Recherche appliquée

Tués pour un prélèvement terminal s'ils réagissent à la sensibilisation, gardés en vie pour d'éventuelles études futures s'ils n'y réagissent pas, 1 080 cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et 180 d'entre eux sont déclarés réutilisés. En règle générale, chacun reçoit quatre injections de sensibilisation puis une injection test, et ceux qui réagissent subissent une injection du même réactif dans les deux narines, qui déclenche éternuements, frottements du museau, larmoiement et écoulement nasal, observés pendant deux heures en isolement. Les candidats médicaments contre la rhinite allergique leur sont donnés une seule fois ou jusqu'à 28 fois en quatre semaines, avec au plus deux prises de sang en cours d'étude. Le porteur retient le cobaye parce qu'il présente, "contrairement à la souris et au rat", une réaction allergique précoce et tardive comme chez l'humain.

Objectifs

La rhinite allergique est une maladie chronique des voies respiratoires très fréquente. Sa prévalence a augmenté considérablement ces dernières décennies, au point de constituer un problème de santé publique. 25% de la population est affectée dans les pays développés. La rhinite allergique constitue un problème de première importance en raison de sa prévalence élevée, des coûts qu’elle occasionne, de son évolution vers l’asthme et de ses effets considérables sur la qualité de vie des personnes affectées. La rhinite est déclenchée par une réaction excessive du système immunitaire en présence d’un allergène, comme le pollen ou les acariens. Pour défendre l’organisme, le système immunitaire libère divers composés, notamment de l’histamine, qui sont responsables des symptômes allergiques. Le traitement le plus efficace est l’éviction de l’allergène en cause, mais ceci est difficilement possible en pratique (e.g. cas d’une allergie aux pollens). Différents traitements sont disponibles. Cependant, les corticoïdes en suspension nasale ont des d’effets indésirables, tels que saignement de nez, irritation, fragilisation de la muqueuse nasale en cas de traitement prolongé. Les antihistaminiques peuvent également entrainer de la sédation. L’immunothérapie spécifique ou désensibilisation permet aussi d’induire une tolérance à un ou plusieurs allergènes. Dans ce contexte, le présent projet aura pour objectif d'évaluer l’efficacité préclinique de candidats médicaments susceptibles de lutter contre l’inflammation et les symptômes (éternuement, écoulement nasal,…) de la rhinite chez le cobaye.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'évaluer l'efficacité de substances en cours de développement sur l'apparition des symptômes de la rhinite mais également sur la réponse inflammatoire. En effet, si les symptômes de la rhinite ne sont pas graves en soi, leur association peut les rendre difficiles à supporter et avoir un impact non négligeable sur la qualité de vie des patients (troubles du sommeil, fatigue chronique, difficultés de concentration, baisse de performance,…). Sans compter que les allergies peuvent exacerber les maladies suivantes : asthme, infection des voies respiratoires supérieures, sinusite ou bronchite. Dans ce contexte, il est nécessaire de développer un traitement efficace afin d’inhiber les symptômes de la rhinite et améliorer la qualité de vie des patients.

Procédures

Dans ce projet, les cobayes seront sensibilisés à 4 reprises en standard par l'injection d’un réactif (durée d’environ quelques secondes). Une semaine a minima après la dernière sensibilisation, les animaux répondants seront sélectionnés par injection (durée de quelques secondes) du même réactif (observation non invasive pendant 40 minutes de l’apparition d’une réaction inflammatoire au point d’injection). La rhinite est ensuite induite par une injection du réactif au niveau des 2 narines, durée de quelques secondes. Les symptômes de la rhinite seront évalués par observation du comportement de l’animal (en général pendant 2 heures après le challenge, après une période d'habituation de 30 minutes). Des prélèvements sanguins (durée de quelques secondes) peuvent être réalisés au cours de l’étude (maximum 2 prélèvements). Après l’évaluation des symptômes, les animaux seront euthanasiés pour prélèvements, e.g. sang, liquide nasal ou organes d’intérêt (durée de quelques secondes). Les candidats médicaments seront administrés (durée de quelques secondes) de manière aigue (une administration unique) ou chronique (durée maximum de 4 semaines selon le composé, soit 28 administrations).

Impact sur les animaux

Dans ce type de procédure, il est attendu le développement des symptômes de la rhinite après le challenge par voie nasale, i.e. principalement éternuement, frottement du museau, larmoiement, rhinorrhée et sécrétion de mucus. Il n’est pas attendu d’effets indésirables pendant la phase de sensibilisation des animaux. Pendant la phase d’observation des animaux, ces derniers sont isolés afin de mieux les observer. Des prélèvements intermédiaires réalisés au cours de l’expérience chez les animaux vigiles pourraient également constituer un stress.

Devenir

Tous les animaux répondants sont euthanasiés en fin de procédure car ils sont soumis à un prélèvement terminal (prélèvement du liquide nasal, de sang et/ou d'organes) afin d'évaluer l'effet des candidats médicaments sur la réponse inflammatoire. Les animaux non-répondants à la sensibilisation sont maintenus en vie car ils ne présentent pas de symptômes particuliers et pourront donc être utilisés dans de potentielles études futures.

Remplacement

Dans le cadre du développement des médicaments testés, de nombreux tests in vitro et in silico ont déjà eu lieu avant l'utilisation de l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne reflètent pas la complexité de l’environnement biologique et du système respiratoire chez l’Homme. De même, il n'est pas possible de prédire les effets secondaires des substances utilisées. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études (otamment, les prélèvements terminaux systématiques permettent d'éviter d'utiliser d'autres animaux). Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe non sensibilisé, à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif si cela s'avère pertinent. Les données de la littérature indiquent qu’un effectif 8-10 animaux par groupe est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test.

Raffinement

Les mesures de raffinement s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites permettant l'euthanasie précoce de tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce est basé sur la bibliographie scientifique. Le cobaye est reconnu comme un bon modèle d'asthme ou inflammation pulmonaire, car contrairement à la souris et au rat, il démontre une réaction allergique précoce et tardive comme c'est le cas chez l'humain. C'est également l'espèce classiquement utilisée pour l'évaluation des symptômes de rhinite ou toux. Les études sont principalement réalisées chez des cobayes sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément à la bibliographie scientifique.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, des injections répétées d'une cytokine et d'anticorps jusqu'à trois fois par semaine, parfois de la chimiothérapie, et des prélèvements sanguins répétés à la queue, une partie subissant un prélèvement de sang terminal. Le porteur indique que la croissance tumorale peut gêner la locomotion et provoquer une ulcération menant à un état moribond. Il affirme que les méthodes sans animaux ne peuvent pas remplacer la souris à ce stade et renvoie les retombées pour les patients, validation d'anticorps avant essais cliniques, au conditionnel.

Objectifs

Les avancées en termes d’immunothérapies dans les cas de cancers sont très encourageantes mais une recherche accrue est toujours de mise afin d’une part de découvrir de nouvelles cibles mais également d’améliorer les traitements déjà existants. Ce projet a ainsi pour but de continuer à approfondir nos données sur les actions de notre cible, une cytokine (protéine messagère et régulatrice du système immunitaire naturellement présente dans chaque organisme), de son blocage à l’aide d’anticorps candidats et ce dans un contexte de développement tumoral (multiplication des cellules tumorales) chez la souris. Grâce à nos modèles de développement tumoraux, nous pourrons analyser la biodistribution et la dégradation de cette cytokine ainsi que l’impact de son blocage en synergie (effet cumulé) avec d’autres immunothérapies et chimiothérapies déjà connues en clinique. Ces étapes sont indispensables pour valider les anticorps candidats avant de futurs essais cliniques antitumoraux.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal de ce projet, par des études de suivi de la cible en présence ou absence d’anticorps, sera de connaitre les cinétiques d’action de ces différentes molécules. Ces approches sont indispensables pour pouvoir amener ces technologies dans des essais précliniques réglementaires puis des essais cliniques chez l’Homme.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet seront greffés une fois en injection sous-cutanée (15 secondes/souris). Les animaux recevront ensuite différents traitements en commençant par l’injection unique de la cible (la cytokine) (en injection intrapéritonéale : 10 secondes, en injection sous-cutanée : 10 secondes, ou en injection intraveineuse dans de rares cas : 3 minutes). L’anticorps dirigé contre la cible sera ensuite injecté jusqu’à 3 fois par semaine par l'une de ces trois voies. Dans certains cas, les souris auront également une injection de chimiothérapie en dose unique (en intrapéritonéale ou en intraveineuse suivie de l’immunothérapie 2 fois par semaine (en injection intrapéritonéales, en injection sous-cutanée ou en injection intraveineuse). Des prélèvements sanguins seront réalisés à la veine de la queue en gestes répétés sur 24h (sans dépassement du volume maximum autorisé) ou une fois par semaine sur 4 semaines. La durée de chaque prélèvement est estimée à 1 minute / souris. Certains animaux subiront un prélèvement de sang terminal à la veine cave (animal sous analgésie + anesthésie profonde et sans réveil) afin de collecter un volume de sang suffisant pour des analyses plus fines.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont ceux inhérents à la croissance des tumeurs chez la souris avec un problème de locomotion possible au-delà d'un certain volume ou une ulcération de la tumeur pouvant entrainer un état moribond de l’animal si elle évolue trop rapidement. Les injections de chimiothérapie et d’immunothérapie observées lors des études précédentes ne montrent quant à elles aucun effet délétère observable sur l’état clinique de l’animal

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérimentation, pour prélever la tumeur et les organes immunitaires périphériques afin de réaliser une analyse des mécanismes impliqués suite aux effets des médicaments (à l’aide de technique d’histologie, de cytométrie ou encore de biologie moléculaire).

Remplacement

Il s’agit du suivi de croissance tumorale, il n’existe pas de méthode alternative à ces expériences in vivo. Ces preuves de concept et ces études de mécanismes d’action ne peuvent s’établir que sur de véritables modèles précliniques dans un contexte de tumeur solide similaire à celui que l’on trouve chez l’homme. Ce projet s’inscrit dans une démarche globale qui a démarré par des études bibliographiques, suivies d’études In Vitro approfondies ayant permis d’affiner et de réduire efficacement les pistes de recherches. Cependant, compte tenu des avancées actuelles, à ce stade du projet, il n’est pas possible de substituer l’animal par un modèle in vitro pour continuer ces recherches.

Réduction

L’analyse statistique permettant de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés est réalisée en collaboration avec une équipe de recherche spécialisée dans les études de biostatistique. L’étude de l’efficacité des traitements testés induit deux types d’analyse : -modélisation de la croissance tumorale et -analyse de la survie des animaux. Compte tenu de ces analyses et des données obtenues lors de précédentes expériences réalisées au sein du laboratoire le nombre de souris est limité à 10 par groupe et chaque étape est reproduite une fois afin de supprimer le biais pouvant être induit par un problème technique et ainsi avoir un résultat de deux expériences indépendantes.

Raffinement

Pour la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats obtenus dans le strict respect du bien-être animal. Les points limites ont été établis dans chaque procédure expérimentale et le suivi clinique des animaux se fera quotidiennement sur la base de la fiche de scoring. Les souris seront surveillées quotidiennement y compris les week-ends et jours fériés : suivi du développement de la tumeur (point limite volume >1500 mm3 ou nécrose tumorale précoce), pesée (toute perte de poids ne devra pas excéder 20% du poids normal attendu de l’animal) et détection du moindre signe de souffrance et/ou de détresse de l’animal. En fonction des observations, des décisions allant de l’adaptation des conditions d’hébergement à l’injection d’analgésique jusqu’à une décision d’euthanasie, seront prises. D’autre part, une fiche de soins est utilisée pour la prise en charge des animaux. Pour l’ensemble du projet nous avons prévu un nombre total de 1440 souris incluant (par type de souris = 480) : 480 souris immunodéprimées et 960 souris immunocompétentes.

Choix des espèces

Ce projet nécessite des modèles de souris immunocompétentes et immunodéficientes afin de comprendre le rôle du système immunitaire et de suivre la cinétique de la cible au sein de la tumeur et dans la circulation sanguine. Le choix s’est porté sur les modèles les plus caractérisés et sur lesquels nous avons déjà un recul important : C57Bl/6, BalbC (immunocompétentes) et athymic nude (immunodéficientes). Les souris seront au stade de développement adulte et âgées de 6 à 12 semaines afin d’avoir des animaux d’âge mûr avec un système immunitaire complètement fonctionnel (pour les souris immunocompétentes) et permettant une prise tumorale optimale.

624 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées de cellules de cancers pédiatriques qui forment des métastases au foie, elles reçoivent jusqu'à sept injections d'anticorps testés et des prélèvements de sang sous anesthésie, avant d'être tuées pour évaluer l'efficacité thérapeutique. Le porteur indique que les effets indésirables liés à la croissance tumorale touchent surtout les groupes témoins non traités. Il décrit un test in vitro concluant sur ces anticorps mais présente le modèle animal comme "indispensable et non substituable" avant les essais chez l'enfant.

Objectifs

Les objectifs du projet sont d’évaluer l’efficacité et la sécurité d’anticorps thérapeutiques ou des anticorps bispécifiques correspondants dans un modèle de souris greffées avec des cellules de cancers pédiatriques. Cette possibilité de combiner les anticorps ouvre la voie à de nouveaux traitements permettant une réponse thérapeutique et des rémissions plus importantes chez les patients. Les versions chimériques (=construit pour être toléré par la souris) de ces anticorps ont déjà été testés lors de précédents projets dans un modèle de souris (immunocompétentes) optimisé et ont prouvé leur efficacité et leur bonne tolérance dans ce modèle. Dans ce projet, nous allons utiliser un modèle de souris immunodéficientes afin de tester les versions humanisées (=construit pour être administré chez l'Homme) de ces anticorps thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le meilleur anticorps thérapeutique sera sélectionné et développé pour des essais cliniques. Ces nouvelles biothérapies (anticorps humanisés, anticorps bispécifiques) sont plus efficaces en termes de réponse thérapeutique et plus respectueuses de la qualité de vie.

Procédures

Mesure de la masse corporelle sur animal vigile (10 pesées, 1 minute maximum chacune, soit 10 minutes au total). Injection intraveineuse sur animal vigile (7 injections maximum, 3 minutes maximum chacune, temps de mise en boîte de contention + injection, soit 21 minutes au total). Prélèvement de sang sur animal anesthésié (4 prélèvements maximum, 2 minutes maximum chacun + prélèvement, soit 8 minutes au total).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont : premièrement le stress et la douleur liée à la manipulation (traitements, prélèvements de sang et pesées) et la contention des souris lors de l’administration des traitements (injections intraveineuse) Deuxièmement, l’injection de cellules tumorales conduit à la formation de métastases hépatiques, et des effets indésirables peuvent apparaître chez les animaux en fin d’expérimentation notamment sur les groupes témoins non traités par les anticorps (au fur et à mesure de la croissance des tumeurs métastatiques). Ces effets indésirables sont pris en compte dans l’annexe 1 attachée à cette demande de projet.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de permettre la réalisation de prélèvements pour évaluer l’efficacité thérapeutique des anticorps et de réaliser également des analyses complémentaires.

Remplacement

Il existe à ce jour un test in vitro nommé ADCC (Test de cytotoxicité à méditation cellulaire) qui permet de contrôler que l’anticorps peut reconnaitre et lier la cellule cancéreuse cible et provoquer sa destruction via des cellules effectrices. Nous avons réalisé ces tests sur les candidats anticorps humanisés notifiés dans cette saisine et les résultats se sont avérés probants. Cette étude donc nécessite impérativement un tissu tumoral en place dans un système physiologique et pharmacodynamique et comprenant un réseau vasculaire capable de se remodeler à partir de toute cellule de l’organisme. Le modèle animal reste indispensable et non substituable pour de telles études et donc un passage obligé avant de pouvoir commencer les études chez les patients.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés tient compte des contraintes statistiques. De plus, nous conserverons tous les prélèvements de sang, d’organes et tissus pour des analyses ultérieures. L’optimisation du modèle syngénique dans un précédent projet, nous a permis d’optimiser les injections, de prélèvements et d’ainsi de diminuer le nombre d’animaux par groupe

Raffinement

Nous assurerons une surveillance quotidienne des animaux par l’expérimentateur (en plus de celle réalisée quotidiennement par le personnel animalier) et nous fixerons des points limites sévères qui conduiront à la mise à mort des animaux dès leur apparition. Nous assurerons aux souris un hébergement de qualité avec 3 à 5 souris par cage enrichie (frisotis). Concernant les injections (cellules tumorales ou traitements), une application de lidocaïne sera effectuée sur le site d’injection quelques minutes avant injection.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence. Grâce à beaucoup d’études, de nombreux outils cellulaires et moléculaires ont été développés. Chez la souris, la distribution de l’antigène ciblé, l’O-Acétyl GD2 est semblable à celle décrite chez l’Homme : absence d’expression dans les tissus sains et surexpression dans les cancers chez la souris De plus, nous utilisons un modèle de souris sur lequel notre équipe a déjà évalué des traitements à base d’anticorps et pour lequel nous connaissons bien le développement. Les animaux sont âgés de 8 semaines, soit un poids approximatif de 20g au début des expérimentations, ce qui est idéal pour la bonne réalisation des injections intraveineuses (veines caudales bien visibles et suffisamment grosses). De plus, ce choix s’inscrit dans la continuité des études précédentes pour lesquelles des souris de 8 semaines avaient également été utilisées dans des traitements similaires avec d’autres anticorps.

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendus diabétiques, ils reçoivent des injections quotidiennes d'une molécule tenue secrète, la "myokine X", subissent des prises de sang répétées à la queue, un test de mémoire en piscine de Morris et une exposition au froid à 4 °C pendant 24 heures, avant d'être tués pour analyse des organes. Le porteur attend une perte de poids, des désordres intestinaux et une détérioration de la queue liés aux prélèvements. Il compare sa molécule, en cours de brevet, au liraglutide déjà utilisé chez les patients et affirme "indispensable" le recours à l'animal.

Objectifs

Le diabète est une maladie chronique qui se déclare lorsque le pancréas ne produit pas suffisamment d’insuline (diabète de type 1, DT1), ou lorsque l’organisme n’est pas capable d’utiliser correctement l’insuline qu’il produit (diabète de type 2, DT2). Ainsi, dans les 2 cas, il y a un trouble de l’utilisation et du stockage du glucose apporté lors des repas, entrainant une hyperglycémie. Cette dernière peut au fil du temps provoquer des maladies cardiovasculaires, des néphropathies, des altérations cognitives (perte de mémoire) … La régulation de la fonction sécrétoire des cellules à insuline et leur survie jouent un rôle central dans la progression du diabète. Le muscle squelettique constitue l’organe le plus sensible à l’insuline de l’organisme et joue donc un rôle majeur dans l'équilibre glycémique de l'organisme puisqu’il constitue le site majoritaire de stockage du glucose sous l'action de l'insuline. Nous avons mis en évidence l’existence d’une communication croisée entre le muscle squelettique et les cellules à insuline par le biais de facteurs appelés myokines. Nous avons montré in vitro (îlots pancréatiques de Rat et Humain) et in vivo, dans un modèle de transplantation d’îlots chez le rat DT1, qu’une myokine, appelée myokine X, permettait d'améliorer la survie, la fonction des îlots pancréatiques et l’équilibre glycémique des animaux diabétiques transplantés. Par ailleurs, dans une autre étude in vivo réalisée récemment, nous avons montré qu’une injection quotidienne de notre Myokine X chez un modèle de rat DT2, permettait de prévenir l’apparition de cette pathologie. En particulier, les premiers résultats montrent un impact intéressant de la myokine X sur le tissu adipeux brun. Ce dernier représente un intérêt important de par sa capacité thermogénique qui améliore l’homéostasie glucidique grâce à une importante consommation des substrats dont le glucose. Le nom de cette myokine, représentant un intérêt thérapeutique important pour le patient diabétique, reste anonyme car un brevet est en cours de dépôt. Désormais, le premier objectif de cette demande est de déterminer si notre Myokine X pouvait également avoir un effet curatif sur un modèle de Rat DT2 ainsi que sur les complications citées précédemment. Le second objectif de cette étude est de comparer les effets de notre Myokine X avec les effets du Liraglutide, qui est aujourd’hui un antidiabétique largement utilisé chez l’Homme mais qui peut présenter certains effets secondaires.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice de ce projet est d’obtenir un effet curatif du DT2 par la Myokine X. De plus, cette étude permettra de comparer les effets de notre molécule avec ceux du Liraglutide, qui est très largement utilisé chez le patient diabétique. Néanmoins, le Liraglutide peut présenter un certain nombre d’effets indésirables tels que des désordres intestinaux qui peuvent amener le patient à vouloir arrêter son traitement. Par ailleurs, nos études précédentes in vivo menées chez le rat diabétique n’ont pas montré de tels désordres. Ainsi, notre traitement pourrait constituer une biothérapie innovante pour le DT2.

Procédures

Afin d’évaluer l’évolution du diabète, différents tests seront effectués sur l’ensemble des animaux pour suivre la glycémie. Tout d’abord, celle-ci sera mesurée quotidiennement et l’acte ne durera que quelques secondes. Par ailleurs, nous complèterons ce suivi par une prise de sang hebdomadaire afin de mesurer des marqueurs en liens avec la glycémie. La durée de la contention pour la prise de sang est de moins de 2 minutes. Pour évaluer le fonctionnement de l’ensemble des organes impliqués dans la régulation de la glycémie, un test de sensibilité à l’insuline sera réalisé la moitié des animaux et sur l’autre moitié un test de tolérance au glucose sera effectué. Ces deux tests dureront chacun 2h et avant le test, les animaux seront mis à jeun 4h (accès à l’eau ad libitum). De plus, nous évaluerons les effets de notre traitement sur les altérations cognitives pouvant être induites par le diabète à l’aide du test de la piscine de Morris. Ce test durera 2 min et sera réalisé 3 fois de suite pendant 3 jours au cours de 3 sessions réparties au cours des 15 semaines de l’étude sur 64 animaux. Enfin, nous étudierons sur 40 animaux l’effet de notre traitement sur l’activation du tissu adipeux en réponse au froid. Pour cela, les animaux seront exposés au froid (4°C) pendant 24h.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus sont : - Perte de poids lié au développement du diabète. - Stress lié aux injections quotidiennes de Myokine X et de Liraglutide. - Désordres intestinaux liés au Liraglutide. - Hyperglycémie lié au développement du diabète au cours de l’étude. - Hypoglycémie. - Hypothermie post test comportemental. - Hypothermie au cours de la mise au froid 4°C–8°C. - Détérioration (infection, nécrose) de l’extrémité de la queue suite aux prises de sang et aux mesures glycémiques répétées. - Hémorragie liée au prélèvement sanguin. – Inflammation au point d’injection due aux injections répétées.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour la collecte de sang/organes et analyses.

Remplacement

Le diabète est une pathologie complexe où de nombreux organes sont impliqués (pancréas, muscles, tissu adipeux…) et communiquent entre eux, ce qui ne peut être modélisé in vitro. De plus, l’impact de la Myokine X a déjà été évalué in vitro sur des ilots pancréatiques. Il est maintenant primordial d’évaluer ses effets dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostaie glucidique sont présents. Pour cela, le recours à une étude in vivo est donc indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux qui sera utilisé par groupe est déterminé selon une étude récente qui a démontré que seulement 75% des rats ZDSD devenait diabétique. Ainsi, pour pallier à ce pourcentage d'obtention de rats diabétiques, à ces variations glycémiques et afin d'obtenir des données statistiquement analysables, nous utiliserons 15 rats par groupe. Par ailleurs, ce nombre est basé sur notre longue expérience obtenu au cours des nombreuses études métaboliques réalisées au laboratoire. Cette étude nécessitera donc 120 rats. De plus, la stratégie d’expérimentation est établie tenant en compte la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Par ailleurs, afin de réduire le nombre d’animaux et le stress que pourrait engendrer l’ensemble des procédures sur chaque animal, une attention particulière est portée sur le fait que tous les animaux ne seront pas utilisés pour l’ensemble des procédures. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque procédure a été défini d’après notre expérience dans le domaine du diabète ainsi que d’après la littérature.

Raffinement

Le raffinement a principalement lieu au niveau de l’hébergement avec un enrichissement des cages à l’aide de cylindres en PVC rouge, qui servent de refuge aux animaux et permet ainsi de diminuer leur stress, ainsi qu’à l’aide de bâtons en bois qui leur permettent de reproduire leur comportement naturel de rongeurs. Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux réalisé quotidiennement durant toute la durée de l’étude, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés. Ainsi, les animaux développant un diabète après alimentation enrichie en gras seront traités par insulinothérapie. Un suivi quotidien sera réalisé afin de mesurer la glycémie afin d’ajuster les doses d’insuline à injecter. Si les animaux présentent des signes de douleur, des antalgiques seront administrés en fonction du degré déterminé.

Choix des espèces

Le modèle de rat diabétique utilisé est celui qui mimique le mieux le syndrome métabolique, le diabète de type 2 et l'obésité trouvé chez l’Homme. Les autres modèles de rongeurs actuellement disponibles pour le diabète et le syndrome métabolique manquent de translationnalité à la condition humaine. Ainsi, nous utiliserons ce modèle de rat. L’utilisation en parallèle de rats sains servira de contrôle afin d’évaluer l’impact de notre molécule en situation non pathologique. Ceci nous permettra de comprendre les mécanismes d’action physiologique impliqué notamment dans la régulation de la glycémie de notre Myokine X, encore à élucider à ce jour. Nous utiliserons des rats âgés de 16 semaines au commencement du protocole (Arrivée dans notre animalerie à 14 semaines donc 2 semaines d’habituation). En effet, le DT2 apparaitra à partir de 16 semaines de vie chez les rats de ce modèle. Ainsi, comme le projet consiste à étudier l'effet curatif de notre Myokine X sur le DT2, il faut que les animaux aient au moins 16 semaine de vie avec un statut diabétique établi avant le commencement des traitements.

15 chiens beagles sains vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, huit réutilisés ensuite pour des travaux pratiques et sept proposés à l'adoption. Chaque animal reçoit trois traitements oraux successifs et subit de nombreuses prises de sang, jusqu'à neuf par journée sur cinq cinétiques réparties sur douze semaines, ainsi que des prélèvements d'urine sous échographie. Le porteur décrit un inconfort limité aux ponctions veineuses répétées et prévoit une sortie d'étude si les veines s'abîment. Il justifie le recours au chien sain par la nécessité d'écarter toute maladie rénale préexistante et compare un antihypertenseur récent, le telmisartan, au bénazépril.

Objectifs

Les maladies rénales chroniques (MRC) sont fréquemment rencontrées chez le chien. Certaines conditions fréquemment associées aux MRC, comme l’hypertension artérielle ou la protéinurie, sont des facteurs péjoratifs en termes de progression de la maladie et nécessitent une prise en charge médicale spécifique. Le traitement repose majoritairement sur des molécules avec divers modes d'action sur la fonction rénale comme le bénazépril ou plus récemment le telmisartan. Néanmoins, ces molécules peuvent avoir des effets secondaires pouvant contre-indiquer leur utilisation et/ou compliquer le suivi des patients atteints de MRC. Pour autant, l’effet du telmisartan sur la fonction rénale n’a pas encore été décrit chez le chien sain, ni n’a été comparé au bénazérpil plus couramment utilisé en cas de MRC à ce jour. Les objectifs de ce projet sont : 1. de décrire l’impact d’un traitement oral d’une semaine à base de telmisartan ou de bénazépril (versus placebo) sur la fonction rénale de chiens sains ; 2. de documenter la persistance dans le temps, après l’arrêt des traitements, des modifications éventuellement constatées ; 3. de comparer les variations observées chez les chiens sains recevant le telmisartan, le bénazépril ou le placebo.

Bénéfices attendus

Cette étude permettrait une meilleure compréhension et la caractérisation des effets cliniques et biologiques inhérents au telmisartan chez un patient sain, en comparaison avec la molécule historique (bénazépril) utilisée dans le contexte des maladies rénales chroniques chez le chien, et contre placébo. Cela permettrait également, dans un contexte clinique réel (insuffisance rénale chronique par exemple) de mieux comprendre et anticiper les variations biologiques présentes lors du suivi de ces patients, comme inhérentes au traitement ou à l’évolution naturelle de la maladie.

Procédures

Administration de 3 traitements successivements : une fois/jour pendant 1 semaine pour les traitements 1 et 2, deux fois par jour pendant 1 semaine pour le traitement 3. Administration d'un marqueur de la fonction rénale par voie intraveineuse : 5 fois soit à chaque début de cinétique plasmatique. Prélèvements sanguins : 9 prélèvements sur une journée * 5 cinétiques réparties sur 12 semaines. Prélèvements urinaires : un à J0 (avant traitement), J7 (fin traitement 1), J28 (fin sevrage 1), J35 (fin traitement 2), J56 (fin sevrage 2), J63 (fin traitement 3), J84 (après traitement).

Impact sur les animaux

Les chiens pourront être soumis à un risque de stress et de douleur lors de la réalisation des prises de sang et d’urines, minimisés par la réalisation d’une contention efficace permettant la réalisation rapide du prélèvement, à l’utilisation d’aiguilles et seringues stériles à usage unique et par un personnel compétent. Les prélèvements d'urine seront réalisés uniquement sous contrôle échographique. L’innocuité de cette procédure a déjà été démontrée et justifie sa réalisation dans l’étude présentée. Au cours de chaque journée de prélèvement, 9 prises de sang seront réalisées avec des volumes totaux de sang prélevés ne dépassant pas 13 mL par journée. Aucun changement majeur dans l’environnement des Beagles ne sera réalisé.

Devenir

Les animaux pourront être réutilisés pour la prochaine sessions de Travaux Pratiques du Service de Physiologie (procédures légères) ou proposés à l'adoption.

Remplacement

Cette étude ne peut être réalisée in vitro compte tenu des interactions métaboliques entre les reins et les autres organes de l’organisme ainsi que de la complexité de la fonction rénale évaluée dans cette étude. Il est nécessaire de travailler avec des chiens sains afin de s’affranchir de l’influence d’une maladie rénale pré-existante sur les variables d’intérêt et donc afin de réaliser cette étude en l’absence de facteur confondant.

Réduction

Les effectifs nécessaires ont été prédéterminés en fonction des données existantes et selon des tests adaptés de puissance statistique.

Raffinement

Les procédures réalisées sur les chiens ne sont pas risquées et peu invasives. La source principale d’inconfort correspond à la réalisation de plusieurs prises de sang sur la journée. Pour limiter la gêne liée à ces actes, seules des personnes expérimentées réaliseront les prélèvements sanguins. De plus, chaque prise de sang sera accompagnée de l’application d’Hémoclar sur la veine jugulaire. Si un chien présente un hématome trop important, la veine contro-latéral pourra être utilisée. Par ailleurs, une sortie d’étude sera considérée si les veines sont considérées trop abîmées et source d’inconfort significatif pour l’animal. La tolérance des prises de médicaments sera évaluée par un bilan sanguin hebdomadaire afin de prévenir l'apparition d'effets secondaires et être en mesure d'écarter l'animal de l'étude avant tout signe d'inconfort ou de douleur.

Choix des espèces

L’étude est conduite sur des chiens qui représentent la principale espèce susceptible de bénéficier des IECA et/ou du telmisartan en pratique clinique. Peu de données sont actuellement disponbile sur l’efficacité comparée de ces deux traitements chez le chien. Le chien d’expérimentation est donc un excellent modèle, directement transposable aux chiens présentés en pratique dans un contexte de maladie rénale chronique. Animaux adultes. Les jeunes animaux (< 1an) ne sont pas inclus compte tenu des différences d’intervalles de référence connues chez les animaux en croissance et de la durée de l’étude s’étalant sur plus d’un mois. Le risque de mettre en évidence des variations dues à la croissance serait alors un biais difficile à compenser. Par ailleurs, épidémiologiquement, les très jeunes adultes sont les moins représentés parmi les animaux présentant des affections rénales.

1 010 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et deux cents réutilisées dans d'autres protocoles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent un stress néonatal ou un régime obésogène, puis une chirurgie stéréotaxique injectant un virus dans le cerveau, des prises de sang à la queue et des tests comportementaux avec privation alimentaire. Le porteur attend un comportement anxieux ou dépressif chez les souris stressées ou rendues obèses, objet même de l'étude sur la dépression humaine. Il affirme que l'étude des facteurs environnementaux et du comportement ne peut se faire que sur animal vivant et rattache les retombées aux troubles de l'humeur.

Objectifs

La dépression représente un problème de santé publique majeur. Parmi les facteurs impliqués dans la vulnérabilité à la dépression, l’adversité dans l’enfance et l’obésité associée au mode de vie sédentaire et aux habitudes alimentaires occidentales sont des facteurs de risques importants. Cependant, les mécanismes impliqués dans la physiopathologie de la dépression restent mal connus. Des travaux récents suggèrent que des processus inflammatoires et des dysfonctions du système dopaminergique mesocorticolimbique contribuent à la physiopathologie de certains symptômes dépressifs. L’objectif de ce projet est d’examiner les effets du stress précoce et de l’inflammation liée à l’obésité dans l’apparition désordres émotionnels à l’âge adulte et de mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques sous-jacents. Pour cela nous utiliserons des méthodes de transfert de gènes viraux chez des souris ayant subies un stress néonatal ou rendues obèses à l’âge adulte pour moduler la transmission dopaminergique. Un total de 1010 animaux est envisagé pour ce projet. L’étude de l’impact des facteurs environnementaux et du comportement ne peut être réalisée que sur animaux vivants, rendant impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro. Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux l’inconfort des animaux.

Bénéfices attendus

Ce travail apportera des données scientifiques utiles pour une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la perte de motivation associée au stress précoce et à l’obésité, et plus précisément le rôle de la voie GTP-CH1. Puisque ce projet s’inscrit dans le cadre de recherches translationnelles (c’est-à-dire permettant d’aborder une même question par des approches précliniques et cliniques), il permettra à plus long terme de développer de nouvelles stratégies nutritionnelles et/ou pharmacologiques pour améliorer la réponse thérapeutique et la prise en charge des individus atteints de troubles de l’humeur, en particulier lorsque ces derniers sont associés à un contexte d’obésité.

Procédures

- Des prises de sang seront réalisées à la veine de la queue (7 prélèvements sur 2 heures représentant moins de 100uL de sang) sur une partie des animaux vigiles pour mesurer différents paramètres métaboliques. - Des injections intrapéritonéales seront réalisées pour évaluer la sensibilité des animaux à l'insuline. - L’ensemble des souris sera soumis à une chirurgie stéréotaxique afin d'injecter un virus recombinant dans une région spécifique du cerveau. Cette procédure sera réalisée une seule fois sur chaque animal. - Une partie des animaux sera soumise à des procédures comportementales de façon journalière (5 jours sur 7) durant 3 à 4 semaines, nécessitant une légère déprivation alimentaire.

Impact sur les animaux

- Un comportement anxieux et/ou de type dépressif est attendu chez les souris soumises au stress précoce et au régime hyperlipidique et fait l'objet de cette étude. - L’exposition chronique au régime hyperlipidique entraine une prise de poids et des désordres métaboliques pour les souris. - La chirurgie peut être cause de douleur chez l’animal. Le stress thermique induit par l’anesthésie est contrôlé par l’installation des souris sur un tapis chauffant assurant un maintien de la température à 37°C. Le dessèchement oculaire potentiel est prévenu par l’application d’un gel ophtalmique. - Les injections et prises de sang peuvent être cause de douleur pour l’animal. - Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère et un isolement en cage individuelle le temps de la procédure.

Devenir

Les mères, mâles reproducteurs et mâles C57Bl/6 utilisés pour le screening (200 animaux) seront préférentiellement réemployés dans d’autres protocoles. Le reste des animaux sera euthanasié à l’issue des procédures.

Remplacement

L’objectif du projet est de mieux comprendre chez l'animal les mécanismes mis en jeu dans le développement des troubles de l'humeur induits par un stress précoce ou une exposition chronique à un régime obésogène. L’emploi de modèles animaux est donc nécessaire pour répondre à la question posée. L’utilisation du modèle murin se justifie par l’emploi de modèles génétiquement modifiés pour comprendre les bases moléculaires de ces comportements. La recherche d'alternatives dans des bases de données démontre que les solutions de rechange ne sont pas à ce jour disponibles ou applicables.

Réduction

Lorsque cela est possible, les mêmes souris seront soumises à plusieurs tests lors de l'évaluation comportementale. De même, un maximum de mesures biologiques (périphériques et cérébrales) sera réalisé sur chaque animal dans la limite de compatibilité entre les différentes techniques. Ceci permettre de réduire au maximum le nombre de souris nécessaire à l'étude. Aucun dupliqua du travail proposé n'est aujourd'hui identifié. Le nombre total d’animaux est susceptible d’être revu à la baisse en fonction du succès des reproductions.

Raffinement

- Les animaux seront hébergés en cages collectives (sauf exceptions précisées par la suite) et environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). - Du fait de la restriction alimentaire durant certaines expériences, les animaux seront observés et pesés quotidiennement. - Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille de score. Si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera sacrifié dans les 48h. - Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée ici est la souris, dont la petite taille et la facilité de manipulation permettent un hébergement facile au sein de l’animalerie du laboratoire, dans le respect des règles d’éthique. Les manipulations nutritionnelles sont également faciles à conduire chez la souris et les expériences de comportement sont faciles à mettre en œuvre et très bien maitrisées au laboratoire qui possède tout l’équipement dédié. De plus, ce projet nécessite l'utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement dans des modèles souris. - La procédure de stress précoce sera réalisée sur des femelles lactantes. - Concernant la cohorte impliquant la mise en place d’un phénotype obèse, les souris seront mises sous régime obésogène ou contrôle à partir du sevrage, pour une durée de 15 semaines. Ce choix repose sur les données de la littérature, notamment issues de notre laboratoire, montrant qu’un début d’exposition au régime obésogène au stade de l’adolescence induit des perturbations métaboliques mais aussi de la sphère émotionnelle, majorées, comparativement à une exposition plus tardive (stade adulte). - La suite des expériences (études comportementales, évaluation de la transmission dopaminergique) sera réalisée à l’âge adulte, 15 semaines après le sevrage.

120 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation sous la peau d'un biomatériau osseux, avant d'être tué pour l'analyse histologique des tissus. Le porteur indique que l'implantation peut provoquer une gêne ou une douleur légère et fixe un seuil d'euthanasie. Il décrit cette étape sur souris comme un préalable à des essais sur os de rat puis chez le "gros animal", et affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier ensemble formation osseuse, vascularisation et innervation.

Objectifs

En raison des changements de mode de vie et du vieillissement des nations industrialisées, les lésions osseuses traumatiques et les fractures fragiles induites par l'ostéoporose représentent un énorme défi médical et socio-économique. Notre projet vise à créer une nouvelle approche de régénération osseuse, qui combine l'administration de gènes et l'impression 3D pour la création de matériaux personnalisés qui permettraient d'aboutir à une meilleure réparation osseuse par la stimulation conjointe de la réparation des nerfs, des vaisseaux et des os. Ici, il s’agit de réaliser une première évaluation de nos matériaux en les implantant sous la peau de souris, en préalable à des expérimentations sur site osseux chez le rat. Cette évaluation servira deux objectifs : d’une part, évaluer la biocompatibilité (réaction inflammatoire, réaction à corps étranger, …), et d’autre part évaluer la fonctionnalité (formation osseuse, vascularisation, innervation) des produits, pour définir la ou les formulations les plus appropriées pour l’application chez le rat en modèle de réparation osseuse.

Bénéfices attendus

Les résultats des expériences d’implantation de nos matériaux menées sur modèle souris sont un préalable à la poursuite des travaux sur site osseux chez le rat. De mauvais résultats obtenus avec ce biomatériau et/ou l'un des gènes administrés conduiront à l’abandon de l’élément mis en cause. En revanche, des résultats positifs (régénération osseuse au moins partielle, supérieure à celle observée avec le matériau de référence) permettent d'envisager dans un premier temps les expérimentations en site osseux chez le rat, et dans un deuxième temps le dépôt de demandes de financement pour la poursuite des études : tests chez le gros animal, puis essais cliniques.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une chirurgie d'implantation sous-cutanée (acte chirurgical unique d'une durée de 5 à 10 minutes)

Impact sur les animaux

L'implantation sous-cutanée peut entraîner une gêne voire une douleur légère. L’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie selon les standards européens. Au-delà d'un certain seuil, l’animal sera euthanasié sans attendre.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de leur temps expérimental pour procéder à une analyse histologique des tissus de la région opérée.

Remplacement

L'utilisation en clinique d'un nouveau procédé chirurgical avec un biomatériau nécessite impérativement une phase d'expérimentation pré-clinique. Des études in vitro ont été réalisées pour éliminer une éventuelle toxicité cellulaire du biomatériau et pour évaluer le potentiel régénératif de celui-ci. Aucune méthode in vitro actuelle (ex. organoïdes, sphéroïdes,...) n'a démontré la capacité ou ne présente de validation scientifique permettant d'étudier simultanément la formation osseuse, la vascularisation et l'innervation induites par les biomatériaux tout en tenant compte de la complexité d'un être vivant (système immunitaire, flux sanguin...).

Réduction

Ne seront testés in vivo que les matériaux ayant démontré in vitro une absence de cytotoxicité, et une seule lignée de souris sera utilisée. Les échantillons explantés à l'issue des temps expérimentaux seront utilisés pour plusieurs types de marquages et détections. Deux implantations seront réalisées par souris, en tenant compte de la taille du matériau et de la taille des animaux. La possibilité d'implanter au moins deux matériaux par animal, de réaliser un suivi longitudinal, d'analyser plusieurs paramètres à partir des mêmes prélèvements sur animaux après euthanasie, permet de collecter un maximum d'informations sur les animaux utilisés.

Raffinement

L’opération est réalisée sous anesthésie générale. Afin de réduire la souffrance des animaux, des analgésiques sont utilisés lors de l’opération, puis de nouveau en cas de douleur après l’opération. En cas de lésion sérieuse ne pouvant être traitée par suture et/ou antiseptique, l’animal est euthanasié. La cage reçoit un surcroît d’enrichissements le jour de la chirurgie de manière à distraire l’animal de la gêne liée à la présence du matériau implanté, et ainsi limiter les risques d’arrachement de l’implant, de rupture des points de suture, et d’infection de la plaie.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris présentant une immuno-déficience marquée, adaptée à l'implantation de matériaux contenant des cellules humaines. Les souris seront implantées à l'âge de 7 à 12 semaines. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l´implantation sous-cutanée.