Recherche appliquée

264 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une irradiation corporelle totale puis une greffe de cellules humaines, parfois leucémiques, et développent une réaction du greffon contre l'hôte ou des tumeurs, pour évaluer un sous-type de lymphocytes censé limiter cette réaction. Le porteur indique que les souris présentent une perte de poids d'environ 20 %, des diarrhées et une altération de l'état général, et ne seront pas conservées au-delà de 80 jours. Sur le remplacement, il affirme que ce modèle murin est "indispensable" à toute étude préclinique de thérapie cellulaire dans la greffe de moelle.

Objectifs

Ce projet de recherche concerne les lymphocytes NKT invariantes (iNKT), qui sont des cellules importantes dans notre système immunitaire qui ont la capacité de réguler les réponses immunitaires et de tuer les cellules cancéreuses. Lorsqu'une personne subit une greffe de moelle osseuse pour traiter une leucémie, les cellules du donneur peuvent attaquer les tissus sains du receveur, causant des dommages graves appelés "réaction du greffon contre l'hôte" (GVH). L'ajout d'iNKT au greffon pourrait aider à réguler la réponse immunitaire pour éviter les problèmes de santé associés à la GVH tout en maintenant l'effet anti-leucémique de la greffe de moelle osseuse. Pour cela, il est important d'étudier comment les iNKT régulent la réponse immunitaire pour éviter les problèmes de santé et déterminer la quantité d'iNKT nécessaire pour obtenir un effet bénéfique. Il est également essentiel de vérifier que l'ajout d'iNKT n'empêchera pas l'effet anti-leucémique de la greffe de moelle osseuse. Pour atteindre ces objectifs, des modèles animaux seront utilisés pour étudier les effets de différentes quantités et sous-types d'iNKT sur la réponse immunitaire. Les interactions entre les iNKT et d'autres types de cellules immunitaires seront également examinées pour mieux comprendre leur rôle dans la régulation de la réponse immunitaire. Enfin, il sera étudié si l'ajout d'iNKT au greffon empêchera l'effet anti-leucémique de la greffe de moelle osseuse. Les résultats de cette étude pourraient améliorer les traitements de greffe de moelle osseuse et réduire les risques associés à la GVH, tout en maintenant l'effet anti-leucémique de la greffe.

Bénéfices attendus

Dans le contexte de la greffe de moelle osseuse, les cellules humaines intégrées dans le greffon détruisent les cellules leucémiques du receveur mais peuvent également reconnaitre et attaquer les tissus sains du receveur (réaction du greffon contre l'hôte appelée GVH). La GVH est responsable de la mortalité de 20% des patients greffés. Par ailleurs, l’effet anti-leucémique ne se développe pas chez tous les patients et le taux de rechute de la leucémie survient chez environ 30% des patients greffés. Ce projet vise à valider un sous type particulier de cellules humaines (les iNKT) qui favorisera l’effet anti-leucémique, avec un moindre effet sur les tissus sains. L’utilisation de ces cellules pourrait par conséquent améliorer le devenir des patients greffés. Les résultats de ce projet pré-clinique sont indispensables à la poursuite du développement de ce traitement innovant en vue de mettre en place des études cliniques chez l’homme.

Procédures

Une radiothérapie corporelle totale de faible dose (2 gy) de chaque animal soit 264 souris pendant 40 secondes par carrousel (6 à 8 souris). -Une injection intraveineuse (IV) sur animal vigile, une seule fois en début d’expérience pour 216 souris, et trois injections pour 48 souris, pendant 1 minute par injection. -Une injection intra-péritonéale (IP) sur animal vigile, au maximum 4 fois pendant 8 semaines sur 76 souris, pendant 1 minute par injections. -Un prélèvement de sang sur animal vigile sur 188 animaux, et cela à 21, 28 et 35 jours après la greffe de cellules humaines, pendant 2 minutes par prélèvement..

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress modéré lors de la procédure de radiothérapie à faible dose préalable à l’injection dans la veine caudale des cellules humaines. Ils développeront des signes cliniques de GVH à partir de 3 à 4 semaines après la greffe. Ces signes cliniques sont une perte de poids (-20% par rapport au poids pré-greffe) avec ou sans diarrhée et des signes de fatigue et d’altération de l’état général : voussure, perte de brillance du pelage, hérissement des poils, inflammation des yeux et diminution de l’activité dans les cas sévères. Ces signes sont gradés par le même expérimentateur selon le score de GVH. Le niveau de souffrance sera modéré. Dans les expériences où seront injectées des cellules leucémiques, les animaux présenteront à partir de 3 semaines après l’injection des signes de croissance tumorale avec prise de poids et développement de masses abdominales qui pourront altérer leur état général (augmentation du score clinique utilisé pour grader le degré de GVH). Le niveau de souffrance sera modéré.

Devenir

Les souris étant partiellement dépourvu de système immunitaire et ayant reçu une injection de cellules humaines plus ou moins avec des cellules leucémiques, une GVH ou une progression tumorale vont pouvoir se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animale, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 80 jours post injections, ou en cas de point limite atteint.

Remplacement

Nous continuons à réaliser des expériences in vitro pour valider la fonctionnalité des cellules humaines de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. Le projet est essentiellement basé sur la recherche d’efficacité et des meilleures conditions d’administration des cellules, ce qui ne peut pas être déterminé in vitro, et ce qui permettra de prévoir les conditions des essais cliniques.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris pour chaque étape du projet au minimum nécessaire pour les études statistiques : ainsi, l’expérimentation s’arrêtera dès l’obtention d’une différence significative entre les groupes (minimum 8 souris totales par groupe), et ne sera pas poursuivie en l’absence de différence statistiquement significative observée à 12 souris receveuses par groupe. Par ailleurs, les différentes étapes du projet seront conditionnées par les résultats obtenus dans les précédentes. Ainsi, au maximum 264 souris seront utilisées.

Raffinement

Les souris seront dans une cage contenant de l’enrichissement (buchette en bois, frisure de papier Craft et coton) avec maximum 4 à 5 individus par cage de 500 cm2, dans un portoir ventilé, dans un secteur spécifique pour les animaux immunodéprimés en animalerie EOPS avec contrôle de la température (22+/-1°C), de l'humidité (55 +/-10%), du cycle jour de 7h à 19h. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évalution sera utilisé. Des points limites sont mise en place.

Choix des espèces

La souris NSG permet l’élaboration d’un modèle de greffe de cellules humaines car cette souris, ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans la greffe de moelle osseuse. Ce modèle permet d’une part d’étudier l’impact de nouvelles thérapies cellulaires sur la GVH et l’effet anti-leumique, et d’autre part d’analyser les mécanismes d’action des cellules de thérapie cellulaire. Les résultats obtenus seront indispensables à l’élaboration d’essais cliniques chez l’homme dans un second temps. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 15 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.

6 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection intrathécale sous anesthésie et plusieurs prélèvements de liquide céphalo-rachidien et de sang, certains sur animal vigile, avant une autopsie, pour valider une technique d'administration en vue de futures études réglementaires de toxicologie. Le porteur indique qu'au réveil peuvent survenir une désorientation, une hypothermie ou une apnée, et que les prélèvements sur animal vigile peuvent être désagréables. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative non animale n'existe et que le macaque est "pertinent" par sa proximité phylogénétique avec l'humain.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de valider le modèle d’administration intrathécale (voie basse [lombaire] et voie haute [base du crane]) chez le primate non-humain. Ce modèle sera validé grâce à l’injection d’un produit pharmaceutique de référence dont la pharmacocinétique et la biodistribution seront évaluées et via une évaluation histopathologique complète afin de confirmer que la procédure d’administration intrathéchale (voie haute et voie basse) sera compatible avec une étude de toxicologie générale. Ce modèle permettra de répondre aux exigences réglementaires dans le cadre de l’évaluation de la sécurité des produits pharmaceutiques utilisant des stratégies thérapeutiques innovantes du système nerveux central qui seront injectées par voie intrathécale chez l’homme.

Bénéfices attendus

La validation du modèle d’administration intrathécale chez le primate non-humain permettra la réalisation d’études de toxicologie règlementaire qui sont nécessaires pour démontrer la sécurité des produits pharmaceutiques en développement, avant leur mise sur le marché ou les premiers essais cliniques (notamment pour le développement de thérapie innovante telle que la thérapie génique administrée par voie intrathécale chez l’homme). De plus la validation pourra contribuer à la mise sur le marché de nouvelles thérapies sûres pour les patients atteints de pathologie du système nerveux central (exemples: maladies de Parkinson et Alzheimer ou le dystrophie musculaire).

Procédures

L’injection unique intrathécale et les prélèvements de liquide céphalo-rachidien (4 temps, d’une durée d’envion 45 min par procédure) seront réalisés sous anesthésie générale volatile (après intubation endotrachéale) avec surveillance anesthésique et analgésie périopératoires (induction anesthésique via une injection intramusculaire). Une évaluation neurocomportementale sera réalisée en post-administration/prélèvement (durée d’environ quelques minutes) afin de déceler toute potentielle atteinte neurologique en lien avec la procédure. Une analgésie préventive (pré et post procédure pendant 2 jours), des grilles d’évaluation et des points limites spécifiques seront mis en place afin d’anticiper toute douleur ou détresse chez les animaux. Des prélèvements sanguins seront réalisés à raison de 4 temps (durée d’environ quelques minutes) dans les 24h suivant l’injection. Dès que possible, les prélèvements sanguins seront réalisés sur animal anesthésié à l’occasion des prélèvements de LCR. Pour les autres occasions, les prélèvements sanguins seront de courte durée (quelques minutes).

Impact sur les animaux

Les procédures d’administration/prélèvement intrathécale se faisant sur animaux anesthésiés qui seront mis à jeun la veille de la procédure. Lors du réveil anesthésique une désorientation/perte d’équilibre et une hypothermie peuvent être observées temporairement. En cas d’hypothermie, une prise en charge par lampe chauffante sera mise en place. Des évènements anesthésiques liées à l’anesthésie volatile peuvent survenir (apnée). Certains prélèvements sanguins (PS) seront réalisés sous anesthésie et seront donc sans effet attendu pour les animaux. Pour les prélèvements sanguins (PS) qui seront réalisées sur animaux vigiles celles-ci pourraient être associées à des sensations désagréables de ponction mais seulement pendant une courte durée. Les signes cliniques suivant pourraient être observés en cas de réaction exagérée au produit pharmaceutique de référence : • Troubles de la coordination des mouvements • Diminution de l’appétit • Somnolence • Vomissement • Diarrhée Ces signes cliniques devraient être seulement transitoire et seront surveillés.

Devenir

Les animaux seront autopsiés à la fin de la procédure afin d’évaluer l’impact de la procédure d’ administrations/prélèvements de liquide céphalo-rachidien (LCR) d’un point de vue histopathologique. Ceci afin de valider le modèle, dans le contexte des études réglementaires de toxicologie.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas d’alternative non animale permettant d’évaluer la sécurité et la toxicité, notamment systémique et neurocomportementale des futurs candidats médicaments dans le cadre du développement de thérapie innovante, telle que la thérapie génique. Il n’existe pas non plus d’alternative non animale pour valider que la technique d’administration intra thécale aboutit à une exposition de l’animal au produit pharmaceutique de référence et que celle-ci est bien tolérée (analyse histopathologiqueà. Le macaque cynomolgus est un modèle animal pertinent car il est proche de l'Homme d’un point de vue phylogénétique, transcriptomique et anatomique, permettant le développement de candidats médicaments et/ou de formulations innovantes dans les études de toxicologie.

Réduction

Le nombre d’animaux dans ce projet a été défini sur la base du nombre minimum d’animaux requis pour pouvoir conclure à la validation de la technique (pharmacocinétique et la biodistribution du produit réference). De plus, dans les études réglementaires de toxicologie 3 animaux par groupe sont généralement utilisés. Au total, 6 animaux seront utilisés dans ce projet : 3 animaux par localisation (zone lombaire ou cisterna magna).

Raffinement

Le produit pharmaceutique de référence sera injectée à une seule occasion et à une dose subclinique pour laquelle aucun effet toxique n’est attendu. Des points limites basés sur le comportement, l’état clinique et la perte de poids sont décrits dans des procédures internes et présentés dans la section points limites de ce projet (section 4.2). L’injection intratéchale sera réalisée sous anesthésie générale volatile (après intubation endotrachéale) avec surveillance anesthésique. Une analgésie préventive sera mise en place avant administration de l’élément de référence/prélèvements de liquides céphalo-rachidien (LCR) afin d’anticiper toute douleur ou détresse chez les animaux. Des mesures de prévention de l’hypothermie seront appliquées pendant l’anesthésie et au réveil. En raison du potentiel impact de l’administration intrathécale et des prélèvements de LCR, une évaluation neurocomportementale sera réalisée à deux occasions après adminisration et chaque prélèvement de LCR (+4h et +24h post-procédure). De plus, lorsque possible, les prélèvements sanguins (PS) seront réalisés sur animal anesthésié, à l’occasion des prélèvements de LCR. Pour les PS qui seront réalisées sur animaux vigiles (sans anesthésie) celles-ci pourraient être associées à des sensations désagréables de ponction mais seulement pendant une courte durée. L’euthanasie sera considérée pour les signes cliniques suivants : • convulsions ne rétrocédant pas spontanément ou à l'administration d'anti-convulsivants ou convulsions répéétes dans la même journée • Incapacité prolongée de l'animal à se déplacer ou pertes d'équilibres durables impactant la qualité de vie de l'animal.

Choix des espèces

Les études réglementaires de toxicologie doivent se faire chez une espèce pertinente pour l’évaluation de la sécurité des futurs candidats médicaments. La pertinence du primate non-humain est basée sur une homologie phylogénétique, anatomique et transcriptomique importante avec l’Homme. De nombreuses nouvelles stratégies thérapeutiques actuelles du système nerveux central (SNC) sont basées sur des produits biologiques ou de thérapie génique (oligonucléotide) qui nécessitent une homologie phylogénétique ou transcriptomique importante avec l’Homme afin d’évaluer les propriétés pharmacodynamiques du produit mais également les potentiels effets toxiques. Par conséquent, l’utilisation d’autres modèles non-rongeur (tel que porc et chien) est inapproprié dans ces études. L’utilisation du primate non humain pour la validation du modèle d’administration intrathécale est donc justifiée puisque les études précliniques non rongeurs sur ces nouvelles thérapies seront réalisés chez le macaque. La validation du modèle d’administration intrathécale ne nécessite pas de pré-requis d’âge et se fera sur jeunes adultes/adultes comme pour les études de toxicologie réglementaire.

200 souris "nude" vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules de cancer du sein triple négatif dans le flanc et la glande mammaire, puis des injections de peptides trois fois par semaine pendant trois semaines, pour évaluer l'effet anti-tumoral de ces molécules. Le porteur indique qu'une perte de poids et une gêne à la locomotion liée au volume tumoral peuvent survenir. Sur le remplacement, il affirme n'avoir "pas d'autres choix" que le modèle animal, la culture in vitro ne recréant pas l'environnement tumoral.

Objectifs

Depuis plus de 10 ans, le cancer est la première cause de mortalité en France. Or il a été démontré qu’une protéine de la matrice extracellulaire est surexprimée et sécrétée par les cellules cancéreuses au sein du microenvironnement tumoral sous une forme immature. Cette protéine est considérée comme un marqueur de mauvais pronostic et de récurrence dans de nombreux cancers tels que le cancer du sein, cancer le plus fréquent chez les femmes en France, ce qui en fait une cible thérapeutique d’intérêt et notamment dans le cancer du sein triple négatif, un sous type pour lequel la plupart des stratégies thérapeutiques proposées sont déficientes. Il a été montré qu’une accumulation anormale de cette protéine stimule la prolifération des fibroblastes (cellules saines autour de la tumeur) qui vont à leur tour stimuler et entrainer la multiplication des cellules cancéreuses. C’est donc dans ce contexte que différents peptides ont été synthétisés afin de répondre à un besoin thérapeutique non satisfait notamment dans le cancer du sein triple négatif (TNBC). Ce projet permettra de déterminer l’effet anti-tumoral des différents peptides développés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus par ce traitement sont une diminution de la croissance tumorale liée à une diminution de la prolifération fibroblastique. La réalisation de ce projet d’expérimentation animale permettrait de valider les résultats obtenus in vitro et ex vivo et confirmerait la pertinence de la stratégie thérapeutique associée aux peptides dans un modèle complexe de progression tumorale in vivo.

Procédures

- Injection de cellules tumorales au niveau du flanc droit (1 fois, moins de 5 minutes) - Injection de cellules tumorales au niveau de la glande mammaire (1 fois, moins de 5 minutes) - Injection de traitement par voie intra-péritonéale, 3 fois par semaine pendant 3 semaines (2 min) - Identification des souris par tatouage au niveau des oreilles (durée moins d’une minute – 1 fois)

Impact sur les animaux

Une perte de poids peut être observée suite à l’injection des cellules tumorales et doit être prise en considération. Une gêne à la locomotion due au volume tumoral ainsi qu’à la localisation de la tumeur peut être observée.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de limiter la douleur et/ou l’inconfort liés au développement des tumeurs.

Remplacement

Une étude in vitro seule ne peut suffire pour représenter les mécanismes physiologiques d’un organisme entier et les approches informatiques ne permettent pas à ce jour de mimer la fonction d’un organisme et sa réaction face aux traitements. En effet, il est notamment très difficile de recréer exactement, in vitro, l’environnement tumoral. Ainsi, nous n’avons pas d’autres choix que d’utiliser le modèle animal pour apporter la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique des peptides « LBC ».

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé de manière à réduire au maximum la quantité d’animaux tout en permettant une interprétation fiable des résultats basée sur des analyses statistiques adaptées.

Raffinement

Une observation à raison de trois fois par semaine des souris sera réalisée afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. L’utilisation d’anesthésiques, d’analgésiques et d’antalgiques permettra de prévenir et/ou traiter toute douleur éventuelle. Une attention particulière sera portée à l’observation des points limites fixés tout au long du projet afin d’éviter toute souffrance non soulagée par les soins apportés, auquel cas l’animal sera euthanasié. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe, surveillance trois fois par semaine). En ce qui concerne les souris nude, elles seront hébergées dans des cages homologuées sur portoir ventilé, dans une litière en cellulose. Des outils d’imagerie non invasifs seront utilisés.

Choix des espèces

Les cellules MDA-MB-231 et Hs578T sont des lignées de cancer mammaire triple négatif humain. Des souris Balb/c nude (immunité réduite) seront donc utilisées pour l’injection de ces cellules afin qu’elles ne soient pas rejetées par le système immunitaire et qu’une tumeur puisse se développer. Des travaux antérieurs ont été réalisés sur ce modèle murin dans le cadre de l’évaluation de nouveaux agents thérapeutiques dans le traitement de différents cancers. La protéine étudiée est la même chez l’Homme et chez la souris. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique, les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines, ce qui correspond à un stade adulte (jusqu’à environ 1 an chez la souris).

4 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues du croisement de deux lignées génétiquement modifiées, elles sont pesées puis soumises à des tests d'agrippement et de rotarod, le porteur prévoyant de les laisser atteindre les points limites pour évaluer un éventuel gain de survie dans un modèle de sclérose latérale amyotrophique. Il indique que l'atteinte de ces points limites peut occasionner des effets indésirables et une difficulté à se nourrir en fin de vie. Sur le remplacement, il décrit des modèles in vitro qu'il juge seulement "complémentaires" de l'approche in vivo.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) ou maladie de Charcot est une maladie caractérisée par une dégénérescence des neurones commandant les muscles. La SLA survient pendant la vie adulte et conduit à une paralysie fatale. Aucun traitement n'est disponible pour cette maladie. La plupart des études se sont focalisées sur les périodes symptomatiques ou pré-symptomatiques et non sur les mécanismes initiaux conduisant fort probablement à la survenue de la SLA. La présente DAP est basée sur nos récents travaux montrant que la transmission synaptique inhibitrice est réduite aux stades périnataux au niveau des neurones moteur de la moelle épinière de souris modèle de la maladie SLA. Notre projet est donc basé sur l’hypothèse que les premières dérégulations liées à la SLA débutent dès le développement du système nerveux central et sont accompagnées de mécanismes de compensation. L'effondrement tardif de ces mécanismes de compensation conduirait à l'apparition des symptômes de la SLA. Nos travaux montrent un déficit dans la transmission synaptique inhibitrice à des stades précoces de développement. Nous proposons donc d’augmenter la transmission synaptique inhibitrice chez la souris en utilisant une approche génétique et nous émettons l’hypothèse que cette augmentation aura des répercussions positives sur le développement de la maladie chez la souris adulte.

Bénéfices attendus

Le présent projet a pour but de mettre en évidence un défaut d'inhibition chez une souris modèle de la maladie sclérose latérale amyotrophique (SLA). Cette démonstration pourra être bénéfique aux patients SLA qui pourraient être traités par des molécules agissant sur l'inhibition synaptique.

Procédures

Aucune procédure chirurgicale n'est prévue dans le présent projet. Les souris seront pesées de manière hebdomadaire, soumises au test d'agrippement (grip-test) et au test du rotarod (locomotion sur un cylindre mobile). La survie des souris sera également évaluée. Enfin, certaines souris seront euthanasiées afin de collecter les tissus nerveux (moelle épinière).

Impact sur les animaux

Notre projet prévoit de laisser les souris atteindre les points limites afin d'évaluer l'éventuelle amélioration de leur durée de vie après croisement avec des souris ayant un niveau d'inhibition accru. L'atteinte des points limites, bien que ces derniers soient controlés, peut occasionner des effets indésirables sur les animaux. Certaines souris seront enthanasiées en vue de prélever des tissus nerveux pour étude immunohistochimique à posteriori. Là encore, bien que réduits au maximum par des injections de produits anesthésiants, des effets indésirables sur les animaux sont à considérer.

Devenir

Les souris modèle de sclérose latérale amyotrophique ayant atteint les points limites et les animaux contrôles du même âge seront euthanasiés afin de prélever des tissus nerveux et réaliser à postériori des analyses immunohistochimiques.

Remplacement

Les souris utilisées dans notre projet sont des souris transgéniques modèles murins de la maladie sclérose latérale amyotrophique (SLA) et des souris génétiquement modifiées afin d'augmenter le niveau d'inhibition au sein du système nerveux. Les deux souris seront croisées pour obtenir des animaux doublement génétiquement modifiés. Des animaux contrôles de la même lignée (et même portée) seront utilisés. Les modèles murins de la maladie SLA sont les animaux les plus utilisés pour tenter de comprendre les mécanismes de développement de cette maladie neurodégénérative touchant les neurones moteurs. Des modèles in vitro ont été développés pour l'étude du dysfonctionnement des motoneurones issus de patients SLA mais ces modèles restent complémentaires aux approches in vivo. Il est donc logique que le modèle murin de la SLA soit utilisé dans le cadre de la présente DAP.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, notre projet basé sur des méthodes variées permet d'utiliser au maximum tous les embryons et animaux néonataux disponibles issus d'une portée. Concernant les expériences réalisées chez l'adulte, un nombre minimum d'animaux est programmé en accord avec les tests statistiques qui seront réalisés à posteriori.

Raffinement

Les souris sont élevées avec un enrichissement. Des points limites sont établis afin de réduire au maximum la souffrance des animaux liée à leur difficulté à se nourrir en fin de vie.

Choix des espèces

La souris modèle de la maladie sclérose latérale amyotrophique (SLA) que nous utilisons reproduit les symptômes de la maladie de manière fiable et reproductive. L'autre souris présente un taux d’inhibition accru. Ces deux souris seront croisées afin d'obtenir des souris SLA ayant un niveau plus élevé d'inhibition (souris présentant une double modification génétique). Ces souris et leur contrôles non génétiquement modifiés seront testées chez des mâles puis femelles, au niveau comportemental à l'âge de 8 semaines jusqu'à l'âge de 20 semaines environ (= âge moyen de fin de vie de nos souris modèles de SLA).

Infectées par voie intranasale sous anesthésie avec des souches mutantes de Mycobacterium bovis, l'agent de la tuberculose bovine, les souris reçoivent aussi une puce télémétrique et subissent une prise de sang chaque semaine. 264 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes, afin de préciser le rôle de trois gènes de virulence de la bactérie. Le porteur part de groupes de 24 souris pour en garder 6 au dernier jour, les autres étant mises à mort au fil du protocole quand elles atteignent les points limites, en général entre J21 et J35, avec perte de poids rapide et prostration. Il annonce une mise à mort "dès l'apparition des premiers signes de souffrance comme définis par le point limite", sans chiffrer ce seuil.

Objectifs

La tuberculose bovine est une pathologie majeure en santé animale. L'espèce mycobactérienne adaptée aux animaux, Mycobacterium bovis (Mb), est le principal agent pathogène responsable de la tuberculose bovine en Europe et au Royaume-Uni. C'est un pathogène zoonotique multi-hôtes capable d'infecter les ruminants (bovins, caprins, ovins), la faune sauvage et l'homme. Les programmes de surveillance et d’éradication, basés sur des campagnes de tests et l'abattage systématiques des bovins réactifs, n'ont pas permis d'éradiquer la tuberculose bovine (bTB). La bTB représente donc un risque direct pour les économies agricoles, la santé animale et humaine et la biodiversité dans les pays touchés. Il existe une hétérogénéité dans la réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par Mb, ce qui influence directement le risque de transmission par les bovins infectés et la faune sauvage. Une meilleure compréhension des interactions hôte-pathogènes lors des infections à Mb est essentielle pour développer de nouvelles approches visant à éradiquer la tuberculose bovine. Le projet a pour objectif de comprendre comment Mb interagit avec le système immunitaire de l’hôte et comment cette bactérie module la progression et la transmission de la maladie. Pour cela, nous souhaitons identifier les gènes de Mb essentiel pour sa persistance et sa dissémination. Pour cela nous souhaitons i) Comparer la virulence de mutants de Mb (ii) Suivre la réponse immunitaire et le développement du granulome en réponse aux différents mutants.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous mettrons au point pour la première fois la vidéosurveillance d’animaux infectés en isolateur pour raffiner nos points limites (détection plus précoce de comportements). La validation du matériel, son installation, et de la méthode d’analyse permettra de proposer ce suivi pour nos prochains projets. Les résultats permettront de caractériser le rôle de 3 gènes de virulence pour la physiopathologie et la dissémination de Mb. Enfin, nous nous attacherons à une description exhaustive des réponses immunitaires chez les animaux infectés par les différentes souches.

Procédures

Pose de la puce d’identification et télémétrique : 1 fois et 1min/animal. Anesthésie par administration médicamenteuse par voie intrapéritonéale + infection par voie intranasale : 1 fois et 15 min/animal. Prise de sang : 1 fois par semaine et 3 min/animal/prélèvement. Pesée : bi hebdomadaire et 1min/pesée/animal. Les prises de sang peuvent engendrer un hématome et la contention peut engendrer du stress pour l’animal.

Impact sur les animaux

Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après l’injection de la puce d’identification pourraient être observés. Nous savons par expérience que les souris sont sensibles aux infections mycobactériennes. Ces animaux sont plus susceptibles d'atteindre les points limites lors d'infections avec la souche M.bovis de référence. Nous pourrons observer une perte de poids assez rapide associée à une prostration des animaux. Afin d'assurer un bon suivi de ces animaux, une grille d'évaluation de bien-être des animaux a été mise en place basée sur une observation quotidienne et une pesée bi-hebdomadaire.

Devenir

L'ensemble des animaux du projet seront euthanasiés à la fin du protocole afin de permettre le prélèvement post mortem des organes (poumons, foie, rate, cerveau, ganglion médiastinal) et fluides biologiques (sang, urine et fèces). Ces prélèvements nous permettront d'effectuer l'ensemble des analyses souhaitées comme l'analyse de charge bactérienne, des lésions, du recrutement cellulaire ou de la sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

A ce jour, aucun système in vitro ne permet de reproduire la complexité du tissu pulmonaire et les processus complexes de recrutement des cellules immunitaires. Le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, un test statistique de calcul de la puissance ou de l'effectif nécessaire en utilisant un test de comparaison de deux échantillons indépendants a été réalisé. Pour les données mesurées que ce soit le recrutement cellulaire, cytokines secrétées, nous obtenons une puissance de test pour un effectif de 6 animaux de 87% pour un test statisitique. Pour obtenir un groupe de 6 souris au dernier jour du protocole, nous savons qu’il nous faut partir d’un groupe de 24 animaux. En effet, tous les animaux ne réagissent pas pareil à l’infection, certains la contrôlent en formant des granulomes pulmonaires matures (25% des animaux), et les autres doivent être sacrifiés au fur et à mesure du protocole car ils atteignent les points limites (entre J21 et J35 classiquement). Chez ces animaux sensibles, des lésions désorganisées sont observables dans le poumon. En résumé, nos protocoles comprennent 24 souris, nous analysons les réponses immunitaires de deux groupes : les animaux résistants (5-6 souris) et sensibles (18-19 souris). Nous utilisons des souris consanguines dont la variabilité génétique est très faible. Nous utilisons des tests statistiques non paramétriques spécialement conçus pour comparer des groupes de petits effectifs. Un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène).

Raffinement

Les animaux seront élevés en communauté dans des cages enrichies avec du papier essuie tout, tunnel carton. Des visites des animaliers seront quotidiennes et la vidéosurveillance sera mise en place pour mieux suivre les souris. Les animaux seront 6 par cage de 530 cm2. Nous réduisons, et limitons au maximum l'inconfort, la douleur, pouvant être subie par les animaux. les animaux seront habitués en amont à la cellule d’expérimentation, une semaine avant le début de l’expérimentation Pour cela les animaux sont anesthésiés lors des infections et leur état général est suivi tout le long de l’expérimentation (poids, prostration…). Ainsi les animaux sont euthanasiés dès l’apparition des premiers signes de souffrance comme définis par le point limite. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type bouchée fruités ou rondelle de banane séchée ou popcorn sera réalisée.

Choix des espèces

Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse immunitaire d'un organisme entier. De plus, les modèles murins d'infections mycobactériennes sont très bien établis et permettent de mimer la physiopathologie observée chez l'homme et le bovin. De plus le modèle murin permet une manipulation en animalerie A3 et nous avons à notre disposition de nombreux outils pour cette espèce. Le modèle murin nous offre la possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées pour les voies de signalisation ou cytokines impliquées dans les réactions immunitaires. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 semaines (sexe indifférent). Pour ce projet, il nous faut des animaux ayant un système mature compétent pour cela il nous faut des animaux adultes mais pas trop âgées. De plus nous utilisons un modèle validé par la communauté scientifique.