Recherche appliquée

794 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par voie intraveineuse des cellules de myélome puis des lymphocytes T modifiés, avec jusqu'à douze séances d'imagerie et des prélèvements de sang, pour comprendre les rechutes d'une immunothérapie. Le porteur indique que le cancer peut provoquer une perte de mobilité puis une paralysie des pattes arrière et une perte de poids, l'euthanasie intervenant avant ces signes quand l'imagerie le permet. Il affirme que l'évaluation à long terme de ces cellules rend "indispensable" le recours à un "organisme vivant entier".

Objectifs

Le myélome multiple (MM) est caractérisé par le développement incontrôlé (prolifération) d'un type particulier de cellules sanguines de la famille des globules blancs appelées plasmocytes. Ces plasmocytes, cellules productrices d’anticorps, s’accumulent dans la moelle osseuse. Les traitements actuels du MM reposent sur la chimiothérapie et la greffe de moelle osseuse. Bien que ces traitements aient amélioré la survie des malades, certains patients répondent mal aux traitements conventionnels. Une nouvelle stratégie thérapeutique, ayant déjà fait ses preuves dans le traitement d'autres cancers du sang, vise à forcer les défenses immunitaires à reconnaitre et à détruire les cellules cancéreuses. Ainsi il est possible de modifier génétiquement une population de cellules du système immunitaire (les lymphocytes T) afin qu'ils reconnaissent spécifiquement les cellules tumorales et les éliminent. Le but ultime étant d'améliorer la prise en charge des patients résistants aux traitements classiques. Les plasmocytes tumoraux ont à leur surface des molécules qui vont être reconnues par les lymphocytes T modifiés entrainant l’élimination des cellules cancéreuses avec des taux de réponse de l’ordre de 80% chez des malades ayant reçu différentes stratégies de traitement. Cependant des rechutes surviennent encore et la survie reste au mieux de l’ordre de 2 ans. Dans notre projet, nous cherchons à mettre en évidence les mécanismes liés à ces rechutes et parmi eux le défaut de persistance des cellules thérapeutiques (lymphocyte T modifié) in vivo.

Bénéfices attendus

Cette étude va apporter des informations importantes pour la thérapie du MM où actuellement il n’y a pas de thérapie curative. En effet le défaut de persistance des cellules thérapeutiques est une des causes de rechute chez les patients atteint de cancer soigné avec l’immunothérapie, approche thérapeutique qui agit sur le système immunitaire d’un patient pour lutter contre sa maladie. La découverte de gènes influençant la persistance et l’efficacité des cellules thérapeutiques ciblant spécifiquement des molécules à la surface des cellules tumorales du MM pourraient ouvrir des portes pour le traitement d’autres cancers où l’immunothérapie est utilisée ou dans les études de nouvelle stratégie immuno-thérapeutique qui sont actuellement en phase de test préclinique ou clinique.

Procédures

Les modèles murins de MM consistent en l’injection par voie intraveineuse de cellules tumorales de MM humain ou murin à des souris éveillées (durée 1 min). Après 14 jours, notre stratégie thérapeutique sera injectée (par voie intraveineuse sur souris éveillées ; durée 1 min). Le développement de la tumeur et l'efficacité de nos cellules thérapeutiques seront suivis par imagerie in vivo sous anesthésie générale et ce une fois par semaine pendant toute la durée de l'étude (durée de la session : 10 min). Dans le cas où la prolifération des cellules cancéreuses serait rapide, nous Pourrions faire deux acquisitions d'imagerie par semaine. Sur toute la durée du protocole, chaque souris aura eu au maximum 12 séances d'imagerie. Nous réaliserons également des prélèvements de sang hebdomadaire (au niveau de la veine de la joue, sur souris éveillée; durée 30s; 5 prélèvements au maximum) afin de détecter les cellules tumorales circulantes. Ce type de suivi ne concernera qu'un petit nombre de souris pour lesquelles les cellules tumorales utilisées ne peuvent pas d'être détectées par imagerie.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pouvant être observés sont liés au développement du cancer du sang. Dans le modèle de MM humain, les cellules tumorales se multiplient dans la moelle osseuse. Ceci entraine fréquemment, quand le traitement n’est pas efficace, l’apparition d’une perte de mobilité qui dans la plupart des cas est suivi par une paralysie des pattes inférieures, s’accompagnant d’une perte de poids. Il est à noter que des tumeurs au niveau du crane sont également des évènements susceptibles d’être attendus sur ce modèle, néanmoins ces tumeurs apparaissent à long terme à environ 2 mois post injection des cellules tumorales. Dans le modèle de MM murin, les cellules tumorales s’accumulent au niveau de la rate, pouvant générer une douleur abdominale. Les souris pourront donc ressentir un stress lié à leur manipulation (anesthésie/imagerie répétée), des douleurs liées au développement de la maladie. Etant donné que les lignées utilisées n'ont pas de système immunitaire pour se défendre contre les microbes, un environnement non adapté (absence de barrière sanitaire) pourrait entraîner une mortalité précoce.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Nous analyserons à partir de la moelle osseuse et de la rate prélevées en post-mortem, les cellules thérapeutiques présentes afin d’identifier les gènes responsables de leur persistance sur le long terme.

Remplacement

Nous avons réalisé le maximum d'expériences in vitro afin de valider l'efficacité de nos cellules thérapeutiques. Cependant ces tests ne nous permettent pas d'évaluer à long terme ces cellules thérapeutiques. L’utilisation d’un organisme vivant entier est donc indispensable afin de reproduire les conditions observables chez l’Homme dans le cadre de leur utilisation en thérapie. De plus, il est nécessaire de vérifier ces résultats dans un modèle in vivo, car celui-ci intègre la plupart des caractéristiques de ces pathologies humaines telles que l’hétérogénéité des cellules tumorales, l’existence de tissus sains, la présence de barrières limitant l'efficacité des traitements

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisés au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Plusieurs groupes de souris seront analysés simultanément permettant de n’avoir qu’un seul groupe d’animaux « contrôle ». L’utilisation de l’imagerie in vivo permet également de réduire le nombre d’animaux utilisé grâce à l’analyse d’une même souris sur toute la durée de l’expérience.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes procédures. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant une grille d'évaluation prenant en compte l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. Ce suivi clinique sera réalisé une fois par semaine. De plus la mesure hebdomadaire voire bi-hebdomadaire par imagerie in vivo, nous permettra d'évaluer la propagation tumorale et euthanasier les animaux si celle si devient trop invasive et avant que les signes cliniques n’apparaissent (paralysie par exemple).

Choix des espèces

L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont le comportement est bien connu et proche de l’humain. Ainsi, l’évaluation du bien-être et de la douleur liée à l’expérimentation peut être effectuée aisément (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, isolement) permettant une prise en charge rapide et adapté. De plus, les modèles de MM humains et murins sont bien décrits dans la littérature scientifique. Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux adultes de 2 à 3 mois au début de la procédure (injection des cellules tumorales) qui est l’âge de référence utilisé dans de nombreux modèle expérimentaux sur souris adultes.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle de la maladie de Pelizaeus-Merzbacher, elles reçoivent une injection intraveineuse de thérapie génique sous anesthésie, une IRM d'environ deux heures et quatre tests comportementaux dont le contenu n'est pas précisé, tout en développant tremblements et paralysie progressive liés à la maladie. Le porteur mentionne un risque d'arrêt cardiaque et d'hémorragie lors de l'injection ainsi qu'une hypothermie sous IRM. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'existe pour cette maladie et que la souris "reste le modèle de choix".

Objectifs

La maladie de Pelizeus Merzbacher (PMD) est un défaut héréditaire de formation de la myéline (membrane isolante permettant le transport du message nerveux dans les neurones) du système nerveux central (SNC). Cette forme est causée par des mutations du gène de la protéine appelée proteolipide protein 1 (PLP1) indispensable à la bonne formation des gaines de myeline. La PMD se caractérise chez les patients de sexe masculin par une altération précoce du développement psychomoteur (inférieur à 6 mois de vie). Au cours des premières années de myélinisation active, le manque de force musculaire est associé à des signes neurologiques progressivement modifiés par la maturation du système nerveux. Il existe un modèle murin de la pathologie présentant une bonne similitude avec la maladie rencontrée chez l’Homme pour nous permettre de tester nos thérapies géniques. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement pour cette pathologie. Notre objectif est de tester différentes stratégies thérapeutiques basées sur une approche de thérapie génique au moyen d’une construction d’ADN appelée vecteur adeno-associé (AAV) conduisant à la surexpression d’un gène médicament (confidentiel). Nous avons d’ores et déjà démontré l’efficacité de notre gène médicament dans d’autres modèles de maladies neurologiques avec des atteintes similaires. L’objectif du projet étant d’établir la preuve de concept de l’approche thérapeutique afin ensuite de mener les étapes précliniques pour une application chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Des bénéfices pour les animaux ayant reçus la thérapie qui doit s’apprécier dans les tests comportementaux Le bénéfice du projet est d’etablir la preuve de concept de l’efficacité de nos approches de thérapie génique dans le modèle murin de Pelizeus Merzbacher pour pouvoir le transposer chez l’Homme afin de prendre en charge des patients aujourd’hui démunis et leur proposer un traitement.

Procédures

- Une injection intraveineuse sous anesthésie générale (durée 5 min au total) - Une Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 2h)) sous anesthésie générale Des tests comportementaux basés sur une appréciation de comportements spontanés (4 tests réalisés à 1 et 2 mois d’âges d'une durée de 2 à 20 min chacun). - phenotype dommageable des animaux avec un tremblement et une paralysie progressive

Impact sur les animaux

- Une injection intraveineuse avec un risque d’arrêt cardiaque et un risque d’hémorragie - Une Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 2h) avec un risque anesthésique et une hypothermie - Des tremblements et des signes de paralysie liés au modèle de la maladie - pas d'effets secondaires du traitement attendu - stress et angoisse et fatigue lié aux tests comportementaux

Devenir

En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires post-mortem

Remplacement

À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle In vitro ou de système cellulaire pour étudier les symptômes et marqueurs moléculaires associés à la maladie de Pelizeus Merzbacher (PMD). Nous avons donc besoin de modèles animaux pour reproduire et étudier cette maladie et surtout évaluer l’effet thérapeutique de nos approches de thérapie génique. Le modèle souris reste le modèle de choix car il reproduit les atteintes cliniques présentent chez les patients.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire. De ce fait un nombre de 20 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 300 souris sera nécessaire pour ce projet.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, la procédure a été mise en oeuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress. La procédure fait l’objet de raffinement : la lutte contre l’hypothermie lors des anesthésies, la surveillance des anesthésies notamment lors de l’IRM. Pour les souris étant en evaluation de survie, une surveillance quotidienne sera mise en place ainsi qu’un acces à la nourriture facilitée avec croquettes et nourriture gélifiée mise en place dans la cage mais aussi de l’eau gélifiée avec la mise en place de points limites. Les animaux seront hébergés en groupe dans des conditions protégées avec la couverture de tous leurs besoins physiologiques. La température, l'hygrométrie sont surveillées. un cycle nycthéméral est mis en place, l'alimentation et l'abreuvement sont à disposition sans restriction. Le changement des cages est assuré toutes les 1 à 2 semaines en fonction de la densité d'animaux (avec une litière faite de copeaux de bois) De l'enrichissement adapté aux besoins des rongeurs est disponible : coton et kraft pour fabriquer un nid, des maisonnettes pour être dissimulés, des bâtonnets à ronger voire des barrières visuelles pour complexifier la circulation dans la cage et permette là aussi la dissmulation, si besoin.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’un modèle animal pour évaluer l’efficacité thérapeutique de notre stratégie de thérapie génique de la maladie de Pelizeus. Nous prévoyons de conduire notre étude sur un modèle murin déjà connu qui reproduit la pathologie développée chez les enfants Les souris seront utilisées juste après leur sevrage et analysées jusqu’à l’âge de 2 mois pour la majorité avant l’apparition des symptômes invalidants. Seul un groupe de souris permettant d’apprécier la survie sur le meilleur de nos traitements sera gardé au-delà de l’âge des 2 mois avec suivi attentif.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome humain, des gavages quotidiens pendant trois semaines et des injections d'anticorps, pour tester une cible thérapeutique contre le mélanome métastatique. Le porteur indique que la tumeur peut gêner les déplacements et que les métastases pulmonaires peuvent provoquer perte de poids et troubles respiratoires, la mise à mort intervenant à 2 cm³ de tumeur. Il vise une collaboration avec l'industrie pharmaceutique et affirme que les méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes de la tumorigenèse.

Objectifs

Le mélanome cutané est un cancer de la peau agressif et malgré le développement de thérapies ciblées et d'immunothérapies, les patients diagnostiqués au stade métastatique ont toujours un mauvais pronostic. Il est donc urgent de trouver de nouvelles cibles pour les tests de diagnostic précoce et pour les traitements de la maladie métastatique. Ce projet vise à démontrer que cibler une protéine exprimée de façon non conventionnelle par les cellules tumorales peut altérer la formation de mélanome et la progression des métastases, en association avec les traitements déjà existants. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour démarrer des essais cliniques.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre la validation préclinique d'une nouvelle approche thérapeutique pour le mélanome cutané. Si les résultats obtenus confirment ceux des précédentes expériences in vitro, des essais de xénogreffes de tumeurs provenant de patients humains dans un modèle murin, pourront être envisagées. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique afin d’étudier l’effet de notre approche d’immunothérapie lors d'essais précliniques, dans l'objectif final d'identifier de nouveaux traitements pour le mélanome cutané.

Procédures

Toutes les souris seront injectées une fois avec des cellules tumorales humaines (200 microlitres). Les injections se font sous anesthésie gazeuse et durent une dizaine de secondes. Les injections d'anticorps (2 fois par semaine, 100 microlitres) ou de produit luminescent (une fois par semaine, 100 microlitres) sont faites sur animal vigile et durent quelques secondes. Le gavage oral sera quotidien à raison de 100 microlitres, est réalisé sur animaux vigiles et dure une dizaine de secondes. Les traitements durent au maximum trois semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont l'introduction d'une canule de gavage pour l'administration des molécules per os. Une douleur peut apparaitre à cause de la répétition des gavages (1 fois par jour pendant 3 semaines maximum). L’introduction d’une aiguille pour les différentes injections entraine une légère douleur au point d’injection mais qui est brève. L'injection de cellules tumorales va provoquer la croissance d'une tumeur primaire à l'endroit de l'injection et/ou la formation de métastases distantes, notamment dans les poumons. La tumeur primaire pourra générer un inconfort physique lors des déplacements des souris. Les métastases ne seront pas visibles mais pourront entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés notamment problèmes respiratoires liés aux métastases sur les poumons.

Devenir

Il est prévu de mettre à mort tous les animaux pendant ou à la fin du projet : l'injection de cellules tumorales devant conduire à la formation de tumeurs voire de métastases chez les souris, les animaux seront mis à mort pendant le projet si la taille de(s) tumeur(s) atteint les points limites, en cas de signes de souffrance ou à la fin du projet. Les tumeurs et métastases seront prélevées à des fins d'histologie pour étudier les marqueurs de cancer et la composition des tumeurs ainsi que pour d'autres analyses : séquençage d'ARNs, quantification protéique afin d'évaluer le résultat des différents traitements.

Remplacement

Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’effet du traitement par un anticorps spécifique sur la croissance tumorale in vivo. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis.

Réduction

Le nombre total de souris expérimentales sera de 200 réparti comme suit : 4 cohortes de 20 animaux injectés avec 4 lignées de cellules tumorales puis traités ou non avec l'anticorps et 3 cohortes de 40 animaux injectés avec 3 lignées cellulaires différentes, puis traités ou non avec l'anticorps en présence ou en absence d'une thérapie ciblée complémentaire. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Les paramètres étudiés seront la taille de la tumeur (mesurée avec un pied à coulisse) ainsi que sa vitesse de croissance et le développement des métastases pulmonaires. Les mélanomes humains sont des tumeurs hétérogènes dont les cellules ont un potentiel d’invasion plus ou moins important. Leur étude n'a pas permis d'isoler une lignée cellulaire modèle unique : il est donc nécessaire de tester plusieurs lignées cellulaires par différentes voies d'injection.

Raffinement

Des souris femelles seront utilisées : moins agressives que les mâles, elles seront hébergées en cohorte pour conserver l’interaction sociale. Les expérimentateurs établiront le contact avec les souris 8 jours avant le début de l’expérimentation les habituer à la manipulation et réduire leur angoisse. Les cages seront enrichies. Nous surveillerons quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. Nous mesurerons la taille de la tumeur primaire trois fois par semaine pour suivre la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 2 cm3 par souris. Nous adapterons la période de mesure pour chacune des lignées cellulaires utilisées en fonction de la vitesse de croissance tumorale. La migration des cellules métastatiques sera suivie par l'utilisation du système d’imagerie in vivo (IVIS) une fois par semaine.

Choix des espèces

In vitro, nous avons validé nos techniques expérimentales et obtenu des premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques environnementales de la tumorigenèse in vivo et ne peuvent donc fournir le niveau d'information requis. La souris est un modèle reconnu dans la communauté scientifique pour la greffe de lignées cancéreuses humaines afin de tester des traitements potentiellement transférables en médecine humaine. Pour éviter le rejet des cellules humaines de mélanomes après injection, nous utiliserons des souris immunodéprimées NOD/SCID/IL2GammaR. Ces souris présentent un système immunitaire déficient et nécessitent des conditions d'élevage stériles. Nous utiliserons des souris ayant atteint le stade adulte (6 semaines) qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc ou intraveineuse rétro-orbitale. La croissance tumorale ne devrait pas être impactée par l'âge des souris. Il est cependant préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes n'entravent pas leur capacité de mouvement.

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une infection pulmonaire par voie intra-trachéale puis, pour certaines, une greffe de cellules cancéreuses et des injections répétées, pour étudier le rôle de lymphocytes dans la défense anti-cancéreuse du poumon après une infection. Le porteur indique une perte de poids transitoire et modérée après l'infection et présente le modèle de métastases comme sans souffrance jusqu'au jour de l'euthanasie. Il affirme que la complexité de la réponse immunitaire rend le recours aux modèles animaux "indispensable" et évoque une valorisation par brevet.

Objectifs

Notre laboratoire a montré que suite une infection bactérienne pulmonaire, une cicatrice immunitaire se mettait en place, avec l’apparition de plusieurs populations de lymphocytes. Nous avons montré que ces lymphocytes jouaient un rôle majeur dans la défense anti-cancéreuse pulmonaire. Les objectifs du projet sont de caractériser le rôle de ces populations de lymphocytes 1) au cours de la défense anti-cancéreuse ; 2) lors d’une 2ème infection bactérienne.

Bénéfices attendus

Notre projet nous permettra d’améliorer nos connaissances de l’immunité anti-cancéreuse dans le poumon. Ce projet nous aidera à comprendre les modifications induites par la cicatrice immunitaire pulmonaire créée lors de la 1ère infection sur les fonctions des lymphocytes et les conséquences de ces modifications au cours d’une 2ème infection ou dans un modèle de cancer pulmonaire. Ceci nous permettra en finalité la valorisation (brevet) et la mise en place de traitements adaptés pour lutter contre le cancer et les infections bactériennes.

Procédures

Tous les animaux de ce projet sont soumis à une administration intra-trachéale sous anesthésie générale Un quart des animaux sont soumis à une administration unique par voie rétro-orbitale sous anesthésie générale. La moitié des animaux sont soumis à plusieurs injections intrapéritonéales en condition vigile. La moitié des animaux sont soumis à une injection intra-veineuse par voie caudale sur souris vigile. Tous les gestes sont de courte durée (au maximum 1 minute) et pour les souris anesthésiées, le réveil est quasiment instantané. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanées d’analgésiques pourraient être réalisées.

Impact sur les animaux

Modèles d’infection bactérienne : Les modèles d’inflammation respiratoires aiguës sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3jours) et modérée (< 10%) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les souris reprennent une courbe de poids normale. Les modèles cancéreux de métastases pulmonaires sont sans souffrance jusqu’à J21, temps d’euthanasie pour analyse. La déplétion des cellules gamma delta par administration intra-péritonéale de toxine diphtérique n’induit pas d’effets indésirables connus chez la souris (Sandrock et al. JEM. 2018).

Devenir

Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.

Remplacement

Les paramètres étudiés dans ce travail ne peuvent être aujourd’hui remplacés par des procédures in vitro et le recours à l’utilisation de modèles animaux est indispensable. Les multiples interactions entre types cellulaires différents et la complexité de la mise en place de l’immunité entraînée nous oblige à utiliser les modèles animaux pour appréhender ces phénomènes dans leur globalité.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=5) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Le test statistique utilisé sera une Anova suivie d’un test post-hoc. Une valeur de p

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux dans des cages enrichies en frisottis, de taille suffisante et dont la litière est changée une fois par semaine. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place (annexe 2). Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite de lidocaïne (1mg/kg) afin d’anesthésier localement la trachée.

Choix des espèces

Les modèles murins d’infections bactériennes ainsi que les modèles tumoraux sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature

130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de tamoxifène pour inactiver un gène, puis des prélèvements réguliers de touffes de poils et de fèces pendant six mois, pour étudier le rôle des hormones somatotropes dans le maintien des tissus au cours du vieillissement. Le porteur qualifie ces gestes de peu invasifs et compare la douleur du prélèvement de poils à celle d'interactions entre souris. Il affirme que la souris est la seule espèce vertébrée permettant cette approche transgénique et qu'un "organisme entier" est "indispensable".

Objectifs

Vieillir en bonne santé est un objectif majeur de notre société. La découverte de traitements anti-âge efficaces ou de comportements nutritionnels mieux adaptés pourrait avoir un impact spectaculaire sur la santé publique, en réduisant les problèmes de santé liés à l'âge tels que la démence, les accidents vasculaires cérébraux et les maladies cardiaques. Cette découverte devrait permettre de maintenir une qualité de vie acceptable au sein d’une population de plus en plus vieillissante. Plusieurs caractéristiques d’un vieillissement en bonne santé ont été identifiées à ce jour. Notamment, au cours du temps, il est connu que les tissus constituant les organes s’altèrent et ont donc besoin d’être renouvelés voire remplacés. Ce maintien tissulaire dépend fortement de l’alimentation, qui peut être considérée comme le premier stress environnemental d’un organisme à travers l’action des nutriments sur les tissus. D’ailleurs, une restriction calorique montre en effet une meilleure longévité dans des modèles animaux. L’expression des hormones somatotropes qui participent à la détection des nutriments est diminuée lors de cette restriction alimentaire. Ces hormones somatotropes et leurs récepteurs cellulaires ont été clairement identifiées comme étant des facteurs qui influencent la durée de vie des mammifères. Elles ont de plus des rôles critiques dans le développement, la croissance et le métabolisme des organismes. Le blocage de cette régulation hormonale somatotrope conduit à une augmentation de longévité. Selon notre hypothèse, cet accroissement de longévité devrait s’appuyer sur un meilleur maintien des tissus au cours du vieillissement. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de ces hormones somatotropes dans le maintien et le renouvellement tissulaire au niveau de différents organes. Le rôle de ces récepteurs hormonaux dans le maintien tissulaire sera exploré dans des modèles où cette signalisation somatotrope est altérée. Notamment, nous ferons varier les taux de blocage du récepteur impliqué et nous suivrons le devenir des cellules inactivées au sein des tissus au cours du vieillissement par des mesures longitudinales des taux d’inactivation sur des souris transgéniques mutantes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre comment l’axe somatotrope influence le devenir des cellules souches responsables du bon maintien des tissus au cours du vieillissement. Cette étude ne peut être effectuée qu’in vivo sur des modèles animaux de mammifères proches de l’homme où les tissus/organes sont dans un contexte permettant à différents types de cellules d’interagir entre eux au cours du temps. L’aspect intégré du modèle est essentiel pour comprendre dans son ensemble les mécanismes gérant l’activité des cellules souches dans les processus de régénération et de maintien à l’équilibre des tissus constitutifs d’organes. L’évaluation du rôle du récepteur hormonal dans l’homéostasie tissulaire proposée ici sera bénéfique en santé humaine, car elle permettra de proposer des pistes dans la prévention d’une meilleure santé humaine dans notre population vieillissante.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques afin de répondre aux objectifs scientifiques. Les interventions sont majoritairement peu invasives. Les souris seront injectées en intrapéritonéale avec contention sur animal vigile par trois doses différentes de tamoxifène afin d’induire l’inactivation du gène cible (environ 30 secondes par animal). Les poils et les fèces seront prélevés sur l’ensemble des animaux vigiles sur une période de 6 mois à raison d’un prélèvement par quinzaine, soit au total 14 prélèvements de touffes de poils et de crottes par souris (nombre maximum). Ces prélèvements ne durent pas plus de quelques minutes par animal (environ 2 minutes). A la fin de la période de maintien, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales de tamoxifène nécessaire pour induire le modèle implique une contention qui entraine un léger stress et une douleur de courte durée liée à l’injection. La récolte de fèces nécessite un isolement de quelques minutes qui peut également être source d'un léger stress mais n’a aucun impact sur le comportement global de l’animal. Le prélèvement de poils sera effectué par prise de petites touffes avec une pince plate et sera espacé d’au moins deux semaines. Ce type de prélèvement induit une légère douleur similaire à celle des interactions sociales entre deux souris.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à l’issus des actes mis en œuvre par une méthode réglementaire effectuée selon les bonnes pratiques. L’euthanasie des animaux est requise pour limiter la souffrance animale et pour l’étude histologique ou biochimique des tissus. La récupération des tissus post-mortem permettra une analyse des taux d’inactivation du gène cible par amplification quantitative de l’ADN.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, utiliser l’animal vivant est indispensable pour étudier les acteurs mis en jeu dans le maintien des tissus d’un organisme au cours du vieillissement. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu, notamment pour caractériser les compétitions/interactions existant entre des cellules inactivées pour le récepteur hormonal au sein des tissus d’un organisme multicellulaire. De plus la stimulation de croissance suite à l’inhibition de la voie de signalisation ne peut être obtenue que dans des modèles in vivo où les régulations hormonales peuvent se mettre en place. Notre objectif étant d’évaluer la possibilité de remplacement cellulaire au sein d’un tissu complexe, il ne peut être atteint que dans notre modèle de souris transgénique.

Réduction

Le projet impliquera un total de 130 animaux. Nous limitons systématiquement le nombre d’animaux au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Chaque souris est utilisée pour un maximum de protocoles expérimentaux, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. La procédure expérimentale a été affinée pour éviter l'utilisation inutile de souris comme un ajustement des doses de tamoxifène à injecter. Le suivi longitudinal du taux d’inactivation du récepteur qui sera effectué par prélèvement de petites touffes de poils et de fèces au cours de la vie de la souris, permet de réduire substantiellement le nombre de souris nécessaire pour l’étude proposée. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée tout en tenant compte des impératifs de réduction. Les taux d’inactivation seront comparés au sein de chaque groupe par un test statistique adapté.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la règlementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi en continu à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés quand cela est possible/nécessaire. Les prises de touffes de poils prélevés seront réduites au minimum nécessaire pour les analyses par amplification quantitative de l’ADN et les volumes injectés de tamoxifène seront adaptés au poids de chaque animal afin de ne pas induire de stress supplémentaire.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce vertébrée qui permet une approche par transgénèse avec élaboration de modèles génétiques complexes. Dans le cadre d’une étude intégrée au sein d’un organisme du devenir du maintien des tissus, elle représente un modèle de choix. De plus, l’utilisation de souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifiées dans lesquelles les gènes de l’axe somatotrope peuvent être invalidés. La souris représente un modèle de choix pour l’analyse exploratoire de ces gènes impliqués dans l’homéostasie tissulaire au cours du vieillissement. Les premières études menées sur ces modèles transgéniques ont permis d’aborder des questions fondamentales au niveau du maintien de la fonctionnalité des organes qui n’auraient pas pu être obtenues à partir de lignées cellulaires. Les expériences seront réalisées sur des animaux adultes âgés de 3 mois ou d’un an, et seront suivies pendant six mois. Les deux âges choisis sont les plus adaptés à l’étude du maintien tissulaire au cours du vieillissement et sont assez éloignés des stades du développement où la croissance de l’animal peut perturber le remplacement tissulaire.

11 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont immunodéprimées puis infectées par instillation pulmonaire de Mycobacterium abscessus, et reçoivent des composés par voie orale ou injectable une à deux fois par jour pendant cinq semaines, pour tester de nouveaux antibiotiques. Le porteur indique que l'infection peut provoquer une respiration difficile, un écoulement des yeux et du museau et de l'apathie, avec mise à mort anticipée si les points limites sont atteints. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la dynamique de l'infection, ce qui rendrait "nécessaire" le recours à l'animal entier.

Objectifs

Les mycobactéries non tuberculeuses ou mycobactéries atypiques sont des bactéries opportunistes dont le réservoir réside dans l’environnement (sol et eaux). Ce sont des bactéries non pathogènes intrinsèquement pour l’homme, elles sont dites opportunistes car elles vont devenir infectieuses sur un terrain affaibli. Elles vont être responsables d’infections pulmonaires chez des sujets fragilisés, atteints de mucoviscidose, de bronchopneumopathie chronique obstructive ou immunodéprimés. Ces sujets vont alors développer une infection pulmonaire progressive entrainant une insuffisance respiratoire sévère voire la mort si elle n'est pas traitée. Avec une moindre incidence, ces bactéries peuvent être responsables d’infections cutanées, toujours sur des sujets affaiblis. Ces maladies pulmonaires dues aux mycobactéries non tuberculeuses sont en augmentation dans le monde et dans plusieurs pays, dont les États-Unis et le Canada, le taux d'incidence de ces maladies est supérieur à celui de la tuberculose. Les approches thérapeutiques sont limitées et les infections sont difficiles à traiter en raison de la résistance aux antibiotiques conférée par une paroi cellulaire imperméable, des pompes à efflux ou des enzymes de résistance. Parmi les mycobactéries non tuberculeuses, le groupe Mycobacterium abscessus complex est l’un des plus cliniquement pertinents. La prévalence de groupe a augmenté au cours des deux dernières décennies. Afin d’éviter l’émergence de mutants résistants, les traitements sont des cocktails d’antibiotiques sur de longues périodes, plusieurs mois voire plusieurs années. Le développement de nouvelles thérapeutiques s'impose donc de toute urgence. L’objectif de notre projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés dans des modèles d’infection pulmonaire chez la souris induite par des bactéries appartenant au groupe Mycobacterium abscessus complex. Ces composés auront par ailleurs montré leur efficacité in vitro sur ces mêmes bactéries.

Bénéfices attendus

Après avoir montré leur efficacité in vitro sur un panel de Mycobacterium abscessus complex, et démontré de bonnes caractéristiques pharmacocinétiques, les molécules d’intérêt seront testées in vivo dans un ou des modèles d’infection pulmonaire chez la souris. Comme chez l’homme, les mycobactéries non tuberculeuses ne sont pas intrinsèquement pathogènes chez la souris saine. Afin d’obtenir un niveau d’infection permettant d’observer une efficacité, nous devons diminuer voir supprimer leurs défenses immunitaires. Nous utiliserons 2 types de modèles : Un premier, court (maximum 2 semaines) utilisant des souris immunodéprimées, nous permettra de savoir rapidement si le composé testé est efficace pour diminuer significativement la charge bactérienne pulmonaire. Un second, plus long (4 à 5 semaines) utilisant des souris immunocompétentes à l’immunité affaiblie nous permettra de savoir si malgré la présence d’une réaction immunitaire même diminuée le composé reste efficace. Pour chaque modèle, une première procédure, nous permettra d’établir les conditions optimales d’infection. Les nouvelles molécules seront tout d’abord évaluées sur le modèle utilisant des souris immunodéprimées, puis les meilleures d’entre-elles seront évaluées sur le modèle utilisant des souris immunocompétentes.

Procédures

1/ Administration des composés à tester ou de leur solvant, par voie orale ou sous-cutanée ou intra-veineuse ou intra-péritonéale, une à deux fois par jour pendant un maximum de 5 semaines. 2/ Injection en intra-péritoneale, d’un immuno-suppresseur, 2 fois pendant l’étude. 3/ Injection sous-cutanée d’un anti-inflammatoire, une fois par jour pendant un maximum de 6 semaines. 4/ Instillation en intranasale ou en orotrachéale d’une souche infectieuse 5/ Prélèvement sanguin après anesthésie gazeuse, une fois pendant l’étude

Impact sur les animaux

Les nuisances principales et effets indésirables sont ceux d’une infection pulmonaire : Respiration difficile et/ou bruyante, yeux et museau qui coulent, apathie. Les animaux recevront également les différents traitements par gavage oral ou par injection en sous cutané, en intrapéritonéal ou en intraveineux, traitements susceptibles de créer de l’inconfort voir de la toxicité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédures expérimentales, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.

Remplacement

A ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement, ni sur une durée de quelques semaines, la dynamique bactérienne dans un organisme, la complexité cellulaire impliquée et la cinétique d’absorption et d’élimination d’une molécule. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour évaluer l’efficacité de potentiels candidats médicaments.

Réduction

Nous utiliserons des modèles bien établis dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de limiter le nombre d’animaux. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Dans la littérature, le nombre d’animaux par groupe est compris entre 6 à 10. Une analyse statistique rétrospective permettra de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe afin d’obtenir pour chaque paramètre étudié une puissance de 80% et alpha=0.05. Tous les composés qui seront testés dans ce modèle seront sélectionnés sur la base de leurs efficacité in vitro et leur bonne distribution pharmacocinétique. Un grand nombre de composés synthétisés par notre recherche sont éliminés sur la base de ces résultats et ne sont pas évalués in vivo.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance journalière avec administration d’analgésique dans l’eau de boisson dès l’infection. Si les points-limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera mis à mort de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. Lors de la mise à mort, les animaux seront placés sous anesthésie profonde. Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. Pour éviter tout risque de surinfection, un couvercle filtrant sera placé sur toutes les cages. Les animaux à phénotype dommageable seront hébergés en portoir ventilé. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la durée de l’expérimentation.

Choix des espèces

L’espèce choisie sera la souris, espèce majoritairement utilisée dans la littérature dans les modèles d’infection pulmonaire et qui permet de recourir à des animaux génétiquement modifiés ou mutants, immunodéprimés. Les animaux seront utilisés à un stade adulte afin d’avoir une maturité pulmonaire.