Recherche appliquée

86 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection intracérébrale de vecteurs viraux pour surproduire la neuromélanine, puis jusqu'à cinq séances d'imagerie sous anesthésie et un essai de traitement par ultrasons, avant mise à mort pour analyse du cerveau. Le porteur indique que l'injection peut provoquer douleur et perte de poids, et qu'un syndrome parkinsonien progressif peut mener à l'apathie. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité du cerveau nécessaire à l'étude de la maladie de Parkinson.

Objectifs

La neuromélanine, qui joue un rôle dans le développement de la maladie de Parkinson, est principalement contenue dans une structure cérébrale appelée substance noire qui est fortement impactée dans la maladie. L’imagerie par résonance magnétique permet de mesurer in vivo le volume de certaines structures cérébrales, incluant la substance noire, ainsi que de mesurer la présence de neuromélanine. L’objectif du projet est de mesurer le niveau de neuromélanine par imagerie par résonance magnétique dans un modèle rat de la maladie de Parkinson afin de mieux comprendre le lien entre cette molécule et le développement de la maladie. Un essai thérapeutique par stimulation mécanique des tissus par ultrasons focalisés transcrâniens sera également réalisé dans l’objectif de réduire la concentration intracellulaire de neuromélanine et de ralentir le processus dégénératif.

Bénéfices attendus

Ce projet participera à la recherche contre la maladie de Parkinson avec de nombreux bénéfices à court et long-terme. Dans un premier temps, les résultats de la première étude permettront de mieux comprendre le développement de maladie de Parkinson en étudiant la corrélation entre les niveaux de neuromélanine dans la substance noire, les symptômes moteurs et les caractéristiques histopathologiques des neurones dopaminergiques. Selon notre hypothèse, un seuil de neuromélanine pathologique sera établi à la suite de cette étude. Dans un second temps, notre projet permettra le développement et l’évaluation in vivo du traitement par ultrasons transcrâniens focalisés sur un modèle pertinent. Nous attendons de ce traitement qu’il ralentisse l’apparition du syndrome parkinsonsien chez les rats. Nos données présentant plusieurs fenêtres thérapeutiques seront alors une base solide pour la conception d’un essai clinique. En supplément de ces bénéfices directs, le projet permettra une meilleure caractérisation du modèle rat utilisé. Ces résultats, qui pourront être valorisés à travers des publications dans des revues scientifiques, seront utiles à toute la communauté scientifique travaillant sur ces problématiques. Par ailleurs, les images acquises en imagerie par résonance magnétique et les échantillons cérébraux issus de rats modèles de la maladie de Parkinson à différents âges, pourront par la suite être réutilisés dans de futurs projets.

Procédures

Le projet inclut les interventions suivantes : - Injection intracérébrale de vecteur viraux induisant la surproduction de neuromélanine : 86 rats (tous les animaux). Sera pratiqué une seule fois par animal, sous anesthésie générale avec prise en charge analgésique pour une durée de 30 min. - Imagerie par résonance magnétique sensible à la neuromélanine : Sera pratiqué sur 86 rats entre 1 et 5 fois par rat en fonction des groupes expérimentaux (temps de maintien plus long), avec un minimum d'1 mois entre deux sessions. Pratiqué sous anesthésie générale pour une durée de 2h30. - Test comportemental (observation du rat dans une cage propre) : Sera pratiqué entre 1 et 5 fois par rat en fonction des groupes expérimentaux (temps de maintien plus long), avec un minimum d'1 mois entre deux sessions. Pratiqué sur animaux vigiles pour une durée de 5 min. - Traitement par ultrasons focalisés : Pratiqué sous anesthésie générale en même temps qu'une session d'imagerie de 30 min sur 30 rats 1 fois par semaine pendant 3 semaines.

Impact sur les animaux

Les rats recevront une injection stéréotaxique de vecteurs viraux exprimant la tyrosinase humaine. Suite à cet acte, les rats sont susceptibles de montrer des signes de douleur et une perte de poids qui devrait durer une semaine maximum. Les sessions d’imagerie et de traitement ne nécessitent pas de chirurgie et aucune nuisance n’est attendue après réveil. Enfin, les tests comportementaux prévus (observation d’un rat dans une cage propre pendant 5 min) seront réalisés sur des rats vigiles. Ces tests pourraient générer un léger stress qui devrait s’estomper rapidement après retour du rat dans sa cage d’hébergement. Le phénotype des rats exprimant la tyrosinase humaine n’est pas considéré comme dommageable dans la limite d’âge attendue. Le développement du syndrome Parkinsonien chez les rats exprimant la tyrosinase humaine, très progressif, pourrait cependant mener à terme à une perte de poids due à une apathie et inactivité des rats.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever leurs tissus cérébraux et d’analyser les neurones dopaminergiques de la substance noire. Ces données nous permettront de mieux comprendre les liens entre le niveau de neuromélanine, les troubles moteurs, et la dégénérescence neuronale dans ce modèle de la maladie de Parkinson.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun moyen de modéliser in vitro ou in silico la complexité du cerveau nécessaire à l’étude des mécanismes à l’origine de la maladie de Parkinson.

Réduction

Un calcul de puissance statistique d’après nos précédents résultats a montré un nombre minimal de 8 rats nécessaires dans chaque groupe expérimental pour pouvoir répondre à la question scientifique posée. Afin de garantir que la perte d’un animal pour une quelconque raison ne puisse pas compromettre les analyses statistiques de l’étude, ce nombre a été porté à 10 rats par temps d’observation (5 temps x 10 rats = 50 rats). La conception de l'étude permet de réduire le nombre d’animaux utilisés en effectuant un suivi longitudinal plutôt que l’établissement d’une nouvelle cohorte pour chaque âge étudié. De plus, afin de garantir le bon déroulement de l’étude principale , celle-ci sera précédée d’une étude préliminaire permettant d’optimiser les protocoles d’injection et d’imagerie. Un nombre de 6 rats est prévu dans cette procédure pour pouvoir ajuster notre protocole avant le lancement de l’étude comportant un nombre important d’animaux, dans le cas où le protocole initial ne serait pas satisfaisant pour répondre à la question scientifique. De plus, cette étude principale permettra d’identifier la fenêtre temporelle la plus pertinente pour l’évaluation d’une thérapie. Cela permet de réduire le nombre d’animaux qui auraient dû être utilisés pour tester le traitement à différents temps post injection. Au total un nombre de 86 rats sont donc inclus dans les procédues expérimentales.

Raffinement

Les rats seront hébergés par 2 en portoir ventilé, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture seront fournies ad libitum. Un environnement enrichi par un système de nidification périssable renouvelé lors du change hebdomadaire sera fourni aux animaux. Une période d’acclimatation d’une semaine est prévue avant toute manipulation des animaux lors de leur arrivée. Les animaux seront ensuite examinés quotidiennement par le responsable du projet. Une surveillance et une fréquence de pesée accrues seront mises en place en cas d’approche d’un point limite, en particulier en cas de perte de poids corporel constatée lors du suivi hebdomadaire. Lors des injections intracérébrales, les rats âgés de deux mois seront anesthésiés et recevront une analgésie 20 minutes avant l’injection intracérébrale. La température corporelle des animaux sera maintenue avec un tapis d’eau chaude circulante thermo-régulée. De l’ocrygel sera placé sur les yeux pour éviter tout dessèchement. Une crème analgésique locale sera également appliquée au niveau des points de contact du cadre stéréotaxique. Suite aux actes chirurgicaux, une prise en charge analgésique sera réalisée pour la prise en charge aigüe, puis des analgésiques seront mélangés à la boisson pendant 24h. Le suivi hebdomadaire du poids corporel des rats nous permettra d’instaurer un point limite de nuisance au bien-être des animaux. Suite aux actes chirurgicaux, ou en cas de perte de poids des animaux, une surveillance accrue sera mise en place avec un suivi renforcé à trois fois par semaine. La plaie sera surveillée. En cas d’infection, la plaie sera nettoyée et une pommade cicatrisante sera appliquée quotidiennement. L’utilisation d’ultrasons transcraniens est une mesure de raffinement en elle-même puisqu’elle permet une approche thérapeutique sans ouverture crânienne. Lors des examens d'imagerie, les rats seront anesthésiés et fixés par un cadre stéréotaxique au lit de l’appareil d'imagerie. Une analgésie locale sera appliquée par gel au niveau des oreilles pour minimiser la douleur induite par le cadre stéréotaxique.

Choix des espèces

Les rats sont de bons modèles pour l’étude du cerveau par imagerie par résonance magnétique, car leur taille permet de les examiner dans des imageurs à résonance magnétique à haute performance, avec de nombreux modèles pathologiques disponibles. De plus, de nombreux tests comportementaux permettent d’évaluer les altérations cognitives et motrices dans ces modèles. En particulier, le modèle utilisé permet de reproduire de nombreux aspects de la maladie de Parkinson. Les animaux seront utilisés à l’âge de deux mois, au début de l’âge adulte, idéal pour l’injection des vecteurs viraux et passage à l’imagerie par résonance magnétique.

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le parasite de la leishmaniose est injecté dans l'oreille, puis les lésions sont suivies pendant plusieurs mois, le porteur indiquant que des ulcérations peuvent se développer et durer jusqu'à douze semaines. Il étudie le rôle d'un récepteur immunitaire dans cette maladie et situe le bénéfice, une thérapie, à long terme. Il affirme que les mécanismes inflammatoires ne peuvent être étudiés de façon intégrée que dans un organisme entier.

Objectifs

Les leishmanioses sont des pathologies causées par le parasite leishmania qui font de plus en plus de ravages autour du monde. Aujourd’hui plus d’un milliard de personnes vivent dans des zones endémiques et peuvent donc contracter le parasite et développer la maladie. Les manifestations cliniques des leishmanioses cutanées chez l’homme peuvent varier de nodules, pustules, ulcères, jusqu’à atteindre des défigurations au niveau du visage et parties externes du corps. La nature de la réponse immunitaire dans la physiopathologie des leishmanioses cutanées joue un grand rôle dans la résolution ou la persistance de la maladie. La reconnaissance du pathogène par le système immunitaire se fait grâce à des recepteurs présents sur les cellules immunitaires. L’objectif principal de notre projet est d’étudier l’interaction du parasite avec un récepteur immunitaire pour comprendre le rôle que joue ce dernier dans cette pathologie et suivre la réponse immunitaire qui peut en résulter.

Bénéfices attendus

Les leishmanioses cutanées peuvent être contractées par l’homme de tout âge, comme par l’animale. Plusieurs tentatives ont été faites pour développer des traitements efficaces mais à ce jour il n’existe pas de traitement effectif pour cette pathologie. Il devient donc de plus en plus urgent de se pencher sur cette pathologie car cette dernière risquerait de se propager rapidement dans les prochaines années. Cela serait dû à plusieurs facteurs dont le réchauffement climatique. L’objectif à long terme est de développer une thérapie efficace en ciblant des récepteurs présents sur des cellules immunitaires afin de réduire et limiter ainsi l’invasion parasitaire.

Procédures

-1 Injection dans l'oreille pendant 15 secondes -Suivi hebdomadaire de l'évolution des lésions pendant 15 mois

Impact sur les animaux

Suite à l’injection de parasites, les souris peuvent présenter une douleur modérée, une inflammation localisée au site de l’injection. Par la suite, des ulcérations peuvent se développer à partir de la semaine 2-3 et peuvent durer jusqu’à 12 semaines. La manipulation de souris pour le suivie s’effectuera à partir du moment de l’injection jusqu’à la semaine 20 post injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocol expérimental afin de réaliser diverses prélèvements (tissus, sang, organes...)

Remplacement

Ce projet s’intéresse à la compréhension du rôle du récepteur CD32a dans la réponse inflammatoire dans le cas des leishmanioses cutanées. La pathologie étant cutanée, le développement de lésion est le symptôme dominant observé dans cette pathologie. Ainsi, les mécanismes physiologiques et immunologiques complexes aboutissant à cette inflammation ne peuvent être étudiés de façon intégrée que dans un contexte d’organisme entier, dans des modèles in vivo.

Réduction

Un total de 96 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet permettant de réaliser 3 études de 6 groupes (groupes contrôles et groupes infectés) avec 6 animaux par groupe (pour les groupes infectés) et 4animaus (pour les groupes contrôles) sur une durée de 2 ans. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cages ventilées, par groupe social stable de 5. La nourriture, et l’eau de boisson seront fournies. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être ainsi que de l'enrichissement (batonnet de bois, coton, maison en cellulose). Au moment de leur entrée, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation (une semaine) et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière-obscurité (12h – 12h), d’une température (20 - 24°C). Les souris seront surveillées tous les jours pour vérifier l’absence de souffrance. Toutes les injections sont réalisées sur animaux sous anesthésie gazeuse général et avec un analgésique. Les injections sous la peau seront réalisées avec grand soin pour éviter d’atteindre le muscle. On a mis en place une fiche de scoring comme point limite fafin de prendre en charge l’animal au cas où il y a atteinte à son bien-être et pour éviter la souffrance animal.

Choix des espèces

Deux modèles murins sont choisis pour étudier le rôle du récepteur, des souris sauvages qui n’expriment pas le récepteur et une lignée transgénique de souris exprimant ce récepteur. La souris adulte, agée entre 6 et 8 semaines, est le modèle le plus utilisé dans l'étude de la leishmaniose cutanée puisque c'est un mammifère et qu'il est aussi bien connu. En plus de cela, le comportement de la souris est bien étudié ce qui nous permet de lui administrer les soins nécessaires pour limiter et réduire sa douleur.

21 porcelets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont inoculés par voie veineuse avec la bactérie Streptococcus suis, puis soumis à des écouvillonnages des amygdales et des prises de sang hebdomadaires, avant mise à mort pour prélèvements. Le porteur indique que l'infection peut provoquer de la fièvre, des troubles articulaires et des symptômes méningés, et prévoit d'ajuster la dose à la dose minimale infectante. Il étudie la transmission de cette bactérie entre porcelets et présente le porc comme la "seule espèce adaptée", en tant que cible naturelle de l'agent.

Objectifs

Ce projet est dans le prolongement d’une précédente saisine dont l’objectif était d’évaluer l’efficacité d’un autovaccin (visant une streptococcie à sérotype 9) administré à des truies en gestation sur leurs descendances. Si nos investigations ont permis de mettre en évidence une transmission horizontale directe de Streptococcuis suis sérotype 9 entre les porcelets issus de truies inoculées avec la bactérie et/ou vaccinées avec un autovaccin, la transmission de la bactérie entre des porcelets Exempts d’organismes pathogènes spécifiés (EOPS) issus de truies elles mêmes EOPS n’a à ce jour jamais été étudiée. Ces connaissances sont nécessaires afin de valoriser le travail réalisé depuis plus de 3 ans par notre laboratoire sur cette bactérie responsable de troubles méningés caractéristiques chez le porc. L’objet de cette présente saisine est donc d’évaluer la transmission horizontale directe de Streptococcus suis sérotype 9 chez des porcelets EOPS issus de truies EOPS. Une seule procédure expérimentale sera conduite. L’expérimentation sera menée sur 21 porcelets au total répartis dans 4 groupes : un groupe de porcelets inoculés par voie veineuse avec une souche de sérotype 9 (Groupe « Inoculé »), un groupe de porcelets placés au contact direct des porcelets du groupe « Inoculés » (Groupe « Contact »), un groupe de porcelets inoculés hébergés dans une animalerie indépendante (Groupe « Contrôle ») et un groupe de porcelets témoins hébergés dans une animalerie indépendante (Groupe « Témoin »).

Bénéfices attendus

Streptococcus suis est une bactérie dite zoonotique, ou transmissible à l’Homme, répandue dans les élevages porcins. Elle est responsable de graves affections (méningite, septicémie et polysérites) pouvant entraîner des pertes économiques importantes (réduction des performances zootechniques des animaux affectés, détérioration de la qualité des carcasses, élévation du taux de pertes et de saisies à l’abattoir, etc.). Cette bactérie est généralement enveloppée d'une capsule recouverte d'antigènes. En fonction de la nature de ces antigènes, 29 sérotypes ont été décrits au sein de l'espèce Streptococcus suis. Le sérotype le plus souvent impliqué dans les infections à Streptococcus suis (ou Streptococcie) en France est le sérotype 2. Cependant, une émergence du sérotype 9 a été observée ces dernières années sans que l’on puisse réellement l’expliquer. Le contrôle de l’infection des animaux par cette bactérie est généralement difficile et les mesures de prévention aléatoires. En élevage, l’antibiothérapie constitue un des élements de l’arsenal thérapeutique. Cependant, son utilisation doit être limitée en raison de résistances développées par les bactéries vis-à-vis de certains antibiotiques. Une des méthodes alternatives pour lutter contre Streptococcus suis repose sur la vaccination et plus précisément, dans la mesure où aucun vaccin commercial n’est disponible, sur l’utilisation d’autovaccins. Ces derniers sont préparés à partir de germes pathogènes isolés d’un sujet malade d’un élevage et sont administrés aux animaux de ce même élevage. Les autovaccins sont utilisés pour prévenir les infections à Streptococcus suis chez les truies ou les porcelets sans que leurs efficacités ne soient clairement démontrées. Quelles que soient les stratégies utilisées, médicamenteuse ou vaccinale, les porcs ayant survécu à l’infection et séjournant dans l’élevage, continuent à héberger la bactérie au niveau des voies respiratoires supérieures et des amygdales (portage amygdalien). Ces porcs cliniquement sains et porteurs de Streptococcus suis représentent un danger pour leurs congénères mais également le personnel en contact avec les animaux (éleveurs, vétérinaires, personnel d’abattoir). Acquérir des connaissances sur la transmission de cette bactérie pathogène apportera des éléments pour comprendre la dynamique de contamination au sein de groupes d’animaux et ainsi aider à mieux gérer cette zoonose dans les élevages.

Procédures

Tous les animaux (n=21) seront inoculés par voie veineuse avec soit du diluant stérile soit l'inoculum bactérien : une seule fois au cours de la procédure, et en moins de 10 secondes. Pour ce qui concerne les prélèvements sur animal vigile, des écouvillonnages amygdaliens seront réalisés sur chacun des porcs une fois avant le jour de l’inoculation, puis 1 fois par semaine pendant 3 semaines (soit 4 interventions). A chaque jour de prélèvement, un écouvillonnage amygdalien sera effectué sur les porcs inoculés par Streptococcus suis et les porcs contacts et témoins (n=21 animaux). Des ponctions sanguines seront réalisées une fois par semaine à compter du sevrage jusqu’à la fin de l’expérimentation pour suivre la séroconversion et deux fois au cours de la première semaine suivant l’inoculation (suivi de la bactériémie), soit 7 interventions au total. Afin de limiter la contention des animaux, les écouvillonnages amygdaliens seront réalisés en même temps que les ponctions sanguines. La réalisation d’un écouvillonnage amygdalien et d’une prise de sang est effetuée en moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

L’infection expérimentale avec Streptococcus suis est généralement symptomatique chez les porcelets de 6 semaines. Ils peuvent présenter de l'hyperthermie, des troubles articulaires et des symptômes méningés. Cependant la sévérité clinique peut être limitée lorsque la dose d’inoculation est ajustée à la dose minimale infectante. C’est la dose que nous utiliserons dans cette procédure expérimentale. Toutefois, un soin particulier sera apporté au suivi clinique quotidien de chaque porc. Ils seront examinés a minima au cours de deux visites quotidiennes pendant les 10 premiers jours suivant l’inoculation. Des visites supplémentaires seront instaurées autant que de besoin. Au-delà de ces 10 jours, si l’état de santé des animaux le permet, ils seront examinés une fois par jour. Dans les cas où l’infection conduirait à une altération importante de l’état de santé, à une atteinte des points limites préalablement définis, les porcs seront mis à mort afin qu’ils ne souffrent pas.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par une méthode permettant la récolte de prélèvements de bonne qualité.

Remplacement

L’expérimentation consistant à étudier la transmission horizontale de l’agent infectieux par contact direct, il n’y a aucune possibilité de remplacement du modèle animal par une étude in vitro ou in silico.

Réduction

L’expérimentation conduite sera faite dans le respect de l’éthique et du bien-être des animaux. Ce protocole expérimental est pensé de façon à minimiser le nombre de porcs utilisés tout en menant une étude suffisamment puissante pour avoir des résultats statistiquement significatifs. Nos études antérieures montrent qu’il est indispensable d’avoir au minimum trois porcelets inoculés et des groupes de 6 porcelets pour considérer la variabilité inter-individuelle des animaux pour avoir une pression d’infection suffisante pour reproduire une colonisation des amygdales et/ou la maladie. Dans la mesure où nous avons déjà mis en évidence une exacerbation de l’infection lorsque des animaux inoculés sont en contact direct avec d’autres qui ne le sont pas, un groupe « Contrôle » constitué uniquement d’animaux inoculés est inclus dans cette procédure expériementale. Ce projet impliquera au total 21 porcs EOPS.

Raffinement

Les porcs seront élevés en groupe stable, bénéficieront d’un enrichissement social et auront à leur disposition des objets manipulables (jouets type boule fixée à l’extrémité d’une chainette, tourniquet et mordilles). Ils seront nourris et abreuvés à volonté. Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique rapproché. Ils seront examinés a minima au cours de deux visites quotidiennes pendant les 10 premiers jours suivant l’inoculation. Des visites supplémentaires seront instaurées autant que de besoin en fonction de l'évolution de l'état de santé des animaux. Au-delà de ces 10 jours, si l’état de santé des animaux le permet, ils seront examinés une fois par jour. En cas d’atteinte de points limites préalablement définis, les porcs seront mis à mort afin qu’ils ne souffrent pas. Un système de récompense sera proposé aux porcs une fois l’ensemble des prélèvements réalisés afin d’associer un moment positif aux manipulations opérées pour les besoins du projet (distribution de sirop de grenadine grâce à une seringue drogueuse).

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible de Streptococcus suis. Il est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de la procédure expérimentale. Les animaux impliqués dans la procédure auront en moyenne 4 semaines de vie au début de l’étude et entre 6 et 7 semaines de vie au moment de l’inoculation. Le modèle expérimental a été précédemment validé à cet âge ce qui permet de s’affranchir d’une étape de validation.

3 840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une molécule induisant une fibrose pulmonaire est injectée dans la trachée après incision et suture, puis un traitement ciblant un récepteur immunitaire, avant mise à mort et prélèvement des poumons. Le porteur indique que la fibrose peut provoquer des difficultés respiratoires, une perte de poids et une mortalité inférieure à 20 %. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour modéliser un organe entier et qualifie la souris d'animal "incontournable" pour les enjeux de santé humaine.

Objectifs

Le système immunitaire regroupe des récepteurs permettant de réguler la réponse immunitaire. L’une des thérapies anti- cancéreuses révolutionnaires consiste à bloquer un sous type des récepteurs immunitaires. La Fibrose Pulmonaire Idiopathique (FPI) est une maladie respiratoire chronique associée à une mortalité élevée. Toutefois, l’étude des récepteurs immunitaires dans la FPI représente un domaine sous-étudié. Nos précédents travaux de recherche ont montré l’implication d’un récepteur X dans le contrôle des maladies respiratoires, telles que l’asthme allergique. Nos nouveaux résultats préliminaires suggèrent aussi une implication remarquable du récepteur X dans la FPI. L’hypothèse qui sous-tend ce projet de recherche est que le ciblage du récepteur X dans la FPI permettrait de reprogrammer les cellules immunitaires vers une fonction anti-fibrosante. Les objectifs du projet sont 1) d’évaluer l’expression de X sur les différentes cellules immunitaires dans deux modèles expérimentaux de fibrose pulmonaire, 2) d’étudier l’effet de l’absence du récepteur X sur le développement de la fibrose pulmonaire dans une souris transgénique et 3) d’étudier l’efficacité d’un traitement ciblant X dans un modèle de souris humanisée. Ces différentes approches fondamentales et précliniques permettraient de valider X comme une nouvelle cible thérapeutique dans la FPI.

Bénéfices attendus

La FPI est une maladie respiratoire chronique et fatale. Dans cette étude, nous investiguerons le rôle modulateur d’un récepteur immunitaire dans des modèles murins de fibrose pulmonaire afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques. Atteindre cet objectif de recherche exige l’étude des mécanismes immunitaires pertinents dans un organisme animal vivant respectant la complexité du système immunitaire qui implique plusieurs organes, types cellulaires et médiateurs. L’étude de ces interactions complexes d’une façon fiable et appropriée dans nos modèles murins de fibrose pulmonaire assurerait une meilleure connaissance de l’immunologie pulmonaire chez les patients FPI. Les résultats des différentes parties du projet seront profitables, notamment via l’amélioration du diagnostic clinique de la FPI et via le développement de nouvelles thérapies efficaces et ciblées.

Procédures

Nous utilisons dans ce projet des souris contrôles, des souris transgéniques n'ayant pas le récepteur X et des souris humanisées ayant un système immunitaire humain fonctionnel. En début de procédure, les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture (la totalité de la procédure de l’incision de la peau à la suture durera de 5 à 7 minutes) : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répétée. Une semaine plus tard, les souris recevront deux doses d’une protéine thérapeutique permettant de moduler le récepteur X. L’injection se fera via 2 voies non invasives, la voie intranasale (durée 25 secondes) et la voie intrapéritonéale (durée 10 secondes). Pour la voie intranasale, les souris seront sous anesthésie générale afin d’éviter le réflexe de déglutition et ainsi le passage des molécules injectées dans l’œsophage au lieu de la trachée. Avant l’injection thérapeutique un prélèvement sanguin à partir de la veine faciale (sous-maxillaire) est prévu (durée 25 secondes). A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées à des temps différents après anesthésie profonde, après quoi un prélèvement de sang sera réalisé ainsi que le recueil des poumons sur l'animal euthanasié.

Impact sur les animaux

L'induction de la fibrose pulmonaire chez les souris peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids. Une fréquence respiratoire anormalement élevée ainsi qu’une gêne respiratoire sont des conséquences possibles de la fibrose. Dans les modèles de fibrose adoptés, il existe un risque de mortalité liée au développement de la fibrose, à partir du 7eme jour, et jusqu'au 14eme jour après injection. La mortalité ne survient en règle générale pas au décours immédiat de l'injection ni entre J0 et J7 après celle-ci, ce qui suggère qu'elle est la conséquence du développement de la fibrose et non du geste en lui-même. Cette mortalité est en général < 20% des effectifs.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. L'euthanasie de l'animal est nécessaire pour le prélèvement des poumons. Ces prélèvements sont nécessaires pour l’analyse des tissus afin d'étudier et de mieux comprendre les mécanismes immunitaires impliqués dans la fibrose pulmonaire.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire. Ces affirmations se basent sur des discussions avec des confrères; des conférences en pneumologie/immunologie, et une recherche bibliographique approfondie. Il faut noter que des méthodes alternatives basées sur l'utilisation des cellules humaines sont déjà utilisées dans notre projet mais ne nous permettent pas encore de répondre à l’ensemble de nos questions. En particulier, ces modèles n’intègrent pas les cellules immunitaires et ne peuvent pas reproduire le dynamisme de leur recrutement aux poumons.

Réduction

Des stratégies d’optimisation de l’utilisation de chaque animal seront appliquées afin de respecter le principe de réduction. Nous allons par exemple collecter le maximum d’organes de toutes les souris expérimentales et partager des tissus/organes au sein de notre unité de recherche. Dans ce même contexte, nous adoptons une approche bio-informatique qui permet de prédire une réaction biologique, et ainsi réduire le nombre de souris nécessaires pour la réalisation de ce projet. En outre, des mesures strictes seront prises pour éviter les biais expérimentaux comme la randomisation et le travail en aveugle.

Raffinement

Nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. Les gestes invasifs (injections intratrachéales et intranasales) sont réalisés sous anesthésie. Les animaux seront anesthésiés lors des procédures. Des antalgiques seront donnés en post opératoire. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton dans les cages, et d'une nourriture gélifiée facile à ingérer. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture et de la boisson. En plus de la surveillance visuelle effectuée quotidiennement par les animaliers, les animaux bénéficieront d'une surveillance clinique après le réveil et jusqu’à la fin du protocole. Cette surveillance clinique sera effectuée au moins 3 fois par semaine par l'expérimentateur. Elle se base sur une grille de points limites évaluant l’apparence de l’animal (yeux, poils, oreilles, posture...), son comportement (motricité, apathie, posture, rythme respiratoire...), la diminution du poids et la fermeture de la suture. La fréquence de surveillance clinique des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. En cas d'atteinte des points limites, une euthanasie sera effectuée par surdosage en anesthésique en injection péritonéale.

Choix des espèces

D’une part, les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature et reproduisent des aspects cliniques clés de la fibrose humaine. D’autre part, l’étude du système immunitaire murin a conduit vers de nombreuses découvertes dans le domaine d’immunothérapie et a permis de tester la sécurité et l’efficacité des thérapies ciblant les récepteurs immunitaires avant les essais cliniques humains. Les souris offrent aussi la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et de cibler le rôle d’une molécule en particulier dans le poumon. En outre, les souris reconstituées avec des cellules immunitaires humaines permettent la mise en place de modèles bien profitables dans le domaine thérapeutique. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire, ainsi la souris est un animal incontournable pour répondre à des enjeux de santé humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 8 et 16 semaines. La fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte.

12 femelles macaques à longue queue vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisées pour d'autres projets. Chaque animal subit jusqu'à quinze injections, treize prises de sang sous anesthésie, six échographies ovariennes et deux laparotomies sous anesthésie générale. Le porteur teste une molécule recombinante destinée à réduire le nombre d'injections hormonales chez la femme, un bénéfice qu'il situe à long terme. Il justifie l'usage du macaque par la proximité de son cycle sexuel avec celui de la femme et n'envisage pas de sédation pour les injections, jugées sans bénéfice.

Objectifs

Nous avons démontré l’efficacité de ces molécules recombinantes in vitro sur des lignées cellulaires, et in vivo sur différents modèles animaux, y compris le singe cynomolgus. In vitro comme in vivo, ces molécules amplifient l’activité de l’hormone, c'est-à-dire qu’une dose d’hormone qui seule n’a pas d’effet, induit, lorsqu’elle est complexée à cette molécule, une stimulation maximale. Le but de cette étude est de démontrer l’effet de notre molécule seule dans un traitement agoniste.

Bénéfices attendus

Le but de notre expérience, à long terme, est de développer un nouveau traitement d'induction de l'ovulation chez la femme, diminuant considérablement le nombre d’injections hormonales nécessaires, tout en améliorant leur bien-être et leur confort au cours du traitement.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections (sur animaux vigiles, 15 injections maximum par animal sur 15 jours et chaque injection durera 2 minutes maximum (en incluant l'isolement de l'animal, l'injection, et le retour dans le groupe)), des prises de sang (sur animaux anesthésiés, 13 prises de sang par traitement et par animal, à raison de 1,5 ml de sang prélevé par prise de sang, chaque prise de sang dure maximum 15 minutes (anesthésie de l'animal, sorti de la cage, prise de sang, réveil et retour dans la cage)). Les animaux seront également soumis à des échographies ovariennes par voie trans abdominale, sous anesthésie générale. Il y aura 6 échographies par traitement et par animal, et chaque échographie dure environ 30 minutes. Enfin, tous les animaux subiront 2 laparotomies à au moins 2 mois d'intervalle. La laparotomie est réalisée sous anesthésie générale et dure environ 1 heure.

Impact sur les animaux

Lors de nos expériences précédentes comportant les mêmes procédures sur le singe cynomolgus, nous n'avons constaté aucun effet secondaire de notre molécule. Les nuisances attendues sont liées : - aux injections : les injections seront faites soit en intra-musculaire, soit en sous-cutané, sur animal vigile. Une sédation n'est pas envisageable car elle ne présenterait aucun bénéfice (introduction d'une aiguille, au même titre que l'injection elle-même) ; - à la laparotomie : la douleur pendant la laparotomie sera traitée par une anesthésie adaptée décrite dans la procédure, et la douleur post-opératoire sera traitée par injection d'anti-douleurs pendant 7 jours ; - aux prises de sang : afin de réduire le stress, un renforcement positif par clicker training sera mis en place. Dans ce cas, les prises de sang pourront être réalisées sur animal vigile. Pour les animaux réfractaires, une légère sédation sera appliquée. La formation d'un hématome est également possible.

Devenir

Cette saisine comporte une seule procédure. A l'issu de celle-ci, les animaux pourront être ré-utilisés pour d'autres projets.

Remplacement

Des effets sur la fonction de reproduction ne peuvent pas être observés uniquement in vitro sur cellules ou exvivo. En effet, la régulation de la reproduction est issue d’une communication étroite entre l’hypothalamus, l’hypophyse et les ovaires, et requière un organisme vivant entier. D’un point de vue physiologique, le cycle sexuel du singe cynomolgus est très proche de celui de la femme et présente les mêmes particularités. Il est de 30 ± 4 jours, avec une phase lutéale et une phase folliculaire similaire à celles de la femme. De plus, comme chez la femme, le singe cynomolgus ne présente pas de période d’anoestrus ce qui n’est pas le cas du macaque rhésus.

Réduction

Le nombre d'animaux est faible, mais sera suffisant pour observer les effets souhaités. Tout comme chez la femme, la variabilité inter-individu de la réponse à une stimulation ovarienne est très élevée chez le macaque. Chercher à tout prix des différences statistiques nécessiterait un très grand nombre d’individus. Par exemple, les essais cliniques chez la femme comparant l’efficacité d’une hormone folliculostimulante (FSH) déjà commercialisée à celle en cours de développement comprennent des centaines de patientes, pour pouvoir conclure à une non-infériorité du nouveau produit. C’est pourquoi, nous ne chercherons pas des différences statistiquement significatives, mais des tendances. Nous espérons pouvoir gommer ces variabilités inter-individus et tirer des conclusions grâce au design des expériences en carré latin : chaque animal sera son propre contrôle. Dans l’ensemble, les animaux devront avoir une meilleure réponse lorsqu’ils seront traités avec notre molécule, comparé au traitement FSH classique.

Raffinement

Nous avons raffiné nos procédures (prise de sang sous anesthésie, procédure d’imagerie non invasive). Le système d’élevage ne sera pas modifié et il y aura un enrichissement social (hébergement en groupe, surface suffisante par animal, présence de jouets). Nous avons raffiné nos procédures (prise de sang et laparotomie sous anesthésie, procédure d’imagerie non invasive). Le système d’élevage ne sera pas modifié et il y aura un enrichissement social (hébergement en groupe, surface suffisante par animal, présence de jouets). Au long cours, seront surveillés l’apparence physique, la réponse à différents stimuli (interaction avec les animaliers lors des soins journaliers, avec les éléments d’enrichissement,…), le comportement avec les congénères pour l’ensemble des macaques. L’animal qui n’interagit pas sera isolé et emmené à l’infirmerie pour consultation du vétérinaire référant et analyses. A chaque anesthésie seront mesurés le poids, le pouls, la saturation, et un examen clinique complet. Une diminution de 5% du poids ou des modifications du comportement (prostration dans un coin, relation avec les congénères, accès à la nourriture…) constitueront le point limite et nécessiteront l’arrêt de l’étude pour l’animal concerné. Les animaux sont observés quotidiennement au moins 3 fois par jour (distribution de fruits). Ils reçoivent un fruit ou une confiserie en récompense lors de leur retour en cage après la procédure. Un renforcement positif au clicker est mis en place pour les prises de sang ; Une sédation légère est appliquée aux animaux réfractaires.

Choix des espèces

Le traitement d’induction de l’ovulation étant destiné à être utilisé chez la femme, nous avons besoin de le tester et de faire la preuve de concept in vivo chez l’espèce la plus proche de la femme d’un point de vue physiologique. Le singe cynomolgus est l’espèce réglementaire reconnue et utilisée pour l’étude de la fonction de reproduction chez la femme. D’un point de vue physiologique, le cycle sexuel du singe cynomolgus est très proche de celui de la femme et présente les mêmes particularités. Il est de 30 ± 4 jours, avec une phase lutéale et une phase folliculaire similaire à celles de la femme. De plus, comme chez la femme, le singe cynomolgus ne présente pas de période d’anoestrus ce qui n’est pas le cas du macaque rhésus. Le but étant d’induire une stimulation ovarienne, les animaux doivent être des femelles pubères de 36 mois minimum.

100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent six injections intramusculaires et jusqu'à sept prélèvements de sang, avant mise à mort pour prélever les muscles injectés. Le porteur affirme n'attendre aucun signe clinique et présente ce contrôle d'immunogénicité comme "nécessaire" à son dossier réglementaire avant des essais cliniques sur un candidat myorelaxant. Sur le remplacement, il indique que la pertinence des modèles cellulaires reste débattue et que le système immunitaire ne peut être reproduit in vitro.

Objectifs

Après avoir démontré le bénéfice d’efficacité de notre produit (FTP-501) face aux produits de référence utilisés en clinique lors de projets précédents, ce projet expérimental s’intéresse au potentiel immunogène (développement de réaction pro-inflammatoire) de ces candidats. Cette étude a pour objectif de confirmer la non-présence d’Anticorps Anti-Drug (ADA) (anticorps dirigé contre notre propre molécule) suite aux injections de notre composé. Cette molécule pourrait a priori provoquer une réaction immunitaire suite aux injections, diminuant ainsi l’efficacité du traitement et sa tolérance. Il est donc important de vérifier qu’une telle réaction est limitée ou inexistante. De plus ce test est nécessaire pour l’évaluation de notre dossier règlementaire en vu des essais cliniques.

Bénéfices attendus

Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entrainer des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet global est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé nos 2 premiers Lead (FTP-501 et FTP-101) quasiment au terme de leur développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes : certains induisent une myorelaxation très rapide (FTP-101), et d’autres offrent un effet durable par exemple (FTP-501). Or, selon la maladie neuromusculaire, le besoin clinique est différent, et donc chaque caractéristique est plus ou moins critique. Ainsi, ce projet permettra de vérifier qu’aucune réaction immunitaire ne se manifeste suite aux injections du composé FTP-501 et que par conséquent notre produits est très bien toléré après des injections répétées.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - Injection intramusculaire = 6 injections, durée 30 secondes/injection/animal = 3 min - Pesée des animaux = 10 pesées / animal => 30 secondes / pesée = 5 min / animal - Prélèvements de sang = 7 maximum par animal, durée 2 minutes = 14 minutes / animal.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, aucun signe clinique ni effets secondaires n’est attendu ici suite à l’injection des composés, d’après nos résultats obtenus dans nos études précédentes et la littérature. En effet lors de nos précédents projets, aucun signe clinique de type infection ou inflammation suite à une seule injection n’a été observé. Nous n’attendons pas ici de réactions suite aux multiples injections. Dans le cadre de nos procédures, les nuisances attendus sont : le stress des animaux dû à la contention pour l’injection, une douleur liée aux injections i.m. et les multiples prélèvements de sang (7 maximum).

Devenir

Tous les animaux de cette procédure sont concernés En effet, les muscles injectés seront prélevés pour analyse histologie.

Remplacement

Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). De plus, nous recherchons ici des réactions immunitaires suite aux injections de nos composés. Le système immunitaire d’un hôte est extrêmement complexe (impossible à reproduire dans sa globalité in vitro) et nécessite des expérimentations in vivo.

Réduction

Pour la réduction, la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs (test de Kruskal Wallis) a été déterminé avec le logiciel G-Power. Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 20 animaux par groupe.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans des cages en plastique transparent de 1800cm2 au sol et comportant une plateforme. Les cages seront ventilées individuellement, placés dans une pièce sous air conditionné, avec un cycle jour/nuit de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Ils seront maintenus en groupe de 2 ou 3 rats par cage. Ils disposeront de matériel de nidification (litière en chips de cellulose) puis d’enrichissement : les rats ont un tunnel rouge ainsi qu’un bâton de bois à ronger. Les animaux seront surveillés quotidiennement permettant un suivi clinique de chaque animal. Ainsi, des points limites sont mis en place durant tout ce projet permettant de définir des critères d’arrêt si nécessaire. Les prélèvements sanguins seront réalisés par un expérimentateur entraîné, et via une approche limitant le stress et la douleur, tout en ne dépassant pas les limites de volume prélevables chez un rat.

Choix des espèces

La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes interne. Nous recherchons ici des réactions immunitaires suite aux injections de nos composés. Le système immunitaire d’un hôte est extrêmement complexe et nécessite des expérimentations in vivo. De plus, nous avons choisi le rat d’une part, par continuité avec nos études précédentes et notre expérience sur ce modèle et d’autre part, car il s’agit d’un modèle de choix pour des études de toxicité de composé. Nous utiliserons des rats Sprague Dawley âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g) et 30 semaines maximum en fin d’expérimentation. Des jeunes adultes sont choisis ici pour le bon fonctionnement de leur système immunitaire

2 530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une septicémie provoquée par ligature et perforation du caecum, un modèle que le porteur reconnaît induire une mortalité élevée, avant injection de cellules stromales dans la cavité péritonéale. Les souris sont réparties par âge, jusqu'à deux ans, pour évaluer l'effet du traitement au cours du vieillissement. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de confirmer in vivo des effets déjà montrés in vitro et qu'une étude chez la souris est "nécessaire".

Objectifs

L'objectif du projet est de mettre en évidence l'effet de différentes populations de cellules stromales sur la résolution d'une septicémie induit après une péritonite au cours du vieillissement et de comprendre les mécanismes d'action des différentes populations cellulaires.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mettre en évidence l’effet des cellules stromales mésenchymateuses "naives" ou primées sur l’inflammation et la résolution d'une septicémie induite après une péritonite et d’étudier l’intérêt de ce traitement au cours du vieillissement. En effet, nous espérons que les cellules stromales mesenchymateuses diminueront l’inflammation induite par la péritonite augmentant ainsi la survie des animaux. De plus, notre étude nous permettra de mieux comprendre le mode d'action des différentes populations de cellules stromales mesenchymateuses et de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de péritonite.

Procédures

La péritonite est induite chez certains animaux par ligature et ponction du caecum. Les souris sont endormies par inhalation d’un gaz et maintenues endormies sous masque sur une table chauffante pendant l’intervention et jusqu’à leur réveil. La profondeur de l’anesthésie est évaluée par l’absence de réponse à la stimulation des extrémités. Une incision cutanée au niveau de l’abdomen est réalisée puis l’ouverture de la cavité péritonéale est réalisée au ciseau. Le caecum est ligaturé et perforé à l’aide d’une aiguille. Après injection de différentes populations de cellules stromales mésenchymateuses dans la cavité péritonéale encore ouverte, la fermeture du péritoine en deux plans est réalisée. Réalisée par une personne entrainée, la chirurgie dure entre 7 et 10 min. Avant l'intervention, un analgésique est injecté sur animaux endormis Pour les animaux chez qui la péritonite sera induite par injection de composés protéiques, les animaux auront 2 injections intrapéritonéales l’une contenant le composés protéiques l’autres les cellules thérapeutiques. Avant l'intervention, une injection sous cutané d’analgésique est réalisée sur animaux vigiles. L'injection d'analgésique sera répétée toutes les 12 heures pendant 3 jours

Impact sur les animaux

Le modèle de péritonite induit par ligature et ponction ceacale est un modèle qui induit une mortalité assez élevée chez les animaux opérés. La douleur induite par la chirurgie et par l'induction de la péritonite est gérée par administration d'analgésiques.

Devenir

Tous les animaux suivant ces différents protocoles seront mis à mort afin de permettre l'analyse de l'effet des différents traitements sur la réponse immunitaire, l'inflammation générale et les lésions des différents organes de la cavité péritonéale.

Remplacement

L'effet immunomodulateur des différentes populations de cellules stromales mesenchymateuses a été démontré in vitro mais il est indispensable de confirmer ces résultats in vivo, en ayant une vraie situation d’inflammation mettant en jeu l’ensemble des partenaires cellulaires qui interviennent lors de l’inflammation. Une étude chez la souris s’avère donc nécessaire.

Réduction

Notre expérience nous permet de déterminer que le nombre de 5 souris par groupe et la réalisation en triplicat de l'expérience nous permettra d'évaluer l'effet de nos différentes populations cellulaires et de diminuer ainsi le nombre d'animaux utilisés. Nous inclurons suffisamment de souris par groupe et effectuerons trois expériences indépendantes pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. L’expérience de notre laboratoire nous permet de déterminer le nombre optimal de souris à utiliser par lot.

Raffinement

Les animaux sont anesthésiés sous gaz et maintenues endormies sous masque sur une table chauffante pendant l’intervention et jusqu’à leur réveil. Un antalgique est placé dans l'eau de boisson des animaux 24h avant l'intervention puis de manière continue après la chirurgie. Vu la stabilité de la molécule, le biberon sera changé tous les jours. De plus, une injection d’un analgésique sera effectuée au moment de la chirurgie sur animaux endormis afin de diminuer la douleur. Cette injection sera répétée toutes les 12 heures pendant 3 jours. Les animaux seront élevés à 5 animaux par cage) afin de limiter le stress lié à la chirurgie et à l'isolement. Du papier type kleenex ainsi que des cabanes type "igloo" seront ajoutés dans la cage afin de respectivement permettre la formation du nid et d’enrichir l’environnement de vie des animaux. Des croquettes imbibées d'eau contenant un analgésique seront placées directement dans la cage afin de limiter au maximum l'extension des animaux opérés. De plus, une grille de score et l’utilisation de point limite adaptés permettront de définir les critères d’arrêt de souffrance et d'entraîner la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle complexe qui nous permettra d'évaluer l'effet de nos cellules d'intérêt sur la réponse inflammatoire locale mais également en systèmique. De plus, le modèle de sepsis chez la souris est très bien décrit nous donnant des informations essentielles au bon déroulement de notre procédure. Enfin, les outils techniques et biochimiques nécessaires à l'analyse des données obtenues sont développées chez cette espèce. Les personnes âgées présentent un risque accru de mortalité lors d’une évolution négative d’une péritonite. L'utilisation d'animaux à différents âges (8 semaines, 1 an, 2 ans) nous permettra d'évaluer l'intérêt d'utiliser les différentes populations de cellules stromales mesenchymateuses comme traitement d'un sepsis induit après péritonite au cours du vieillissement.