Recherche appliquée

Une partie des 30 souris de ce projet porte, par transgenèse, le gène humain muté responsable de la dystrophie myotonique de type 1, une maladie qui touche les muscles, le cœur et le cerveau. Les souris transgéniques comme les témoins vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : des électrodes leur sont implantées sous anesthésie générale pour enregistrer l'activité du cerveau et des muscles, puis chacune passe deux sessions d'enregistrement d'une semaine, seule dans un baril individuel, une semaine puis un mois après l'opération. Le porteur affirme que la chirurgie "ne devrait pas induire d'effets indésirables", et prévoit de gérer la douleur "avant, pendant et après la chirurgie". À l'issue, toutes sont mises à mort pour revérifier leur génotype, et leur cerveau est prélevé pour des analyses de biologie moléculaire qui ne seront choisies qu'après l'étude du sommeil.

Objectifs

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1, prévalence : 1/8000) est une maladie génétique qui affecte presque tous les organes, comme le cœur et les autres muscles, mais aussi le cerveau. Il en résulte des troubles neurologiques qui ont un impact délétère sur les patients DM1 et leurs familles. Outre des symptômes cognitifs handicapants tels qu'une déficience intellectuelle sévère dans la forme congénitale, on retrouve chez les patients DM1 des altérations motrices, des changements de la perception de l’espace, un déficit attentionnel, de la fatigue intellectuelle et quelques cas d'épilepsies. Une somnolence excessive pendant la journée est également un symptôme fréquent. Initialement focalisée sur le muscle, la recherche sur DM1 dispose de peu de données sur la pathologie cérébrale et les mécanismes à l'origine des troubles neurologiques, comme l'altération de la qualité du sommeil, ont été très peu ou pas étudiés à ce jour. Notre but est de caractériser, dans le modèle murin de la pathologie, les modifications du sommeil.

Bénéfices attendus

La description très détaillée du cycle veille-sommeil au travers du modèle murin DMSXL apporteront des informations inédites sur la pathologie DM1. Nous pensons que les résultats obtenus aideront à la prise en charge de la maladie afin d'améliorer la qualité de vie des patients.

Procédures

Les 30 souris auront une implantation chirurgicale, sous anesthésie générale, d'électrodes pour les mesures de l'activité électroencéphalographiques (EEG) et électromyographiques (EMG), chaque implantation durera au maximum une heure (en moyenne 45 minutes). Les souris seront placées en chambres d’enregistrement pour deux sessions d’une semaine d’enregistrement : une semaine après l’implantation chirurgicale et un mois après.

Impact sur les animaux

Outre l’injection intrapéritonéale de l’anesthésique qui pourra générer un léger stress, la chirurgie pratiquée ne devrait pas induire d’effets indésirables. L’effet indésirable attendu durant les phases d’enregistrement sera uniquement dû à l’isolement des animaux dans des barils individuels (les souris seront isolées deux fois 7 jours).

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de revérifier leur génotype. De plus, les cerveaux seront également prélevés pour des études ex vivo de biologie moléculaire, qui seront déterminées après l'analyse des résultats sur la qualité du sommeil.

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour de modèles in vitro d’études du sommeil. L’étude du cycle veille-sommeil n'est possible que sur un animal entier, vigile et se comportant normalement.

Réduction

30 animaux au maximum devraient être utilisés. Nous prévoyons d’utiliser 12 animaux par groupe (souris transgéniques et contrôles). L’obtention des données qualitatives et quantitatives sera analysée par des tests classiquement utilisés dans l’étude du sommeil sur ces effectifs. Si les 12 premières souris donnent des résultats de qualité, on n’utilisera pas les 6 souris supplémentaires.

Raffinement

Des mesures appropriées seront prises pour suivre la pathologie (surveillance de la pousse des dents qui seront coupées si elles deviennent trop longues), pour minimiser le stress et mal-être individuel (hébergement enrichi et en groupe avant la chirurgie pour éviter un isolement social), pour gérer la douleur avant, pendant et après la chirurgie (médications par un anti-inflammatoire, surveillance de la cicatrisation au niveau de l’implant d’électrodes), et pour limiter l’isolement pendant les phases d’enregistrement électroencéphalographique avec des cages individuelles en espace ouvert pour empêcher que les congénères ne dégradent les implants et permettre aux animaux de se voir et sentir leurs odeurs.

Choix des espèces

Notre choix s'est orienté vers les modèles de souris transgéniques, modèles classiques d'étude de certaines maladies comme celle que nous étudions. Les souris transgéniques créées en insérant le gène humain porteur de la mutation responsable de la maladie permettent d'étudier les mécanismes physiopathologiques. De plus, chez la souris adulte, l’anatomie, les réseaux neuronaux et la neurophysiologie sont maintenant bien caractérisés et de nombreux tests ont été développés pour mesurer le sommeil dans les meilleures conditions possibles et en réponse aux exigences de l'expérimentation animale. Le modèle souris possède enfin les grands principes d’organisation anatomique conservés chez l’homme et les souris ont une taille cérébrale qui permet d’étudier les oscillations locales de l'hippocampe ciblé dans notre projet. L'étude sera réalisée sur des souris âgées de 2 mois (plus précisément 8 semaines) afin d'être à un âge 1/ où le phénotype DM1 est bien établi et 2/ compatible avec l'implantation aisée des électrodes pour la mesure du sommeil.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans l'oeil ou dans le coeur d'une thérapie optogénétique, certaines dès les premiers jours de vie, puis passent fond d'oeil, test visuel et électrorétinogramme. Le porteur indique que les injections sous-rétiniennes peuvent provoquer des décollements localisés de la rétine et des hémorragies oculaires. Il affirme que les propriétés du traitement ne peuvent être évaluées que sur un animal vivant, et renvoie l'application clinique au long terme.

Objectifs

L’objectif de notre projet est de tester une approche indépendante d’un gène muté, pour restaurer la transduction de l’information visuelle en changement de potentiel de la membrane des cellules photoréceptrices, qui est la première étape dans la transmission de l’information visuelle vers le cerveau. La finalité étant le développement de nouvelles thérapies pour le traitement de maladies rétiniennes héréditaires, pouvant bénéficier au plus grand nombre de patients possibles.

Bénéfices attendus

Le projet vise à évaluer l’efficacité d’une thérapie optogénétique qui cible les cônes dormants dans un modèle d’achromatopsie chez la souris. Le bénéfice attendu est à terme d’amener en clinique ce composé à visée thérapeutique pour des maladies rétiniennes héréditaires qui se présentent avec une bonne conservation structurelle des cônes et une baisse significative de leur fonction.

Procédures

- Injection intraoculaire : les animaux recevront une injection intraoculaire (une seule par œil) de la thérapeutique à évaluer. L’injection est rapide (5 à 10 minutes) et sera réalisée sous anesthésie générale. Les souris ne passeront qu’une seule fois par cette étape expérimentale. Les souris qui recevront une injection intraoculaire de la thérapeutique à tester ne recevront pas d’injection intracardiaque. - Injection intracardiaque : les animaux recevront une injection intracardiaque de la thérapeutique à évaluer. L’injection est très rapide (30 secondes) et sera réalisée sous anesthésie locale. Les souris ne passeront qu’une seule fois par cette étape expérimentale. Les souris qui recevront une injection intracardiaque de la thérapeutique à tester ne recevront pas d’injection intraoculaire. - Fond d’œil : suite à l’injection de la thérapeutique, le fond d’œil des animaux sera visualisé pour contrôler la qualité de l’injection réalisée. La procédure est rapide (5 minutes) et sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé une seule fois. - Test optocinétique : ce test permet d’estimer la fonction visuelle in vivo. L’acquisition d’images dure environ 10 minutes par animal et sera réalisée sur animal vigile. Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé une seule fois. - Electrorétinogramme : ce test permet d’évaluer la fonction de la rétine (capacité des cellules de la rétine à répondre à un stimulus lumineux). L’analyse dure environ 30 minutes par animal et sera réalisée sous anesthésie générale. Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé 2 fois par animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances suivantes auxquelles seront soumises les souris sont prises en charge de façon à les minimiser le plus possible. Les injections sous-rétiniennes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et des hémorragies oculaires. Les injections intravasculaires peuvent induire une douleur ponctuelle réversible. L’anesthésie peut provoquer une hypothermie chez la souris qui est la première complication et cause de mortalité lors d’anesthésie de rongeurs. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme).

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de collecter des échantillons pour des analyses histologiques et biochimiques post-mortem.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé que dans un modèle in vivo car les propriétés pharmacologiques du traitement ne peuvent être évaluées que dans des conditions physiologiques, pour notamment étudier l’expression et les résultats fonctionnels de la thérapie optogénétique injectée soit par voie intraoculaire soit par voie intravasculaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés (18 souris par groupe pour les groupes injectés (8 groupes) et 12 souris pour les groupes non-injectés (4 groupes) soit un total de 192 souris) sera toujours limité au minimum nécessaire pour fournir des données biologiquement et statistiquement significatives. Le nombre de 18 souris injectées et 12 souris non-injectées par groupe est basé sur des études antérieures du laboratoire utilisant des techniques similaires.

Raffinement

- Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation (cages de stabulation avec enrichissement, nourriture et boisson à volonté). - Une anesthésie gazeuse courte, permettant un réveil rapide de l’animal, sera privilégiée quand les procédures le permettent (fond d’œil). Les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale par injection d’anesthésiants pour les procédures plus longues (électrorétinogrammes). Pour les injections intraoculaires, les souriceaux à P4-7 seront anesthésiés selon le protocole validé par notre vétérinaire. Une anesthésie locale sera appliquée sur la peau du thorax avant l’injection intracardiaque. Une anesthésie locale de la cornée sera réalisée pour les injections intraoculaires et les électrorétinogrammes. Un gel hydratant sera utilisé pour protéger la surface cornéenne pendant les procédures. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les souris seront placées sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’anesthésie et en chambre thermostatée jusqu’à leur réveil complet. - Une nouvelle aiguille sera utilisée pour chaque animal pour limiter la douleur induite lors des injections intraoculaires, intracardiaques, intrapéritonéales et sous-cutanées. - Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme), les souris resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (tunnel en carton et coton), ainsi que de la nourriture et de l’eau à volonté. - Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque étape de la procédure afin de s’assurer de leur bien-être. - Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale. - Les animaux provenant de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum.

Choix des espèces

Pour ce projet, nous utiliserons un modèle de souris d’achromatopsie, déjà caractérisé dans la littérature. Plusieurs études ont démontré dans ce modèle une bonne préservation des cônes malgré une fonction absente – c’est-à-dire la présence des cônes dormants. Une stratégie optogénétique peut être envisagée pour remédier à la déficience de la cascade de la phototransduction dans ces cônes dormants. L’objectif est de développer une approche thérapeutique non spécifique d’un gène qui aurait la possibilité de soigner un grand nombre de patients jugés incurables à l’heure actuelle. La thérapie optogénétique testée dans ce projet sera injectée avant que la dégénérescence rétinienne ne soit trop avancée, soit dans la première semaine de vie des souriceaux (premiers signes de dégénérescence rétinienne visibles à partir de la 2ème semaine postnatale dans ce modèle de souris).

76 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous-cutanée, des injections, l'insertion d'électrodes à aiguille sous la peau avec stimulation électrique, et sont contenues dans un cylindre fermé pendant qu'on leur diffuse des sons jusqu'à 110 décibels. Le porteur décrit plusieurs tests comportementaux, dont un test des capacités de filtrage sensoriel et un test cognitif avec eau acidifiée sur quatre semaines, pour modéliser un syndrome humain rare. Il indique que le comportement des patients ne peut pas être reproduit in vitro.

Objectifs

Les troubles neurodéveloppementaux (NDD) sont des maladies complexes et hétérogènes présentant des symptômes associés à un développement anormal du cerveau pouvant entraîner plusieurs déficits comportementaux, tels des troubles de l'attention/hyperactivité, les troubles du spectre autistique, une déficience intellectuelle, l'épilepsie ou encore les troubles d'apprentissage. Les NDD englobent plusieurs dysfonctionnements cérébraux développementaux, qui se manifesteront par des troubles neuropsychiatriques ou une altération de la fonction motrice, de l'apprentissage, du langage ou de la communication non verbale avec une grande variabilité et différents degrés de gravité. Des études récentes ont révélé un rôle essentiel du développement cortical embryonnaire dans la physiopathologie des NDD, mais la génétique et les mécanismes sous-jacents sont encore méconnus. En particulier, un gène joue un rôle crucial dans le développement du cerveau. Des mutations sur ce gène entraine l’apparition du syndrome Bosch-Boonstra-Schaaf optic atrophy (BBSOA), qui est une maladie génétique rare, décrite pour la première fois en 2014. Les patients présentent une multitude de symptômes neuronaux et comportementaux, y compris, un retard développemental, une déficience intellectuelle, un trouble du spectre autistique, un trouble déficitaire de l'attention avec hyperactivité, des convulsions, une déficience visuelle et auditive. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les mutations de ce gène peuvent causer le syndrome BBSOA. Certains des symptômes observés chez les patients BBSOA fournissent déjà des indices importants sur le rôle de ce gène dans le développement du cerveau. En outre, des corrélations entre la génétique et le comportement commencent à être caractérisées chez les patients atteints de BBSOA. Néanmoins il est nécessaire d’étudier de façon approfondie des modèles animaux qui permettront de reproduire les mutations génétiques décrites chez l’Homme. Au cours de ce projet nous caractériserons le comportement de 3 lignées de souris présentant des différentes mutations sur ce gène. Cela nous permettra de mieux comprendre comment les mutations contribuent aux différentes anomalies du développement neurologique chez les patients atteints du syndrome BBSOA.

Bénéfices attendus

Les troubles neurologiques du développement sont des maladies neuro-développementales qui impliquent un dysfonctionnement de l’apprentissage, la mémoire, la perception, le langage, la résolution de problèmes et/ou l’interaction sociale. Ces troubles sont principalement d’origine génétique et se manifestent au cours de la petite enfance. Ce projet de recherche expérimentale se focalise sur un gène dont le rôle clé pendant le développement cortical est bien connu et dont plusieurs mutations conduisent au syndrome appelé BBSOA. Les enfants atteints de cette maladie présentent des déficits cognitifs et comportementaux, des crises d’épilepsie au jeune âge et montrent des retards dans l’apprentissage et dans le langage. La majorité des patients (>80%) diagnostiquée présente des troubles du spectre autistique (TSA). Les études récentes à ce sujet ont permis de mettre en évidence des anomalies cérébrales, notamment dans les régions du cerveau impliquées dans le langage et l’abstraction. Pour approfondir la compréhension de l’impact fonctionnel des mutations de ce gène, le projet global vise à mieux caractériser les mécanismes dans le cerveau qui sous-tendent les déficits cognitifs des enfants malades. En particulier, cette étude comportementale qui sera comparée avec celle clinique permettra d’étudier l’impact fonctionnel des mutations du gène dans le contexte des TSA avec le but à long terme de déboucher sur des pistes thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Implantation sous-cutanée d'une puce de radiofréquence sera faite sur les animaux pour enregistrer leurs interactions sociales dans un test comportemental. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique (durée = 30 minutes) - Injection intra-péritonéale d'anesthésique (durée = moins d'une minute) (deux fois). -Etude de la structure de l'oeil par histologie in vivo (durée = 10 minutes). - Mesure neurophysiologique de la fonction motrice et sensorielle (durée = 10 minutes), insertion d'électrodes à aiguille + stimulation électrique (0,1 ms, 8mA). Les aiguilles sont insérées à travers la peau de l'animal à une profondeur de 1 à 2 mm. - Injection sous-cutanée d'antidote de l'anesthésique (durée = moins d'une minute). -Un test comportemental cognitif où l'eau des biberons des cages d'élevage sera acidifiée pendant les jours de test durera 4 semaines. - Contention des animaux dans un cylindre fermé lors du test d'altérations des capacités de filtrage de l'information. Dans ce test des sons de 110 dB pour une durée de 40 msec et d'autres plus faibles (65-70-75-85-90 dB ; durant 10 msec) sont présentés à l'animal. Chaque type de stimulus est présenté 10 fois aléatoirement durant le test. Un intervalle de 20 sec sépare 2 stimuli. Avec 11 types de stimuli présentés 10 fois, une session dure environ 45 min.

Impact sur les animaux

Ce projet comprend une implantationd'une puce d'identification par radiofréquence en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse, une douleur locale post-opératoire peut apparaitre au niveau du site d'implantation. Pour le test d'altérations des capacités de filtrage de l’information, l’animal est placé dans un cylindre fermé.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de réaliser des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude comportementale sera complémentaire d'études in vitro sur des cellules de patients BBSOA porteurs des différentes mutations. Ceci permettra de décrypter les anomalies cellulaires et moléculaires à la base du trouble du développement BBSOA. Néanmoins, la présence d’anomalies comportementales des patients ne pourra pas être reproduite in vitro et nécessite donc l’utilisation d’animaux pour mieux comprendre l’impact/ le lien des mutations sur le phénotype neurodéveloppementale.

Réduction

Dans un souci de réduction, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Nous utilisons une stratégie de croisement qui permet d'utiliser tous les animaux générés, et les mêmes animaux seront utilisés dans les différents tests comportementaux. Nos études antérieures nous montrent qu’un nombre minimal de 12 animaux par groupe est nécessaire pour obtenir une réponse significative. Enfin, pour réduire le nombre d’animaux seulement 2 groupes contrôles seront utilisés pour 3 groupes expérimentaux présentant des mutations.

Raffinement

Afin de réduire l'inconfort des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test, afin de réduire le stress auquel seront exposés les animaux. Des phases de récupérations entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Ils subiront la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie et avec une couverture antalgique suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les implantations pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Un antiseptique local par spray pourra être administré si besoin. De la même manière lors de l'Electromyographie et de la Tomographie par Cohérence Optique une anesthésie sera faite pour éviter tout stress. Les animaux seront injectés en sous-cutané avec un antagoniste de l'anesthésique après les tests et placés sur une couverture chauffante (37°C) jusqu’à leur réveil. Les animaux seront ensuite replacés dans leur cage d’hébergement et surveillés quotidiennement.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris en raison de ses similarités génétiques avec l'Homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Grâce aux progrès des technologies de manipulation génétique, il est aujourd’hui possible d’introduire des mutations génétiques chez la souris et modéliser donc une maladie génétique humaine chez la souris. Les manipulations génétiques nous permettent de simuler in vivo des altérations de l’expression de gènes ou de la physiologie cellulaire, caractéristiques de pathologies humaines. La génération et l’analyse de ces modèles pourront nous être utiles dans la compréhension des mécanismes à la base de la maladie génétique et au développement de nouvelles thérapies. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes et âgés de 6 à 9 semaines. Cet âge a été choisi car le développement du cortex est terminé, mais ce dernier est encore plastique. De plus les systèmes visuels et auditifs sont aussi matures.

128 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent l'implantation intratissulaire d'un dispositif de mesure sous anesthésie puis deux heures d'acquisitions IRM, et 76 d'entre eux subissent en plus l'induction d'un gliome, pour développer des micro-antennes d'imagerie. Le porteur reconnaît des risques de saignement, d'hémorragie et de troubles neurologiques liés à la tumeur intracérébrale. Il indique valider en amont in vitro et in silico, et présente le rat comme le modèle courant des plateformes d'imagerie précliniques.

Objectifs

Les objectifs du projet de recherche portent sur le développement et la validation de nouveaux dispositifs pour l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et à la spectroscopie par résonance magnétique (SRM). Ces dispositifs permettront de détecter et d’analyser de façon plus précoce, plus précise et plus sensible l’apparition et le développement de tumeurs. Ils permettront également de mieux évaluer la réponse des tumeurs aux traitements anti-tumoraux appliqués.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de la réalisation de ce projet sont la validation de nouveaux dispositifs d’analyse IRM et SRM utilisables pour améliorer la compréhension in vivo de processus physiologiques et pathologiques (dans le cas présent, un modèle de gliome) mais également pour évaluer plus finement et précocement l’effet de thérapies ciblants ces pathologies.

Procédures

Les animaux (128), seront soumis à l’implantation intratissulaire d’un dispositif de mesures pour l’IRM. La procédure d’implantation, d’une durée d’environ 30 minutes, sera réalisée sous anesthésie générale. A la suite de de cette implantation, des acquisitions IRM seront réalisées sur les animaux sous anesthésie générale pendant deux heures. Une partie de ces animaux (76) sera soumise également à l’induction de tumeurs (modèle de gliome) réalisée sous anesthésie générale pour une durée d’environ 30 minutes. Le développement de la tumeur se fera sur une période d’environ 10 jours avant l’implantation intratissulaire d’un dispositif de mesures IRM et l’acquisition IRM comme décrit plus haut.

Impact sur les animaux

Pour les animaux utilisés pour la procédure 1, les effets indésirables et nuisances attendus et possibles sont les suivants. La pose de la canule présente un risque de saignement avec des effets indésirables de douleur post-opératoire et de stress lié à la présence de la canule sur le crâne de l’animal. L’introduction de la micro-antenne présente un risque d’hémorragie. Pour les animaux de la procédure 2, sur lesquels l’induction de la tumeur est réalisée, les nuisances et effets indésirables attendus et possibles sont les suivants. L’implantation des cellules tumorales présente un risque d’effet indésirable liés à la douleur post-opératoire. La croissance tumorale intracérébrale peut être cause de troubles neurologiques pour l’animal. La pose de la canule présente un risque de saignement avec des effets indésirables de douleur post-opératoire et de stress lié à la présence de la canule sur le crâne de l’animal. L’introduction de la micro-antenne présente un risque d’hémorragie. Durant la réalisation des gestes, pour l’ensemble des animaux, existent également des risques de déshydratation et de sécheresse oculaire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure. La procédure subie par les animaux ne permettant pas de les maintenir en vie.

Remplacement

En ce qui concerne l’exigence de remplacement, la validation amont des protocoles de recherche sera réalisée dans la mesure du possible in vitro sur des solutions contenant des métabolites à des concentrations similaires à celles rencontrées in vivo ainsi que dans des fruits (raisins, kiwi, ...) et des gels d’agarose. Les antennes miniaturisées RF ont également été caractérisées in silico à l’aide de logiciel de simulation RF. L’ensemble de ces validations en amont permet de réduire le nombre d’animaux qui seront utilisés dans le projet et de s’assurer autant que possible de la pertinence de l’approche avant sa validation in vivo.

Réduction

En ce qui concerne l’exigence de réduction, la spectroscopie et l’imagerie par résonance magnétique (SRM et IRM) sont des techniques qui permettent de suivre longitudinalement l’évolution d’une pathologie ou les bénéfices d’une thérapie. De plus chaque animal peut être son propre témoin. Ceci permet de réduire fortement le nombre d’animaux nécessaire pour distinguer de façon statistiquement significative deux populations.

Raffinement

Le raffinement des conditions d’hébergement comprend l’installation dans les cages de cachettes, coton, frisures pour nidification en lanières de peuplier ou papier craft afin d’introduire de la nouveauté et briquette à ronger. L’hébergement se fait en groupe (3 rats par cage) durant la période d’acclimatation. Procédure 1 : L’état des animaux et leur niveau de souffrance seront évalués au niveau comportemental (posture anormale, isolement, réduction ou augmentation d’activité). L’administration d’analgésique (injection sous-cutanée Buprédine à 0,05 mg/kg) sera répétée dans le cas où l’animal montrerait des signes de souffrance (prostration, comportement, poils hérissés) aboutissant à un score inférieur à la moyenne calculée dans la fiche de suivi de l’animal. Les points limites pouvant entrainer l’arrêt de la procédure et la mise à mort de l’animal sont l’apparition de saignements trop importants au cours de la pose de la canule ou de l’introduction de l’antenne implantable, la perte de la résine et de la canule après le réveil de l’animal.Procédure 2 L’état des animaux et leur niveau de souffrance seront évalués quotidiennement au niveau comportemental (posture anormale, isolement, réduction ou augmentation d’activité). L’administration d’analgésique (injection sous-cutanée Buprédine à 0,05 mg/kg) sera répétée dans le cas où l’animal montrerait des signes de souffrance (prostration, comportement, poils hérissés) aboutissant à un score inférieur à la moyenne obtenue dans la fiche de suivi de l’animal. Les animaux seront pesés 2 ou 3 fois/ semaine jusqu’à la fin de l’étude. L’euthanasie de l’animal sera réalisée en cas de dépassement des points contrôles limites (perte de poids supérieur à 15 % et score obtenu dans la fiche de suivi de l’animal se maintenant à zéro). La taille des tumeurs sera mesurée à intervalle régulier (quelques jours) de façon non invasive par IRM. Une taille de tumeur supérieure à 5 mm sera considérée comme un point limite entrainant l’euthanasie de l’animal. Les autres points limites pouvant entrainer l’arrêt de la procédure et la mise à mort de l’animal sont l’apparition de saignements trop importants au cours de la pose de la canule ou de l’introduction de l’antenne implantable, la perte de la résine et de la canule après le réveil de l’animal.

Choix des espèces

Les rats sont les modèles animaux largement utilisés sur les plateformes d’imagerie IRM dites pré-cliniques. L’instrumentation et les protocoles sont spécifiques à cette espèce animale. Le rat type Wistar sera utilisé dans ce projet. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (entre 3 et 6 mois) afin de faciliter les procédures de chirurgie (pose de canule, implantation des antennes RF et croissance des tumeurs).

1 499 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à trois craniotomies sous anesthésie, avec injection de vecteurs viraux ou implantation, une restriction alimentaire et des tests comportementaux, pour visualiser et moduler les circuits de la mémoire. Le porteur qualifie la chirurgie de douloureuse et limite la perte de poids à 10 %. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne modélise la mémoire et renvoie les thérapies contre Alzheimer ou le stress post-traumatique au long terme.

Objectifs

L'étude de la mémoire et de ses bases neuronales est essentielle pour comprendre ses mécanismes et pouvoir, à partir de ces analyses, traiter les troubles qui y sont liés, comme la maladie d'Alzheimer, le syndrome de stress post- traumatique et d'autres types d'amnésie. Dans ce projet, nous proposons d'utiliser un modèle animal pour étudier comment la mémoire est stockée et rappelée à court et long terme. Cela nous permettra de comprendre les modalités d’activation des régions impliquées, et, en visualisant et en modifiant leur activité, de comprendre dans quelle mesure ces régions influencent le maintien de souvenirs spécifiques. En particulier, nous utiliserons une tâche de conditionnement classique pour former et étudier des souvenirs émotionnels, positifs et négatifs. Par ce projet, nous souhaitons répondre à quatre questions principales : quels sont les changements d'activité observés au niveau des cellules individuelles (1) ou du cerveau entier (2) lorsqu'un animal apprend et se souvient d'un événement passé ? La manipulation artificielle de ces régions identifiées peut-elle influencer le comportement de l'animal (3) et l'activité des régions cérébrales qui leur sont liées (4) ?

Bénéfices attendus

Le modèle souris est un excellent modèle translationnel, qui nous permet d’étudier la complexité des fonctions cognitives telles que la mémoire. Il nous permet, grâce à des techniques invasives, de tester par la manipulation et la visualisation in vivo les dynamiques neuronales qui sous-tendent la formation et le rappel de la mémoire, et ce à différentes échelles. A court terme, le projet permettra d’élucider le fonctionnement de la formation et du rappel des souvenirs à court et long termes, chez la souris mais également de façon translationnelle chez l’Humain. A plus long terme, ces connaissances pourront conduire à la découverte et au développement de thérapies plus ciblées et efficaces pour lutter contre divers troubles de la mémoire, et donc avoir un impact clinique concret. Nous utilisons le modèle souris en particulier car la reproduction est rapide et mène à un grand nombre d’animaux dans chaque portée, ce qui facilite l’obtention rapide de résultats statistiquement significatifs. Par ailleurs, l’ensemble de l’équipe est formé sur ce modèle, ce qui permet la réduction maximale du nombre d’animaux utilisés, et la littérature sur la mémoire est très riche pour cette espèce (par comparaison, par exemple, au modèle rat).

Procédures

Au cours de chaque phase de ce projet, les animaux peuvent passer par : - Un régime alimentaire de maximum 5 jours (et de maximum 2 fois par animal, à plusieurs semaines d'intervalle) pendant lequel l'animal reçoit une quantité restreinte de nourriture. Chaque jour, les animaux sont surveillés et si leur poids diminue trop, les quantités de nourriture mises à disposition sont modifiées en conséquence ; - Des tests comportementaux pour étudier leur mémoire et leur niveau de stress. Ces tests sont très courts et durent entre 5 et 10 minutes. - Des opérations chirurgicales sous anesthésie générale qui durent entre 30 et 50 minutes. Si un animal subit plusieurs interventions chirurgicales (dans tous les cas, 3 au maximum par animal), celles-ci sont espacées d'au moins 1 semaine. - Dans certains cas spécifiques, les animaux seront maintenus en isolement depuis l'intervention chirurgicale jusqu'à la fin des expériences comportementales, qui dureront au maximum deux mois à compter de la date de l'opération.

Impact sur les animaux

Pour ces études, la technologie de pointe utilisée nécessite des procédures d'implantation invasives à l'intérieur du cerveau de l'animal. Les animaux subiront donc une ou deux craniotomies, suivies d’une injection d’un vecteur viral ou d’une implantation. Cette procédure, douloureuse, sera donc effectuée sous anesthésie générale et durera un peu moins d’une heure. Les implants n'affectent toutefois pas le comportement normal et le bien-être de l'animal une fois implantés. Certains animaux devront subir une privation de nourriture partielle, procédure indispensable à leur motivation pour certaines tâches comportementales. La quantité de nourriture qu'ils ingèrent chaque jour sera limitée, mais de manière à ne pas dépasser une perte supérieure à 10% de leur poids normal afin d’éviter tout stress superflu ou malnutrition, ce qui serait non seulement préjudiciable à l'animal mais aussi contre-productif pour nos expériences, qui exigent que l'animal soit en parfaite santé et non stressé ou même malade, car cela fausserait les résultats de nos recherches. Pour les expériences employant l’électrophysiologie, la fragilité des implants ne permet pas de replacer les souris dans la même cage que leurs congénères, et ceci cause un stress émotionnel modéré à fort. Néanmoins, cela permet de réduire le nombre d’animaux utilisé, en réduisant au maximum les risques que l’implant ne tienne pas dans la durée. Par ailleurs, cet isolement n’est pas le cas pour tous les autres implants utilisés. Par ailleurs, ce projet étudiant les souvenirs émotionnels, certains animaux devront subir un conditionnement aversif, induisant une douleur moyenne brève, ainsi qu’un stress passager d’intensité modérée.

Devenir

Tous les animaux subiront l’euthanasie. Celle-ci interviendra alors que l’animal sera profondément anesthésié. Ceci est absolument nécessaire pour les études histologiques et immunohistochimiques.

Remplacement

Du fait des approches intégratives de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants reste incontournable. En effet, à l’heure actuelle, il n'existe pas de méthodes substitutives in vitro, ex vivo ou in silico pour obtenir des données sur ces processus cognitifs, bien trop complexes pour envisager toute simulation informatique. Par ailleurs, de par la nature de nos expérimentations (chirurgie, conditionnement aversif, analyse par immunohistochimie), il nous est impossible d’employer directement des sujets humains. Le modèle souris se révèle alors être idéal du fait de la proximité fonctionnelle entre son système nerveux central et celui de l’humain quant à ses capacités à créer des souvenirs émotionnels simples (auxquels nous nous intéressons, type conditionnement pavlovien) et de sa petite taille. Ceci explique également l’impossibilité d’utiliser des modèles animaux invertébrés, trop éloignés de l’humain pour raisonnablement étudier une réponse émotionnelle à un souvenir ainsi que trop éloignés dans la configuration du système nerveux central, critique à notre étude inter-régions.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au nombre minimal permettant de faire des études statistiquement significatives, nombre choisi sur la base d'expériences présentées dans des articles montrant des analyses similaires. Nous utilisons également les tissus après les expériences, maximisant ainsi l’utilisation de chaque animal.

Raffinement

Afin d’améliorer les conditions de vie des animaux, réduire la douleur, le stress et l’anxiété causés lors des différentes procédures, un certain nombre de mesures sont mises en place : - Les cages seront enrichies d’un tube en carton qui permettra de manipuler les souris sans les soulever par la queue. - Les animaux seront habitués plusieurs jours avant les expériences aux branchements et débranchements de leurs implants afin de réduire leur stress. - Nous avons amélioré la technique d’implantation des optrodes et des plaques de base du miniscope afin de ne plus avoir à isoler les animaux après implantation. - En plus de l’utilisation d'anesthésiques adaptés et d’anti-inflammatoire, nous appliquons également un anesthésique local ainsi qu’un analgésique lors de la chirurgie et après la chirurgie en cas de signes de douleurs.

Choix des espèces

Les comportements que nous souhaitons étudier sont trop complexes pour justifier de l’utilisation d’espèces non-mammifères (drosophile, poisson-zèbre, etc.). De même, les méthodes in silico et in vitro ne sont pas assez développées pour modéliser ni la mémoire, ni le fonctionnement du cerveau à si grande échelle. Par ailleurs, eu égard au nombre d’animaux requis, les rongeurs (et plus particulièrement les souris) s’imposent de par la facilité et la stabilité de leur élevage. La souris a également été préférée au rat pour deux principales raisons: - La littérature relative à la mémoire, incluant tous nos précédents travaux, est bien plus riche chez la souris que chez le rat. - Notre équipe est déjà formée sur la souris, notamment pour la réalisation des chirurgies. Ne pas changer de modèle nous permettra de conserver ce savoir-faire, et ainsi de ne pas sacrifier d’animaux supplémentaires pour adapter les chirurgies à un nouveau modèle animal. Les souris étudiées seront adultes (plus de 7 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.

3 chats vont être utilisés, gardés vivants et réutilisés dans un autre projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent, sous anesthésie générale de deux heures trente, l'implantation d'électrodes cérébrales, un transport vers un établissement partenaire et des administrations orales d'une molécule, pour tester un antagoniste du récepteur H2 de l'histamine sur le sommeil. Le porteur reconnaît une douleur post-opératoire d'environ trois jours et le stress du transport. Il présente le chat comme un modèle de référence du sommeil transposable à l'être humain et affirme que seul l'animal "entier" reproduit l'alternance veille-sommeil.

Objectifs

L'être humain est soumis à l'alternance du cycle veille-sommeil. L'éveil est un état permettant la réalisation d'activités vitales et cognitives. Durant l’éveil le cerveau reçoit des informations internes et externes et les analyse pour y répondre de manière adaptée. Inversement le sommeil lent est un état comportemental de repos, permettant à l'organisme d'assurer la récupération physique et fonctionnelle dans des conditions de dépense énergétique minimale. Notre équipe s’intéresse depuis de nombreuses années à l’histamine qui est l’un des neurotransmetteurs majeurs de l’éveil. Les neurones à histamine sont localisés dans une région située sous l’hypothalamus postérieur et émettent des prolongements dans l’ensemble du cerveau. Il existe plusieurs récepteurs à l’histamine, dénommés H1, H2 et H3. Suivant le type de récepteur et sa localisation, l’histamine libérée au cours de l’éveil va avoir des effets activateurs sur ses récepteurs cibles ou inhibiteurs sur ses récepteurs d’autorégulation. Afin de mieux comprendre les mécanismes de déclenchement et de maintien de l’éveil il est important d’identifier précisément l’action de l’histamine sur ces différents récepteurs. Ceci est rendu possible par l’utilisation d‘antagonistes c’est-à-dire des molécules qui vont bloquer sélectivement l’un de ces récepteurs. A l’inverse des récepteurs H1 et H3 dont le rôle sur le sommeil est bien démontré, celui des récepteurs H2 reste peu connu. Dans le cadre d’une autorisation précédente, nous avons obtenu une amélioration du sommeil lent à l’aide d’une nouvelle molécule ciblant spécifiquement ce type de récepteurs, l’effet restant néanmoins à être confirmé statistiquement en raison d’un petit échantillon (n=3). L'objectif de cette étude consiste à finaliser la caractérisation de l’effet de ce nouvel antagoniste H2 sur les états de vigilance et sur l’électroencéphalogramme (EEG) en réalisant des expériences complémentaires sur un nombre réduit d'animaux afin de compléter et confirmer nos premiers résultats.

Bénéfices attendus

Les retombées potentielles de cette étude sont non seulement d’ordre scientifique sur l’animal-modèle (connaissances des mécanismes neuronaux de l’éveil et du sommeil, du rôle des récepteurs centraux H2 de l’histamine) mais aussi transposables à l’Homme et notamment en situation clinique. Les résultats de l’étude pharmacologique vont nous permettre de finaliser la caractérisation du nouvel antagoniste H2 et de ses effets sur les états d’éveil et de sommeil, sur le plan comportemental et de la qualité du sommeil. Ces résultats permettront également de conforter le potentiel translationnel de l’étude. En effet, ce nouvel antagoniste du récepteur H2 a récemment obtenu un statut « cliniquement approprié » après une série de tests réglementaires montrant son innocuité aigue et chronique chez l'animal. Cette étude de preuve de concept chez le chat constitue donc une étape cruciale pour la conception d’une nouvelle thérapie capable d’améliorer le sommeil affecté par les différents types de stress rencontrés dans la vie au cours de l’éveil.

Procédures

L’étude comporte une analyse quantitative et qualitative du sommeil grâce à des enregistrements par électrodes (électroencéphalogramme (EEG), électromyogramme (EMG)) ainsi que des administrations par voie orale de la molécule d’intérêt testée à trois doses contre placebo. La procédure implique pour les animaux les étapes suivantes - une acclimatation d’une durée minimale de deux semaines dans notre établissement - un transport (aller et retour) dans un établissement partenaire d’une durée de 35 minutes - une intervention chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée maximale de deux heures trente visant à implanter les électrodes. - une période post-opératoire de 24h à 48h dans l’établissement partenaire suivie d’une convalescence de deux semaines avec évaluation de la douleur et soins appropriés incluant des injections répétées (2 à 3) d’antalgique sous la peau (1 minute). - des sessions d’enregistrement du sommeil au nombre de 24 (8 enregistrements de référence et 16 enregistrements avec administration orale de la molécule d’intérêt ou du placebo). Les sessions durent chacune 6h et sont séparées d’au moins trois jours pour permettre l’élimination de la molécule. Lors des sessions, l’animal est placé seul dans une pièce expérimentale de 4m^2 équipée comme la salle d’hébergement, avec enrichissement. Il est privé de ses congénères dont la présence et les interactions pourraient affecter la qualité de son sommeil, puis les retrouvent à la fin des sessions. Chaque session débute avec une courte immobilisation de l’animal (30 secondes) pour placer l’émetteur sans fil et introduire la gélule contenant le composé testé par voie orale. Pour un animal donné, l’expérience dure au total onze semaines.

Impact sur les animaux

Lors du transport aller-retour dans l’établissement partenaire, l’animal est susceptible d’éprouver un stress, de l’angoisse passagère et un mal des transports Les animaux subissent une intervention chirurgicale au cours de laquelle un dispositif est implanté pour capter les signaux cérébraux. Cette intervention va être à l’origine d’une douleur post-opératoire susceptible de se prolonger plusieurs jours et de se traduire par une modification de l’état général et du comportement ainsi qu’une réaction au toucher de la zone opérée. Ces douleurs pourront durer plus ou moins longtemps selon l’animal, mais leur durée moyenne est estimée à trois jours environ et font l’objet d’une prise en charge par des injections de médicaments antidouleurs ; ces injections entraineront une douleur transitoire au niveau de la peau du site d’injection et pourront être répétées plusieurs fois. Malgré leur taille réduite, les électrodes d’enregistrement peuvent générer des microlésions cérébrales, un œdème (gonflement) ou un hématome (saignement). Il existe également un léger risque d’infection au niveau de l’implant. Lors des sessions l’animal est placé seul dans une pièce expérimentale, il est momentanément privé de ses congénères et est susceptible d’éprouver un stress lié à l’isolement ou à la nouveauté de la situation. Les sessions débutent avec la pose d’un petit émetteur sans fil sur l’implant et l’administration orale de la gélule contenant le placebo ou la dose du composé testé. Ceci nécessite une contention de l’animal créant un inconfort momentané qui peut se traduire par une réaction de fuite ou de défense s’il n’est pas habitué. Il n’est pas attendu d’effet indésirable avec la molécule testée.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie. Les animaux implantés seront réutilisés dans un autre projet car l'implantation est pérenne dans le temps et les enregistrements sont possibles pendant plusieurs mois. Les animaux non implantés qui n’auront pas été inclus dans l’étude seront proposés à l’adoption par le biais d'une association. La décision est prise en concertation par le responsable du projet et le vétérinaire désigné.

Remplacement

Cette étude fait suite à des travaux préalables in vitro qui ont montré l’implication du récepteur H2 de l’histamine dans l’excitabilité et l’activité neuronale. Elle a pour objet la caractérisation des effets d’un nouvel antagoniste des récepteurs H2 sur les états de vigilance et l’électroencéphalogramme (EEG) ce qui intègre une réponse physiologique et comportementale complexe qui ne peut être obtenue que chez l’animal entier. Il n’existe pas à ce jour de modèle de sommeil in silico ou ex-vivo capable de reproduire les mécanismes neuronaux complexes qui sous-tendent l’alternance des états d’éveil et de sommeil. Les mammifères sont les seuls animaux possédant un cycle veille/sommeil comparable à celui de l’homme.

Réduction

Notre plan d’expérience est conçu pour collecter le maximum de données sur un nombre réduit d’animaux, grâce à des mesures répétées sur un même animal (3 répétitions) et au recueil simultané de données à la fois quantitatives et qualitatives sur le sommeil. Le nombre d’animaux est ainsi réduit au minimum sur la base d’expériences préliminaires et du nombre d’essais complémentaires à réaliser pour obtenir des résultats exploitables et valides d’un point de vue statistique. En outre, l’étude sera menée de façon séquentielle avec un premier animal dont nous analyserons les données avant d’envisager l’ajout d’un second animal ou d’un troisième, uniquement si cela s’avère nécessaire. Les résultats obtenus feront l’objet de tests statistiques pour mesures répétées qui figurent parmi les plus fiables et les plus robustes. L’étude donnera lieu à une publication scientifique ; les enregistrements de sommeil pourront faire l’objet d’un partage avec la communauté scientifique grâce aux plateformes de données ouvertes. La réutilisation par d’autres scientifiques de ces données rares permettra de limiter le recours à de nouveaux animaux.

Raffinement

Les conditions d'hébergement, de soins et les méthodes mises en œuvre dans ce projet ont été définies en collaboration avec des vétérinaires spécialistes et la structure chargée du bien-être animal de façon à réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables : Une période d’acclimatation minimale de deux semaines est prévue, ainsi que des délais de récupération après le transport et l’intervention chirurgicale. L’implantation chirurgicale d’électrodes est réalisée sous anesthésie générale profonde avec analgésie peropératoire dans un établissement vétérinaire offrant des conditions optimales de réalisation ; la prise en charge postopératoire repose sur un protocole de soins post-opératoires qui inclut une évaluation de la douleur, des injections de puissants antalgiques et prévoit des points limites adaptés. Des visites quotidiennes assurent une familiarisation de chaque animal avec l’expérimentateur et les zootechniciens ainsi que le suivi individuel du bien-être au moyen de grilles de score. Notre expérience montre que des visites et manipulations régulières avec chaque individu atténue l’expression de comportement de fuite ou d’agression et les signes de stress. De façon importante, les animaux implantés cohabitent en parfaite harmonie avec des individus non implantés. Les administrations du composé ou du placebo se font par voie orale en gélule et non au moyen d’injections. L’animal est brièvement tenu à la main par l’expérimentateur pour introduire la gélule, il ne subit dont pas l’inconfort et la douleur d’une piqûre. Les enregistrements d’éveil et de sommeil sont limités à 6 heures et sont réalisés à l’aide d’un système sans fil ce qui permet à l’animal d’être complétement libre de ses mouvements. Les sessions se déroulent après une habituation dans une volière séparée et enrichie comme la volière d’hébergement. Un temps de repos est ménagé entre chacune des sessions pendant lequel l’animal est replacé en hébergement commun avec ses congénères.

Choix des espèces

Le chat est un modèle animal de référence pour le sommeil et les théories contemporaines sur l’alternance veille-sommeil. Par rapport aux petits mammifères comme les rongeurs, il a un cerveau de plus grande taille et un électroencéphalogramme dont les caractéristiques sont très proches de celui de l’Homme ; il a de plus une plus grande propension à dormir (environ 70% du temps contre 50% pour les rongeurs) et son sommeil comprend des stades similaires à ceux de l’homme, avec des de sommeil lent et l’activité pontogéniculooccipitale (absente chez le rongeur). Le chat est aussi l’espèce qui nous a permis d’identifier le modafinil et plus récemment, une thérapie histaminergique basée sur le récepteur H3 et utilisée depuis 2016 en Europe et 2019 aux USA pour améliorer l’éveil des patients narcoleptiques et hypersomniaques. Dans la continuité de nos recherches, cette espèce modèle devrait nous permettre d’explorer une nouvelle piste thérapeutique utilisant un ligand H2 en vue d’améliorer le sommeil notamment dans le cadre des troubles du sommeil lié au stress. Chats adultes d'un poids compris entre 3,0 et 5,0kg. Les paramètres étudiés dans cette étude nécessitent des animaux ayant atteint une maturité cérébrale, ainsi qu’une stabilité de l’architecture globale du cycle veille-sommeil, par opposition à des animaux jeunes ou sénescents. Le stade adulte garantit l’implantation reproductible des électrodes aux coordonnées stéréotaxiques prédéfinies.

24 chats vont être utilisés, gardés vivants et susceptibles d'être réutilisés dans un autre projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent deux administrations orales d'un comprimé puis douze prélèvements de sang, et sont hébergés seuls pendant 24 heures, pour comparer la pharmacocinétique de deux produits. Le porteur reconnaît des douleurs aux sites de prélèvement, à la veine jugulaire, et le stress de l'isolement. Il indique que l'objet est de mettre sur le marché un anti-inflammatoire vétérinaire équivalent à un produit existant et juge l'animal "entier" "indispensable".

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de deux produits tests différents. Il s'agit de comparer les paramètres pharmacocinétiques du produit référent avec ceux du produit testé pour voir s'ils sont bioéquivalents. Les produits testés seront sous forme de comprimés et administrés par voie orale.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir démontrer que les paramètres pharmacocinétiques de l'élément test sont équivalents à ceux de l'élément référent. L'intêret de ce projet est de pouvoir générer un anti inflammatoire non stéroïdien en administration orale équivalent à celui qui existe déja sur le marché chez le chat.

Procédures

Les animaux auront deux administrations orales, sous forme d'un comprimé, par animal . Temps estimé par administration de l'ordre de la minute. Des prélèvements de sang seront réalisés. Nombre total de prélèvement n=12. Temps estimé par prélèvement: inférieur à la minute. Les animaux seront hébergés de façon individuelle durant 24h maximum. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont des douleurs aux sites de prélèvements ( au niveau des veines jugulaires principalement). Les animaux seront hébergés de façon individuelle durant 24h aprés administration. Cela peut engendrer un stress pour l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure. Les animaux auront une période de repos suffisante et pourront être ré inclus dans un autre projet si besoin.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier.

Réduction

24 animaux seront inclus dans ce projet. Ils seront répartis en 2 groupes de 12 animaux. Chaque groupe recevra chacun des éléments testés sur 2 périodes différentes. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats interprétables.

Raffinement

Les chats seront hébergés par groupe de 2 ou 3 (2 ou 3 males ou 2 ou 3 femelles par box d'hébergement , 8 males et 4 femelles par groupe) mais seront en condition individuelle pendant les 24 premières heures suivant l'administration pour chacune des périodes. Durant cette période les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. De l'enrichissement (exemple: griffoir, coussin) sera présent dans chaque box autant que possible. Lors des prélèvements sanguins, l'analgésie par le froid pourra être faite si necessaire en appliquant un peu de glace dans une compresse au point de prélèvement.

Choix des espèces

Espèce cible pour ce produit vétérinaire Adulte, age supérieur à 1 an. Animaux compris entre 2.5 et 6 Kg. Nécessaire pour avoir des doses comprises entre 1 et 2.4 mg/kg

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie Borrelia, subissent des prélèvements de sang hebdomadaires puis un prélèvement de liquide céphalorachidien avant leur mise à mort, jusqu'à 45 jours après l'infection, pour développer des tests diagnostiques de la maladie de Lyme. Le porteur indique que l'infection peut provoquer une arthrite avec gonflement, douleur et perte de poids. Il affirme que le recours aux animaux est "nécessaire" faute d'échantillons humains suffisants et renvoie les bénéfices pour les patients au long terme.

Objectifs

La Borréliose de Lyme, aussi appelée maladie de Lyme, est due à la transmission d’une bactérie, la Borrelia, lors d’une morsure de tique infectée. Les signes cliniques sont variés et évoluent. En phase précoce, nous observons des lésions cutanées associées à des symptômes non spécifiques. En cas d’absence de diagnostic et de traitement antibiotique, la bactérie peut se disséminer dans le corps entrainant une évolution de la maladie. On parle de phase de dissémination puis de la phase chronique ou persistante, avec l’apparition plusieurs mois voire années après le début de l’infection d’arthrites, de troubles neurologiques, cardiaques ou de manifestations cutanées. Le diagnostic repose majoritairement sur l’observation d’un signe clinique typique, l’érythème migrant (70 à 80% des cas). En son absence le diagnostic est complexe, les signes cliniques sont non spécifiques et les performances des tests biologiques sont insuffisantes. Ces tests sont indirects et souffrent d’un manque de sensibilité, de spécificité et d’une absence de standardisation. Ils reposent exclusivement sur la recherche d’anticorps dirigés contre la bactérie. De plus, au stade précoce de la maladie, les anticorps sont peu ou pas présents et chez certaines personnes infectées on ne retrouve pas d’anticorps dirigés contre Borrelia même à un stade avancé de la maladie. Le diagnostic direct par détection de la bactérie est possible mais difficile car le nombre de bactéries dans le sang ou au lieu de l’infection est très faible et/ou difficilement accessible. Comme souvent en bactériologie, la culture est la technique de référence, mais dans le cas de Borrelia cette approche est longue (2 à 8 semaines) et peu sensible. Il est primordial de diagnostiquer rapidement et avec certitude la maladie pour limiter le risque de développement des symptômes plus invalidants mais également pour éviter l’errance médicale des patients. Il y a une véritable demande pour ces tests comme en témoigne le plan national de lutte contre la maladie de Lyme, lancé en septembre 2016 par la ministre de la santé. Notre objectif est de développer différents tests de diagnostics directs basés sur la détection de protéines de la bactérie. Nous souhaitons récolter des échantillons de fluides biologiques provenant de souris infectées par Borrelia aux différents stades de la maladie afin d’évaluer la capacité des anticorps développés au laboratoire à détecter les antigènes de Borrelia.

Bénéfices attendus

Le développement de nouvelles méthodes de diagnostic directes, plus sensibles, plus rapides et plus fiables de la maladie de Lyme est nécessaire afin de limiter le risque de développer une forme dite chronique ou persistante de la maladie mais également pour éviter les errances médicales de ces patients. A long terme, le développement de ce type de test permettrait une meilleure qualité de vie aux patients et une réduction des coûts de diagnostic, de soins et de prise en charge psychologique.

Procédures

Une injection sous cutanée de bactérie sera réalisée sous anesthésie gazeuse. En tenant compte du délais d’anesthésie, cette intervention dure entre 3 et 5 minutes et aura lieu qu’une seule fois. Une fois par semaine, elles seront soumises à une technique de contention sous anesthésie afin de réaliser des prélèvements de sang (durée d’une minute maximum) à 4 temps différents maximum après infection. Après anesthésie profonde, un prélèvement de LCR (durée de trois minutes environ) sera réalisé une seule fois puis les animaux seront euthanasiés afin de récupérer plusieurs tissus.

Impact sur les animaux

- Stress lors des manipulations diminué grâce à une semaine d’habituation. - 7 jours après l’infection, une arthrite avec gonflement et rougeur des membres peut apparaitre et entrainer une douleur et une diminution de la mobilité. Une perte de poids et déshydratation légères peuvent également être observé. La repousse des poils est plus lente au point d’injection. Durée totale des symptômes entre 5 et 10 jours correspondant à la phase de dissémination de la maladie. Selon la littérature, après un rétablissement, des épisodes d’arthrites peuvent apparaitre au-delà de 28 jours après infection. Les souris seront euthanasiées au maximum 45 jours après infection.

Devenir

Lors des phases tardive et chronique, la peau, le système nerveux central et les articulations sont les tissus préférentiellement ciblés par la bactérie. Tous les animaux utilisés seront euthanasiés afin de prélever et analyser ces différents tissus.

Remplacement

Il existe peu de cohortes d’échantillons humains ou vétérinaires bien caractérisés. Les performances des outils de diagnostic sont très variables entre les laboratoires et la souche infectante et la phase de la maladie ne sont pas toujours identifiés. Lorsqu’ils existent, ces échantillons sont peu nombreux et très précieux, leur accès est difficile. La production des protéines bactériennes n’est pas toujours effective in-vitro et ne reflète pas celle induites lors d’une infection chez un hôte. C’est pourquoi l’utilisation d’animaux de laboratoire est nécessaire. Une étude pilote a déjà été réalisée et a permis de valider le modèle animal et la capacité des 3 souches de Borrelia utilisées dans ce projet à induire une infection persistante.

Réduction

Le but de cette expérimentation est de concevoir une cohorte d’échantillons biologiques pour rechercher la présence des protéines bactériennes et de tester l’efficacité de détection de nos outils immunologiques. Nous avons déterminé que le nombre minimum d’animaux par temps et par souches de Borrelia était de 10 afin d’obtenir un volume suffisant de fluides corporels pour détecter les protéines bactériennes, développer et évaluer les tests diagnostiques. Les performances de ces tests seront évaluées en utilisant un test statistique adéquat pour un faible nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans un milieu enrichi. Une période d’adaptation à leur environnement et d’habituation à la manipulation d’une semaine est respectée. Une surveillance quotidienne des animaux par des personnes habilitées et formées est effectuée. Afin de diminuer le stress et la douleur dus aux expérimentations et prélèvements, les animaux sont anesthésiés et les expérimentations réalisées dans une pièce au calme sans passage. Une grille d’évaluation de la douleur et de l’état de santé de la souris est mise en place et décrit clairement les signes qui, s’ils apparaissaient, conduiraient à une euthanasie de l’animal (points limites). Lors des pics de symptômes, un complément alimentaire (mélange d’aliments et d’eau gélifiés) est disposé dans la cage et un antidouleur peut être administré en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Nous utiliserons des jeunes souris adultes de 4 à 8 semaines, lesquelles sont plus sensibles que les adultes à l’infection par les Borrelia. De nombreuses études dans la littérature sur ce sujet ont déjà utilisé ce modèle murin pour étudier la maladie de Lyme. Les souris infectées avec Borrelia présentent certaines caractéristiques similaires à la maladie de Lyme chez l’homme tout en étant capable de développer une réponse immunitaire complète.

3 chats vont être utilisés, gardés vivants et réutilisés dans un autre projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent, sous anesthésie générale de deux heures trente, l'implantation d'électrodes cérébrales, un transport vers un établissement partenaire et des administrations orales d'une molécule, pour tester un antagoniste du récepteur H2 de l'histamine sur le sommeil. Le porteur reconnaît une douleur post-opératoire d'environ trois jours et le stress lié au transport. Il affirme que seul l'animal "entier" reproduit l'alternance veille-sommeil et présente le chat comme un modèle de référence transposable à l'être humain.

Objectifs

L'être humain est soumis à l'alternance du cycle veille-sommeil. L'éveil est un état permettant la réalisation d'activités vitales et cognitives. Durant l’éveil le cerveau reçoit des informations internes et externes et les analyse pour y répondre de manière adaptée. Inversement le sommeil lent est un état comportemental de repos, permettant à l'organisme d'assurer la récupération physique et fonctionnelle dans des conditions de dépense énergétique minimale. Notre équipe s’intéresse depuis de nombreuses années à l’histamine qui est l’un des neurotransmetteurs majeurs de l’éveil. Les neurones à histamine sont localisés dans une région située sous l’hypothalamus postérieur et émettent des prolongements dans l’ensemble du cerveau. Il existe plusieurs récepteurs à l’histamine, dénommés H1, H2 et H3. Suivant le type de récepteur et sa localisation, l’histamine libérée au cours de l’éveil va avoir des effets activateurs sur ses récepteurs cibles ou inhibiteurs sur ses récepteurs d’autorégulation. Afin de mieux comprendre les mécanismes de déclenchement et de maintien de l’éveil il est important d’identifier précisément l’action de l’histamine sur ces différents récepteurs. Ceci est rendu possible par l’utilisation d‘antagonistes c’est-à-dire des molécules qui vont bloquer sélectivement l’un de ces récepteurs. A l’inverse des récepteurs H1 et H3 dont le rôle sur le sommeil est bien démontré, celui des récepteurs H2 reste peu connu. Dans le cadre d’une autorisation précédente, nous avons obtenu une amélioration du sommeil lent à l’aide d’une nouvelle molécule ciblant spécifiquement ce type de récepteurs, l’effet restant néanmoins à être confirmé statistiquement en raison d’un petit échantillon (n=3). L'objectif de cette étude consiste à finaliser la caractérisation de l’effet de ce nouvel antagoniste H2 sur les états de vigilance et sur l’électroencéphalogramme (EEG) en réalisant des expériences complémentaires sur un nombre réduit d'animaux afin de compléter et confirmer nos premiers résultats.

Bénéfices attendus

Les retombées potentielles de cette étude sont non seulement d’ordre scientifique sur l’animal-modèle (connaissances des mécanismes neuronaux de l’éveil et du sommeil, du rôle des récepteurs centraux H2 de l’histamine) mais aussi transposables à l’Homme et notamment en situation clinique. Les résultats de l’étude pharmacologique vont nous permettre de finaliser la caractérisation du nouvel antagoniste H2 et de ses effets sur les états d’éveil et de sommeil, sur le plan comportemental et de la qualité du sommeil. Ces résultats permettront également de conforter le potentiel translationnel de l’étude. En effet, ce nouvel antagoniste du récepteur H2 a récemment obtenu un statut « cliniquement approprié » après une série de tests réglementaires montrant son innocuité aigue et chronique chez l'animal. Cette étude de preuve de concept chez le chat constitue donc une étape cruciale pour la conception d’une nouvelle thérapie capable d’améliorer le sommeil affecté par les différents types de stress rencontrés dans la vie au cours de l’éveil.

Procédures

L’étude comporte une analyse quantitative et qualitative du sommeil grâce à des enregistrements par électrodes (électroencéphalogramme (EEG), électromyogramme (EMG)) ainsi que des administrations par voie orale de la molécule d’intérêt testée à trois doses contre placebo. La procédure implique pour les animaux les étapes suivantes - une acclimatation d’une durée minimale de deux semaines dans notre établissement - un transport (aller et retour) dans un établissement partenaire d’une durée de 35 minutes - une intervention chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée maximale de deux heures trente visant à implanter les électrodes. - une période post-opératoire de 24h à 48h dans l’établissement partenaire suivie d’une convalescence de deux semaines avec évaluation de la douleur et soins appropriés incluant des injections répétées (2 à 3) d’antalgique sous la peau (1 minute). - des sessions d’enregistrement du sommeil au nombre de 24 (8 enregistrements de référence et 16 enregistrements avec administration orale de la molécule d’intérêt ou du placebo). Les sessions durent chacune 6h et sont séparées d’au moins trois jours pour permettre l’élimination de la molécule. Lors des sessions, l’animal est placé seul dans une pièce expérimentale de 4m^2 équipée comme la salle d’hébergement, avec enrichissement. Il est privé de ses congénères dont la présence et les interactions pourraient affecter la qualité de son sommeil, puis les retrouvent à la fin des sessions. Chaque session débute avec une courte immobilisation de l’animal (30 secondes) pour placer l’émetteur sans fil et introduire la gélule contenant le composé testé par voie orale. Pour un animal donné, l’expérience dure au total onze semaines.

Impact sur les animaux

Lors du transport aller-retour dans l’établissement partenaire, l’animal est susceptible d’éprouver un stress, de l’angoisse passagère et un mal des transports Les animaux subissent une intervention chirurgicale au cours de laquelle un dispositif est implanté pour capter les signaux cérébraux. Cette intervention va être à l’origine d’une douleur post-opératoire susceptible de se prolonger plusieurs jours et de se traduire par une modification de l’état général et du comportement ainsi qu’une réaction au toucher de la zone opérée. Ces douleurs pourront durer plus ou moins longtemps selon l’animal, mais leur durée moyenne est estimée à trois jours environ et font l’objet d’une prise en charge par des injections de médicaments antidouleurs ; ces injections entraineront une douleur transitoire au niveau de la peau du site d’injection et pourront être répétées plusieurs fois. Malgré leur taille réduite, les électrodes d’enregistrement peuvent générer des microlésions cérébrales, un œdème (gonflement) ou un hématome (saignement). Il existe également un léger risque d’infection au niveau de l’implant. Lors des sessions l’animal est placé seul dans une pièce expérimentale, il est momentanément privé de ses congénères et est susceptible d’éprouver un stress lié à l’isolement ou à la nouveauté de la situation. Les sessions débutent avec la pose d’un petit émetteur sans fil sur l’implant et l’administration orale de la gélule contenant le placebo ou la dose du composé testé. Ceci nécessite une contention de l’animal créant un inconfort momentané qui peut se traduire par une réaction de fuite ou de défense s’il n’est pas habitué. Il n’est pas attendu d’effet indésirable avec la molécule testée.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie. Les animaux implantés seront réutilisés dans un autre projet car l'implantation est pérenne dans le temps et les enregistrements sont possibles pendant plusieurs mois. Les animaux non implantés qui n’auront pas été inclus dans l’étude seront proposés à l’adoption par le biais d'une association. La décision est prise en concertation par le responsable du projet et le vétérinaire désigné.

Remplacement

Cette étude fait suite à des travaux préalables in vitro qui ont montré l’implication du récepteur H2 de l’histamine dans l’excitabilité et l’activité neuronale. Elle a pour objet la caractérisation des effets d’un nouvel antagoniste des récepteurs H2 sur les états de vigilance et l’électroencéphalogramme (EEG) ce qui intègre une réponse physiologique et comportementale complexe qui ne peut être obtenue que chez l’animal entier. Il n’existe pas à ce jour de modèle de sommeil in silico ou ex-vivo capable de reproduire les mécanismes neuronaux complexes qui sous-tendent l’alternance des états d’éveil et de sommeil. Les mammifères sont les seuls animaux possédant un cycle veille/sommeil comparable à celui de l’homme.

Réduction

Notre plan d’expérience est conçu pour collecter le maximum de données sur un nombre réduit d’animaux, grâce à des mesures répétées sur un même animal (3 répétitions) et au recueil simultané de données à la fois quantitatives et qualitatives sur le sommeil. Le nombre d’animaux est ainsi réduit au minimum sur la base d’expériences préliminaires et du nombre d’essais complémentaires à réaliser pour obtenir des résultats exploitables et valides d’un point de vue statistique. En outre, l’étude sera menée de façon séquentielle avec un premier animal dont nous analyserons les données avant d’envisager l’ajout d’un second animal ou d’un troisième, uniquement si cela s’avère nécessaire. Les résultats obtenus feront l’objet de tests statistiques pour mesures répétées qui figurent parmi les plus fiables et les plus robustes. L’étude donnera lieu à une publication scientifique ; les enregistrements de sommeil pourront faire l’objet d’un partage avec la communauté scientifique grâce aux plateformes de données ouvertes. La réutilisation par d’autres scientifiques de ces données rares permettra de limiter le recours à de nouveaux animaux.

Raffinement

Les conditions d'hébergement, de soins et les méthodes mises en œuvre dans ce projet ont été définies en collaboration avec des vétérinaires spécialistes et la structure chargée du bien-être animal de façon à réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables : Une période d’acclimatation minimale de deux semaines est prévue, ainsi que des délais de récupération après le transport et l’intervention chirurgicale. L’implantation chirurgicale d’électrodes est réalisée sous anesthésie générale profonde avec analgésie peropératoire dans un établissement vétérinaire offrant des conditions optimales de réalisation ; la prise en charge postopératoire repose sur un protocole de soins post-opératoires qui inclut une évaluation de la douleur, des injections de puissants antalgiques et prévoit des points limites adaptés. Des visites quotidiennes assurent une familiarisation de chaque animal avec l’expérimentateur et les zootechniciens ainsi que le suivi individuel du bien-être au moyen de grilles de score. Notre expérience montre que des visites et manipulations régulières avec chaque individu atténue l’expression de comportement de fuite ou d’agression et les signes de stress. De façon importante, les animaux implantés cohabitent en parfaite harmonie avec des individus non implantés. Les administrations du composé ou du placebo se font par voie orale en gélule et non au moyen d’injections. L’animal est brièvement tenu à la main par l’expérimentateur pour introduire la gélule, il ne subit dont pas l’inconfort et la douleur d’une piqûre. Les enregistrements d’éveil et de sommeil sont limités à 6 heures et sont réalisés à l’aide d’un système sans fil ce qui permet à l’animal d’être complétement libre de ses mouvements. Les sessions se déroulent après une habituation dans une volière séparée et enrichie comme la volière d’hébergement. Un temps de repos est ménagé entre chacune des sessions pendant lequel l’animal est replacé en hébergement commun avec ses congénères.

Choix des espèces

Le chat est un modèle animal de référence pour le sommeil et les théories contemporaines sur l’alternance veille-sommeil. Par rapport aux petits mammifères comme les rongeurs, il a un cerveau de plus grande taille et un électroencéphalogramme dont les caractéristiques sont très proches de celui de l’Homme ; il a de plus une plus grande propension à dormir (environ 70% du temps contre 50% pour les rongeurs) et son sommeil comprend des stades similaires à ceux de l’homme, avec des de sommeil lent et l’activité pontogéniculooccipitale (absente chez le rongeur). Le chat est aussi l’espèce qui nous a permis d’identifier le modafinil et plus récemment, une thérapie histaminergique basée sur le récepteur H3 et utilisée depuis 2016 en Europe et 2019 aux USA pour améliorer l’éveil des patients narcoleptiques et hypersomniaques. Dans la continuité de nos recherches, cette espèce modèle devrait nous permettre d’explorer une nouvelle piste thérapeutique utilisant un ligand H2 en vue d’améliorer le sommeil notamment dans le cadre des troubles du sommeil lié au stress. Chats adultes d'un poids compris entre 3,0 et 5,0kg. Les paramètres étudiés dans cette étude nécessitent des animaux ayant atteint une maturité cérébrale, ainsi qu’une stabilité de l’architecture globale du cycle veille-sommeil, par opposition à des animaux jeunes ou sénescents. Le stade adulte garantit l’implantation reproductible des électrodes aux coordonnées stéréotaxiques prédéfinies.