Recherche appliquée

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues prédiabétiques par une alimentation grasse et sucrée, elles sont gavées chaque jour pendant cinq semaines, puis soumises à des tests de tolérance au glucose et aux lipides avec incision de la queue, pour comparer des bactéries probiotiques. Le porteur mentionne comme effets un gonflement de l'œsophage, une prostration possible et une infection au point d'incision, les souris étant anesthésiées puis mises à mort pour prélever leurs organes. Il justifie l'usage de la souris par l'impossibilité éthique de prélever ces organes chez l'humain.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie reconnue comme une priorité urgente et un enjeu majeur de santé publique. La mortalité et la morbidité associées à cette maladie entraînent des coûts exorbitants de santé dans le monde. A ce jour, malgré un arsenal thérapeutique important, le traitement est loin d'être optimal. Il apparaît urgent d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour optimiser le traitement des patients. Une nouvelle voie s’est ouverte depuis que des études ont montré que l’un des effets bénéfiques d’un médicament anti-diabétique très largement prescrit résulte de sa capacité à modifier les populations de bactéries présentes dans l’intestin. Actuellement, des souches de bactéries probiotiques sont développées pour améliorer l’état du métabolisme des patients diabétiques de type 2. Les probiotiques sont définis comme des microorganismes vivants qui, lorsqu’ils sont administrés en quantité suffisante, confèrent un bienfait pour la santé de l’hôte. Récemment, dans modèle de souris, une nouvelle souche de bactérie probiotique ciblant le diabète de type 2 a été identifiée. Ce projet vise à identifier le mécanisme d’action de cette nouvelle souche en la comparant avec des bactéries probiotiques déjà connues et qui ont des effets bénéfiques sur le diabète.

Bénéfices attendus

A court teme, ce projet permettra de comparer les effets d’une nouvelle bactérie probiotique avec des bactéries probiotiques déjà connues sur le métabolisme du glucose et des lipides afin identifier son mécanisme d’action. A plus long terme, les résultats de ce projet ouvriront la possibilité de valider l’effet anti-diabétique de la nouvelle bactérie vivante ou de préférence de la bactérie sous une forme inactivée pasteurisée (risque sanitaire réduit) chez des personnes diabétiques au cours d’un essai clinique. Ainsi, ce projet doit permettre de développer un nouveau traitement pour les patients avec un diabète de type 2, ce qui est particulièrement précieux face à des traitements médicaux existants qui ne sont pas optimaux.

Procédures

Toutes les souris éveillées seront gavées pendant 5 semaines (tous les jours, une fois par jour, 15 secondes au maximum par souris). A l’issue des 3 premières semaines de traitement à l’âge de 13 semaines, toutes les souris éveillées seront soumises à un test sanguin permettant de mesurer l’effet du traitement sur la capacité de leur organisme à utiliser le glucose injecté dans la cavité abdominale (une fois, 15 secondes). L’évolution du taux de sucre dans le sang après l’injection du glucose sera mesuré 5 fois dans une goutte de sang issue d’une légère inscision à la queue de l’animal (une seule incision, 5 secondes par prélèvement). A l’âge de 14 semaines, toutes les souris éveillées seront soumises à un test de charge en lipides donnés par gavage pour tester leur capacité à absorber les lipides (une fois, 15 seconde). L’évolution des taux de lipides dans le sang sera suivie 4 fois par un prélèvement d’une goutte de sang à la queue des souris (5 secondes par prélèvement). A l’âge de 15 semaines, toutes les souris seront anesthésiées par injection (une fois 15 secondes) pour effectuer un dernier prélèvement sanguin (20 secondes). Les souris anesthésiées seront mises à mort immédiatement après le prélèvement sanguin (2 secondes).

Impact sur les animaux

On pourrait observer après gavage du sang sur la canule, un gonflement de l’œsophage et/ou une prostration de la souris. Dans les jours qui suivent l’incision superficielle de la veine de la queue (une seule fois par test), une infection au point d’incision peut être observé. Il est important de noter qu’au cours des protocoles similaires précédemment réalisés, aucun comportement anormal qui dénote une souffrance ou une anxiété particulière chez les animaux n’a été observé.

Devenir

A l’issue du protocole, à l’âge de 15 semaines, tous les animaux seront anesthésiés avant une dernière prise de sang, puis les souris seront rapidement mises à mort pour récupérer les organes nécessaires aux analyses biologiques pour permettre l’identification du mécanisme d’action de la bactérie probiotique.

Remplacement

Comme l’effet attendu d’un anti-diabétique se fait par des modifications physiologiques coordonnées entre plusieurs organes (foie, intestin et tissus adipeux, entre autres) et qu’il n’est pas possible éthiquement de réaliser ces prélèvements dans chacun de ces organes chez l’Homme, ils seront réalisés chez la souris, un animal qui fonctionne physiologiquement de manière similaire à l’Homme pour les paramètres physiologiques analysés.

Réduction

Le nombre de 16 animaux par groupe a été déterminé par un calcul de puissance statistique et par l’expérience acquise dans des protocoles précédemment réalisés. Avec cet effectif de 16 souris par groupe, les données recueillies pourront être comparées entre le groupe contrôle et les groupes traîtés à l’aide de tests statistiques ce qui permetta de répondre aux questions initialement posées. Plusieurs bactéries seront testées en parallèle afin de ne consituter qu’une seule fois les groupes contrôles et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les souris seront surveillées tous les jours avec une attention particulière en période de gavâge pour vérifier l’apparition de troubles du comportement ou de stress. Il est important de noter qu’au cours des protocoles similaires précédemment réalisés, aucun comportement anormal qui dénote une souffrance ou une anxiété particulière chez les animaux n’a été observé. De plus, la personne qui va manipuler les souris lors du gavage est très expérimentée (si possible toujours la même), et réalisera un geste rapide et précis pour limiter la souffrance et l’angoisse des animaux.

Choix des espèces

Au sein de la communauté scientifique, les travaux effectués dans le domaine des bactéries probiotiques sont majoritairement réalisés chez la souris ce qui permet la comparaison des résultats obtenus par les différentes équipes. Comme la physiologie du métabolisme des sucres et des lipides chez la souris est proche de celle de l’Homme, les expériences seront réalisées chez cette espèce animale. La souris C57BL/6J est reconnue comme une souche de référence pour les études du métabolisme et tolère très bien la nourriture riche en gras et en sucres. De plus, les altérations du métabolisme glucidique et lipidique induites chez les souris par une nourriture riche en gras et en sucres sont très bien décrites et maîtrisées. L’intervention nutritionnelle débutera chez les souris âgées de 10 semaines car à cet âge, les souris sont adultes et présentent un microbiote intestinal mature. De plus, à l’âge de 10 semaines de vie, les souris sont métaboliquement prêtes à consommer une nourriture riche en gras et en sucres et à développer les altérations métaboliques voulues.

930 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une ou deux neurochirurgies pour induire un modèle de maladie de Parkinson, des prélèvements sanguins sous anesthésie et une batterie de tests comportementaux moteurs, cognitifs et sensoriels dont le RNT ne précise pas le détail, pour évaluer un implant censé protéger les neurones. Le porteur indique que le modèle induit des symptômes moteurs qui restent légers et que les rats sont mis à mort pour analyse du cerveau. Il affirme qu'"il n'existe pas de méthodes alternatives" et renvoie les bénéfices pour les patients au conditionnel et au long terme.

Objectifs

Ce projet a pour but d'étudier les effets d’un dispositif ayant des propriétés protectrices contre la mort des neurones impliqués dans la maladie de parkinson sur un modèle de rat parkinsonien. Ce projet a pour but d'évaluer l'effet bénéfique de ce dispositif sur la perte de ces neurones ainsi que les performances des rats dans des tâches comportementales motrices, sensorielle, psychiatrique et d'apprentissage caractéristiques de la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Ce projet aura pour bénéfice d’apporter les dernières preuves d’efficacité du dispositif sur les mécanismes connus pour déclencher la maladie de Parkinson. Ces résultats permettront de faciliter le passage aux essais cliniques directement chez le patient. La maladie de Parkinson, ainsi que de nombreuses maladies neurodégénératives, n’a à l’heure actuelle aucune solution thérapeutique autre que le soulagement des symptômes. La finalité de ce projet est que ce dispositif apportera une possibilité de ralentir la progression de la maladie et ainsi, l’évolution des patients vers des stades de plus en plus handicapant pouvant aller jusqu’à la perte d’autonomie, la démence et une forte réduction de la qualité de vie des patients.

Procédures

Les rats subissent des neurochirurgies pour une durée de 30 minutes, anesthésie incluse. Les rats peuvent avoir une ou deux neurochirurgies. Les rats auront 4 prélévements sanguins sous anesthésie générale pour une durée de 10 minutes maximum. Les rats participeront également à des tests comportementaux pour évaluer leurs capacités motrice, psychiatrique, d'apprentissage et sensorielle impactées par le modèle de la maladie de Parkinson. La durée de ces tests est de 1 à 30 minutes et se feront durant deux semaine, avec un test par jour maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux seront : 1) la neurochirurgie pour induire le modèle de rats parkinsoniens qui implique une anesthésie générale, 2) Le modèle utilisé induit l’apparition progressive des symptômes moteurs et non-moteurs qui restent cependant légers sur la plus grande partie de ce projet 3) Nous effectuerons 4 prélèvements sanguins dans la veine de la queue du rat qui peut induire du stress dû à l'anesthésie et une légère hémorragie. 4) Nous effectuerons un large panel de tests comportementaux afin d’évaluer l’effet de notre modèle de rats parkinsoniens et l’effet bénéfique de notre implant qui peuvent induire un stress dû au déplacement dans la salle d'expérimentation et le passage dans un nouvel environnement.

Devenir

Les rats seront mis à mort pour effectuer des analyses des tissus cérébraux.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives, n'impliquant pas d'animaux vivants, qui permettent d'évaluer l'impact du modèle de rats parkinsoniens et du dispositif sur les différents marqueurs cellulaires et moléculaires caractéristiques de la maladie de Parkinson et du modèle de rats parkinsoniens et sur le comportement des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin de ne pas compromettre la validité des expériences. Ce nombre a été estimé à l'aide d'une approche statistique. Les animaux seront testés en deux sessions successives incluant la moitié des rats de chaque groupe. Si les résultats sont suffisant pour mettre en évidence des différences satistiquement significative sur les paramètres décrits précedemment, il ne sera pas nécessaire de faire la deuxième session.

Raffinement

Le projet implique la mise en place d’un état pathologique chez le rongeur ayant pour avantage que les déficits moteurs bilatéraux restent modérés tout au long du protocole. Afin de prévenir toute douleur post-opératoire supplémentaire pouvant affecter la récupération de l’animal, une injection d'un analgésique avant la procédure chirurgicale puis toutes les 24 heures après la chirurgie si nécessaire sera effectuée. Ces chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale en maintenant une température constante, les yeux sont protégés du déssechement et un anesthésique local est injecté sur le crâne de l’animal avant incision. Suite à la chirurgie, les rats sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Afin de réduire le plus possible toute douleur ou détresse que les animaux pourraient ressentir, ils seront observés au moins une fois par jour par le personnel compétent impliqué dans la réalisation des expériences et/ou dans le soin des animaux. Une échelle de cotation de douleur sera utilisée afin d'évaluer l'état général de chaque animal. Les animaux seront également hébergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l'hébergement des animaux de l'Annexe II du premier février 2013 de l'arrêté fixant les conditions d'agrément.

Choix des espèces

Le rat est une espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau d'un réseau de neurones important pour notre étude car il est connu pour dysfonctionner dans la maladie de Parkinson, ce qui peut être reproduit chez le rat. Les modèles de rats Parkinsoniens seront réalisés sur des rats jeunes adultes (à partir de 10 semaines, environ 300g en début d’expérience) afin de travailler sur des systèmes cérébraux matures et stables qui resteront stables tout au long du projet.

12 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Six sont inoculés par voie oronasale avec des eaux recyclées d'abattoir, six servent de témoins, tous étant soumis à des prélèvements sanguins, nasaux et rectaux pendant six semaines, pour vérifier si deux virus porcins détectés dans ces eaux restent infectieux. Le porteur indique que les infections sont asymptomatiques chez ces porcs et que tous sont mis à mort en fin d'étude pour prélever des organes. Il affirme que le recours au porc est "indispensable", les modèles in vitro ayant selon lui une sensibilité "bien moindre".

Objectifs

Les abattoirs de porcs sont de très gros utilisateurs d’eau. Compte tenu des contraintes économiques et environnementales il est important de préserver cette ressource. Afin de maitriser leur consommation en eau, les abattoirs de porcs ont de plus en plus souvent recours à de l’eau recyclée (après traitement) pour le nettoyage des camions de transport d’animaux. Cependant, il est important de s’assurer que l’eau recyclée présente une qualité microbiologique satisfaisante afin d’éviter la recontamination des camions. Dans le cadre de notre projet, nous avons évalué la qualité microbiologique des eaux recyclées dans 5 abattoirs de porcs et nous avons pu montrer, dans 4 abattoirs sur 5, la présence d’ADN de deux virus importants en pathologie porcine (PCV2 et PCV3). L’objectif du présent projet est d’évaluer à l’aide d’un essai d’infection sur porcs (bioassay) si les virus PCV2 / PCV3 que nous avons détecté par PCR dans les eaux recyclées peuvent infecter des porcs. Le recours aux animaux (porcs exempts d’organismes pathogénes spécifiques : EOPS) est indispensable car les modèles in vitro ou ex vivo d’infection ne sont pas suffisamment sensibles pour évaluer l’infectiosité de ces deux virus. Etant donné qu’on ne peut pas exclure la présence d’autres virus infectieux dans les eaux recyclées, en plus des prélèvements sanguins (pour la détection des PCV2 et PCV3), des prélèvements au niveau respiratoire et digestif seront également réalisés.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer de façon objective le risque infectieux viral qui peut être lié à l’utilisation des eaux recyclées en abattoir de porcs. Si nous montrons que les eaux recyclées ne présentent aucun risque viral, ces résultats pourraient conduire plus d’abattoirs à avoir recours au recyclage de leurs eaux usées ce qui est souhaitable d’un point de vue des économies d’eau et sur le plan environnemental. Au contraire, si nous demontrons une risque d’infection viral dans notre bioassay, ces résultats conduiront à réviser les méthodes de traitement des eaux recyclées pour le nettoyage des camions de transport d’animaux vivants.

Procédures

Au cours de la procédure, les animaux seront inoculés par voie oronasale avec de l’eau recyclée (concentrée ou non) sous un volume de 35 ml. Cette inoculation sera réalisée sur animaux vigiles à l’aide d’une seringue (sans aiguille) insérée au niveau des narines (injection de 5 ml par narine) puis de la commissure des lèvres (injection de 25 ml dans la bouche) et prendra 1 à 2 minutes. Les animaux inoculés seront ensuite soumis à des prélèvements 1 fois par semaines pendant les 6 semaines de suivi (soit un total de 7 séries de prélèvements par animal). Ces prélèvements réalisés également sur animaux vigiles consisteront en : - Une prise de sang réalisée par des animaliers pratiquant ces prélèvements très régulièrement, la durée des prises de sang n'excède donc pas 1 minute - Un écouvillonage nasal qui ne demande qu’une dizaine de seconde - Un écouvillonage rectal, lui aussi nécessitant seulement une quinzaine de seconde Les animaux controles seront inoculés de la même manière avec de l’eau stérile et ils seront soumis aux mêmes prélèvements, mais uniquement à 3 reprises

Impact sur les animaux

Dans notre modèle de porcs EOPS, les infections par les virus du PCV2 et du PCV3 sont asymptomatiques. Dans la mesure où on ne peut pas exclure la présence d’autres virus pathogènes pour le porc dans les eaux recyclées qui seront inoculées, un suivi clinique des animaux sera effectué tout au long de l’étude, avec un suivi rapproché pendant les 2 premières semaines après inoculation. Si les animaux atteignent un des points limites définis, ils seront mis à mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale. Des prélèvements d’organes seront réalisés après la mise à mort de l’animal. Ces prélèvements premettront la recherche de PCV2 / PCV3 et éventuellement d’autres virus à tropisme digestif ou respiratoire.

Remplacement

L’objectif du projet étant d’évaluer si l’utilisation des eaux recyclées d’abattoirs de porcs présentent un risque infectieux viral pour l’espèce porcine, l’utilisation de porcs est indispensable pour cette étude. Les modèles in vitro ou ex vivo disponibles permettant la mise en évidence de virus infectieux sont très limités et ont une sensibilité bien moindre que l’utilisation d’un modèle in vivo porcin. C’est en particulier le cas pour les virus du PCV2 et du PCV3.

Réduction

Le lot d’animaux inoculés sera constitué de 6 porcs subdivisés en 2 groupes de 3 porcs inoculés par de l’eau recyclée ou bien de l’eau recyclée concentrée. L’ajout d’un groupe d’animaux inoculés avec de l’eau recyclée concentrée (charge virale multipliée par 10 environ) permet d’augmenter les chances d’infection et ainsi de limiter le nombre d’animaux inoculés nécessaires pour mettre en évidence l’infectiosité virale de l’eau recyclée. Le groupe contrôle comportera 6 porcs. Ce groupe contrôle permettra la collecte de données cliniques et zootechniques de référence de manière contemporaine aux animaux inoculés. L’effectif de 6 animaux par groupe est le minimum nécessaire pour des analyses statistiques fiables.

Raffinement

Les animaux seront élevés en groupes stables au cours de toute la durée du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Ils auront accès à des jouets. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine sera distribuée aux animaux. Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal au quotidien pendant toute la durée de la procédure expérimentale. En cas d’atteinte d’un des points limites, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

L’objectif du projet étant d’évaluer si les eaux recyclées en abattoir présentent un risque infectieux viral pour l’espèce porcine, l’utilisation de porcs est indispensable pour cette étude. Les animaux sont sevrés et transférés dans les installations expérimentales à 4 semaines d’âge. Ils seront inoculés la semaine suivant leur transfert afin de leur laisser le temps de s’adapter à leur nouvel environnement.

3 chiens vont être utilisés, réutilisés ensuite dans d'autres phases plutôt que tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent à trois reprises une injection de fentanyl, puis un placebo ou un antidote, avec pose de cathéters veineux et artériel et suivi cardiovasculaire et respiratoire, pour comparer une naloxone modifiée à la naloxone standard. Le porteur mentionne comme nuisances le stress de la contention et un hématome possible au cathéter, le surdosage de fentanyl restant selon lui "peu probable". Il justifie le recours au chien par la nécessité d'un "organisme entier" métaboliquement proche de l'humain et prévoit de réutiliser les trois animaux sur avis vétérinaire.

Objectifs

Les surdoses d’opiacés (molécules de la famille de la morphine) sont un problème croissant, en particulier aux Etats-Unis où elles représentent plus de 100000 morts par an. En parallèle, les chiens peuvent également être victimes d’intoxications aux opiacés, que ce soit par consommation accidentelle dans le cas de chiens de compagnie, ou au cours du travail pour des chiens de recherche de drogues. Chez l’Homme comme chez le chien, la Naloxone (NX) est utilisée comme antidote. Elle est très efficace et agit rapidement. Néanmoins, son effet n’est pas immédiat, des doses importantes sont nécessaires pour antagoniser les dérivés morphiniques, et sa durée d’action est plus courte que celle du fentanyl, un dérivé morphinique fréquemment utilisé, ce qui induit un risque de re-surdose. La NXm est une nouvelle formulation de Naloxone modifiée qui a été mise au point pour atteindre plus vite le système nerveux central, afin d’antagoniser plus rapidement et à moindre dose le fentanyl. Par ailleurs, le métabolisme prédit de la NXm est plus long que celui de la Naloxone, ce qui devrait conduire à une durée d’action plus longue dépassant celle du fentanyl. Tous ces éléments ont déjà été validés in vitro puis in vivo chez le petit animal (rat). Néanmoins, des études in vitro ont montré que le NXm est très instable dans le plasma de rat ou de souris, alors que sa demi-vie est pus longue et très similaire chez l’Homme et le chien. L’objectif de ce projet est de réaliser une première étude pilote chez le chien, visant à comparer l’effet de la NXm et de la NX après une dose standard de fentanyl, afin de vérifier que les critères mesurés permettent de détecter l’effet du fentanyl puis de l’antagoniste, et de vérifier que la NXm antagonise le fentanyl de manière comparable à la Naloxone. Cette étude permettra de préparer des phases ultérieures d’évaluation pré-clinique de la NXm.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de vérifier que la NXm permet d'antagoniser le fentanyl au moins aussi efficacement que la NX, et que les critères mesurés au cours du projet permettent bien de détecter l'effet du fentanyl et de son antagonisation chez le chien. Ce projet constitue donc une expérience pilote qui posera les jalons des phases ultérieures de validation pré-clinique de la NXm. A terme, la NXm pourrait remplacer la NX et permettre de sauver davantage de vies humaines et canines.

Procédures

Les chiens seront soumis 3 fois, espacées d'une semaine, à une injection IV de fentanyl à la dose recommandée chez le chien pour une analgésie per-opératoire. Après 30 minutes, ils recevront soit un placebo, soit de la Naloxone, soit la NXm. Ils seront suivis sur le plan de leur pression artérielle, leur température, leur électrocardiogramme et leur respiration, durant 2h00 en tout sur une table d'examen, puis durant 4 heures (électrocardiogramme et respiration) dans leurs conditions habituelles d'hébergement). Les gestes invasifs requis pour ces procédures sont la pose d'un cathéter veineux (5 minutes), et celle d'un cathéter artériel (5 minutes). Des prélèvements de sang (7 prélèvements de 1 ml, quelques secondes par prélèvement) seront effectués directement au cathéter artériel, sans avoir recours à une nouvelle ponction.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues de ce projet sur les chiens sont les suivantes : - Stress lié au fait d'être manipulé sur une table d'examen - Gêne liée au port d'un dispositif de suivi ambulatoire ECG et respiratoire (modérée) - Hématome possible suite au positionnement d'un cathéter artériel - Surdose de fentanyl (très peu probable)

Devenir

Les trois chiens utilisés dans ce projet seront réutilisés dans des phases ultérieures de validation pré-clinique de la NXm, sur avis du vétérinaire désigné.

Remplacement

Des études in vitro ont été menées en amont sur la molécule développée. Des études in vivo chez le petit animal ont par ailleurs montré son efficacité après une surdose de fentanyl. Les étapes de validation pré-cliniques doivent désormais être réalisées dans un organisme entier métaboliquement proche de l'Homme et permettant de mesurer les effets du fentanyl et de son antagonisation sur les fonctions cardiovasculaires et respiratoires notamment.

Réduction

Le nombre de chiens inclus (3) a été réduit au minimum nécessaire permettant de conclure sur les données obtenues. Il s'agit du nombre d'animaux nécessaire et suffisant pour démontrer un retour à une fréquence cardiaque normale après antagonisation du fentanyl (passage de 66 bpm à 110 bpm, écart-type 10 bpm). Le protocole d'étude en cross-over permet également de contribuer à la réduction.

Raffinement

Une attention particulière sera portée à la réduction du stress engendré par la manipulation des chiens sur table d'examen. Ils y seront progressivement habitués en amont du projet ("medical training" en phase d'acclimatation). Le jour J ils seront rassurés et manipulés par des personnes connues. Un monitoring complet sera mis en place permettant de détecter précocement d'éventuelles complications et d'agir rapidement si elles se présentaient. Les gestes invasifs, certes peu nombreux (cathéters veineux et artériel), seront pratiqués de manière à éviter toute complication, l'asepsie lors de la pose et l'hémostase au retrait des cathéters seront notamment particulièrement soignées. Des points limites adaptés ont été définis, portant principalement sur les risques liés à un surdosage de fentanyl (même si celui-ci est peu probable), permettant d'injecter de la naloxone en pareil cas. Sur le plan de l'hébergement, les chiens sont hébergés en petits groupes sociaux compatibles, sur litière, et ont à leur disposition des plateformes, lieux de couchage et jouets. Ils bénéficient de sorties quotidiennes 7j/7 en groupes plus larges et d'interactions quotidiennes avec l'Homme.

Choix des espèces

Des études in vitro ont démontré que la demi-vie de la NXm est plus proche de celle qui sera observée chez l'Homme chez le chien que dans d'autres espèces. C'est pourquoi les étapes de validation pré-cliniques sont prévues dans cette espèce. Par ailleurs, si le développement de la NXm est un succès, cela pourra également bénéficier à l'espèce canine. Les chiens utilisés seront de jeunes adultes, permettant de travailler sur des organismes pleinement matures, sans interférence du vieillissement.

1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante sous anesthésie une pompe diffusant de l'angiotensine II pendant quatre semaines, avec des administrations répétées de molécules candidates et des prélèvements sanguins, pour tester des composés censés freiner la fibrose rénale. Le porteur indique que l'hypertension provoquée peut évoluer vers une insuffisance rénale, avec polyurie et déshydratation, et que les reins sont prélevés après mise à mort. Il conclut que les tests sans animaux ne reflètent pas la complexité de l'organisme et que le modèle animal reste "indispensable".

Objectifs

La fibrose est un problème de santé publique affectant des millions de personnes à travers le monde. La fibrose n’est pas une maladie, mais elle se développe le plus souvent suite à un processus inflammatoire marqué. Elle se caractérise par le remplacement d’un tissu parenchymateux par du tissu connectif et la formation d’un tissu cicatriciel épaissi qui affecte de façon plus ou moins importante la fonction initiale de l’organe atteint. La fibrose peut impacter différents types de tissus parmi lesquels les poumons, le foie, le cœur ou encore les reins. Le vieillissement de la population et l’augmentation du nombre de patients atteints de diabètes ou d’hypertension entraînent une forte accélération de l’incidence des néphropathies menant à l’insuffisance rénale. Quelle qu’en soit l’origine, la majorité des atteintes rénales aboutissent au développement d’une fibrose tubulo-interstitielle dont la présence signe l’évolution vers la perte de la fonction rénale. La fibrose rénale représente le trait histologique commun des néphropathies associées à une insuffisance rénale chronique évolutive. Comprendre et lutter contre le développement de la fibrose représente ainsi un enjeu scientifique et médical de la plus grande importance. Il n’existe pas actuellement de médicament dont les effets anti-fibrosants soient clairement démontrés au niveau rénal chez l’homme. Ainsi le présent projet aura pour objectif d'évaluer l’efficacité préclinique de candidats médicaments susceptibles de lutter contre l’inflammation et la fibrose dans un modèle d’hypertension et de l'insuffisance/fibrose rénale induits par la perfusion d’angiotensine II chez la souris.

Bénéfices attendus

La fibrose rénale est un problème de santé publique. A l'heure actuelle il n'existe pas de traitements médicamenteux et les patients sont soignés par des thérapies lourdes que sont la dialyse et la transplantation. Ce projet permettra d'évaluer l’activité anti-fibrotique et/ou anti-inflammatoire de substances en développement qui pourraient trouver un intérêt dans le traitement de la fibrose rénale chez l’homme, réduisant ainsi les prises en charges lourdes utilisées actuellement.

Procédures

Les animaux sont anesthésiés transitoirement (la procédure ne dure que quelques minutes) pour être implantés avec un dispositif sous-cutané (pompe osmotique) permettant la perfusion d’une solution d’angiotensine II pendant 4 semaines. Les substances-test peuvent être administrées par bolus (la procédure ne dure que quelques secondes).. Les administrations peuvent être uniques ou le plus souvent répétées pendant plusieurs jours ou plusieurs semaines, et cela en fonction de l’objectif de l’étude. Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang (nombre limité au strict minimum selon les besoins de l'étude) peuvent être réalisés sous anesthésie (la durée de la procédure de prélèvement est d’environ 30 secondes).

Impact sur les animaux

Dans ce type de procédure, il est attendu une hypertension artérielle évoluant à terme vers une insuffisance rénale. Les symptômes peuvent comprendre une polyurie et une déshydratation malgré une augmentation de la consommation d’eau. Les phases d’induction de l’anesthésie et de réveil peuvent être source de stress ou d’inconfort pour l’animal, tout comme les phases de contentions nécessaires aux administrations substances (antalgique en post-chirurgie, produit test).

Devenir

Dans la procédure, les animaux sont euthanasiés, le prélèvement des reins (pour analyses) ne permettant pas le réveil et le maintien en vie.

Remplacement

Dans le cadre du développement des médicaments testés, de nombreux tests ex vivo, in vitro et in silico, ont déjà eu lieu avant l'utilisation de l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substance à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne reflètent pas la complexité de l’environnement biologique et du système endocrinien chez l’Homme. De même, il n'est pas possible de prédire les effets secondaires des substances utilisées. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Les données de la littérature indiquent qu’un effectif de 8-12 animaux en standard par groupe (nombre d'animaux et groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Si à la suite des premiers essais, il est montrer (par une approche statistique) que les données permettent de diminuer le nombre d’animaux sans impacter la fiabilité des résultats, alors une décision sera prise en ce sens. Par ailleurs, en plus des organes cibles (reins) de ce modèle, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.

Raffinement

Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites permettant l'euthanasie précoce de tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse. De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.

Choix des espèces

Aujourd’hui encore, les rongeurs (souris) demeurent essentiels pour étudier les fibroses. Le modèle proposé dans ce projet est bien décrit dans la littérature scientifique . Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, soit jeunes (il est notamment prévu de commencer les études autour de l'âge de 2-4 mois), soit agés (jusqu'à environ 18 mois) car l'apparition de la fibrose rénale dans ce modèle est décrite comme de plus en plus importantes avec l'âge.

1 200 animaux non-humains, 400 rats, 400 cobayes et 400 lapins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent sous anesthésie des injections de produits de comblement sous la peau, dans le derme ou le muscle, suivies de séances répétées de scanner et d'imagerie optique, pour évaluer des dispositifs injectables destinés à la médecine esthétique et reconstructrice. Le porteur justifie l'étude par la progression du marché de la chirurgie esthétique et la recherche de produits "plus performants et plus persistants". Il affirme qu'il n'existe pas de méthode fiable sans animaux pour modéliser un produit injecté, et les tue pour analyser les sites d'injection.

Objectifs

Le marché mondial de la chirurgie reconstructrice ne cesse de progresser ces dernières années. Selon l’Observatoire Mondial du Marché et de la Profession, ce marché a bondi de 10% en un an, en 2012. En France, les technologies non chirurgicales, à base de produits injectables progressent, au point que ces interventions dominent aujourd’hui ce marché (correction des cicatrices d'acné, restauration et correction des signes de perte de graisse faciale (lipoatrophie) chez les personnes atteintes du VIH, ...). Certains produits de comblement se résorbent naturellement avec le temps nécessitant pour les patients de répéter les injections, il est donc nécessaire d'améliorer la persistance de ces produits. La recherche de nouveaux produits, performants et sains pour le patient, est donc plus que jamais nécessaire. Ce projet a pour objectif de tester et évaluer des dispositifs médicaux injectables de comblement sur différents modèles animaux. Il comporte plusieurs protocoles visant à évaluer leur comportement (persistance et potentielles réactions locales de type inflammatoire) après injections sous la peau, sous le derme, sous le muscle ou dans le muscle chez les rongeurs ou le lapin. Lors de ce projet, l’imagerie médicale sera utilisée afin de suivre l’évolution (volume et forme) des produits injectés au cours du temps. Un effet inflammatoire des produits pourra également être mis en évidence, notamment par imagerie optique (bioluminescence/fluorescence) ou par analyse histologique.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à la mise sur le marché de nouveaux produits dans le but de proposer des produits plus performant et plus persistant.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés (anesthésie volatile ou fixe) afin de réaliser l'injection ou les injections en sous-cutané, en intradermique, en intramusculaire et/ou en sous musculaire en respectant les volumes d'injections recommandés. Ces injections seront réalisés en maximum 10 minutes (anesthésie comprise). Des examens scanners ou d’imagerie optique seront également réalisés sous anesthésie générale. Un examen scanner dure jusqu’à 20 minutes et les examens d'imagerie optique en moyenne 5 minutes (anesthésie comprise). La fréquence des examens d'imagerie optique sera de : -maximum 10 acquisitions par jour le premier jour puis, - maximum 3 acquisitions par jour pendant les 3 jours suivants puis, - maximum 1 acquisition par jour jusqu’au 10ème jour puis, - maximum 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude. La fréquence des examens scanners sera de : -maximum 3 acquisitions par jour le premier jour puis, - maximum 1 acquisitions par jour pendant les 15 jours suivants puis, - maximum 1 acquisition par semaine pendant les 2 premiers mois puis, - maximum 1 acquisition par mois jusqu’à la fin de l’étude.

Impact sur les animaux

Les animaux seront manipulés régulièrement pour la réalisation des différents actes techniques: injection des produits, réalisation des acquisitions d'imagerie et suivi clinique avec pesée. Les injections des produits et la réalisation des acquisitions d'imagerie seront réalisés sous anesthésie. Ces manipulations bien que réalisé avec le plus grand soin par du personnel formé sont susceptibles d'induire un stress.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole. Les sites d'injection pourront être prélevés après mise à mort de l’animal afin de réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable le comportement de produits injectés dans un organisme entier vivant. Ce comportement dépend de très nombreux facteurs tels que la zone d’injection, les tissus environnants, l’activité de l’animal, etc.

Réduction

Le suivi de la persistance (volume et forme) des produits injectés sera réalisé par imagerie médicale sur les mêmes animaux au cours du temps. Cette méthode d'analyse permet de conserver les animaux tout au long de l'étude et donc de diminuer le nombre d'animaux impliqué dans chaque procédure. Afin d'obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant d'étudier la performance et/ou la persistance du produit au cours du temps (à court/moyen et long terme), des groupes de minimum 6 sites d'injection seront constitués (en fonction de l'espèce plusieurs sites d'injection peuvent être réalisés sur un même animal réduisant également le nombre d'animaux à utiliser : par exemple 8 sites intradermiques pourront être réalisé sur 1 lapin).

Raffinement

Une période d'acclimatation de 2 jours minimum sera respectée pour les rongeurs et de minimum 4 jours pour les lapins. Les rongeurs seront hébergés en cage et les lapins en parc de manière collective durant toute la durée de l'étude (sauf exception en cas de bagarre ou blessure) avec des enrichissements appropriés en fonction de l'espèce (abris, matériel de nidation, bois à ronger, balles, ...). Au cours de l'étude les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout signe clinique anormal et ainsi prendre le plus rapidement possible, les mesures nécessaires : mesure de soutien (désinfection de plaies, isolement, réchauffement, etc…) ou la mise à mort des animaux ayant un état clinique jugé moribond. Le poids des animaux sera contrôlé régulièrement tout au long de l'étude et un suivi clinique approfondi pourra être réalisé afin de détecter les signes suivants: signes cliniques généraux = comportement général de l’animal pour déceler une éventuelle apathie, la réponse à la stimulation, l’état de son pelage (soyeux ou en piloérection), présence d’écoulement nasaux et oculaires, difficultés respiratoires ou en lien avec l’administration de produit = inflammation, lésion, nécrose du site d’injection. Toute anomalie clinique sera rapportée au vétérinaire responsable du suivi. Les signes cliniques observés seront pris en charge (injection de fluides, analgésiques, antibiotiques, etc…) dans la mesure où les actions n’interfèrent pas avec les produits injectés (en fonction des connaissances des produits).

Choix des espèces

Les rongeurs ont été choisis afin de tester les différentes techniques d’injections et de comparer les modèles entre-eux. L’espèce sera choisie en fonction du type d’injection (volume, fréquence, localisation, etc.) et d’imagerie : - Le cobaye est aujourd’hui une espèce référence en terme d’injection intradermique, tandis que le rat sera privilégié pour les injections sous-cutanées (volumes injectables plus importants que chez la souris, permettant un suivi en imagerie médicale). - Le lapin a quant à lui été choisi afin de tester des volumes plus importants et ainsi mimer les volumes d’injections les plus importants réalisés chez l’humain. Les rats et les cobayes seront utilisés au stade de jeune adulte (environ 7 semaines). Les lapins pourront être utilisés à partir de 10 semaines. Le stade de développement jeune adulte est celui habituellement utilisé (pas de contrainte spécifique lié à l’âge - animaux avec un système immunitaire mature).