Recherche appliquée

Sensibilisées à des allergènes, exposées deux fois par semaine pendant six semaines par inhalation, prélevées chaque semaine, 5 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les modèles reproduisent l'asthme allergique, l'allergie alimentaire et la réaction anaphylactique, cette dernière pouvant faire chuter la température corporelle. Une trachéotomie terminale sous anesthésie clôt le protocole, sans réveil possible. Toutes les souris sont ensuite tuées pour prélever sang et organes.

Objectifs

Les maladies allergiques, qu’elles soient respiratoires (comme l’asthme allergique) ou alimentaires, sont en constante augmentation dans le monde, aussi bien dans les pays développés que dans les pays en développement. En France, on estime qu’environ un tiers de la population est concerné par au moins une forme d’allergie. Certaines de ces pathologies peuvent être graves, voire mettre en jeu le pronostic vital, comme certaines formes sévères d’asthme ou les réactions allergiques aiguës liées à l’ingestion de fruits à coque. À ce jour, il n’existe pas de traitement permettant de prévenir efficacement les allergies ou d’en contrôler durablement les symptômes. Les mastocytes, qui sont des cellules du système immunitaire, jouent un rôle central dans les réactions allergiques. Leur activation, notamment via les immunoglobulines E (IgE), déclenche les phénomènes inflammatoires responsables des symptômes. Dans ce contexte, ce projet propose d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques reposant sur l’utilisation d’anticorps humanisés ciblant les IgE. Ces stratégies seront étudiées dans différents modèles d’allergies majeures, incluant l’asthme allergique, l’allergie alimentaire et les réactions anaphylactiques. L’objectif est d’améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans les allergies et d’identifier de potentielles pistes de traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans les maladies allergiques, en particulier dans l’asthme allergique, les allergies alimentaires et les réactions anaphylactiques. Ces pathologies, fréquentes et parfois graves, représentent un enjeu important de santé publique. Le projet proposé permettra de mieux caractériser le rôle de certains acteurs clés du système immunitaire dans le déclenchement et l’amplification des réactions allergiques. Cette meilleure compréhension est indispensable pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. À plus long terme, les connaissances acquises dans le cadre de ce projet pourraient contribuer au développement d’approches thérapeutiques innovantes, visant à prévenir ou à mieux contrôler les réactions allergiques, et ainsi à réduire leur impact sur la qualité de vie et la santé des patients.

Procédures

Chaque injection se fera sur animal vigile et sous contention (20 sec), alors que les inhalations (2x par semaine pendant 6 semaines) et les injections intra-dermiques (1x dans le modèle de PCA) se feront sous anesthésie gazeuse, (induction/perte de conscience : 2min ; inhalation 20 sec). Des prélèvements sanguins seront réalisés en sub-mandibulaire sur animal sous anesthésie gazeuse au minimum 1 fois par semaine, avec alternance des joues de prélèvement (induction/perte de conscience : 2min ; prélèvement : 30 sec). Une trachéotomie sera réalisée sous anesthésie générale, après vérification de la profondeur de la narcose et suppression de tout réflexe (10-15min), par du personnel diplomé en « chirurgie de l’animal de laboratoire », en fin de procédure expérimentale et sans réveil possible (procédure sans réveil).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus chez les animaux sont principalement liés aux procédures expérimentales et aux modèles d’allergie utilisés. Les administrations de traitements par injection peuvent entraîner une douleur aiguë de courte durée liée à la piqûre (quelques secondes) ainsi qu’un inconfort transitoire au point d’injection. Des nuisances spécifiques sont attendues en fonction des modèles d’allergie étudiés. Dans le modèle d’asthme allergique, l’exposition aux allergènes par voie respiratoire peut induire une gêne respiratoire transitoire. Dans le modèle d’allergie alimentaire, le gavage peut entraîner un stress de courte durée lié à la contention et à l’administration (environ 20 secondes). Ce modèle peut également provoquer des troubles digestifs (diarrhées, inconfort abdominal). L’induction d’une réaction anaphylactique peut entraîner une baisse transitoire de la température corporelle. Dans le modèle d’anaphylaxie cutanée, une inflammation locale (gonflement de l’oreille) est attendue, pouvant être associée à une sensibilité ou une douleur locale, difficilement quantifiable en l’absence de signes comportementaux marqués. Afin de limiter la douleur et le stress, plusieurs mesures seront mises en place. Les procédures potentiellement les plus invasives ou stressantes (notamment certains prélèvements sanguins et expositions par inhalation) seront réalisées sous anesthésie lorsque cela est compatible avec les objectifs scientifiques. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière permettant de détecter précocement tout signe de souffrance, et des critères d’arrêt seront appliqués si nécessaire.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser des prélèvements de sang et d’organes pour analyser les cellules et les tissus, notamment grâce à des techniques permettant d’identifier les différents types de cellules et d’observer leur organisation au sein des tissus (comme la cytométrie en flux ou l’histologie).

Remplacement

Bien que des expériences in vitro avec des cellules humaines ou d’animaux sont réalisées au laboratoire, celles-ci expériences in vitro ou méthodes alternitives ne permettent pas de reproduire la réponse systémique d’un organisme complet. Les maladies allergiques sont des maladies multifactorielles complexes dans lesquelles plusieurs organes du corps jouent un rôle important (épithélium, organes lymphoïdes secondaires, système vasculaire…). C’est pourquoi, l’utilisation d’animaux est primordiale afin d’étudier les mécanismes mis en jeu dans les différents modèles allergiques.

Réduction

L'expérience du porteur du projet dans l'analyse de ces divers modèles de pathologies et la présence des données préliminaires nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne de 4 animaux contrôle versus 4 animaux allergiques de même âge et sexe pour chaque expérience. Pour certaines procédures, chaque souris sera son propre contrôle (une oreille traité vs. une oreille contrôle). Les expériences seront répétées 3 fois de manière indépendante afin d’assurer la validité de nos résultats. En fonction du type d’expérience, du nombre d’échantillons analysés et de la distribution des valeurs, un des tests statistiques suivants sera utilisé :1-way ou 2-way ANOVA, Mann-Whitney ou unpaired 2-tailed Student’s t test.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et les conditions d'hébergement (enrichissement des cages avec des carrés de ouates, igloos...) seront également surveillées. Lors de leur arrivée dans la zootechnie d’expérimentation, quelle que soit leur origine, le souris auront une phase d’acclimatation dans une pièce séparée sur portoirs ventilés d’au moins cinq jours. Les souris seront hébergées à maximum 5 par cage de 500cm² en portoir ventilé dans un environnement contrôlé. L’enrichissement sera constitué d’une maison en plastique et de frisure de papier kraft pour faire un nid. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Bien que des signes de douleur ne semblent pas apparaître dans nos modèles d’allergie, tout animal, présentant une douleur évidente (isolement, baisse importante de l’activité, perte de poids > 10%, pilo-érection et/ou grimace) sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponible chez la souris et sous un fond génétique bien contrôlé. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présente de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles pathologiques mimant les maladies humaines observées chez les patients. Pour la majorité des expériences, les animaux seront utilisés entre 7 et 12 semaines, ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature.

Le protocole dépend du mode d'administration, de la fréquence et de la durée demandés par le donneur d'ordre: 600 rats, 120 porcs et 50 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des formulations de médicaments contre le diabète et l'obésité. Les porcs portent un cathéter à demeure jusqu'à quatre mois, subissent des jeûnes et des anesthésies répétées, les chiens et les rats des prélèvements de sang à la jugulaire. Le porteur décrit un effet possible trop marqué des molécules, avec hypoglycémie et perte de poids. Les rats sont tués en fin d'étude, les porcs réutilisés puis tués quand leur poids gêne les manipulations, une partie des chiens réutilisée et le reste proposé à l'adoption.

Objectifs

L’obésité et le diabète constituent deux enjeux majeurs de santé publique à l’échelle mondiale. Selon l’Organisation mondiale de la santé, la prévalence de l’obésité a presque triplé depuis 1975 : plus d’un milliard de personnes vivent désormais avec une obésité, dont une proportion croissante d’enfants et d’adolescents. Cette progression s’accompagne d’une augmentation rapide du diabète de type 2, fortement associé au surpoids et à la sédentarité. D’après l’International Diabetes Federation, environ 537 millions d’adultes vivaient avec un diabète en 2021, et ce chiffre pourrait dépasser 640 millions d’ici 2030. En Europe, la prévalence du diabète avoisine 8 à 10 % chez l’adulte, avec un poids économique considérable pour les systèmes de santé en raison des complications associées. Les traitements de ces maladies reposent en grande partie sur l’utilisation de différents types de molécules actives agissant sur la glycémie ou le métabolisme. Cependant, l’efficacité d’un médicament ne dépend pas uniquement de la molécule active qu’il contient, mais aussi de la manière dont elle est formulée et présenté. La forme pharmaceutique, c’est-à-dire la manière dont un médicament est présenté (comprimé, gélule), joue un rôle essentiel dans son efficacité. Elle influence la vitesse à laquelle le principe actif est libéré dans l’organisme, son absorption et donc l’intensité et la durée de son action. Les excipients, souvent perçus comme de simples composants « inactifs », sont également déterminants : ils assurent la stabilité du médicament, facilitent sa dissolution et son absorption. Ainsi, le choix de la forme pharmaceutique et des excipients ne relève pas seulement de la fabrication, mais constitue un levier majeur pour optimiser l’efficacité des traitements. Le but du projet est de tester de nouveau excipient qui ont vocation à améliorer l’efficacité de molécules pour mettre à disposition des thérapeutes un large panel de médicaments à action rapide ou lente pour le traitement ces pathologies.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont les suivants : 1- Santé : Pour les patients, de nouveaux traitements plus efficaces, mieux tolérés et plus simples d’utilisation pourraient améliorer significativement leur qualité de vie. Des formes d’administration moins contraignantes, des effets secondaires réduits et une meilleure efficacité sur le poids ou la glycémie favoriseraient l’adhésion au traitement et l’autonomie des personnes malades. 2- Economique : ces innovations pourraient générer des économies pour les systèmes de santé en réduisant les hospitalisations, les complications coûteuses et les traitements lourds associés aux formes avancées de la maladie.

Procédures

Les porcs seront anesthésiés pour la mise en place du cathéters. Les injections d'anesthésiques se feront dans le muscle et seront très bref, quelques secondes. Les animaux seront ensuite maintenus anesthésiés grâce à une anesthésie gazeuse. Ils resteront anesthésiés (gazeuse) le temps de la pose du cathéter soit environ 45min. Les cathéters restent à demeure et sont remplacés s'il deviennent non fonctionnel au cour du projet. Les prélèvements sont réalisés sur animaux vigiles par l'intermédiaire des cathéters. Si les cathéters sont non fonctionnel et qu'il n'est pas possible dans reposer un pour le prochain prélèvement, celui-ci sera réalisé à la jugulaire sur animal anesthésié. La pose de cathéters chez les chien sera réalisée sur animal vigile, les cathéters seront implantés à une veine au niveau de la patte. La durée de l'intervention est de 5 min. Un cathéter est posé avant chaque session de prélèvement. Les prélèvements sont réalisés sur animaux vigiles par l'intermédiaire des cathéters pour les temps court. Pour les temps long ou si le cathéter est non fonctionnel, les prélèvements sont réalisés sur animal vigile à la jugulaire. Nous réaliserons 4 à 5 prélèvements de ce type pour une durée n'excédant pas 1 min par prélèvement. Pour les rats, les prélèvements seront réalisés sur animal aneshésié (anesthésie gazeuse), les prélèvements sont réalisés à la jugulaire, la durée est 5min pour l'anesthésie plus le prélèvement. Le nombre de prélèvements sanguins nécessaire par session sera le suivant : Porc entre 15 à 18 prélèvements, chien entre 10 à 15 prélèvements et rats entre 10 à 15 prélèvements.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues peuvent être dus à un effet trop important des molécules testées. Il peut s’agir d’hypoglycémie, perte d’appétit, perte de poids survenant quelques jours après l’administration. Les élements suivants provoqueront du stress et un inconfort chez les animaux : 1- Toutes les anesthésies générales nécessaires aux prises de sang, aux administrations d'éléments d'essais ou aux poses de cathéter pour les porcs. 2- Les administrations d'élement d'essai sur animaux vigiles. Exemple administration orale chez le chien ou sous-cutané chez le rat. 3- L’isolement dû à la mise en place d’un cathéter, permanant chez le porc (maximum 4 mois) et transitoire chez le chien (max 4h). 4- Les mises a jeun nécessaire pour les administrations d'élements d'essais ou pour les anesthésies. La mise à jeun solide sera de 20H maximum pour les porcs et les chiens et de 6H pour les rats. La mise à jeun hydrique sera elle de 3H maximum pour les porcs, les chiens et les rats. 5-Pour les cohortes de porcs et de chiens la répétition des études peut engendrer des effets cumlatifs. Ces effets correspondent à l’ensemble des conséquences physiologiques (altération des paramètres sanguins), clinique (inflammation des sites de prélèvement) et comportementales (stress chronique) résultant de la répétition des procédures expérimentales.

Devenir

Pour les porcs, a l'issue de leur procédure et après une période de repos suffisante, les animaux peuvent être inclus dans une nouvelle session. Les animaux seront euthanasiés lorsque leur poids (85kg) ne permet plus un hébergement adapté ni des manipulations en toute sécurité. Pour les chiens, a l'issue de leur procédure et après une période de repos suffisante, les animaux peuvent être inclus dans une nouvelle session. Les animaux sont à terme réformés et entre dans un processus d'adoption ou peuvent être inclus dans d'autres projets. Pour les rats, la procédure présente des contraintes importantes (volume prélevé, anesthésies et prélèvements répétés), incompatible avec une reutilisation. Par conséquent ils seront euthanasiés en fin d'étude.

Remplacement

Les études in vitro sont utiles pour obtenir des premières informations sur le métabolisme ou la stabilité d’une molécule, mais elles ne peuvent pas reproduire la complexité d’un organisme vivant. La pharmacocinétique dépend en effet de nombreux processus intégrés : absorption digestive, distribution dans les tissus, passage des barrières biologiques, métabolisme hépatique et élimination rénale, qui interagissent entre eux et varient dans le temps. Ces phénomènes reposent sur des fonctions physiologiques complètes et complexes, impossibles à modéliser totalement in vitro. Ainsi, l’expérimentation animale reste aujourd’hui indispensable pour évaluer de façon fiable le devenir d’un médicament dans l’organisme avant son administration chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons des cohortes pour les pharmacocinétiques avec des porcs et des chiens. Ces cohortes permettront de réaliser plusieurs sessions jusqu’à ce que les animaux soient réformés. Chaque animal sera ainsi son propre témoin. Pour les rats le nombre d’animaux sera réduit au maximum afin d’avoir des données exploitatables. En général, les études font intervenir 6 groupes composés de 5 animaux chacun. 1 groupe par formulation. Aucun calcul statistique n’a été réalisé pour déterminer le nombre d’animaux. Celui-ci a été défini sur la base de l’expérience antérieure, de la variabilité attendue des paramètres étudiés et des objectifs de l’étude.

Raffinement

Les animaux feront l'objet d'un conditionnement positif, basé sur des interactions amicales avec les personnels en charge des soins, ceci afin de permettre des manipulations avec un minimum de contraintes et de stress. Après administration des molécules testées, les animaux seront observés quotiennement et un examen clinique avec pesée sera réalisé une fois par semaine. Cathéter veineux percutané (porc) : Afin d’éviter la douleur et le stress lié aux prises de sang répétées, un cathéter per cutané sera placé au niveau de la jugulaire, 5 jour minimum avant la première pharmacocinétique. Ce cathéter sera laissé à demeure même entre les sessions. Cathtéter à la veine de la patte : Afin d’éviter de prélèver à la jugulaire, un cathéter sera posé avant la première prise de sang de la session. Ce cathéter sera laissé à demeure pour les premiers temps de la session (pas plus de 4H). Les chiens sont isolés tant qu’ils ont le cathéter. Hébergement individuel en raison du maintien permanent du cathéter : Les boxes sont ajourés, permettant au cochon de se voir,et se sentir. En outre, ils seront promenés tous les jours (fréquence qui pourra être augmenté si nécessaire) par un soigneur qu’il leur distibuera des récompenses. Afin d’atténuer le stress durant l’administration des éléments d’essai (chien et porc), les animaux seront habitués durant la période d’acclimatation à être manipulés et ils seront conditionnés à se coucher et à rester calmes quand le technicien doit réaliser les administrations (notament sous cutanée). Des anesthésiques locaux seront appliqués avant de réaliser les injections sous cutanée. Si cela est compatible avec l’étude, de la nourriture pourra être distribuée à J0 afin de faciliter les administrations. Des traitements locaux seront appliqués lors des sessions pour traiter les hématomes. Si nécessaire, suivi de la glycémie régulièr avec la mise en pace d’un arbre décisionnel. Pour les cohortes, la sucession des procédures est susceptible d’entraîner des effets cumulatifs liés aux prélèvements sanguins (volume et site prélevé) et aux manipulations répétées. Ces effets sont maîtrisés par un suivi clinique, comportemental et physiologique régulier (examen clinique, pesée, numération de formule, paramètres sanguins…), associé à des périodes de repos et aux respects des seuils limites de prélèvement. Tout signe d’altération du bien-être animal conduira à l’exclusion de l’animal et à sa réforme le cas échéant. Des points limites ont été définis.

Choix des espèces

Le rat sera pincipalement utilisé en phase précoce car il permet d’explorer rapidement l’absorption, la distribution et l’élimination d’une molécule, tout en nécessitant de faibles quantités de produit. Son métabolisme est bien caractérisé et il existe de nombreuses données historiques facilitant l’interprétation des résultats. Il est particulièrement utile pour comparer différentes formulations ou voies d’administration et orienter les choix de développement. Le chien présente une forte similarité avec l’humain en termes de physiologie digestive. De plus ce modèle présente une résistance au jeun plus importante que le porc ce qui permet de limiter le risque d’hypoglycémie lors des sessions de pharmacocinétique le necéssitant. Le porc présente une forte similarité avec l’humain en termes de physiologie digestive, d’épaisseur cutanée, de composition du tissu adipeux et de métabolisme. Il est donc particulièrement adapté pour prédire l’absorption orale et la diffusion après injection sous-cutanée. Les animaux utilisés en étude sont de jeunes adultes. Les Chiens en étude de pharmacocinétique sont de jeunes adultes finissant leur croissance pondérale. Ils présentent à ce stade un juste équilibre entre réponse physiologique et acclimatation en étude. Les Porcs utilisés en étude sont de jeunes animaux qui arrivent à maturité sexuelle, leur croissance n’est pas terminée mais leur taille permet un hébergement en animalerie conventionnelle dans de bonnes conditions. D’autre part, leur poids (50kg à l’arrivée en étude) est proche d’un poids humain et permet de travailler avec des doses humaines. Les Rongeurs sont quant à eux intégrés en étude à 10 semaines, ce qui permet d’avoir des animaux avec un volume de sang circulant compatible avec le nombre de prèlèvement.

Soumises à une occlusion provoquant un accident vasculaire cérébral, sous anesthésie, 1 888 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. À l'accident vasculaire s'ajoutent une hyperglycémie induite, trois à huit injections et des prélèvements de sang. Le porteur indique que le modèle peut provoquer douleurs, prostration et difficultés à se déplacer, et que la baisse des plaquettes expose à des saignements. L'étude porte sur les hémorragies intracrâniennes de l'AVC aggravé par un excès de sucre dans le sang, situation qu'il dit rencontrer chez environ 40 % des patients.

Objectifs

En France, l’accident vasculaire cérébral reste une cause majeure de handicap, de troubles cognitifs et de mortalité. Le traitement actuel repose sur la dissolution du caillot par un médicament et/ou son retrait mécanique, quand cela est possible dans les premières heures. Cependant, malgré ces traitements, certains patients s’aggravent rapidement. Un facteur de risque important est l’excès de sucre dans le sang, observée chez environ 40 % des patients. Elle peut provoquer des saignements intracrâniens, aggraver les lésions cérébrales et stimuler des cellules sanguines impliquées dans l’inflammation. Les objectifs du projet sont, d’une part, de mieux comprendre la physiopathologie des saignements intracrâniens chez les patients présentant un accident vasculaire cérébral associé à un excés de sucre dans le sang et, d’autre part, d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements visant à protéger le cerveau contre ces complications hémorragiques.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet donnera des résultats concernant la physiopatholgie de la survenue des saignements intracrâniens et l'efficacité thérapeutique de différents candidats médicaments pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux présentant des saignements. Il permettra ainsi d’envisager une meilleure prise en charge des patients atteints d’un accident vasculaire cérébral ischémique et ainsi une amélioration de la fonction neurologique et de l’état de santé chez ces patients.

Procédures

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de souris d’accident vasculaire cérébral ischémique, procédure réalisée systématiquement sous anesthésie et analgésie. L’intervention chirurgicale dure environ 30 minutes. Chaque animal recevra entre trois et huit injections (traitements, diabète anesthésie profonde et analgésie) ainsi que deux prélèvement sanguins (réalisé à J-1 et J1). L’injection dure en moyenne 10 secondes, tandis que le prélèvement sanguin ne dépasse pas 2 minutes. Toutes les souris feront l’objet d’une évaluation neurologique qui dure environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les modèles d’accidents vasculaires cérébraux peuvent provoquer des douleurs anisi que prostration et difficultés à se déplacer. L’injection de médicament et d’analgesie peuvent provoquer un stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins peuvent provoquer un stress et une douleur légère de courte durée L’hyperglycémie aiguë peut également entraîner une déshydratation chez l’animal. La diminution des globules blanc peut induire un risque infectieux. La diminution des plaquettes peut induire un risque de saignement. Les tests comportementaux induisent un stress de l’anxiété ou un stress modéré de courte durée

Devenir

Les souris seront mises à mort afin de prélever les tissus cérébraux pour des analyses biologiques.

Remplacement

Aucun modèle in vitro ne permet de rendre compte de l’efficacité d’un traitement thérapeutique à la phase aiguë d’un accident vasculaire cérébral associé à une hyperglycémie aiguë. L'effet biologique des molécules utilisées sur leur cible a été démontré in vitro. La démonstration de leur effet bénéfique thérapeutique avant transposition chez l'homme ne peut se faire que dans un modèle animal proche de la physiopathologie humaine. Les modèles de souris d'accident vasculaire cérébral permettent de reproduire la physiopathologie de l'occlusion de l’artère cérébrale chez l'homme.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons réalisé une étude statistique préalable à l’aide d’un logiciel spécialisé. Cette analyse nous permet de déterminer précisément le nombre minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Nous avons conçu nos groupes de manière optimisée en nous basant sur des études antérieures, garantissant ainsi l’utilisation du strict nécessaire d’animaux. De plus, le modèle d’accident vasculaire cérébral hémorragique que nous utilisons est bien maîtrisés par notre équipe, ce qui nous permet de mener nos recherches de façon rigoureuse et éthique. Pour analyser les résultats, nous appliquerons des méthodes statistiques adaptées, garantissant une interprétation fiable des données tout en respectant notre engagement à réduire l’usage des animaux

Raffinement

Leur suivi sera assuré par une équipe qualifiée : un soigneur spécialisé s’occupera d’eux chaque jour, et un chercheur expérimenté effectuera un contrôle approfondi deux fois par semaine. Les souris seront hébergées par groupes de cinq dans des cages ventilées, équipées de materiel pour leur permettre de construire des nids et d’améliorer leur confort. Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique en pré et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 24h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie, nous surveillerons attentivement leur état de santé grâce à une grille d’évaluation précise, prenant en compte des points limites stricts et adaptés au projet. Cette méthode permettra de détecter rapidement toute souffrance et d’y remédier. En cas de douleur, un traitement adapté sera administré, et si nécessaire, une mise à mort sera réalisée selon les réglementations en vigueur afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines). C'est à cet âge que les modèles utilisés sont validés

56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie du cerveau de deux à deux heures et demie sous anesthésie, des périodes d'isolement, des enregistrements de sommeil de vingt-quatre heures et des tests de mémoire spatiale. Le modèle vise à voir si l'activation d'un type de neurones de l'hippocampe améliore la mémoire dans une forme de maladie d'Alzheimer reproduite chez la souris. Les bénéfices, repérer plus tôt les dysfonctionnements cérébraux et ouvrir des pistes thérapeutiques, sont renvoyés au long terme.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer entraîne une détérioration progressive de la mémoire et d’autres fonctions du cerveau. Avant même l’apparition de lésions importantes, le fonctionnement des réseaux de neurones peut déjà être perturbé. Mieux comprendre ces changements précoces est important, car ils pourraient expliquer une partie des troubles de la mémoire observés au début de la maladie. Ce projet cherche à comprendre le rôle d’un type particulier de cellules du cerveau qui participent au bon contrôle de l’activité nerveuse. Ces cellules sont connues pour être importantes dans l’organisation de l’activité cérébrale et dans certaines fonctions cognitives, notamment la mémoire. Des travaux antérieurs suggèrent que leur fonctionnement est altéré dans la maladie d’Alzheimer, ce qui pourrait contribuer aux troubles observés. L’objectif du projet est donc de déterminer si l’activation ciblée de ces cellules peut améliorer le fonctionnement global du cerveau et les performances de mémoire dans un modèle murin de la maladie. En parallèle, le projet cherchera à identifier des modifications de l’activité cérébrale associées aux premiers stades de la maladie, afin de mieux comprendre comment apparaissent les dysfonctionnements. Plus largement, ce travail permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes précoces de la maladie d’Alzheimer. À plus long terme, il pourrait contribuer à identifier de nouvelles pistes pour repérer plus tôt certaines anomalies du fonctionnement cérébral et, à terme, orienter le développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes précoces impliqués dans les troubles de la mémoire au cours de la maladie d’Alzheimer. Il pourrait aider à identifier certaines modifications de l’activité cérébrale associées aux premiers stades de la maladie. À plus long terme, ces travaux pourront contribuer à faire émerger de nouvelles pistes pour repérer plus tôt certains dysfonctionnements cérébraux et, à terme, orienter le développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale à l’âge de 5 à 8 mois d’une durée d’environ 2h à 2h30. Ils seront isolés le temps du réveil de la chirurgie (maximum 12h), entre les phases d’acquisition et de rétention des tâches mnésiques (3h de délai, pendant lequel l’activité cérébrale est enregistrée) et la tâche d’association place-objet (5 min de délai). De la même manière, des enregistrements de sommeil de 24 ± 1h seront répétés 2 fois entre les sessions de comportement. Enfin les souris sont soumises à des tests comportementaux afin d’évaluer leur mémoire spatiale (3x10 mins sur 2 jours par animal pour le test de localisation d’objet et 20 minutes pour le test d’association place/objet).

Impact sur les animaux

L’anesthésie générale peut provoquer un stress transitoire lié à son caractère aversif. L’intervention chirurgicale peut entraîner une douleur modérée ainsi qu’une altération temporaire de l’état général dans les jours qui suivent. Des difficultés de cicatrisation ou, plus rarement, une infection au niveau de la plaie peuvent également survenir. Enfin, les périodes d’hébergement individuel nécessaires à certaines étapes de l’étude peuvent être une source de stress pour les animaux.

Devenir

Les souris seront mises à mort pour réaliser des prélèvements de tissus et effectuer des observations anatomiques et histologiques nécessaires à la validation scientifique de ce projet.

Remplacement

Ce projet vise à établir un lien causal entre le remodelage des neurones PV, l’amélioration des performances mnésiques et le rétablissement de dynamiques électriques cérébrales globales chez des souris modèles de la maladie d’Alzheimer (MA). Une telle démonstration causale, couplant manipulation neuronale spécifique, enregistrements et évaluation comportementale, n’est pas réalisable chez l’humain, en particulier aux stades précoces. Les modèles murins génétiques permettent au contraire de sélectionner des animaux à un âge défini (ici 5 à 8 mois), correspondant chez le modèle utilisé à un stade avec troubles de la mémoire spatiale en l’absence de dépôts amyloïdes détectables selon nos critères. Enfin, l’étude de dynamiques cérébrales globales associées à des comportements complexes requiert un cerveau intact et ne peut pas être menée in vitro ; elle doit donc être réalisée chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum compatible avec les objectifs scientifiques du projet. Le protocole repose sur un suivi des mêmes animaux à différentes étapes de l’étude, ce qui permet de limiter le nombre total d’animaux nécessaires tout en augmentant la robustesse des comparaisons. Tous les animaux inclus contribuent à plusieurs volets du projet, avec l’enregistrement de l’activité cérébrale, l’évaluation de la mémoire et les analyses finales sur les tissus. Cette organisation permet d’éviter la constitution de cohortes supplémentaires. Le nombre d’animaux prévu tient également compte d’un risque limité d’exclusion, par exemple en cas de qualité insuffisante des enregistrements, de ciblage insuffisant de l’intervention ou de complication après la chirurgie. L’effectif retenu vise donc à obtenir un nombre suffisant de données exploitables sans avoir à recommencer une expérimentation complémentaire.

Raffinement

Plusieurs mesures sont mises en place pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux tout au long du projet. L’intervention est réalisée sous anesthésie générale, avec une prise en charge adaptée de la douleur avant, pendant et après la chirurgie. Les animaux bénéficient d’une surveillance rapprochée après l’intervention, avec une attention particulière portée à leur état général, à la cicatrisation et à la reprise de l’alimentation. Les conditions de maintien sont également adaptées pour limiter le stress : période d’acclimatation avant le début des expériences, familiarisation progressive à la manipulation, au transport et au dispositif d’enregistrement, hébergement en groupe en dehors des phases où un isolement temporaire est nécessaire, et présence de matériel permettant le nid et l’enrichissement du milieu de vie. Des points limites précoces ont été définis afin qu’un animal en difficulté puisse être pris en charge rapidement ou retiré de l’étude si nécessaire.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle constitue un modèle de référence pour l’étude des maladies neurodégénératives et du fonctionnement de la mémoire. Son cerveau présente une organisation générale compatible avec l’étude des circuits impliqués dans la mémoire, ce qui permet d’explorer des mécanismes difficilement accessibles chez l’humain. Les animaux seront étudiés à l’âge adulte, à un stade correspondant à l’apparition de troubles de la mémoire dans le modèle utilisé. Ce choix est important pour analyser les changements précoces du fonctionnement cérébral, avant l’installation de lésions plus avancées, et pour étudier des mécanismes susceptibles de jouer un rôle au début de la maladie.

1 300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, jusqu'à vingt injections directement dans la tumeur, des prélèvements de sang derrière l'œil et des séances d'imagerie sous anesthésie. Le projet teste des ARN thérapeutiques contre le cancer colorectal, dont l'activité a déjà été observée sur cellules en culture. Le porteur écrit que le recours à l'animal devient "indispensable" pour juger l'effet dans un "organisme entier", avant une utilisation espérée chez l'humain.

Objectifs

Ce projet de recherche a pour but d'évaluer le potentiel antitumoral d’ARN thérapeutiques sur des modèles précliniques de cancer. Malgré de nombreuses avancées, en particulier avec l’arrivée des thérapies ciblées puis des immunothérapies, les thérapeutiques anticancéreuses actuellement disponibles restent limitées et des résistances émergent le plus souvent, nécessitant un changement de stratégie thérapeutiques. Il est donc essentiel de développer des nouveaux traitements, dont les mécanismes d’actions seraient différents des traitements actuellement utilisés, afin d’élargir le spectre des options thérapeutiques ais également de pouvoir adapter le traitement au patient et aux caractéristiques biologiques et moléculaires tumorales. Les arylsulfonamides sont une classe de drogue dont l’intérêt pour le traitement des cancers a été évalué. Nous avons récemment développé une approche thérapeutique via des ARN thérapeutiques, et avons fait la preuve de concept in vitro de leur activité antitumorale. Nous souhaitons donc avec ce projet valider nos observations in vitro.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider l'utilisation d'ARN thérapeutiques pour le traitement des cancers, en particulier le cancer colorectal. A plus long terme, ce projet pourrait aboutir au développement en clinique de ces mêmes ARN thérapeutiques.

Procédures

Greffe de cellules tumorales sous-cutanée dans les flancs : Durée 10 minutes - 1 fois par animal / Injection intrapéritonéale de luciferine pour bioluminescence : Durée 1 minute - 5 à 6 fois par animal - Anesthésie gazeuse durant l'imagerie : Durée 30 minute - 5 à 6 fois par animal / Prélèvements sanguins retroorbitaires - Durée 2 minutes - 3 fois par animal / Injection de traitements par voie IV - Durée 2 minutes - 3 à 5 fois par animal / MODIFICATION - Injection de traitements par voie intratumorale - Durée 2 minutes - 5 A 20 FOIS PAR ANIMAL / Injection de traitements par voie intrapéritonéale - Durée 2 minutes - 3 à 5 fois par animal

Impact sur les animaux

La greffe de lignées cellulaires tumorales, suivi de la croissance des tumeurs, engendreront une altération de l'état général des animaux avec perte de poids, fatigue, et anémie principalement. Le traitement par indisulam pourrait engendrer certaines toxicités, même si la littérature décrit des toxicités systémiques limitées chez l'homme et la souris (rares anémies). Nous n'avons pas encore évalué la toxicité potentielle des ARN thérapeutiques, mais celle-ci sera évaluée grâce aux expériences de mise au point. LES INJECTION REPETEES INTRATUMORALES POURRAIENT ENGENDRER UN SURCROIT DE STRESS ET D'INCONFORT POUR LES ANIMAUX.

Devenir

Des tests sur des cellules tumorales cultivées au laboratoire nous ont déjà permis de déterminer certains effets de nos traitements. Cependant, l’utilisation de modèles animaux est indispensable mieux comprendre leur effet dans un organisme entier, nottament concernant la toxicité. Cette étape est primordiale puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme. Afin d'évaluer l'effet de nos traitements sur les tumeurs, nous devons récupérer en fin d'expérience les tumeurs des animaux traités. Nous devons pour cela procéder à l'euthanasie et mise à mort systématique de l'ensemble des animaux du projet. L'étude biologique des tumeurs au laboratoire, ainsi que celles des tissus des autres organes est indidspensable pour évaluer les effets antitumoraux mais également la toxicité des traitements testés.

Remplacement

Des tests sur des cellules tumorales et des cellules normales en culture in vitro nous ont déjà permis de déterminer certains effets de nos traitements. Cependant, l’utilisation de modèles in vivo comme la souris est indispensable à la compréhension des mécanismes d’action du traitement dans un organisme entier proche de l'homme, incluant des paramètres comme le développement tumoral, le microenvironnement, les contraintes physiques etc. qui ne sont pas retrouvés in vitro. Cette étape est également nécessaire puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme comme thérapie.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d'animaux, nous utiliserons les mêmes animaux pour évaluer à la fois la prise et la croissance tumorale, la dose des traitements et leur toxicité. Nous utiliserons également les mêmes souris pour nos contrôles positifs et négatifs dès que ce sera possible. Cette association nous permet de réduire le nombre de souris contrôles utilisées. Le nombre d’animaux par lot sera également réduit au maximum afin d’avoir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Le bien-être de l’animal au quotidien est nécessaire au bon déroulement de nos expériences, mais également à la reproductibilité de nos résultats. Des enrichissements (maisons rouges) sont présents dans les cages. Au cours de nos expériences, de la nourriture humidifiée sera accessible directement dans la cage pour éviter la déshydratation des souris. Des tapis chauffants seront également utilisés dès l’anesthésie des souris, pendant les injections, et lors de la phase de réveil. Des injections d'analgésique pré et postopératoire pourront être réalisées en fonction de l'expérience et de la souffrance de l'animal. Un suivi attentif quotidien par du personnel compétent et formé, weekend compris, sera également mis en place. L'environnement des animaux sera enrichi par des tunnels en polycarbonate. Au moindre doute, nous ferons appel aux conseils de notre vétérinaire ou de la structure du Bien-Etre Animal (SBEA).

Choix des espèces

La souris représente l'animal classiquement décrit dans littérature pour ce type d'éxpérimentation. Nous utiliserons des lignées génétiquement modifiée immunodéprimées afin de permettre la bonne prise tumorale des xénogreffes de cellules humaines. L'utilisation d'un modèle syngénique nous permettra de valdier nos observations dans un système immunocompétent ce qui est essentiel pour envisager un dévellopement chez l'homme par la suite. Comme ce qui est classiquement décrit dans littérature pour ce type d'expérimentation, les animaux utilisés seront de 8 à 12 semaines.

Soumises à un traumatisme crânien par chirurgie sous anesthésie pour 60 % d'entre elles, puis à une infection pulmonaire provoquée par injection dans la trachée, 4 410 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles peuvent perdre jusqu'à 20 % de leur poids après l'infection, et de rares fractures du crâne déclenchent leur mise à mort. Le projet teste des polysaccharides extraits d'algues censés restaurer l'immunité et réduire le recours aux antibiotiques. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour prélever organes et liquides biologiques.

Objectifs

Des études ont montré de profondes altérations immunitaires chez les patients au cours de l'infection, de l'inflammation et des traumatismes aigus. Plus particulièrement, il a été démontré une défaillance du système immunitaire et une inflammation cérébrale immédiatement après le traumatisme, pouvant perdurer sur le long terme. Ces altérations immunitaires sont un terrain favorable au développement d’infections secondaires, dont la pneumonie acquise à l’hôpital (PAH) est la plus fréquente. L’utilisation d’antibiotiques est actuellement le principal traitement de la PAH qui est souvent provoquée par des agents pathogènes résistants aux antibiotiques. Le développement de la résistance aux antibiotiques, constitue un problème majeur de santé publique. De plus, chez les patients souffrant d’un traumatisme, ces infections secondaires altèrent considérablement le devenir des patients à court et long terme, ainsi que le pronostic neurologique. L'objectif global de ce projet est de développer les polysaccharides sulfatés (PS) extraits d’algues, en tant que médicament immunostimulant afin de fournir une nouvelle modalité thérapeutique ciblant l’hôte pour : i) restaurer une réponse immunitaire adaptée ; ii) réduire le taux de pneumonies bactériennes secondaires et iii) réduire les complications à long terme. En effet, ce traitement pourrait permettre le renforcement des défenses immunitaires, et ainsi diminuer le taux de pneumonies secondaires et finalement réduire l'administration d'antibiotiques à large spectre, participant ainsi à la lutte contre l'émergence de l'antibiorésistance. Ce traitement permettrait également d’améliorer le pronostic neurologique et fonctionnel en limitant les phénomènes inflammatoires cérébraux pour éviter la mise en place de déficits neurologiques post-traumatiques aigus et chroniques. Les principaux objectifs de ce projet sont donc les suivants : caractériser les effets des PS, au niveau tissulaire, ainsi que les mécanismes d'action cellulaires et moléculaires dans un modèle préclinique d’altération du système immunitaire post-traumatisme.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront 1) une meilleure compréhension des processus mis en jeu lors de la restauration du système immunitaire au niveau cérébral et pulmonaire des patients ayant subi un traumatisme cérébral. 2) d’enrichir les connaissances sur la manière de restaurer la réactivité immunitaire afin de prévenir les infections pulmonaires secondaires dues à la défaillance du système immunitaire induite par le traumatisme. 3) d’ouvrir, avec les polysaccharides sulfatés (PS), une nouvelle voie vers des stratégies thérapeutiques non antibiotiques innovantes pour lutter contre les infections pulmonaires chez les patients de réanimation atteints d’une défaillance de leur système immunitaire post agression sévère de l’organisme. 4) ce projet pourrait permettre également de proposer une nouvelle modalité thérapeutique permettant de limiter les lésions cérébrales secondaires et les séquelles à long terme liées au traumatisme. Ces nouvelles connaissances acquises permettront de mieux comprendre comment le système immunitaire est régulé grâce à l'identification des cibles cellulaires et moléculaires des PS et leur application pourra être élargie à d'autres domaines d'infections aiguës et chroniques. L’ensemble de ces données pré-cliniques qui seront obtenues dans ce projet est une étape essentielle pour permettre dans un second temps le lancement d’études de pharmacodynamique et d’un essai clinique.

Procédures

60% des animaux sont soumis au traumatisme nécessitant une chirurgie réalisée sous anesthésie générale. 60% des animaux sont soumis à une infection induite par injection intratrachéale réalisée sous anesthésie générale. 4% des animaux sont soumis à 2 injections intratrachéales réalisées sous anesthésie générale. Selon les résultats de la partie 2, 60% des animaux seront soumis à une ou plusieurs injections intrapéritonéales, ou per os (administration par voie orale), ou sous cutanées, réalisées sur animaux vigiles, ou intra-veineuses réalisées sur animaux anesthésiés. Tous les gestes sont de courte durée (au maximum 1 minute) et pour les souris anesthésiées, le réveil est quasiment instantané. En fonction de l’état général des souris et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanées d’analgésiques peuvent être réalisées sur animaux vigiles. 5% des animaux seront soumis à des tests non invasifs d’exploration fonctionnelle et comportementale réalisés sur animaux vigiles, incluant des évaluations de la force musculaire, de la marche, de la coordination motrice et de reconnaissance. Chaque test a une durée comprise entre 5 et 10 minutes. Ces évaluations seront réalisées à trois reprises au cours de la procédure et espacées dans le temps.

Impact sur les animaux

Suite au traumatisme primaire une perte de poids transitoire (1-2 jours) et modérée (< 10%) est observée, sans perte de motricité. L’induction du traumatisme peut induire une douleur transitoire (

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et liquides biologiques

Remplacement

Les paramètres étudiés dans ce travail ne peuvent être aujourd’hui remplacés par des procédures in vitro et le recours à l’utilisation de modèles animaux est indispensable. Les multiples interactions entre types cellulaires différents et la complexité des mécanismes responsables de l’altération du système immunitaire suite à un traumatisme sévère, nous oblige à utiliser les modèles animaux pour appréhender ces phénomènes dans leur globalité. En effet, les méthodes in vitro développées par d’autres laboratoires de recherche ne permettent pas une étude globale des modifications entraînées par une activation anarchique du système nerveux et son impact sur le système immunitaire global. Seule l’étude dans un organisme entier nous permet d’étudier l’influence du microenvironnement sur les différents acteurs de l’immunité au cours du processus inflammatoire et l’effet de nos polysaccharides sulfates sur l’ensemble de ces acteurs.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les analyses des processus cérébraux, pulmonaires et systémiques seront réalisés sur un même animal.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux harmonieux dans des cages enrichies en frisottis, de taille suffisante et dont la litière est changée une fois par semaine. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place. Les procédures n’entraînent pas de douleur résiduelle. Les procédures de chirurgie seront effectuées sur tapis chauffants. Afin de limiter la douleur consécutive au traumatisme crânien, un morphinique sera administré aux animaux en sous cutané avant la réalisation du geste. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage est préalablement enduite d’une solution anesthésique afin d’anesthésier localement la trachée. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intra-veineuse retro-orbitale, un morphinique sera administré en sous cutané aux animaux avant la réalisation du geste. L’ensemble des tests fonctionnels et comportementaux, validés et non invasifs, sera réalisé sur animaux vigiles. Afin de limiter le stress lié à la manipulation et aux procédures expérimentales, les animaux bénéficieront d’une phase d’habituation préalable à la salle d’expérimentation, aux dispositifs et à l’expérimentateur. Les tests seront réalisés dans un environnement dédié, distinct de la salle d’hébergement, et des mesures de renforcement positif (récompense après les essais) seront mises en place. L’organisation et la fréquence des tests seront optimisées afin de limiter la fatigue et l’impact sur le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Les modèles murins de pneumonie et de traumatisme crânien sont des modèles bien caractérisés, reproductibles, et parfaitement adaptés pour tous les types d’analyses prévus pour cette étude. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. Pour pouvoir étudier le système immunitaire, les animaux utilisés seront âgés entre 7 et 14 semaines de vie, car à ce stade de développement le système immunitaire est mature.

Élevées pour développer spontanément une arthrite inflammatoire, 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie est génotypée par poinçonnage de l'oreille sur animal vigile, sans anesthésie mentionnée. Le porteur décrit une inflammation articulaire apparaissant vers huit à dix semaines, avec un gonflement des pattes pouvant affecter la mobilité. Sur les 1 200 animaux, 900 sont expédiés vers un autre établissement pour y être utilisés, 300 servent à l'élevage et sont tués avant vingt semaines pour limiter l'aggravation de la maladie avec l'âge.

Objectifs

Ce projet décrit une procédure de l'élevage avec la prise en charge des animaux d’une lignée de souris développant progressivement une arthrite inflammatoire. Ces souris sont un modèle d’inflammation articulaire qui est causée par un mélange de facteurs génétiques, environnementaux et liés aux microbes présents dans l’intestin. Normalement, le corps produit une molécule inhibant l’interleukine 1 qui va limiter l’inflammation. Mais chez ces souris, cette molécule est absente, ce qui entraîne une inflammation excessive qui va notamment toucher les articulations. De plus, des éléments comme certains additifs alimentaires ou les antibiotiques ou les bactéries situées dans l’intestin que l’on appelle microbiote intestinal peuvent aggraver cette inflammation. L’objectif de cet élevage est de produire des animaux reproduisant la maladie observée chez l'homme. Ces animaux seront par la suite utilisés dans des projets de recherche afin d'étudier l’arthrite inflammatoire et, à terme, aider à la recherche sur cette maladie chez l’homme qui représente 1 million de patients en France.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre à l'équipe de recherche et à leurs partenaires d’avoir les souris nécessaires pour mener leurs études sur l’arthrite inflammatoire. A long terme, ces souris aideront les chercheurs à : mieux comprendre l’arthrite, identifier des marqueurs pour mieux la diagnostiquer, trouver de nouvelles façons de traiter cette maladie, tester de nouveaux médicaments anti-inflammatoires et évaluer leur efficacité par rapport aux traitements déjà disponibles pour les patients atteints d’arthrite.

Procédures

Afin de réaliser le génotypage, un poinçonnage de l’oreille sera effectué après l’âge de 14 jours. Cette méthode consiste à prélever sur animaux vigiles un petit échantillon de tissu (environ 2 mm de diamètre) sur la périphérie du pavillon de l’oreille où le tissu est le plus mince, à l’aide d’un poinçon. Cette intervention n’est réalisée qu’une fois par animal et dure moins de 30 secondes. Seulement certains animaux utilisés pour les croisements seront génotypés.

Impact sur les animaux

Les souris qui n’expriment pas le récepteur inhibant la molécule de l’inflammation interleukine 1 peuvent, pour certaines, développer spontanément une inflammation articulaire à partir de l'âge de 5 semaines. Cependant, les observations récentes de l’équipe de recherche démontrent un âge plus tardif pour l’apparition de l’arthrite, vers 8-10 semaines. Il s’agit de symptômes comme une rougeur ou un gonflement des articulations. Lorsque l’atteinte est sévère, elle peut se manifester par un gonflement des pattes qui peut affecter la mobilité de la souris. Selon les observations antérieures, ces souris ne développent que très peu de signes généraux et leur mobilité est peu affectée. Les souris reproductrices pourraient ressentir une légère nuisance due au prélèvement effectué pour le génotypage (douleur légère de courte durée).

Devenir

Une partie des animaux sera expédiée en début ou avant l’expression du phénotype dommageable et utilisée dans des projets de l’équipe de recherche dans un autre établissement utilisateur (900 animaux pour l’expérimentation en 5 ans). Une autre partie des animaux sera utilisée pour l’élevage dans notre établissement (300 animaux pour l’élevage en 5 ans). Les animaux utilisés pour l’élevage seront mis à mort avant 20 semaines, pour limiter l’évolution du phénotype dommageable avec l’âge. Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d’évaluation du bien-être animal seront mis à mort.

Remplacement

L'utilisation d'animaux de laboratoire est nécessaire car le projet étudie l’arthrite, qui est une maladie complexe multifactorielle faisant intervenir différents facteurs (le système immunitaire, les bactéries situées dans l’intestin que l’on appelle microbiote intestinal, le patrimoine génétique et l’environnement), différents organes et la présence d’une inflammation à la fois chronique locale (articulation) et systémique. Par ailleurs, l’utilisation d’un modèle mammifère vertébré est nécessaire, car les organes impliqués dans la physiopathologie de l’arthrite (notamment le système immunitaire, l’intestin, les articulations et les tissus lymphoïdes associés) présentent des différences anatomiques, physiologiques et immunologiques importantes chez les espèces non mammifères, limitant leur pertinence translationnelle pour l’étude de cette pathologie humaine. Afin d'étudier l'interaction entre l’environnement, le microbiote intestinal et le génome de l'hôte, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (par exemple, modèles cellulaires).

Réduction

Un nombre total de 1200 animaux au phénotype dommageable est nécessaire et comprend les animaux pour l’élevage et les animaux nécessaires pour l’expérimentation pour les projets scientifiques associés. La production des animaux sera planifiée et suivie par l’expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Le nombre de reproducteurs et la durée d’accouplements seront définies en amont de la mise en place des croisements. Ces paramètres seront définis en fonction des objectifs et des différentes caractéristiques connues des lignées (taille de portées, viabilité, phénotype, etc.). L'élevage sera suivi via le fichier de l'élevage. En fin de projet expérimental, le modèle pourra être cryoarchivé dans notre établissement.

Raffinement

Tous les animaux mutés de manière homozygote pour la modification génétique et susceptibles de développer le phénotype dommageable à partir de 5 semaines seront suivis à partir de 4 semaines et ce jusqu'à leur envoi avant 8 semaines vers l’établissement où sera réalisée l’expérimentation (ou leur mise à mort) : une évaluation du bien-être animal sera réalisée en prenant en compte l'arthrite, la sensibilité articulaire, l'aspect général, le comportement et la mobilité de l’animal. En fonction de l’état de l’animal, des mesures de raffinement seront mises en place selon les conseils de la vétérinaire et/ou la SBEA (disponibilité de la nourriture directement dans la cage, mise à disposition d’une solution de réhydratation gélifiée, augmentation de la fréquence du suivi, application d'un antiseptique). Les points limites précoces et spécifiques pour les signes cliniques de l’arthrite ont été définis. Si, malgré le raffinement mis en place, un point limite est atteint, l’animal sera immédiatement mis à mort. Dans le cas où les animaux homozygotes ne sont pas transférés pour l’expérimentation, ces derniers seront utilisés pour l’élevage et mis à mort avant 20 semaines (pour limiter les nuisances liées à la progression de l’arthrite avec l’âge).

Choix des espèces

Les souris sont souvent utilisées pour étudier l’arthrite, car elles permettent de mieux comprendre les liens entre l’alimentation, l’environnement, les microbes intestinaux et l’articulation elle-même. Dans ce projet, nous utilisons une lignée de souris qui ne produit pas une protéine clé entraînant ainsi une inflammation articulaire ressemblant à une arthrite chez l’humain. Ce modèle génétique de la maladie n’existe que chez la souris. Les souris seront utilisées pour les croisements dès l’âge de 7-8 semaines (maturité sexuelle) et ce jusqu’à 20 semaines, pour limiter l’expression du phénotype dommageable qui progresse avec l’âge. Le phénotype dommageable d’arthrite est susceptible d'apparaître à partir de l'âge de 5 semaines, mais dans l’élevage de l’EU du chercheur ne se manifeste pas avant 8-10 semaines. Les animaux envoyés pour expérimentation auront ainsi un âge de 5-8 semaines pour limiter et potentiellement éviter l’expression du phénotype dommageable avant l’envoi.

2 366 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune soumise à quatre tests de mémoire, à des injections et parfois à l'ablation des glandes génitales. Nourries douze à quinze semaines d'un régime obésogène dès le sevrage, une partie subit une ou deux chirurgies sous anesthésie, puis une imagerie de la masse grasse en fin d'expérience. Le projet vise à comprendre le rôle des hormones sexuelles dans les troubles de mémoire liés à l'obésité, chez les mâles comme chez les femelles. Les stratégies thérapeutiques évoquées restent lointaines, quand la stérilisation et la mise à mort des 2 366 individus sont, elles, programmées.

Objectifs

L'obésité, en tant que défi de santé publique, réduit l'espérance de vie en raison des pathologies qu'elle favorise (hypertension, cancers, diabètes, etc.). Elle est également associée à des troubles de la mémoire, ce qui est particulièrement préoccupant durant l’enfance et l’adolescence, des périodes clés pour la maturation de structures cérébrales essentielles à la mémoire. Chez la souris, la consommation d'une nourriture riche en lipides pendant l'adolescence, en plus d'entrainer une prise de poids excessive, altère les capacités de mémoire en impliquant des mécanismes spécifiques dans certaines régions du cerveau. La majorité des travaux scientifiques ont été réalisés chez des mâles, alors que, chez l’humain, l’obésité touche de manière comparable les deux sexes. Afin de mieux transposer ces résultats, des études ont également été menées chez des femelles. Comme chez les mâles, la nourriture riche en lipides, à l’adolescence, a des effets négatifs sur la mémoire. Toutefois, les mécanismes impliqués semblent différer selon le sexe. L’objectif de ce projet est donc d’identifier le rôle des hormones sexuelles dans les altérations de la mémoire induites par un régime riche en lipides, chez les mâles comme chez les femelles.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet devrait produire des données expérimentales sur l'évaluation de la mémoire dans différentes conditions expérimentales (régime, age, sexe, traitement) chez la souris. Les résultats issus de ce projet devraient être accessibles à moyen terme, à l’issue de l’analyse complète des données et de leur diffusion via des publications scientifiques et des communications dans des congrès spécialisés. Et à plus long terme, ces expériences devraient permettre une meilleure compréhension des mécanismes à la base des effets délétères d'une nourriture hyperlipidique sur le cerveau et la mémoire en fonction du sexe et le rôle des hormones sexuelles, afin d'envisager potentiellement des stratégies thérapeutiques, puisque le surpoids concerne 47 % des français adultes et 17% des français souffrent d'obésité.

Procédures

Tous les animaux subiront, à au moins 48h d’intervalle, quatre tests comportementaux afin d'évaluer leur mémoire. Chaque étape de ces tests dure 10 minutes. Une partie des animaux subira lors de ces tests comportemantaux des injections périphériques ou locales. Une partie des animaux subira une fois un jeune de 5h préalablement aux mesures métaboliques (7 prélèvements sanguins sur une durée de 2 h). Une partie des animaux subira une ou deux interventions chirurgicales réalisées sous anesthésie gazeuse et en présence d'antalgique et d'anti-inflammatoire. Ces interventions durent entre 20 et 45 minutes avec une phase de réveil entre 5 et 20 minutes. Tous les animaux subiront en fin d’expérimentation, une seule analyse en imagerie d’une durée de 2 min afin d’évaluer la répartition de leur masse grasse/masse maigre et un seul prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

L’alimentation obésogène donnée pendant 12 à 15 semaines entraîne un surpoids qui reste non délétère chez des animaux jeunes comme ceux utilisés dans notre étude. Outre la sterilité induite par le retrait des glandes génitales, il n'y a que peu d’effets secondaires notables. Les tests de comportement, ainsi que les injections peuvent induire un stress qui sera limité par une habituation à la manipulation et à l'injection avant expérimentation et limitée par la maitrise des expérimentateurs. Les prélèvements durant le test de tolérance au glucose pourront engendrer une légère douleur aux animaux. Les chirurgies pourraient entraîner dans les 48h suivant l’opération une douleur et un stress se traduisant par une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue de récupérer leurs cerveaux pour des analyses post mortem.

Remplacement

L’étude intégrée des effets de la nutrition sur des aspects comportementaux et du fonctionnement cérébral est permise grâce à l’utilisation du modèle de rongeur soumis à de la nourriture obésogène et il n’est pas possible de le remplacer par des approches cellulaires sur des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux en effectuant plusieurs tests comportementaux chez les mêmes individus plutôt que des groupes différents. De plus, le nombre d’animaux sera réduit au mieux pour obtenir des résultats concluants lors de nos comparaisons statistiques. Pour réduire le nombre d’animaux transgéniques produits, les besoins expérimentaux seront planifiés et les stratégies de croisement optimisées par l'utilisation de reproducteurs génotypés. Cela représente un total de 2366 animaux (1183 males et 1183 femelles) sur 5 ans.

Raffinement

Des critères objectifs d’arrêt des souffrances des animaux sont définis afin d’encadrer de manière objective et graduée les décisions visant à prévenir toute souffrance excessive. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec administration d’antalgiques en pré-, péri et post-opératoire pour limiter la douleur. Toutes les précautions d'asepsie et de confort seront prises pour limiter l'inconfort des animaux. Les jours suivant la chirurgie, les animaux sont surveillés attentivement une fois par jour pour s’assurer de leur bon rétablissement. Avec la mise en place de points limites, si un animal présente une anomalie il sera immédiatement isolé, surveillé et soigné pendant 3 jours jusqu’à amélioration. Si il n'y a pas d'amélioration et après avis de la cellule bien être et de l'avis du vétérinaire désigné, les animaux seront mis à mort. Si il y amélioration et durant les mois suivant la chirurgie, les animaux seront pesés 1 fois par semaine et un suivi avec des critères objectifs est mis en place. S’il n’y a aucun signe de mal-être chez l’animal, il passera en phase comportementale, qui sera optimisée pour durer le moins de temps possible. Une période d’habituation des souris à l'expérimentateur sera mise en place avant les taches comportementales afin de réduire le stress lié aux manipulations et aux procédures, contribuant ainsi à améliorer leur bien-être et la fiabilité des données recueillies. Les souris seront remises avec leurs congénères entre chaque phase de test. Les injections pharmacologiques seront réalisées de sorte à limiter les interventions sur l’animal.

Choix des espèces

L'espèce animale utilisée dans ce projet est la souris. Ce choix s’explique par la possibilité de modifier de façon précise le fonctionnement de certains éléments du cerveau chez cet animal. Ce sont des animaux sur lesquels les traitements nutritionnels et l'induction de l'obésité sont faciles à conduire et notre équipe dispose d’une expérience de longue date pour conduire des approches nutritionnelles chez cette espèce. Le modèle de rongeurs soumis à des régimes obésogènes permet l’étude intégrée de la nutrition sur des aspects comportementaux et de fonctionnement cérébral qu’il n’est pas possible de remplacer par des approches cellulaires. Les chirurgies et les tests comportementaux, maîtrisés sur cette espèce dans notre laboratoire, sont facilement mis en œuvre et permettent d’évaluer chez l’animal vigile les dimensions cognitives et émotionnelles, qui sont une nécessité expérimentale pour évaluer la réalité physiologique de nos résultats. Les souris seront exposées au régime hyperlipidique ou contrôle dès le sevrage (3 semaines) et pendant 12 semaines. Cette exposition commence dès le sevrage (jusqu’à l'âge adulte) afin de couvrir la période de l'adolescence. Certains animaux subiront une chirugie, une partie à l’âge de 4 semaines (pré adolescence) et une autre partie à l’âge adulte (8 semaines). Les taches comportementales seront réalisées à l'age adulte entre 15 et 18 semaines.