Recherche appliquée

11 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent l'injection d'un vecteur de thérapie génique censé faire produire au foie un facteur de coagulation, puis dix-huit prélèvements sanguins sous anesthésie sur six mois et une ponction de moelle osseuse juste avant la mise à mort. Le porteur décrit une étude de dose préalable à un développement clinique encore "potentiel", et justifie le recours au primate par une reconnaissance du vecteur limitée aux cellules humaines ou de primates. La mise à mort est présentée comme "nécessaire" pour prélever les tissus.

Objectifs

L’hémophilie B est une maladie génétique dont l’origine est un déficit en facteur IX, un facteur de coagulation. Elle se traduit par un déficit de la coagulation sanguine. Les patients hémophiles B non traités présentent des symptômes tels que des saignements excessifs lors de blessure et parfois même des hémorragies spontanées pouvant être fatales si non traitées. L'activité biologique du facteur IX s'évalue en pourcentage de la normale. L'individu normal étant considéré comme ayant 100% d'activité. Si l'activité est indétectable (inférieur à 1%), il s'agit d'une hémophilie sévère, si l'activité est comprise entre 1 et 5%, l'hémophilie est dite modérée; au-delà et jusqu'à 30% l'hémophilie est mineure. L’intervention au niveau de l’activité biologique de ces facteurs peut avoir un bénéfice substantiel pour les patients avec hémophilie sévère. Le traitement que nous souhaitons évaluer dans ce projet est basé sur l’utilisation d'un vecteur de thérapie génique (vecteur lentiviral) qui, suite à une injection systémique, est capable de cibler les cellules du foie et permettre la sécrétion de facteur IX humain dans le flux sanguin. Le vecteur lentiviral qui sera testé dans cette étude a été conçu pour être peu reconnu par le système immuntaire de l'organisme qui le reçoit, ce qui améliore la délivrance du gène thérapeutique dans les cellules du foie et réduit les réponses inflammatoires aiguës. L'objectif de la présente étude est de réaliser une étude de dose avec de vecteur lentiviral chez des primates non humains (cynomolgus macaca) après administration intraveineuse.

Bénéfices attendus

L’hémophilie B, qui touche environ 1 homme sur 30000, entraîne un déficit de la coagulation sanguine en réponse à une hémorragie. Les patients non traités présentent des hémorragies prolongées ou spontanées pouvant être fatales. Le traitement actuel de l’hémophilie B est substitutif. Il repose sur l’administration intraveineuse plusieurs fois par semaine de concentrés de facteur IX, issus du plasma ou produits par biotechnologie. Ce traitement préventif est contraignant, coûteux, ne permet qu’une correction transitoire et partielle du déficit et est associé au risque de développement d'une réponse immunitaire, qui inhibe par la suite l'efficacité du traitement. Les résultats préliminaires des études d'efficacité de thérapie génique sont très prometteurs, mais demandent encore à être optimisés pour réduire leur coût mais également l'immunogénicité des vecteurs viraux utilisés. L'objectif de la présente étude est de réaliser une étude de dose, chez le primate non humain, d'un nouveau type de vecteur de thérapie génique (vecteur lentiviral) développé pour traiter l'hémophilie B. Les résultats fourniront des données importantes sur la dose minimale efficace de ce produit chez les primates non humains, avant les études de toxicologie réglementaire ultérieures et son développement clinique potentiel.

Procédures

Chaque animal de cette étude sera soumis aux interventions suivantes: - Dans les 2 mois avant injection: 3 à 4 prélèvements sanguins, sous anesthésie (maximum 15 à 30min) - La veille de l’injection : un traitement immunosuppresseur appliqué par voie intraveineuse, sous anesthésie (maximum 30min) - Le jour de l’injection (J0) : un traitement immunosuppresseur appliqué par voie IV + une injection du vecteur thérapeutique, par voie intraveineuse, le tout sous anesthésie (maximum 3h) - Le jour de l’injection (+3h) : Un prélèvement sanguin, sous anesthésie (maximum 15min) ou sur animal vigile - Entre 1 jour et 6 mois post-injection : un total de 18 prélèvements sanguins, sous anesthésie (maximum 15 à 30min) - A 6 mois post-injection (J180): un prélèvement de moelle osseuse + un prélèvement sanguin, le tout sous anesthésie (maximum 45min), avant euthanasie par injection intraveineuse d’une dose léthale de pentobarbital.

Impact sur les animaux

La majorité des gestes réalisés sur ces animaux seront non ou peu invasifs (injection du vecteur thérapeutiques par voie IV et prélèvements sanguins par ponction veineuse). Ils seront réalisés sur animaux anesthésiés. Le seul acte douloureux par lui-même sera la ponction de moelle osseuse (dans l’os d’une hanche) qui sera réalisé juste avant la mise à mort des animaux. Cet acte sera également réalisé sous anesthésie, et une injection de morphine sera réalisée avant l’acte afin de garantir une analgésie. D'autre part, l’injection systémique d’un vecteur lentiviral peut induire, au moment de son injection, une réaction inflammatoire et allergique transitoire. Cette réaction, asymptomatique chez les animaux, est limitée grâce à l’administration d’un traitement immunosuppresseur à base d’un corticostéroïde et d’un antihistaminique. Enfin, il n’est pas attendu que l’expression de la protéine facteur IX (exprimée par le vecteur lentiviral) pendant une durée de 6 mois soit associée à des phénomènes toxiques ou délétères provoquant des symptômes sévères chez l’animal. Malgré tout, un suivi rapproché des paramètres cliniques (observations quotidiennes et examens cliniques) et des paramètres sanguins (hématologie et chimie clinique) des animaux sera mis en place afin de pouvoir détecter toute anomalie.

Devenir

Les 11 animaux concernés par cette procédure seront suivis pendant 6 mois après l'injection du vecteur lentiviral puis euthanasiés pour prélèvements de tissus post mortem. L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements de tissus sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques et histologiques réalisées. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier et sur le long terme (plusieurs semaines après injection). L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier (i) l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents tissus: foie, coeur, muscles squelettiques et autres tissus majeurs), et (ii) la réponse immunitaire contre un vecteur de thérapie génique. Ce projet ne peut donc être réalisé in vitro. D'autre part, la tolérance immunologique de ce vecteur (et donc son efficacité) passe par la reconnaissance d'un facteur spécifique présent à la surface de ce vecteur, et ne pouvant être reconnue que par des cellules humaines ou de primates non humains. Pour que cette étude de dose soit pertinente, il donc est important qu'elle soit réalisée dans un modèle animal pouvant reconnaître cette protéine, d'où le choix du primate non humain.

Réduction

La détermination du nombre d’animaux a été réalisée sur la base de l'expérience d'études similaires en thérapie génique. La constitution de groupes de 3 animaux permettra d’obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Cela semble être un nombre minimal qui permette d’assurer la robustesse des résultats sans être excessif. Ce nombre d’animaux permettra une analyse statistique.

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. L'état de santé des animaux est surveillé tout au long des expériences afin d’éviter l'apparition éventuelle d'une souffrance. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation et les animaux disposent de nourriture et d'eau ad libitum. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage (dans la limite réglementaire) dans un milieu enrichi comprenant des enrichissements alimentaires, physiques, sonores et visuels variés et l’enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. L'application de critères d'arrêts nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés ou de décider d'une euthanasie anticipée.

Choix des espèces

La tolérance immunitaire (et donc son efficacité) du vecteur lentiviral de thérapie génique testé dans cette étude passe par la reconnaissance d'un facteur spécifique présent à la surface de ce vecteur, et ne pouvant être reconnue que par des cellules humaines ou de primates non humains. Pour cette raison, les primates non humains sont les espèces les plus pertinentes pour réaliser une étude de dose du vecteur lentiviral testé dans cette étude. Les résultats seront plus prédictifs de ce qui pourra se passer chez l'Homme, au contraire des résultats qui pourraient être obtenus en réalisant cette étude dans une autre espèce. Le traitement évalué dans ce projet s'adressait, dans le futur essai clinique, à des patients hémophiles adultes. Les animaux inclus seront inclus à l'âge d'environ 3 ans. Il s'agira de jeunes adultes, matures sur le plan métabolique.

2 688 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à sept actes en un peu plus d'un mois, dont des injections, deux anesthésies rapprochées, une hyperthermie localisée et un prélèvement de sang intracardiaque terminal, pour tester des nanoassemblages contre l'hépatite auto-immune. Le porteur obtient ce total en triplant un effectif de 896 animaux, soit trois répétitions indépendantes. Le bénéfice annoncé, un traitement ciblé épargnant l'immunité globale, reste une perspective, ces produits n'ayant jamais été administrés à des animaux.

Objectifs

Les maladies auto-immunes comme le diabète de type I, la polyarthrite rhumatoïde ou la sclérose en plaque résultent d’un dérèglement du système immunitaire. Parmi ces maladies, l’hépatite auto-immune (HAI) est une maladie rare avec une prévalence en Europe de 16 à 18 cas pour 100 000 habitants. Ce dérèglement hépatique provoqué par une attaque du foie par des lymphocytes T peut entraîner des défaillances hépatiques et/ou des cirrhoses. Le traitement actuel, non-spécifique (à base d’immunosuppresseurs combinant des corticostéroïdes et de l’azathioprine) présente de nombreux effets secondaires et entraîne une rémission complète en 18 mois pour seulement 75% des patients. De plus, 50 à 90% des patients rechutent dans l’année après arrêt du traitement. Des nouveaux traitements sont donc nécessaires. Nous souhaitons tester une nouvelle approche de thérapie sous la forme de nanoassemblages (NA) complexes combinant plusieurs stratégies. Une première étape de caractérisation, de validation, et de test de toxicité dans des cellules en culture a été réalisée pour plusieurs formulations, à l’issue de laquelle, 4 différentes formulations ont été sélectionnées pour faire l’objet d’une poursuite d’étude dans un modèle animal. Nous disposons de 2 modèles murins complémentaires d’une atteinte autoimmune hépatique. Les objectifs du projet sont de tester l’innocuité des 4 formulations sélectionnées sur des souris sauvages, puis de tester l’effet thérapeutique de ces NA sur les modèles murins d’hépatite. Ces travaux permettront in fine de combler l’absence actuelle d’approche thérapeutique ciblée pour le traitement de l’hépatite autoimmune.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’établir l’efficacité d’une nouvelle approche pour le traitement de l’hépatite autoimmune. Le traitement actuel de cette maladie n’a pas évolué depuis plus de 30 ans et consiste en une immunosuppression non spécifique prise au long cours, qui présente des effets indésirables certains. L’approche testée dans ce projet permet d’envisager un traitement ciblé, permettant de ne pas altérer l’immunité globale du patient.

Procédures

Au maximum, les animaux subiront 7 actes, sur une période de 34 à 37 jours. Des animaux recevront une injection (durée 1 minute, animal anesthésié), suivie 10 jours après d’une injection (durée 30 secondes, animal vigile), puis deux injections seront réalisées à une semaine d’intervalle (durée 1 minute chacune, animal anesthésié). Des souris subiront deux anesthésies à des temps rapprochés, la première pour une injection (durée 1 minute) et la seconde, 6 heures après, pour une phase d’hyperthermie modérée localisée (durée 30 minutes), Enfin, un prélèvement sanguin intra-cardiaque (durée 1 à 2 minutes, animal anesthésié) est prévu avant euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection intrapéritonéale et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Des animaux subiront deux anesthésies gazeuses rapprochées (6 heures d’intervalle), ce qui pourrait engendrer un stress. De plus la seconde anesthésie, d’une durée de 30 minutes pourrait entrainer une dépression cardiovasculaire transitoire, ainsi qu’une diminution de la température corporelle de l’animal. Les modèles d’hépatite utilisés provoquent tous deux une hépatite modérée qui n’entraine pas d’effets indésirables notoires. Pour ce qui est des traitements testés, on ne peut pas savoir à l’avance puisqu’ils n’ont jamais été utilisés chez l’animal. Toutefois en se basant sur la bibliographie utilisant des produits comparables, aucun effet indésirable n’a été rapporté. Les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive après les traitements.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures sont euthanasiés pour récupérer le foie, les organes, le sang, la rate, les ganglions et mener des analyses d’histologie, de microscopie, de biologie cellulaire et d’immunologie.

Remplacement

Les étapes de mise au point ont été autant que possible réalisées sur des cellules en culture, y compris les premiers tests de toxicité cellulaire. Le passage aux études in vivo est réduit aux tests nécessaires qui requièrent un système physiologique complexe, qu’il n’est pas encore possible de modéliser en vitro. Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique adapté.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet 2688 animaux seront étudiés : Nous estimons un nombre total de 112 lots de 8 animaux = 896 ; 3 répétitions indépendantes : 2688 animaux. De façon à réduire au plus le nombre d’animaux nécessaires, le calcul des effectifs a été réalisé par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. S’il s’avère qu’un traitement présente une toxicité, l’étude de ce traitement ne sera pas poursuivie dans les procédures suivantes. Dans un but de réduction, nous pourrons réduire le nombre de groupes contrôles s’il s’avère que les concentrations sont les mêmes pour plusieurs produits et en absence d’autres effets potentiels de paramètres extérieurs qui pourraient interférer. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toutes manipulations, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases de manipulation. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Les manipulations invasives seront précédées d’une courte anesthésie générale gazeuse et d’une analgésie locale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. A notre connaissance, il n’existe pas de modèle pertinent autres pour notre étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont des souris adultes de 8 à 10 semaines, car la croissance hépatique est achevée et le système immunitaire mature. A des âges plus avancés le système immunitaire ainsi que la capacité de prolifération du tissu hépatique peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité dans l’induction de la pathologie et dans la réponse au traitement.

920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée par injection de cellules cancéreuses, suivie d'injections de nanoparticules d'or et d'immunomodulateurs, de séances d'imagerie et d'une irradiation localisée. Le porteur indique que la tumeur et le traitement peuvent réduire l'alimentation et affaiblir fortement les souris, tuées ensuite car porteuses de tumeurs. La triple combinaison est présentée comme "prometteuse" pour les patients, mais l'apport reste une évaluation d'efficacité chez l'animal.

Objectifs

Le projet répond au besoin de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques pour augmenter la sensibilité des tumeurs aux rayonnements (radiosensibilité). Augmenter la dose maximale de radiation dans les tissus tumoraux tout en cherchant à réduire les dommages aux tissus normaux a toujours été un grand défi en radiothérapie. Les développements technologiques ces dernières décennies ont permis une amélioration croissante de l’indice thérapeutique (différence entre la dose thérapeutique et la dose toxique). En outre, plusieurs stratégies ont été développées et testées pour surmonter la radiorésistance de la tumeur et pour augmenter l’efficacité de la radiothérapie comme l’utilisation de radiosensibilisants. Les radiosensibilisants sont des produits chimiques ou des agents pharmaceutiques qui peuvent améliorer l’effet destructeur sur les cellules tumorales en accélérant les dommages à l’ADN et en produisant indirectement des radicaux libres. À cet égard, le rôle émergent de la nanomédecine pour le traitement de différents types de cancer peut représenter une approche prometteuse pour équilibrer l’efficacité de la thérapie et les effets secondaires. En particulier, l’utilisation d’une nouvelle classe de nanoparticules améliorant le rayonnement pourrait constituer une approche révolutionnaire pour le traitement local des tumeurs solides traitées par radiothérapie. L’objectif principal de ce projet est de mettre au point des nanoparticules synergiques et non persistantes pour la chimio-radiothérapie en vue de la gestion avancée du cancer. Afin d’améliorer l’application potentielle aux cliniques des nanoparticules, leur efficacité sera évaluée dans des modèles in vivo avancés, avec un intérêt particulier pour le carcinome de la tête et du cou qui est globalement le sixième cancer le plus fréquent par l’incidence dans le monde et il est caractérisé par une résistance aux médicaments importants.

Bénéfices attendus

Les nanoparticules métalliques sont développées de plus en plus comme agents prometteurs en oncologie en tant que vecteurs de médicaments et radiosensibilisants. Avec ce projet, nous allons évaluer l'efficacité anti-tumorale des nanoparticules d’or. Nous eallons évaluer l'efficacité de la triple combinaison radiothérapie, nanoparticules métalliques et immunomodulateurs pour obtenir des effets antitumoraux systémiques. Cette triple combinaison propose un modèle original et nouveau de coopération thérapeutique pour lutter contre le cancer, qui pourrait améliorer la prise en charge des patients de cancers des voies aériennes et digestives supérieures.

Procédures

Les animaux auront une injection de cellules tumorales (durée 1 minute, sous anesthésie générale). Les animaux subiront aussi une injection de nanoparticules et, pour certains, une injection d'immunomodulateur (durée 1 minute). Les animaux auront 3 séances d'imagerie in vivo sous anesthésie générale (durée 10 minutes). Des animaux subiront une irradiations localisée sur la tumeur par animal (durée 10 minutes).

Impact sur les animaux

Le traitement ainsi que la façon dont croît la tumeur peuvent réduire la capacité de la souris à s’alimenter et affaiblir fortement la souris. Les animaux subiront aussi du stress lors des préhensions pour examen, des injections (peu de nuisances car anesthésie locale) et des séances d'imagerie (stress de préhension).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés car ils seront porteurs de tumeurs. De plus, sur certains lots, des analyses post-mortem seront efectuées sur des tissus .

Remplacement

Nous avons utilisé au préalable des tests in vitro pour évaluer l'efficacité des nanoparticules sur les différentes lignées cellulaires utilisées dans ce projet. Les modèles in vivo s’avèrent indispensables pour valider ces résultats avec un système d’administration proche à celle que sera utilisée en clinique (injections intratumorales). Le recours à des modèles animaux est aussi incontournable pour étudier les effets des combinaisons thérapeutiques dans un contexte qui inclut le micro environnement tumoral et qui permet donc l’interaction des cellules tumorales avec le stroma (dont les cellules immunitaires sous dépendance de médiateurs type cytokines ou cellules provenant du reste de l'organisme). Cela est indispensable dans le contexte de la radiothérapie (par exemple: effet «bystander» de l’irradiation i.e. effets que les cellules irradiées pourraient exercer sur des cellules non irradiées à proximité ou à distance par exemple). Il n’existe pas de modèle alternatif permettant une telle étude. Le projet nécessite donc d’être mené sur un organisme vivant disposant d’un système immunitaire complet, et permettant l'étude du microenvironnement tumoral.

Réduction

Nous avons utilisé au préalable des tests in vitro pour évaluer l'efficacité des nanoparticules sur les différentes lignées cellulaires utilisées dans ce projet. ces tests ont permis de sélectionner certaines types de nanoparticules qui ont montré une meilleures efficacité en combinaison avec la radiothérapie. Nous allons donc effectuer les test in vivo uniquement avec le meilleur candidat sélectionné sur la base de ces tests préliminaires, ce qui va nous permettre de réduire le nombre d'animaux nécessaires. En outre, la connaissance des deux modèles tumoraux nous permet d'utiliser uniquement deux doses unique de radiothérapie, car nous connaissons déjà la radiosensibilité de ces modèles. De plus, ces modèles sont bien maitrisés au laboratoire, ce qui a permis d'avoir un tas d'inclusion élevé (très bonne prise de croissance des tumeurs). Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour ce projet nous nous sommes basés sur des analyses statistiques. Le suivi hebdomadaire des animaux permettra de réduire le nombre d'animaux utilisées (augmentation de la puissance statistique).

Raffinement

Un suivi quotidien clinique pour recherche de signes éventuels de souffrance sera effectué, et des mesures d'analgésies seront mises en oeuvre en cas de besoin. Le développement de la tumeur sera suivi par la mesure du volume tumoral grâce à l'imagerie in vivo et par des mesures directes. Des points limites précis et précoces ont été définis et seront strictement appliqués. L'environnement sera enrichi avec des sizzlenests et des tunnels en carton afin de diminuer l'angoisse. Les interventions (injections, imagerie) seront faites sous anesthésie.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques: - La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie. - Génétique proche de celle de l’Homme et bien connue - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - Les modèles de tumeur étudiés sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité. Les souris seront âgées de 8 ou 9 semaines, un âge où la souris est suffisamment mature.

77 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs ovaires sont retirés par chirurgie pour reproduire l'ostéoporose post-ménopause, puis elles reçoivent des injections tous les deux jours pendant jusqu'à huit semaines et deux prélèvements de sang. Le porteur admet une mortalité chirurgicale acceptée jusqu'à 10 %, et une mise à mort finale pour analyser les tissus osseux. Le test porte sur une famille de molécules développée avec des chimistes, dont l'effet reste à consolider.

Objectifs

L’ostéoporose est une problèmatique de santé publique. Cette pathologie, qui touche près de 40% des femmes et 15% des hommes de plus de 65 ans dans le monde, se traduit par une perte excessive de la masse osseuse et une diminution de la résistance des os, induisant une augmentation considérable du risque de fractures (377 000 nouvelles fractures dues à l’ostéoporose sont recencées chaque année en France). Il en résulte un important impact pour la société en raison des prises en charges hospitalières et thérapeutiques nécessaires à ces patients. Dans le cadre du développement de traitements contre l’ostéoporose nous avons développé, conjointement avec une équipe de chimistes, une famille de molécules agissant à la fois sur les symptômes directs de la maladie associés au remodelage osseux (pertes osseuses) mais également sur les phénomènes inflammatoires associés. L’objectif de ce projet est donc de consolider les données dores et déjà acquises sur l’effet biologique de ces molécules, en étudiant la restauration du phénotype osseux associé à leurs emplois, dans un modèle murin d’ostéoporose induit chez l’animal par le retrait des ovaires (ovariectomie). Cette approche expérimentale permet de récapituler les changements majeurs intervenant dans le cadre de la survenue de la ménopause et impactant l’homéostasie tissulaire osseuse (ostéoporose post-ménopause). Ce travail permettra donc, à terme, de proposer de nouvelles molécules pour lutter contre l’ostéoporose.

Bénéfices attendus

L’ostéoporose se traite actuellement par des moyens non médicamenteux et médicamenteux. La prise en charge non médicamenteuse fait ainsi appel à l’optimisation de la prise de calcium, le plus souvent d’origine alimentaire, une activité physique adaptée et régulière, couplées à la réduction de tous les facteurs favorisant la perte accélérée du capital osseux et les facteurs favorisant les chutes. Les traitements médicamenteux de l’ostéoporose se basent essentiellement sur des médicaments bloquant la résorption osseuse ou des substituts hormonaux, mais toutes ces approches thérapeutiques doivent être adaptées en fonction de différents facteurs de risques. En traitement de première intention, si certaines molécules bloquent la formation et l’activité des cellules qui dégradent naturellement l'os limitant ainsi la perte osseuse, cette approche thérapeutique ne permet pas de récupérer de la densité osseuse car elle bloque également à terme la reformation osseuse. Par ailleurs de nombreux effets secondaires sont associés à ces différents types de traitements : douleurs musculo-squelettiques et troubles digestifs auxquels s’ajoute un risque de destruction des os de la mâchoire avec certaines molecules. L’approche proposée vise à l’obtention d’une efficacité similaire à celle de ces molécules via des modes d’actions différents, laissant présager de ne pas reproduire leurs effets indésirables principaux, favorisant la prise en charge des patientes souffrant d’ostéoporose post-ménopause.

Procédures

Les animaux recevront une intervention chirurgicale de 30min sous anesthésie générale visant au retrait de leurs ovaires, puis des injections tous les 2 jours pendant 8 semaines au maximum sur animaux vigiles, sauf détection de stress ou d’inconfort des animaux qui nous inciterai à réaliser ce geste sous anesthésie générale. Les animaux auront également deux prélèvements sanguins (100µL chacun) à la queue, sous anesthésie générale, le premier en pré-opératoire et le second à 4 semaines post-opératoires.

Impact sur les animaux

Toute approche chirurgicale implique un risque non négligeable de mortalité. Une mortalité en lien avec la réalisation de la chirurgie de 10% est le maximum acceptable au-delà duquel la procédure complète sera abandonnée. Un gonflement, une perte de liquide et une irritation, susceptibles d’engendrer une diminution de l’activité de l’animal, peuvent nuire à la bonne alimentation et donc mener à une perte de poids voire à un comportement de repli. Une légère perte de poids des animaux, classiquement constatée en post-opératoire, est attendue dans les premiers jours.

Devenir

A l’issue des procédures tous les animaux seront euthanasiés suite à la nécessité de réaliser un prélèvement sanguin puis de prélever les tissus osseux et observer la microarchitecture osseuse par scanner et analyses histologiques et immunohistochimiques afin de pouvoir évaluer l'efficacité des traitements.

Remplacement

A notre connaissance il n’y a pas d’alternative non animale efficace pour étudier la perte osseuse induite par chute des taux hormonaux, mimant l’ostéoporose post-ménopause chez l’Homme. Les modèles d’organes isolés ne peuvent pas, à notre connaissance, fournir une réponse pertinente. Les mécanismes complexes de régulation en cascade des différents tissus, chacun contenant plusieurs types cellulaires, et du système immunitaire notamment via la mise en place d’une mobilisation augmentée des cellules résorbant l’os par exemple n’est pas réalisable en dehors de modèles in vivo impliquant un animal complet. Les données sur ces régulations complexes et multifactorielles sont encore trop minimalistes en l’état actuel des connaissances scientifiques pour envisager une modélisation numérique susceptible de répondre à notre hypothèse.

Réduction

Des analyses à mi-parcours avec dispositif d’arrêt de l’expérience si l'expérmentation ne peut statistiquement pas donner de résultat seront appliquées. Une logique d’arrêt de la procédure est mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux pour chaque groupe des points limites, la procédure sera interrompue. Pour que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique, un nombre minimum d’animaux sera utilisé. Nous proposons donc d’effectuer une première série de 5 animaux par groupe, avec une analyse statistique intermédiaire permettant de déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir une puissance statistique satisfaisante dans la limite de 10 animaux par groupe au maximum. Des tests statistiques adaptés aux effectifs de cette étude seront ensuite utilisés.

Raffinement

Lors de leur arrivée à l'animalerie, une période de quarantaine d’une semaine sera appliquée afin que les souris s'acclimatent à leur nouveau lieu d'hébergement. Les cages seront enrichies d’abri et roues ainsi que de matériaux (morceau de coton ou de sopalin, tube en carton…) permettant aux animaux d'améliorer leur milieu. A chaque intervention les animaux seront anesthésiés si nécessaire afin de limiter le stress et la douleur. Du fait de l’approche chirurgicale, une douleur post-opératoire sera anticipée avec l’injection préventive et curative d’antidouleurs. Un suivi rapproché (2 fois par jour) sera effectué sur les trois jours suivants la chirurgie et dès les premiers signes d’inconfort détectés. Le suivi des animaux se fera tous les deux jours lors des injections de façon à contrôler l'absence de points limites tout au long de l'étude. Les molécules choisies seront injectées sur animaux vigiles sauf détection de stress ou d’inconfort des animaux qui nous inciterai à réaliser ce geste sous anesthésie générale (afin de réduire le stress des animaux) tous les deux jours pendant 28 à 56 jours. Le poids des animaux sera mesuré à chaque temps de traitement. Les animaux seront finalement euthanasiés sous anesthésie générale gazeuse.

Choix des espèces

La réalisation de ces études chez la souris via le modèle est décrite et validée. Les expériences antérieures de l’équipe ont donné des résultats exploitables concernant les traitements dans d’autres champs d’application. La souris étant un animal de petite taille, son hébergement en groupe sociaux de plusieurs individus est facilité au sein de notre établissement utilisateur en regard du matériel à disposition. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 8 semaines à l’initiation de la procédure.

6 000 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'antigènes, parfois avec adjuvant, et des prélèvements de sang pouvant aller jusqu'à quatre par jour, pour produire des anticorps destinés à des tests de diagnostic et des médicaments. Hébergés seuls alors que l'espèce est sociale, ils sont tués en fin de protocole, un prélèvement de sang final important rendant leur maintien en vie impossible selon le porteur. Celui-ci reconnaît que la production d'anticorps in vitro existe mais affirme qu'une immunisation in vivo reste "nécessaire" dans certains cas.

Objectifs

L’objectif des protocoles d’immunisations sont utilisés à des fins scientifiques et médicales. Les applications pour leur utilisation peuvent être diverses comme par exemple : Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine, Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine (médicaments biologiques), Applications diverses en recherche et développement.

Bénéfices attendus

Ces études d’immunisation sont utilisées à des fins scientifiques et médicales. Ces études sont bénéfiques pour les patients à court terme (e.g. fabrication de tests de diagnostic de type ELISA) et à moyen/long terme (eg. Phase de recherche et développement pour la mise à disposition de médicaments biologiques).

Procédures

Tous les animaux rentrant dans une étude d’immunisation peuvent être soumis à des injections d’antigène et des prélèvements sanguins répétés. Concernant les injections, les volumes maximum sont de 2 mL répartis sur 4 à 8 sites maximum pour la voie sous-cutanée, 0.5 mL sur 4 sites maximum pour la voie intra-musculaire, 5 mL/kg pour la voie intraveineuse, 2mL sur 40 sites maximum pour la voie intra dermique. La durée d’injection est d’une dizaine de secondes à 5 minutes selon la voie. Le nombre d’injections dépend de la voie d’injection et du protocole du scientifique mais seront au maximum espacés d’un à deux jours sur une durée totale d’un mois. En cas de durée supérieure à un mois, la structure en charge du bien-être animal sera contactée pour évaluer le bénéfice / risque. Concernant les prélèvements, les animaux peuvent être soumis à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale de 5 minutes. Tous les animaux rentrant dans une étude d’immunisation peuvent être soumis à une anesthésie générale par injection d’un anesthésique par voie intraveineuse ou à une anesthésie locale répétée par application d’une pommade anesthésiante. Une pesée hebdomadaire d’une durée inférieure à 5 minutes est réalisée jusqu’à une fois par jour selon le protocole et l’état clinique de l’animal.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : douleur, stress, perte de poids et inflammation localisée au site d’injection liés à des injections répétées d’antigènes (+/- adjuvés), douleur, stress, perte de poids et saignements et/ou inflammations localisés aux sites de prélèvements liés aux prélèvements sanguins répétés, la contention de l’animal d’une manière générale qui peut amener à du stress chez l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Il est en effet impossible de : réutiliser ces lapins dans le cadre d’un autre protocole d’immunisation, réutiliser ces lapins dans le cadre d’un autre projet effectué par l’établissement utilisateur. Lors du prélèvement final de la procédure, un volume significatif de sang est récupéré et cela rend incompatible la réutilisation de l’animal.

Remplacement

La production d’anticorps par méthode in-vitro exclusive comporte des avantages mais dans certains cas (exemples :besoin de concentration en anticorps élevée, glucosylation appropriée, affinité des anticorps spécifique…), une immunisation de type in-vivo reste encore nécessaire de nos jours. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Réduction

Également, à travers les années d’expertises gagnées par l’établissement utilisateur, il n’est pas nécessaire de commander plus d’animaux que demandés par le scientifique pour réaliser le projet. Si une exception à cela devait avoir lieu, une revue par les membres de la SBEA serait nécessaire avant d’initier le projet. Avec l’expérience acquise, le nombre d’animaux prévu dans ce projet est diminué de l’ordre de 20% par rapport au projet précédant. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Raffinement

Les lapins sont hébergés individuellement en gardant un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. De l’enrichissement est mis à leur disposition (balles de cellulose et/ou foin, anneau en plastique, mousqueton…) Un cycle jour nuit est présent en zone d’expérimentation (12h/12h). Les animaux sont observés de manière quotidienne par du personnel formé et compétent et pesés toutes les semaines. Durant cette pesée, un examen approfondi de l’état clinique des lapins est effectué par le technicien (e.g. : vérification des points d’injection, maux de patte éventuels, dentition…). Également, durant ce processus, des caresses aux animaux sont prodiguées. Des points limites intermédiaires associés à des actions spécifiques et des points limites terminaux sont en place. Par exemple, en cas de perte de poids ≥ 20% sur une semaine, une nourriture appétante est proposée à l’animal. Également, en cas d’apparition de certains signes cliniques (exemples : masses sans douleur pour l’animal, abcès sans lésion, fécalome) des protocoles de soins validés par un vétérinaire sont prodigués aux animaux. Certains gestes douloureux (injections intra-dermique) sont réalisés sous anesthésie générale et les injections répétées sont effectuées après application d’un anesthésiant local (lidocaïne). En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la «Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l'animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s’assurer de sa récupération immédiate. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Choix des espèces

Le lapin est l'animal le plus utilisé pour la production d’anticorps étant l’espèce animale la plus adaptée pour cela, de par la production de volumes suffisants d'antisérum qualitatif et à titre élevé. Cela permet donc d’utiliser moins d’animaux pour l’objectif scientifique requis. Age minimum des lapins : 10 semaines. A cet âge, les lapins ont un système immunitaire permettant la réalisation des études de type immunisation.