mois.

1 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une xénogreffe tumorale et reçoivent des séries d'injections intraveineuses, orales et intrapéritonéales de composés à base d'or, pour comparer l'efficacité anticancéreuse de ces molécules. Le porteur indique que la tumeur peut gêner les déplacements et que sa nécrose peut ouvrir une plaie susceptible de s'agrandir par frottement ou cannibalisme, paramètre qu'il comptabilise comme signe d'efficacité. Sur le remplacement, il souligne que les composés ont d'abord été identifiés in vitro sans animaux, tout en jugeant le passage in vivo nécessaire.

Objectifs

L'identification de nouvelles séries chimiques originales et efficaces sur les cibles thérapeutiques est devenue un des défis majeurs auxquels les industries pharmaceutiques sont confrontées. Dans l’optique d’étendre la diversité chimique et d’explorer de nouveaux territoires synthétiques, en utilisant la chimie organique nous pouvons envisager plusieurs approches et notamment le design de squelette in silico à partir de méthodes computationnelles. L'équipe de chimistes co-porteuse du projet s’intéresse à la conception et la synthèse d’outils chimiques par la synthèse de nouveaux complexes organométalliques de métaux de transition. Ces outils sont conçus en vue d’application en chimie médicinale. Deux familles de composés à base d'or ont été synthétisées, montrant une activité biologique vis-à-vis des cellules cancéreuses in vitro.

Bénéfices attendus

Les traitements anticancéreux à base de métaux sont apparus au milieu des années 1960 avec l’apparition de composé à base de platine comme le cisplatine. Bien que ces complexes soient utilisés en thérapie ils présentent des effets secondaires importants (neurotoxicité, néphrotoxicité...) sur l’Homme et/ou des résistances. Des études ont été menées pour remplacer le platine par de l’or (III). Ainsi nous avons synthétisé de nombreux complexes d’or avec des ligands CN (Carbone - Azote) ou PP (Phosphore-Phosphore) que nous avons testé sur des lignées cellulaires cancéreuses. Sur 28 composés des familles CN et des familles PP, nous avons mis en évidence une activité biologique anti-cancéreuse. Pour le projet présent nous souhaitons testés in vivo les 5 meilleurs par famille (famille CN et famille PP).

Procédures

Les souris seront soumises aux interventions suivantes : 9 injections en IV sur animaux vigiles sur réparties sur une durée de 19 jours. 5 injections per os sur animaux vigiles 5 jours d'affilés. 5 injections IV sur animaux vigiles sur 5 jours d'affilés 6 injections IV sur animaux vigiles sur réparties sur une durée de 19 jours. 1 injection IP sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

La xénogreffe provoque le développement d'une tumeur solide. Les tumeurs ne sont pas innervées et elles n'entraînent pas de douleur. En revanche la taille tumorale peut provoquer des difficultés de déplacement des souris. L'efficacité de nos composés à l'image des traitements chimiothérapeutiques standards, quand le traitement a un effet, se traduit par un ralentissement du développement de la tumeur, une stagnation ou encore une baisse de la taille tumorale. Ces effets sont la résultante de la destruction de la tumeur par des phénomènes de nécrose qui peuvent atteindre la surface de la tumeur et provoquer une plaie. Ces plaies peuvent s'agrandir soit par cannibalisme soit par frottement en raison du déplacement de la souris. Cependant plus le traitement est efficace plus la nécrose va se développer. Nous comptabilisons ce paramètre pour évaluer l'efficacité de la thérapie.

Devenir

A l'issus de la procédure 1 les animaux sont mises à mort afin de récupérer la tumeur et procéder à l'analyse fine de l'efficacité de nos composés. A l'issue de la procédure 2 les animaux sont mises à mort afin de récupérer la tumeur et procéder à l'analyse fine de l'efficacité en combinaison de nos composés

Remplacement

Le recours aux expérimentations in vitro a mis en évidence une action biologique des composés chimiques à base d'or parmi des centaines de composés obtenus par des synthèses chimiques. L'action biologique observée a été complétée par des expériences de biologie moléculaire et d'analyse cellulaire par cytométrie afin de mettre en évidence les cibles de nos composées et le mode d'action sur les cellules cancéreuses. Aucun animal n'a été utilisé dans cette découverte majeure pour un traitement anticancéreux.

Réduction

Nous avons limité le nombre d'animaux par groupe sans remettre en cause l'analyse statistique de nos résultats mais en prenant en compte la variabilité interanimales et intergroupes. En tenant compte de la bibliographie, notre expérience dans le domaine du traitement des cancers, des tests de puissance statistique pour la taille des groupes, et des effets attendus un nombre de 10 souris par groupe sera utilisé. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultat et d'analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été élaboré afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la règlementation, les animaux seront hébergés en portoir ventilé et ils disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de maison de type igloo et nous ajouterons des nids végétaux à base de fibres courtes de coton. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bienêtre des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites adaptés) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc...). L'administration des traitements devrait apporter un bénéfice pour les animaux avec un ralentissement de la progression tumorale. De plus, l’ensemble des gestes techniques qui sont réalisés sur animaux vigils sont pratiqués par des personnes formées et expérimentées avec du matériel adéquate permettant de réduire significativement les nuisances liées aux actes techniques.

Choix des espèces

Une espèce couramment utilisée et reconnue en oncologie. C'est un modèle ayant permis de déterminer l’importance du protocole d’administration, l’influence du volume tumoral et la toxicité des traitements. La physiologie de la souris est comparable à celle de l'Homme. Les souris seront achetées entre 4 et 5 semaines d'âges et après 1 semaine d’acclimatation entreront en protocole. Selon la fiche research models de la souche NMRI-Foxn1nu/nu proposée par le fournisseur, le poids des animaux se stabilise entre 28 et 35 jours d’âge. Ce stade de développement est couramment utilisé et validé par la communauté scientifique. L’identification par bague est privilégiée, car la plus pratique pour identifier les souris. Elle sera réalisée au cours de la semaine d’adaptation En cas de perte les animaux seront bagués de nouveau ou à défaut des marquages au feutre de couleur des queues pourront également être réalisées pour sécuriser l’identification.