Recherche appliquée

4 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit 25 prélèvements sanguins, cinq chirurgies d'implantation et de retrait et seize ponctions lombaires sous anesthésie, avant sa mise à mort pour des analyses de tissus, dans une étude de faisabilité d'une thérapie contre une leucodystrophie infantile. Le porteur présente ces étapes comme requises par les agences réglementaires avant un essai clinique. Il affirme que l'implantation chez le primate est "indispensable" pour préparer ce dossier.

Objectifs

La leucodystrophie métachromatique (MLD) est une maladie neurodégénérative héréditaire conduisant à une perte de myéline (gaine qui isole la fibre nerveuse) isolation de la gaine nerveuse) qui s’accompagne de signes cliniques très sévères cognitifs et moteurs chez le jeune enfant avec une dégradation très rapide dans les 6 mois suivant les premiers symptômes et un décès des patients dans les deux ans au maximum. De nos jours la majorité des patients atteints de MLD sont diagnostiqués lorsque leurs symptômes sont déjà bien installés (patients symptomatiques). Les traitements actuels, présentent de bons résultats pour les enfants traités en présymptomatique mais restent inefficaces une fois les symptômes présents. L’enjeu pour cette maladie est donc de trouver des traitements pouvant agir sur les patients symptomatiques. Une composante particulière de la MLD est la neuro-inflammation que développent les patients et qui est présente aussi dans le modèle souris de la pathologie. Dans ce contexte, nous proposons de mener le projet de recherche qui a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle thérapie pour le traitement de la pathologie. L’efficacité́ de la thérapie a été évaluée préalablement dans le modèle murin de la pathologie et les résultats préliminaires démontrent des résultats très (approche confidentielle) encourageant. L’objectif ici est de démontrer la faisabilité et la tolérance de notre approche chez le primate non humain (PNH) afin d’évaluer la quantité d’enzyme sécrétée. Le bien-être animal sera surveillé tout au long du projet avec mise en place de critères précis d’interruption.

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle il n’existe aucun traitement pour les patients atteints de leucodystrophie métachromatique (MLD) ayant des symptômes déjà bien installés (patients symptomatiques). Ce projet a pour but d'identifier une nouvelle voie thérapeutique chez les patients déjà symptomatiques pour la MLD.

Procédures

- prelevement sanguin, durée d'environ 5min (25 au total) - une chirurgie d'implantation et de retrait répétée 5 fois par animal d'une durée maximale de 30 min et -16 ponctions lombaires d'une durée de 5min Tous ces actes sont faits sur animaux anesthésiés. Tous ces actes sont fait sous analgésie et l'animal sera euthanasié en fin de procédure pour réaliser les prélèvements

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont: - un risque anesthésique - un risque infectieux/inflammatoire (type rejet) lors de la mise en place des implants - un risque de fuite de LCR lors des prélèvements - la formation d'hématomes lors des prises de sang - un stress lors de la contention pour anesthésie

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux (n=4) sera euthanasié pour permettre les etudes histologiques et de biodistribution composant l'etude preclinique permettant de supporter une étude de Toxicologie et la soumission aux agences reglementaires (FDA et ANSM).

Remplacement

Toutes les études possibles sur des cellules ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des constructions et des implants et la preuve de concept établiet dans le modèle souris de la pathologie. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude de scale-up (efficacité, biodistribution de la protéine d'interet, toxicité, etc) chez le gros animal (PNH). Ces étapes sont requises par l’Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé pour toute demande d’autorisation d’étude clinique

Réduction

4 animaux au total avec plusieurs implantations par animal afin de tester plusieurs conditions et de selectionner la meilleure avant l’euthanasie pour etude de l’efficacité en post mortem. L'etude statistique etant assez limitée en terme de toxicité. La majeure partie des analyses etant une étude histologique par un anatomopathologiste certifié.

Raffinement

Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, les procédures sont réalisées par du personnel formé et experimenté. Enfin, le nombre d'anesthesies est minimisé en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et conforme aux recommandation en terme de Bien être animal validé par le vétérinaire), ponction lombaire) au sein de la meme anesthesie. Les animaux sont hebergés en groupe et recevront un enrichissement adapté. Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthesie, l'utilisation d'analgésique pour les ponctions lombaires pour eviter tout inconfort. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si necessaire. Si un animal ne presentait pas d'amelioration dans le suivi, il sera euthanasié avec avis vétérinaire Enfin, en termes de raffinement nous avons travaillé sur la taille de notre puce à implanter qui est 10 à 15 fois plus petite que celle de notre étude précédente qui avait été utilisée chez la souris

Choix des espèces

La capacité des implants a secréter de manière efficace de la protéine d'interet qui soit mobilisable par les systèmes nerveux centraux et périphériques est dépendante de l’organisme dans lequel on réalise l’implantation. Ainsi à finalité clinique, l’implantation chez le NHPPNH est une étape indispensable en vue de la préparation d’un dossier d’essai clinique. PNH : macaques adultes (1-15 ans) (2 à 10 Kg) ayant un cerveau completement développé

750 esturgeons européens juvéniles vont être utilisés, maintenus vivants puis relâchés en milieu naturel, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issus de reproduction en bassin, ils sont capturés puis opérés sous anesthésie pour l'implantation chirurgicale d'un émetteur acoustique, afin de suivre par télémétrie leurs déplacements en vue d'une réintroduction de l'espèce. Le porteur situe les bénéfices sur le "long terme", pour la faisabilité de cette réintroduction. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative au suivi télémétrique et qu'il est nécessaire de doter chaque individu d'un émetteur.

Objectifs

L'objectif principal de l'étude est de mieux comprendre les fonctionnalités des zones estuariennes et des deltas pour la réintroduction de l'esturgeon européen (Acipenser sturio). Selon les lignes de l'UICN (Union Internationale pour la Conservation de la Nature) pour les translocations de conservation, une analyse de la qualité de l'habitat et de son utilisation par l’espèce est obligatoire avant que la réintroduction ne puisse commencer. Pour étudier les mouvements de juvéniles d'esturgeons européens marqués, un réseau de suivi des esturgeons comprenant 70 récepteurs a été mis en place. Des recherches télémétriques dans ces zones permettront d'observer la distribution, les voies de migration, et d'identifier les zones d'alimentation et de repos des esturgeons juvéniles.

Bénéfices attendus

L'objectif principal de cette étude est de renforcer l'évaluation de la faisabilité d'une future réintroduction de l’esturgeon européen dans un bassin versant. Par ce lâcher expérimental et ce suivi individuel à grande échelle par télémétrie, nous visons à identifier les possibilités et les problèmes potentiels pour les juvéniles d'esturgeons européens.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. L'anesthésie ne durera que quelques minutes. Au préalable les animaux sont soumis à une capture dans des bassins d'élevage.

Impact sur les animaux

Les esturgeons juvéniles seront marqués avec de petits émetteurs acoustiques. Ces émetteurs respectent le ratio de 2% du poids du poisson, n'entrainant aucune perturbation dans le comportement. Au fur et à mesure que le poisson grandit, le poids de ce petit émetteur interne sera de moins en moins perceptible par le poisson. Le comportement des individus une fois remis à l'eau pourra être perturbé par le stress du transport de longue durée, et les changements d'eau. L'impact des captures dans les bassins est minime puisque la capture se fait avec l'aide d'un plongeur professionnel qui va chercher les poissons délicatement. La chirurgie est réalisée par du personnel formé, et est faite sous anesthésie en limitant au maximum le stress des poissons.

Devenir

Tous les animaux marqués seront conservés vivants, et relâchés dans le milieu naturel, tel que prévu dans le cadre du Plan National d'Actions pour la sauvegarde de l'esturgeon européen 2020-2029, et plus spécifiquement son volet en lien avec la coopération internationale.

Remplacement

L'esturgeon européen était autrefois naturellement présent sur le bassin concerné. L'espèce est révélatrice d'un système fluvial amélioré en ce qui concerne la qualité de l'habitat et la migration. En raison de la quasi-absence d'esturgeons européens dans le système étudié, les esturgeons issus de ces lâchers expérimentaux fourniront un aperçu du comportement migratoire local, annuel et saisonnier et des zones d'utilisation de l'habitat par l’espèce. A cette fin, une utilisation spécifique est faite du suivi télémétrique des individus dans ce milieu. Il n'y a pas d'alternative disponible pour cela. Il est nécessaire de doter ces individus d'un émetteur ; il s'agit donc d'une expérimentation animale pour laquelle l’espèce-cible ne peut être remplacée.

Réduction

Le nombre d'animaux à utiliser ne peut pas être déterminé par des modèles ou des méthodes statistiques existants, car l'étude est menée dans un environnement non contrôlé. Le nombre d'animaux est choisi sur la base de l'expérience pratique et des résultats de la littérature, notamment en termes de mortalités attendues. Les expérimentations précédentes mettent en avant un nombre trés faible de mortalités après lâchers en milieu naturel. L'esturgeon européen est une espèce protégée, il est important de réduire au maximum le nombre d'individus utilisés. 750 individus permettront d'avoir des retours intéressants et permettant de conclure sur les capacités de migration. Le nombre a été établi en lien avec des études précédentes réalisées sur d'autres territoires, et en lien avec la multiplication des connections et des voix de migration. Les reproductions assistées sont complexes à mettre en oeuvre, et le nombre d'individus disponibles ne peut être supérieur en l'état actuel du succès des reproductions assistées.

Raffinement

Basé sur des recherches antérieures, la télémétrie est la méthode de suivi la plus appropriée pour mieux comprendre les routes de migration et les zones d'alimentation et de croissance des espèces en milieu naturel. En ce qui concerne l'animal, on veillera lors de l'implantation chirurgicale de l'émetteur à ce que les poissons aient des poids (ou tailles) minimales afin de respecter le ratio convenu des 2% pour limiter au mieux les problèmes de flottabilité, les biais de comportement et les risques de surmortalités. Le protocole a été établi sur la base des rapports de la littérature et de l'expérience pratique, et garantit que le risque d'altération du bien-être de l’animal dû à l'émetteur implanté est minime. Afin de limiter le stress chez les animaux et de favoriser leur récupération physiologique, les animaux seront marqués à la station d'élevage en France. Avant l'insertion de la marque, les animaux seront placés en phase d'anesthésie profonde (dose chirurgicale). Les animaux seront ensuite observés quotidiennement durant 4 semaines pendant leur récupération.

Choix des espèces

Il s'agit d'une étude d'évaluation de faisabilité pour la réintroduction de l'esturgeon européen dans le delta et estuaire des rivières concernées. C'est pourquoi cette étude est dédiée à cette espèce. Les animaux impliqués dans le projet seront des juvéniles âgés de 6 à 12 mois, issus de reproductions assistées en bassin. L'âge exact des individus sera défini en fonction de leur taux de croissance sur le site d'élevage. Il faudra qu'ils fassent a minima 100g pour pouvoir être marqués avec les marquées définies. A ce stade, les esturgeons européens se déplacent normalement en eau douce et en eau saumâtre ; pourtant, d'autres individus de cet âge sont déjà tolérants au sel et se déplaceront vers la mer. Les questions de recherche tiennent compte des déplacements de ces poissons dans la zone d’étude : a) La disponibilité de zones d'eau saumâtre dans le port, pour l'acclimatation des poissons. b) La disponibilité des aires d'alimentation dans la zone d'étude

53 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit deux greffes de tissu adipeux humain sur les flancs, est anesthésiée à quatre reprises pour la chirurgie et des scanners, puis tuée au bout de deux mois pour analyser le greffon, afin de tester un dispositif de lipofilling destiné à être commercialisé. Le porteur relie le projet à un "réel besoin" en chirurgie reconstructrice. Il affirme qu'un modèle in vitro ne peut pas reproduire la rétention du greffon dans un organisme vivant.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester le dernier dispositif de lipofilling de notre sponsor. Un modèle de xénogreffes sur souris immunodéprimées a été choisi, en s’appuyant sur la bibliographie existante. 100 xénogreffes (2 par souris, sur 50 souris) seront réalisées à partir du tissu adipeux prélevé sur 10 patients par lipoaspiration à l’aide du nouveau dispositif testé. Un lot de 5 souris sera utilisé pour chaque lipoaspiration. Nous avons décidé de travailler sur un modèle de souris nude, athymique et donc immunodéprimée. Ceci nous permettra de nous abroger des risques de rejet de la greffe. Notre étude bibliographique a permis de mettre en avant divers obstacles au maintien des xénogreffes. Ainsi, tous les paramètres physiques liés aux étapes d'aspiration, de préparation du tissu adipeux mais aussi d'injection influencent la prise de greffe. Les paramètres physiques choisis par notre sponsor seront donc ici testés. De même, divers paramètres biologiques influencent la prise de greffes : le statut des donneurs et la présence de maladies métaboliques notamment. De même, la mise en place d’une vascularisation de qualité améliore la rétention de la greffe et donc son maintien. Les donneurs prélevés lors des liposuccions seront donc exempts de maladies métaboliques et seront tous d’un IMC inférieur à 30. La vascularisation mise en place au niveau de la greffe sera observée après récupération du tissu et coloration. D’autres paramètres seront alors étudiés en histologie (quantité et diamètre des adipocytes dans le tissu greffé, qualité et quantité de la matrice extracellulaire mise en place, présence de zones de nécrose éventuelles, …). Enfin, l’emplacement de la greffe ainsi que son suivi par imagerie a fait l’objet d’une recherche bibliographique. Nous souhaitions pouvoir suivre son évolution et quantifier son éventuelle résorption au fil du temps. Le suivi par micro-CT (examen tomodensitométrique par rayons X) a été mis au point sur un modèle de xénogreffes au niveau du calvarium. Nous souhaitions cependant garder les flancs comme zones de xénogreffes car celles-ci présentent plusieurs intérêts. Cette zone sera donc testée lors d'un premier screening, réalisé sur un premier groupe de 3 souris. L'étude utilisera donc un total de 3+50 = 53 souris sur l'ensemble du projet.

Bénéfices attendus

Cette étude pourrait permettre de valider le nouveau dispositif de lipoaspiration, dans le but de le commercialiser. La technique de lipofilling serait alors utilisée en médecine humaine à la suite d'interventions chirurgicales délabrantes (Tumeurs mammaires par exemple, retrait de masses, ...) pour des chirurgies reconstructrices et répond donc ici à un réel besoin. Une étude clinique sera réalisée en complément de cette étude préclinique afin de valider l'utilisation du nouveau dispositif chez l'homme.

Procédures

Chaque souris sera anesthésiée une première fois (Durée : 30 minutes), dans le but de réaliser les deux xénogreffes (une sur chaque flanc). 4 injections sous-cutanées seront réalisées :1 injection SC d'analgésique sera réalisée le jour de la chirurgie et 3 injections SC d'antibiotiques seront réalisées à raison d'une par jour à partir du jour de la chirurgie. Les souris seront anesthésiées 3 fois de plus (Durée : 10 minutes), afin de les imager (CT-scan). Elles seront enfin mises à mort à la suite de la dernière imagerie donc au bout de 2 mois afin de récupérer le tissu greffé pour analyses.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues de cette étude sur les 53 souris utilisées seront : - Les deux xénogreffes réalisées sur les souris, à raison d'une greffe par flanc sur chacune des 50 souris - La douleur éventuelle associée à cette chirurgie - Les anesthésies réalisées (1 pour la chirurgie (Durée : 30 min) et 3 pour les imageries (Durée : 10 minutes)) et l'hypothermie éventuelle en résultant - 4 injections sous-cutanées minimum (1 pour l'analgésie, 3 pour l'antibiothérapie) - Le stress éventuel tout au long des différentes étapes de la procédure - La mise à mort en fin d'étude pour la récupération du tissu greffé. Une attention particulière sera cependant portée aux animaux : tout signe de douleur, stress, et/ou tout comportement anormal sera pris en compte. De plus, la chirurgie se déroulera sous anesthésie volatile (Isoflurane) et analgésie (Buprénorphine 0.05mg/kg) et une antibiothérapie permettra d'atténuer voire d'éviter tout risque d'infection (Amoxicilline 15mg/kg, durant 3 jours)

Devenir

Les souris seront maintenues en vie à la suite de la chirurgie et des différentes imageries. Elles devront cependant être mises à mort dans les jours suivant la dernière imagerie afin de récupérer le tissu adipeux greffé et d'en faire une analyse histologique.

Remplacement

Remplacer : Pour répondre à notre objectif scientifique, un modèle in-vitro ne peut être mis en place. Nous avons en effet besoin d’un modèle animal afin d’étudier le processus de rétention des greffes dans son ensemble, avec les contraintes que ce tissu peut subir dans un système vivant (Inflammation locale, nécroses éventuelles, …).

Réduction

Réduire : L’utilisation de l’imagerie nous permet de suivre la rétention de la xénogreffe sans avoir besoin de sacrifier l’animal, ce qui nous permettra de réduire le nombre total d’animaux utilisés. De plus, le nombre d’animaux utilisés a été minimisé grâce au calcul préalable effectué sur R à partir de la bibliographie et de la fonction power.t.test, nous permettant ainsi d’utiliser un nombre réduit de 5 animaux par groupe. De même, le nombre d'animaux nécessaires à l'étape de screening a été minimisé.

Raffinement

Raffiner : Une étude pilote (screening) sera réalisée afin d’optimiser les protocoles de chirurgie, d’imagerie et d’histologie, sur un premier groupe de 3 souris. Elle nous permettra ainsi d’affiner les techniques utilisées pour l'étude. Ainsi, les expérimentateurs pourront s’entraîner à la technique chirurgicale et les comportements anormaux éventuels des animaux suite aux différentes procédures seront pris en compte. La liste des points limites sera de même actualisée si besoin. Elle comprend pour points limites spécifiques au projet : - Mauvaise cicatrisation cutanée suite à la xénogreffe et/ou Infection cutanée suite à la xénogreffe - Hypothermie persistante, avec une température inférieure ou égale à 34°C de façon durable - Réveil incomplet supérieur à 2h à la suite de la chirurgie - Perte de poids supérieure à 20% Afin de diminuer les éventuelles douleurs pouvant survenir suite à la chirurgie et le risque d'infection, une analgésie et une antibiothérapie seront mises en place (par injection sous-cutanée). De plus, les souris seront étroitement surveillées pendant la phase de réveil puis dans les jours qui suivront la chirurgie. Elles seront hébergées en cages groupées afin de satisfaire leurs besoins sociaux, sur des portoirs ventilés afin de tenir compte de leur phénotype dommageable. Un enrichissement adapté à l'espèce (paille, tunnels, dômes, ...) sera mis dans les cages afin de leur laisser exprimer les comportements naturels de l'espèce (enfouissement par exemple).

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour cette étude est la souris. C’est une espèce largement utilisée dans la recherche préclinique, en chirurgie notamment. La lignée nude choisie pour cette étude est une lignée de souris sans poils et athymique. Ceci nous permettra notamment de nous abroger des risques d’incompatibilité inter-espèces et donc de rejet de la xénogreffe. La lignée choisie est de plus facile à élever et à manipuler. Elle est peu coûteuse et largement utilisée dans toutes les disciplines de la recherche médicale. C’est également une lignée ne présentant pas de phénotype dommageable à l’état basal. La physiologie de la souris ressemblant à celle de l’homme, ceci facilitera la translation. De plus, la souris nude étant peu grasse, il sera plus simple de constater l’évolution des xénogreffes de cellules adipeuses sur cette souche. Enfin, le modèle de la souris immunodéprimée est un modèle standard connu pour la xénogreffe. A leur arrivée, les souris seront âgées de 6 semaines. La greffe sera réalisée 2 semaines après réception, afin d'effectuer une semaine de quarantaine puis d'habituation des animaux. Ainsi, les souris nude seront âgées de 8 semaines au moment de la chirurgie, pour un poids moyen de 20 grammes. A ce stade de développement, les organes des souris seront matures. De plus, nous nous abrogeons des problèmes éventuels liés à la vieillesse de notre modèle.

1780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies cérébrales avec injections stéréotaxiques et pose de fibres optiques ou de lentilles, une restriction d'eau pouvant leur faire perdre jusqu'à 20 % de leur poids sur quatre semaines et un isolement pouvant durer deux mois, pour étudier des circuits neuronaux de l'apprentissage olfactif. Les retombées thérapeutiques évoquées contre les maladies neurodégénératives restent lointaines. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative aux techniques in vivo.

Objectifs

Ces dernières années, de nombreuses études ont mis en évidence l’existence d’un phénomène de production de nouveaux neurones dans le cerveau adulte, dont la déficience semble être liée à des maladies neurodégénératives ou à certaines formes de dépression. De plus, il a été mis en évidence que ces cellules étaient impliquées dans des phénomènes d’apprentissage et de mémoire. Ces découvertes ont suscité un grand espoir dans la communauté biomédicale, celui de pouvoir un jour développer des thérapies basées sur cette capacité du cerveau à produire de nouveaux neurones fonctionnels à tout âge. En particulier, le bulbe olfactif, premier relai central du système olfactif et le gyrus denté de l’hippocampe sont des structures où la neurogenèse à l’âge adulte peut être identifiée dans les conditions constitutives du cerveau sain chez la plupart des mammifères. En conséquence, parmi tous les systèmes sensoriels, le système olfactif se distingue par sa grande plasticité, comprenant entre autres la capacité de renouvellement de ses constituants cellulaires, et ceci y compris à l’âge adulte. Chez les rongeurs, des dizaines de milliers de nouveaux neurones sont intégrés chaque jour dans le bulbe olfactif. Ces cellules sont générées à partir d’une région précise, la Zone Sous Ventriculaire, puis acheminées vers le bulbe olfactif par un Courant de Migration Rostral, pour se connecter avec les circuits bulbaires. De nombreuses études ont décrit les modalités de transmission du message olfactif de l’épithélium olfactif au cerveau, permettant notamment l’établissement d’une mémoire olfactive par l’apprentissage d’une odeur, souvent associée à un autre stimulus sensoriel de contexte pouvant lui-même posséder une valeur émotionnelle. Ainsi, une fois une odeur associée à une situation, une nouvelle rencontre avec celle-ci pourrait raviver les souvenirs inscrits dans les circuits neuronaux et permettre de reconnaître ce même contexte. Nous cherchons donc à déterminer pourquoi les neurones générés chez l’adulte dans le bulbe olfactif jouent un rôle si particulier dans l’apprentissage olfactif et comment ils permettent de modifier la perception ultérieure d’une odeur déjà rencontrée.

Bénéfices attendus

De nombreuses études expérimentales ont étudié les modalités de transmission du message olfactif de l’épithélium olfactif au cerveau, permettant notamment l’établissement d’une mémoire olfactive par l’apprentissage d’une odeur, le plus souvent associée à un autre stimulus sensoriel de contexte pouvant lui-même posséder une valeur émotionnelle. Ainsi, une fois une odeur associée à une situation, une nouvelle rencontre avec celle-ci pourrait raviver les souvenirs inscrits dans les circuits neuronaux et permettre de reconnaître ce même contexte. Dans notre équipe de recherche, nous nous intéressons à un aspect particulièrement inexploré de ces mécanismes : Pourquoi les neurones générés chez l’adulte dans le bulbe olfactif jouent-ils un rôle si particulier dans l’apprentissage olfactif et comment permettent-ils de modifier la perception ultérieure d’une odeur déjà rencontrée ? Pour cela, nous souhaitons étudier une sous-population de neurones inhibiteurs du cortex olfactif innervant les neurones nouvellement générés du bulbe olfactif et leur potentielle modification à la suite d’un apprentissage associatif. En effet, un contrôle à distance de l’activité des nouveaux neurones pourrait être le substrat permettant de définir une nouvelle forme de perception subjective, propre à chaque individu et découlant des expériences personnelles antérieures de chacun. Finalement, une meilleure connaissance des mécanismes de neurogenèse adulte pourrait alors permettre dans le futur la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour contrôler cette production neuronale, dans le but de restaurer les fonctions cérébrales de patients accidentés ou atteints de maladies neurodégénératives ou psychiatriques. Dans le domaine complexe des neurosciences modernes, un défi majeur des chercheurs est alors de comprendre précisément les mécanismes qui assurent l’intégration fonctionnelle de ces nouvelles cellules dans un réseau neuronal actif, et de déterminer les conséquences physiologiques de cette production neuronale permanente.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales (injections stéréotaxiques, implantations de fibres optiques ou de lentilles à visée micro-endoscopiques dans le cerveau). Ces interventions ne durent pas plus de 2hs et chaque animal sera soumis à un maximum de deux interversions séparées par un minimum de 30 jours. Ils seront également soumis à des tâches d’apprentissage olfactif de type associatif avec renforcement positif. Ce type d’apprentissage a une durée maximal de 1 mois, avec une session de 30 à 60 minutes par jour, chaque jour.

Impact sur les animaux

Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux tout en évitant au maximum tout stress et inconfort de l’animal. Cependant, au cours de nos expériences les animaux pourront subir quelques effets indésirables comme le stress hydrique, la perte de poids associée (< a 20% du poids original pendant un maximum 4 semaines) et le stress dû à l’isolement (maximum 2 mois). Des implants seront introduits par chirurgie sous anesthésie générale chez les animaux. La présence de ces implants pourrait générer un stress, une douleur légère et de l’inconfort (maximum 2 mois). Cependant, tous les moyens seront mis en place pour éviter toute douleur à la suite des chirurgies.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car il est nécessaire de réaliser des études histologiques sur les tissus à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative aux techniques in vivo pour étudier les circuits neuronaux impliqués dans l’apprentissage olfactif. Toutefois, notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux tout en évitant au maximum tout stress et inconfort de l’animal.

Réduction

L’étude statistique impose des cohortes comprenant un nombre suffisant d’animaux afin d’avoir une évaluation pertinente de l’effet des différentes conditions expérimentales sur le comportement. Le nombre de souris minimum par groupe a été calculé pour pouvoir utiliser des tests paramétriques, plus puissants que les tests non paramétriques grâce à des expériences similaires déjà réalisées dans notre laboratoire. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer les groupes avec un risque de p=0.05 et une puissance statistique >80. L’électrophysiologie sur tranche de cerveau permet de changer rapidement le milieu dans lequel baignent les cellules. Il est donc possible d’appliquer successivement et/ou de rincer plusieurs molécules au cours de l’enregistrement d’une cellule donnée. Ceci permet de réaliser des tests statistiques appariés et de réduire le nombre de cellules nécessaire à l’évaluation de l’effet d’un agent pharmacologique. Pour cette partie, deux personnes travailleront en parallèle sur deux postes d’électrophysiologie, ce qui permettra d’optimiser l’utilisation des tissus, de doubler le nombre de cellules enregistrées, et de réduire d’autant le nombre d’animaux nécessaires. Dans la même optique, les expériences d'imagerie permettent d’analyser l'activité des neurones avant et après l’apprentissage, permettant l’utilisation des tests statistiques appariés et le nombre de cellules nécessaire à l’évaluation de l’effet, et ainsi le nombre d’animaux utilisés dans le projet.

Raffinement

Tous les efforts seront mis en place pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse de l’animal. La durée d’acclimatation à l’animalerie sera d’une semaine minimum. Durant la chirurgie, des anesthésiques et antalgiques seront utilisés, ainsi que des antalgiques de nouveau en post-chirurgie. Ceci est indispensable pour le bien-être de l’animal ainsi que pour notre projet qui est principalement basé sur le comportement : il est nécessaire que l’animal puisse effectuer une tâche de comportement sans biais. Les animaux seront donc observés minimum deux fois par semaine, et tous les jours en post-opératoire. Cette surveillance sera coordonnée entre l’expérimentateur et le personnel de l’animalerie. Pour les souris montrant des signes de douleur (absence de toilettage, posture anormale, défaut de nidification, défaut dans le comportement moteur général et du comportement exploratoire dans la cage, accompagnée ou non d’une perte de poids >20%), l’administration de l’antalgique sera renouvelée 12 et 24h après la chirurgie. Ces animaux seront l’objet d’une surveillance quotidienne accrue. En cas de détresse après l’administration des antalgiques les animaux seront mis à mort (événement très rare). Pour réduire le stress associé à l'isolement (parfois nécessaire lors de combats entre les individus ou en présence d’implants), les cages d’hébergement seront enrichies (igloo, coton extra). Dans le cas des souriceaux, après la chirurgie, le poids de chaque animal sera mesuré deux fois par semaine pour vérifier la bonne croissance des animaux. Le comportement maternel vis-à-vis des souriceaux après la chirurgie sera aussi évaluée (allaitement, toilettage, nidification, signes d’agressivité).

Choix des espèces

On étudie le phénomène de contrôle afférent chez l’adulte dans le système olfactif des souris car ce système est impliqué dans une modalité sensorielle très importante chez les rongeurs : l’olfaction. En conséquence, l’utilisation de cette espèce nous permettra d’obtenir des résultats éthologiquement satisfaisants. De plus, les stimuli olfactifs peuvent participer à l’enrichissement de l’environnement des animaux et donc favoriser leur bien-être durant le temps des expériences. Notre objet d’étude étant les fibres afférentes qui contrôlent l’activité des cellules produites par la neurogenèse chez l’adulte, on utilise dans ces expériences des jeunes souris adultes (8 semaines). Cependant, il faudra comparer l’impact de ces fibres sur les cellules produites dans le cerveau post-natal (neurogenèse post-natale). Pour ce faire, des souriceaux de 6 jours seront utilisés.

48 souris diabétiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur inflige des plaies cutanées chirurgicales sur le dos puis on les anesthésie tous les trois jours pendant 21 jours pour suivre la cicatrisation, afin de tester des biopansements et des molécules bioactives. Le porteur situe les retombées à court terme, les produits étudiés étant déjà commercialisés pour d'autres usages. Il affirme avoir besoin d'un animal vivant pour étudier la cicatrisation dans son ensemble, avec les contraintes que subit la peau au quotidien.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier l’amélioration du processus de cicatrisation par l’usage de molécule bio actives et de nano biomatériaux sur un modèle de plaies cutanées dans un contexte diabètique en utilisant une lignée de souris qui exprime les paramètres physiologiques de la maladie (diabète). Le processus de cicatrisation comporte 4 étapes en condition physiologique : l’hémostase, l’inflammation, la prolifération et le remodelage. Elles se succèdent grâce aux recrutements des cellules immunitaires et la migration de cellules résidentes qui vont sécréter des facteurs permettant d’aboutir à la complète réparation de la lésion cutanée. En situation pathologique, ce processus peut être altéré (infection, maladie métabolique, irradiation…) et entrainer un retard de la cicatrisation et/ou une cicatrisation de moins bonne qualité, avec un risque de réouverture récurrente des plaies qui deviennent alors chroniques. Il est donc important d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l’utilisation de molécules ayant des propriétés anti-inflammatoires, antioxydantes et anti-microbiennes. A ce titre certaines molécules semblent être de bons candidat innovants. Nous testerons ici deux molécules : les HDL reconstitués (rHDL) ainsi que l’Alpha 1 Antitrypsine (AAT). Ces deux molécules seront incorporées dans un gel neutre miscible (gel neutre Cooper) afin de pouvoir les appliquer et les maintenir sur les plaies. Cependant il manque encore des données scientifiques pour étayer cela. Nous voulons également tester en parallèle deux scaffolds : un scaffold solide et un scaffold sous forme d’hydrogel que nous avons déjà testé sur un modèle de plaies cutanés sur des Rats Wistar, non diabétiques, en amont du projet et dont les résultats préliminaires nous amènent à penser qu’ils peuvent être de bon candidats dans le processus de cicatrisation cutanée dans un contexte pathologique comme le diabète. Nous souhaitons évaluer les propriétés cicatrisantes des rHDL , de l’AAT , de la synergie de ces deux molécules ainsi que certains nano bio matériaux sur des plaies aigües en condition hyperglycémique liée au diabète. Nous pourrons ainsi étudier d’une part la potentielle amélioration de la qualité de la cicatrisation et d’autre part la possible normalisation du processus de cicatrisation.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent principalement la santé humaine, et en particulier les personnes souffrant de retard de cicatrisation comme les diabétiques. Les données scientifiques feront l’objet de publications dans des journaux internationaux permettant ainsi une valorisation d’un développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique innovante. Ces bénéfices auront une échéance à court terme puisque les molécules actives étudiées sont déjà commercialisées (pour d'autres applications), et les scaffolds étudiés sont accessibles pour une fabrication industrielle.

Procédures

Les animaux seront tous soumis à une procédure chirurgicale sur le tissu cutanée, d'une durée de 15 minutes environ, sous anesthésie et analgésie. Ils seront tous anesthésiés brièvement (5 minutes) pour l'examen des plaies, tous les 3 jours. La procédure totale aura une durée de 21 jours pour tous les animaux.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances sont celles imputables à la chirurgie à savoir : anesthésie, injections, stress et douleurs. Le suivi des plaies se faisant tous les deux jours sous anesthésie, peut engendrer des réveils difficiles et augmenter le risque d’hypothermie. De plus, le positionnement des pansements peut constituer une gène (risque de retrait du pansement, difficultés à se mouvoir). L’isolement des animaux en cas d’atteinte de points limites peut également constituer une source de stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour analyser les tissus étudiés.

Remplacement

Des tests préliminaires in vitro ont été réalisés préalablement sur un modèle de cellules épithéliales humaines de la peau (HaCat), en condition huperglycémique(MGO) afin d’extrapoler la concentration des molécules à utiliser sur notre modèle animal. De même, les propriétés anti-inflammatoires et de migration cellulaire ont été évaluées in vitro. Afin de répondre à notre objectif scientifique, nous avons besoin d’un modèle animal vivant pour étudier le processus cicatriciel dans son ensemble, notamment les phases telles que l’angiogénèse et la réinnervation, avec les contraintes que peut subir la peau au quotidien à savoir étirement, relâchement, inflammation locale.

Réduction

Nous avons pu réduire au maximum le nombre de souris grâce à une revue systématique bibliographique et à l’utilisation de l’outil statistique R. La taille des plaies induites de 6 mm permettra de réaliser 2 plaies par animal ce qui permettera d’avoir un contrôle négatif pour chaque animal.

Raffinement

Notre protocole a été optimisé afin de minimiser au maximum les contraintes subies par les animaux. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie avec une couverture analgésique en respectant strictement les règles d’asepsie. Le matériel chirurgical utilisé sera rigoureusement stérilisé au préalable. Le gel utilisé comme matrice pour les molécules à tester est un gel neutre et sera appliqué en plus de la plaie sur une partie de la peau du dos rasée préalablement comme contrôle de biocompatibilté. Les animaux seront surveillés et manipulés tous les jours pour détecter tout inconfort lié à la procédure, avec un suivi post-opératoire renforcé dans les premières 48h ainsi que dans les phases de réveil faites en chambre de réveil thermostatée. Nous allons également effectuer un scoring de la douleur.

Choix des espèces

Le modèle souris Db/Db (dabiétique) a été selectionné dans cette étude. La souris Db/Db est un modèle largement utilisé dans la recherche dès lors que nous devons travailler sur un modèle pathologique de diabète. Par ailleurs, la souris possède une architecture de la peau proche de celle retrouvée chez l’Homme : présence d’épiderme, lame basale, derme, hypoderme et présence de follicules pileux. La taille de 6mm de la plaie effectuée nous permettra de faire 2 plaies par souris et donc de réduire notre nombre total d’animaux. Nous travaillerons avec des souris mâles adultes de 8 semaines. Les jeunes souris adultes ont une meilleure récupération post-chirurgicale et nous n’ajouterons pas de biais de cicatrisation lié à l’âge de l’animal qui aura une peau plus souple à 8 semaines. Cela permettra d’avoir un processus de cicatrisation optimal.

129 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats reçoivent un implant de céramique dans l'os par chirurgie, les souris un implant sous la peau, avec suivi par micro-scanner. Le porteur reconnaît des douleurs post-chirurgicales au site opératoire. Il affirme qu'aucun modèle de formation osseuse in vitro ou in silico ne reproduit la complexité de la cicatrisation, et vise à tester des céramiques comme alternative à l'autogreffe.

Objectifs

La réparation du squelette après perte de substance osseuse demeure un problème lorsque les défauts sont de grande taille. Si le traitement par autogreffe (prélèvement d’os chez le même patient) reste la référence, il a cependant des inconvénients. Les matériaux à base de céramiques en phosphate de calcium (CaP) sont une bonne alternative à l’autogreffe osseuse car supportent bien la repousse osseuse mais, généralement qu’aux abords des berges osseuses limitant leur efficacité à des défauts de faible volume. Une stratégie prometteuse pour améliorer le potentiel régénératif de ces matériaux est de mieux mimer la composition chimique de l’os (partie minérale), qui contient de nombreux oligo-éléments sous formes d’ions (tels carbonates, fluor, magnésium, manganèse…). L’insertion d’ions dans les céramiques de CaP est une approche de plus en plus étudiée permettant de moduler les propriétés physico-chimiques et microstructurales du matériau, et ainsi ses propriétés biologiques. Parmi les éléments ‘traces’ présents naturellement dans l’os, le silicium (principal élément composant le sable) joue un rôle essentiel dans le développement, la croissance et la calcification du tissu osseux (une alimentation déficiente en silicium engendre un retard de croissance accompagné d’un développement crânien anormal chez le rat alors qu’un régime enrichi en silicium améliore leur croissance squelettique). Le silicium est présent dans le corps sous forme d’ions silicates. Des études in vitro démontrent que les ions silicates favorise la différenciation de cellules qui produisent le tissu osseux et inhibe les cellules osseuses qui résorbent l’os. L’incorporation d’ions silicates dans ces matériaux a été déjà étudiée ces dernières années mais en raison de la faible dégradation des céramiques de CaP in vivo, les ions Silicates (qui pourraient influencer les cellules osseuses) ne sont en fait jamais libérés. L’incorporation d’ions carbonates, (ions naturellement présents dans le tissu osseux à 5-8%) dans les céramiques augmente leur dégradation in vivo. Considérant les avantages de chacun, l’incorporation simultanée d’ions silicates et carbonates dans la structure des céramiques rendrait le matériau dégradable, libérant ainsi les ions Silicates bioactifs pour stimuler les cellules osseuses et promouvoir l’ostéogénèse. L’objectif de ce projet est d’évaluer la dégradation des différentes céramiques (+/- ions) in vivo et leur potentiel à réparer un défaut osseux.

Bénéfices attendus

Plusieurs données de la littérature ont montré le bénéfice de céramiques contenant des ions silicates sur la formation osseuse ; mais une controverse persiste dans la communauté scientifique en raison de la faible/absence de dégradation des céramique in vivo, limitant la libération des ions silicates bioactifs. Le co-insertion d’ions carbonates et silicates a pour objectif d’obtenir des matériaux dégradables et donc plus bioactifs. Ce projet permettra de valider (ou invalider) l’intérêt d’insérer des ions silicates dans une biocéramique pour la réparation osseuse. Le bénéfice attendu à plus long terme est l’optimisation de la synthèse et fabrication d’implants en biocéramique pour le comblement de grands défauts osseux en remplacement de l’autogreffe.

Procédures

Pour les souris : 1-Implantation sous cutanées de matrices ( 1X ; durée ~20 min) 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (max 7X; durée 15 min) Pour les rats : 1- Implantation intraosseuse au niveau du condyle (1X, durée 40 min) ; 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (6X; durée 15 min) 3- Injection d'agent fluochromes (2X ; durée 5 min)

Impact sur les animaux

Nuisances attendues causées durant les actes expérimentaux : stress dû à la contention puis lors de la perte de connaissance par le gaz anesthésiant (souris et rats) ; Injection en sous cutané (souris et rats); Injection en intrapéritonéal (souris et rats); Chirurgie en sous-cutané (sous analgésie et anesthésie) (souris) ; Chirurgie en intra-osseux (sous analgésie et anesthésie) (rats). Nuisances attendues engendrés suite aux expérimentations : douleurs post-chirurgie (niveau du site opératoire) (souris et rats)

Devenir

Mise à mort car fin de protocole ; les explants seront récupérés et traités selon l’étude (analyse expression génique, histologie, analyse au scanner à plus haute résolution, mesure de la masse de la céramique restante).

Remplacement

Aucun modèle de néoformation osseuse in vitro n’est disponible aujourd’hui. La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel orchestré complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire ; à cela s'ajoute l'impact d'un système hormonal complexe. Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (ostéoblastes/macrophages par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Ces modèles, cependant, sont dénués de système vasculaire qui joue un rôle clé dans la réparation osseuse. Pour toutes ses raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

4 ou 2 implants seront implantés par animal pour diminuer le nombre d’animaux utilisé. L’imagerie non-invasive pour petits animaux (suivi de la formation osseuse par micro-scanner) sera utilisée pour suivre les mêmes animaux dans le temps et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisé. Une analyse statistique en préalable a permis de déterminer qu’il nous fallait 10 animaux par groupe testé pour espérer obtenir une différence statistique entre au moins 2 groupes.

Raffinement

Une période d’acclimatation d’une semaine sera effectuée entre l’arrivée des animaux et la chirurgie. Le manipulateur viendra les voir et manipuler au minimum 3 fois avant la chirurgie. En vue d’éviter le stress, les souris et les rats initialement hébergés ensemble (3 animaux/cage) le resteront du début à la fin du protocole. La souffrance sera limitée par analgésie pré- et post-opératoire pendant les 3 premiers jours. Après anesthésie et avant chirurgie, un gel sera est appliqué sur chaque œil pour éviter le dessèchement des yeux. Après chirurgie, les animaux seront surveillés en per-opératoire puis régulièrement jusqu'à la fin de l'expérimentation. Pour chaque analyse par micro-scanner, les souris et rats seront anesthésiées par inhalation d’un gaz anesthésiant dont les effets se dissipent 1 à 2 minutes après l’arrêt du contact direct avec le produit. Les points critiques (plaie, démarche..) seront surveillés, notés et reportés sur une feuille de score permettant de quantifier la douleur ou la gêne de l’animal. Les mesures à prendre pour chaque situation clinique (Perte de poids, Comportement général altéré, Apparence extérieure altérée, Site d’implantation infecté) et si les points limites sont atteints, sont listées sur cette feuille de score. Un environnement enrichi sera fourni avec briques de bois (usure des dents), dômes (pour souris) et papier afin de contribuer au fouissement des animaux. La température sera maintenue et contrôlée entre 20 et 22°C et le rythme veille/sommeil sera de 12h/12h. Eau et nourriture seront fournies ad libitum.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour les implantations sous-cutanées est la souris immunodéprimée Nude (ayant un système immunitaire adaptatif altéré, mais inné non-altéré) car une procédure implique l’association de céramiques avec des de cellules humaines formatrices de tissu osseux; son poids à 8 semaines (~30 g) permet l’implantation de 4 implants par souris ou 2 chambres de diffusion par souris sans problème. Le modèle animal choisi pour les implantations intra-osseux est le rat Wistar. La taille du rat est plus pertinente que la souris pour évaluer la réparation d’un grand défaut osseux. La souche Wistar est non consanguine ayant une variabilité génétique plus importante qu’un modèle consanguin.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois injections d'un candidat vaccin dans le muscle de la patte, puis deux prélèvements sanguins au sinus situé derrière l'oeil. Le porteur reconnaît que la douleur musculaire peut pousser l'animal à se mordre et que le prélèvement rétro-orbitaire peut provoquer des douleurs oculaires. L'objectif est de valider que des changements dans le procédé de fabrication n'altèrent pas l'activité du vaccin, le recours à l'animal étant présenté comme "incontournable".

Objectifs

Les cytokines sont des protéines naturelles qui assurent la communication intercellulaire et orchestrent les réponses immunitaires, inflammatoires ou allergiques. Leur surexpression ou dérégulation conduit à l’apparition ou au développement de pathologies auto-immunes, inflammatoires ou cancéreuses. Ces pathologies sont aujourd’hui de véritables enjeux de santé publique. C’est pourquoi, une nouvelle stratégie d’immunothérapie active a été développée, reposant sur la production d’anticorps anti-cytokine, par le système immunitaire du patient, après administration d’un candidat vaccin. Ce dernier est composé d’une protéine porteuse couplée à une cytokine. Un test d’activité chez la souris permet de sélectionner les meilleurs candidats vaccin lors de la phase de développement. Il n’existe pas, à ce jour, de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immunologique à ce vaccin. Cette limitation rend incontournable le recours à l’expérimentation animale, pour tester l’efficacité de nouveaux candidats vaccins. Cette étude sert à valider la conformité des lots de vaccins produits pour les études précliniques, ainsi qu’à valider les évolutions du procédé inhérentes au développement jusqu’aux études cliniques. A terme ce test chez la souris sera standardisé pour être utilisé comme test de contrôle qualité pour la libération des lots de vaccins.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider que les modifications apportées au cours du développement du procédé de fabrication du vaccin (changements de tampon, changement de température ou de temps, changement d’équipement…) n’affectent pas l’activité in vivo de ce dernier qui à terme sera administré chez l’homme au cours d’un programme d’évaluation clinique.

Procédures

1) Administration du vaccin : L'injection du vaccin est réalisée sur animaux vigiles maintenus par contention pendant 30 secondes. Les 600 animaux recevront 3 injections de vaccin aux jours 0, 7 et 28 par voie intramusculaire (50 à 100 μL). 2)Prélèvement sanguin: Les animaux sont anesthésiés à l'isoflurane pendant 5min. Ensuite, le prélévement de sang est réalisé en moins de 30 secondes. L’ensemble des 600 souris subira 2 prélèvements sanguins aux jours 41 et 55.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus à l’injection ou au prélèvement au sinus retro orbitaire. Les effets secondaires liées au candidat vaccin ne sont pas attendus. Le principe du vaccin étant de provoquer une réponse immune, des effets indésirables de type inflammatoire peuvent se produire principalement au site d’injection et se manifester par des oedèmes et érythèmes pouvant durer quelques heures à quelques jours. L’injection par voie intramusculaire se faisant dans le muscle de la patte arrière, une douleur musculaire localisée pourra être détectée quand l'animal a tendance à se mordre au niveau de la zone douloureuse. Les prélèvements sanguins se faisant au niveau du sinus rétro-orbitaire, des effets indésirables sur l’oeil peuvent se produire. La survenue de contractions répétées et involontaires des muscles des paupières (blépharospasme), la sécrétion lacrymale éventuellement accompagnée de photophobie, les écoulements, la survenue d'oeil rouge ou opaque seront examinés, puisqu'ils traduisent des douleurs oculaires et l'état des yeux.

Devenir

Le système immunitaire des souris utilisées ayant été stimulé par les candidats vaccin, celles-ci conserveront une « mémoire » des vaccinations précédentes. Nous ne serons donc plus dans la possibilité d’obtenir chez ces souris, une réponse immunitaire comparable à des animaux nouvellement vaccinés. De surcroit les souris ont une durée de vie assez courte et l’utilisation d’animaux âgés n’est pas recommandé pour l’obtention d’une bonne réponse immunitaire. L'ensemble des animaux sera donc mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

La stimulation du système immunitaire par vaccination ne peut s’effectuer que sur animaux vivants. Il n’existe pas à ce jour de méthode in vitro permettant de remplacer le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Ce protocole suit la condition pour laquelle un nombre de 10 animaux par groupe procure une puissance statistique suffisante (tests statistiques classiques).

Raffinement

Les animaux disposent d'une période d'acclimatation conséquente (minimum 7 jours), avant l'initiation de tout protocole, afin de limiter leur angoisse. Ils subissent ensuite des contraintes très modérées. Les injections réalisées en intramusculaire (sur souris vigiles) et les prélèvements sanguins (sous anesthésie gazeuse) ont lieu de façon ponctuelle et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Enfin, des points-limites avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis. De plus, des antalgiques sont prévus si l’animal présenté un signe de souffrance. Si un animal présente l'un des points limite à un seuil critique, il est mis à mort afin d'abréger sa souffrance. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage. Ce milieu sera enrichi (tunnel + coton) et la nourriture et l’eau seront fournis ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus approprié du fait de sa physiologie proche de l’Homme (taux d’homologie 90 %) et de la grande quantité de données disponibles dans la littérature et au sein du laboratoire. Souris adulte, c’est-à-dire de 7 à 9 semaines, soit environ 20-25g. En effet, nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire mature pour tenir compte de la réponse humorale.

112 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 62 tuées pour prélèvements et 50 ramenées en élevage. La moitié est isolée pendant sept jours pour accroître leur agressivité avant un test où les animaux peuvent se battre et se blesser, l'autre test mesurant l'anxiété. Le porteur reconnaît le risque de blessures physiques et le stress social de l'isolement. Il justifie l'usage d'un "organisme entier" par la détection de phéromones, l'application visée étant une apaisine commercialisable pour l'élevage et les animaux de compagnie.

Objectifs

Les phéromones apaisantes maternelles sont des substances chimiques libérées par les glandes sébacées situées dans la région mammaire de la mère, peu après la mise-bas et durant la lactation. Il a été montré que ces phéromones ont des effets apaisants sur la progéniture, et également à l’âge adulte. Leur identification a permis une application pratique de ces « apaisines » en élevage ou chez les animaux de compagnie, pour faciliter la gestion de situations stressantes.. Préciser et comprendre comment ces phéromones agissent, notamment au niveau neurobiologique, immunologique, et de l’expression des gènes est un axe de recherche important dans lequel s’inscrit ce projet et qui nécessite le choix d’un modèle animal sur lequel plusieurs études fondamentales peuvent être facilement menées compte-tenu des outils d’analyse disponibles et des connaissances scientifiques actuelles. La souris est apparue comme le meilleur modèle au vu de l’existence de kits de dosages de neurohormones utilisables et validés, de kits de séquençage des gènes préconçus et la connaissance de plusieurs gènes de référence, et de l’anatomie fonctionnelle du cerveau et du système immunitaire de cette espèce. Au préalable, il est nécessaire d’évaluer/vérifier l’effet des substances chimiques composant la formule des apaisines sur le comportement des souris, notamment leur anxiété et agressivité. Si cette étude s’avère concluante et qu’un tel effet apaisant est confirmé, le projet devrait être poursuivi afin d’investiguer les impacts des apaisines sur la physiologie des souris et les mécanismes qui y sont liés. Outre les connaissances biologiques apportées par une telle recherche sur le plan fondamental, le projet a également un but applicatif plus direct. En effet, les souris comptabilisent près de 64% des animaux utilisés pour la recherche dans des conditions de vie potentiellement anxiogènes (milieu de vie relativement pauvre, stress dû aux manipulations…). Pour une meilleure fiabilité des données scientifiques et pour des raisons tout simplement éthiques, il est important de s'assurer de leur bien-être et de raffiner au mieux leur qualité de vie : l’installation de diffuseurs de phéromones apaisantes dans les animaleries expérimentales pourrait contribuer à l’amélioration de leur bien-être. L’utilisation des apaisines pourrait également être étendue à la sphère domestique pour les souris détenues comme animaux de compagnie.

Bénéfices attendus

Ils sont de 2 natures. Au niveau fondamental, cette étude permettra ensuite la réalisation d’autres études visant à investiguer le mécanisme d’action des apaisines et plus généralement de la communication chimique. Les mammifères terrestres s’appuyant sur la détection et l’interprétation des signaux chimiques de leur environnement pour guider leur comportement, notamment sociaux, cela est primordial pour leur survie et leur reproduction. Il est donc essentiel de connaître et comprendre les mécanismes d’action de la communication chimique. Cela est aussi nécessaire pour conforter l’utilisation actuelle des apaisines chez les animaux de compagnie et de rente. Au niveau appliqué, la confirmation de l’effet apaisant des substances testées permettra de développer une apaisine de souris qui pourra être ensuite directement utilisée dans les élevages à des fins scientifiques ou dans la sphère domestique pour les souris détenues comme animaux de compagnie. En effet, en France, 64% des animaux utilisés à des fins scientifiques sont des souris. S’intéresser au bien-être des individus hébergés dans ce cadre est essentiel : les raisons sont non seulement éthiques, mais elles concernent également la validité des résultats scientifiques – tout stress pouvant influer sur l’état mental et physique d’un individu et ainsi biaiser les résultats obtenus. De plus, assurer le bien-être des animaux utilisés à des fins de recherche est une exigence réglementaire. En fonction des recherches menées sur les animaux (limitant plus ou moins l’enrichissement du milieu de vie), diverses améliorations peuvent être mises en place ; c’est notamment dans ce cadre que s’inscrit la présente étude. En effet, si celle-ci confirme les effets apaisants de la formule de phéromone testée sur les souris (en diminuant leur anxiété et agressivité), le produit pourrait être diffusé dans les animaleries de recherche et ainsi contribuer au raffinement des conditions de vie. Il est également possible d’étendre l’utilisation des apaisines à la sphère domestique, par exemple lorsqu’un particulier adopte une nouvelle souris, afin de faciliter son adaptation à son nouvel environnement.

Procédures

La moitié des animaux (n=56) seront exposés au traitement apaisine, pendant toute la durée de l'étude (7 semaines), mais il n'est pas attendu de nuisances suite à cette exposition. Tous les animaux (n=112) subiront une fois chacun deux tests comportementaux (l’un durant 10 min et mesurant le niveau d’anxiété, l’autre durant 5 min mesurant le niveau d’agressivité) : ils peuvent être source d'angoisse/anxiété, stress psychologique, voire blessures, même si des dispositions sont prises pour éviter ces dernières. La moitié des animaux (n=56) subiront un isolement rapport à leur condition d'hébergement pendant 7 jours, qui peut être source de stress psychologique, mais qui est nécessaire en amont du test comportemental mesurant l’agressivité Une partie des animaux (n=62, 12 provenant de l'étude pilote et 50 provenant de l'étude principale) subiront une anesthésie générale par voie gazeuse au cours de laquelle sera effectué un prélèvement sanguin juste avant leur mise à mort. Cette intervention ne devrait pas durer plus d'une minute.

Impact sur les animaux

Durant la présente étude, les souris sont hébergées dans des conditions standards de laboratoire, ce qui peut engendrer plus ou moins de stress en fonction des individus dépendant de leur sensibilité et de la compatibilité des groupes formés. Certaines souris (n=56) font exception, étant isolées pendant sept jours pour les besoins du test comportemental mesurant l’agressivité dans des cages similaires mais plus grandes : cet isolement peut engendrer un stress social également, ces animaux étant sociaux et ayant toujours vécu en groupe. Cette durée a été choisie car conseillée dans la littérature afin d’accroître leur territorialité et donc leur agressivité envers un intrus. Ce test dure cinq minutes et constitue un stress social aigu. L’agressivité probable des souris faisant consensus dans une telle situation, les individus peuvent se battre plus ou moins violemment ; il y a donc un risque de blessures physiques. L’autre test comportemental a quant à lui été conçu pour évaluer l’anxiété des souris : celles-ci seront donc dans un état potentiellement anxieux durant les dix minutes du test, le fait que le dispositif soit surélevé avec deux branches non protégées par des murs constituant une source d’anxiété. Durant les essais, il y a également un stress de manipulation à prendre en compte, les souris appréciant peu le contact humain Le traitement lui-même, diffusé dans les salles, n’est pas sensé créer d’effet indésirable sur les souris, bien que cela soit surveillé tout au long de l'étude. La manipulation précédant l’anesthésie gazeuse pourrait être source de peur et représenter une nuisance, de courte durée cependant avant la perte de conscience de l’animal.

Devenir

Tous les animaux de l’étude pilote (n=12) sont immédiatement mis à mort à la suite du 2nd test comportemental pour les besoins de la suite du projet, c’est-à-dire la mise au point de méthodes de dosages à partir du volume de sang prélevé. Pour l’étude principale, les 50 souris qui auront subi un isolement rapport à leur condition d'hébergement pendant 7 jours sont mises à mort immédiatement à la suite du 2nd test comportemental, pour l’évaluation des paramètres du projet c’est-à-dire la réalisation des dosages de corticostérone et sérotonine. Les 50 souris ayant continué à être hébergées en conditions standard sont gardées en vie : elles seront ramenées en élevage après le 2nd test comportemental et seront utilisées ultérieurement pour de nouvelles mises au point méthodologiques, en fonction des résultats obtenus dans la présente étude.

Remplacement

Il s’agit notamment d’une étude de recherche fondamentale investiguant les mécanismes d'action physiologiques de la phéromone apaisante maternelle (apaisine). En tant qu'étude de physiologie, elle doit nécessairement porter sur des êtres vivants, qui représentent des systèmes biologiques intégrés, où de multiples organes/tissus fonctionnent de façon associée et coordonnée. En effet, l’utilisation de traitement phéromonal est une stimulation sensorielle par exposition à des phéromones qui nécessite l’utilisation d’organisme entier pouvant détecter et réagir aux composés testés. La détection de ces composés peut engendrer une cascade de réactions physiologiques pouvant mener à une modification du comportement ou de la physiologie de l’animal. Cela ne peut être obtenu et observé que sur animaux entiers pouvant pleinement exprimer leurs comportements et physiologies naturels. Il n'existe pas actuellement de méthodes de remplacement pouvant simuler ces changements suite à une stimulation sensorielle. Cela nécessite donc l’implication d’êtres vivants, dans ce cas des souris.

Réduction

L’effectif des animaux utilisés a été défini grâce à des tests statistiques de calcul de taille d’échantillons nécessaires, avec une puissance statistique de 90%, à partir de données issues d’études publiées. Selon ces calculs, en moyenne, en fonction des données mesurées, un effectif de 44 souris par traitement doit permettre d’observer une différence significative (si elle existe) entre les 2 groupes de l’étude principale (placebo vs. apaisine). 6 souris par condition ont été ensuite ajoutées pour pallier les pertes qui pourraient survenir pendant l’élevage, aboutissant à 50 animaux/groupe, soit 100 animaux au total pour l’étude principale. Une étude pilote est aussi prévue en amont, permettant l’entraînement et l’ajustement logistique et organisationnel des équipes sur un petit nombre d’animaux, qui vise à optimiser les chances de réaliser un essai probant scientifiquement : un effectif de 6 souris/groupe est estimé suffisant pour s’entrainer à la procédure, soit 12 souris au total pour l’étude pilote. Un effectif total de 112 souris est donc nécessaire. Aussi, du matériel biologique prélevé sur les souris de l’étude pilote étant utilisé pour mettre au point les méthodes d’analyse, cela maximise l’utilisation des animaux et contribue à la réduction du nombre d’animaux impliqués dans la recherche.

Raffinement

Concernant l’hébergement, les cages sont nettoyées 1 fois/semaine et aménagées pour répondre aux besoins de l’espèce, comprenant notamment de la litière (copeaux), eau et nourriture ad libitum, des enrichissements comme brique en bois pour ronger, tunnel et cabane en carton pour se cacher, fibres de kraft et coton pour nidifier, et des tapis anti-bruit dans les salles d’élevage. Grâce à une grille d’évaluation du bien-être, les animaux sont surveillés quotidiennement par du personnel qualifié afin de s’assurer d’un état clinique normal et de l’absence de signes de souffrance (par exemple : état du pelage, évaluation de la nidification, présence du comportement fouisseur, absence de comportement anormaux). Un arbre décisionnel basé sur les critères d'arrêt de souffrance est mis en place au cas où des signes de souffrance seraient constatés et les points limites adaptés atteints. Pour manipuler les souris, l’utilisation d’un tunnel de manipulation a été choisie pour limiter le stress. Toutes les manipulations ont lieu pendant la période d’activité des souris au laboratoire (après-midi), et sous lumière rouge (imperceptible) pour respecter leur activité nocturne. Une période d’habituation pré-test à la salle de 30min est réalisée. La présence physique des expérimentateurs dans les salles d’expérimentation sera réduite à son minimum au cours des observations comportementales qui seront vidéo-enregistrées. La ponction sanguine est réalisée sous anesthésie générale. La mise à mort est effectuée sur animal anesthésié en emmenant chaque souris dans une pièce dédiée du laboratoire, hors de la vue/ouïe/odorat de congénères pour éviter toute communication de stress entre individus.

Choix des espèces

L’objectif est de valider les effets comportementaux (anxiété et agressivité) des phéromones apaisantes maternelles (apaisines) sur les souris, pour étudier ensuite leur mode d’action, notamment au niveau neurobiologique, immunologique, et de l’expression des gènes. La souris est apparue comme le meilleur modèle au vu de l’existence de kits de dosages de neurohormones utilisables et validés, de kits de séquençage de gènes préconçus et de la connaissance de plusieurs gènes de référence, de l’anatomie fonctionnelle du cerveau et du système immunitaire de cette espèce. Développer des apaisines chez cette espèce revêt également un intérêt. La souche choisie est connue pour son caractère plus manipulable, moins anxieux et agressif pour limiter les risques de blessures lors des tests comportementaux. Elles ont un comportement maternel plus prononcé, ce qui, pour les apaisines, semble plus pertinent. Aussi, rapport aux études immunologiques envisagées ensuite, ces souris développent une réponse immunologique plus variée et représentative. Les souris impliquées dans l’étude sont des adultes. Elles ont 2 mois pour 56 d’entre elles et 3 mois pour les 56 autres. Le fait qu’une partie d’entre elles soient plus âgées devrait permettre à ces souris d’être plus grosses et plus dominantes envers les autres, et donc d’exprimer plus fortement le comportement agressif/territorial recherché. Le choix de sélectionner des adultes permet également d’étudier des souris susceptibles d’exprimer une diversité de comportements de leur espèce. De plus, ces animaux auront déjà une expérience sociale : ainsi, un isolement pour les besoins du test comportemental mesurant l’agressivité aura hypothétiquement moins d’effets délétères que sur des souris tout juste sevrées; cependant, les recherches sur l’impact d’un isolement à cet âge sur le bien-être des individus manquent à ce jour pour confirmer cette hypothèse.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est immobilisé dans un tube de contention pendant quinze à trente minutes pour recevoir un aérosol, puis reçoit trois anesthésies et injections pour l'imagerie. Le porteur reconnaît que la contention et l'immobilisation répétées sont des sources de stress. L'objectif se limite à comparer deux types de générateurs d'aérosol pour le transfert de gènes vers le poumon.

Objectifs

Nous voulons ici optimiser notre système d'aérosol actuel pour évaluer l'efficacité de transfert de gènes chez le petit animal de formulations issues de nos recherches et de la littérature. L'objectif de ce projet est de pouvoir évaluer l'impact du générateur d'aérosol sur le transfert de gènes appliqué aux poumons. Sur les différents générateurs d'aérosol existants, deux grands types sont majoritairement utilisés en clinique, le générateur pneumatique et le générateur à tamis vibrant. La différence principale entre ces deux générateurs est le mécanisme mis en jeu pour générer l'aérosol. En effet, un générateur pneumatique permet, sous l'effet d'un gaz comprimé, de transformer une solution liquide en microgouttelettes alors qu'un générateur à tamis vibrant utilise une grille de maillage plus ou moins fin et vibrant à haute fréquence pour transformer une solution liquide en microgouttelettes. Dans le cas présent, ces différences physiques jouent sur l'efficacité de transfert de gènes de nos formulations à base de vecteurs synthétiques. Bien que des tests de comparaison d'aérosol des formulations sur culture cellulaire aient été réalisés, il reste nécessaire d'effectuer des tests chez le petit animal de ces mêmes formulations afin de prendre en compte toute la complexité des voies respiratoires pulmonaires lesquelles ne peuvent pas être reproduites en conditions in vitro.

Bénéfices attendus

Ce projet à pour but de déterminer quel générateur d'aérosol est le plus optimal pour l'introduction d'un gène contrôle (ici un gène de bioluminescence) grâce à des vecteurs non viraux dans des cellules du poumon. Les résultats obtenus nous permettraient d'optimiser notre système de nébulisation actuel afin d'obtenir les meilleurs résultats possibles et donc, à terme, diminuer le nombre d'animaux nécessaire pour nos prochaines expérimentations.

Procédures

Chaque animal subit une procédure d'aérosolisation dans un tube limitant ses mouvements. L'aérosol contient soit la solution contenant le gène d'intérêt ou soit du sérum physiologique pour les deux groupes contrôles. Le processus d'aérosol peut durer entre 15 à 30 minutes et donc l'animal devra rester immobilisé durant toute cette période. Une mesure de la lumière émise par les poumons sera réalisée au lendemain des aérosols puis au troisième et septième jour. Les animaux auront une injection d'une durée maximale de 30 secondes suivi d'une anesthésie et d'une mesure de la lumière à proprement parlé d'une durée de 10 minutes. Cette procédure sera réalisée trois fois (J1, J3 et J7). En fin de procédure, les animaux auront une injection d'une durée maximale de 30 secondes d'une solution contenant une anesthésie chimique et un anti-douleur cela afin de pouvoir faire un prélèvement de sang au niveau du coeur.

Impact sur les animaux

Du stress sera généré lors des phases d’habituation au système limitant les mouvements de l’animal. Ce temps d'habituation sera répété tous les jours pendant une semaine avant l'aérosol et ne durera pas plus de 30 minutes par souris. Un stress pourra également être induit lors de chaque geste de pesée d'une durée de 30 secondes. Chaque animal sera pesé 10 fois au total lors de la procédure. L'injection du produit de réaction engendrera aussi un stress ainsi qu'une légère douleur d'environ 15 secondes. Au total, chaque animal recevra 3 injections. L'étape d'aérosol est aussi une source de stress à cause du positionnement de l'animal dans le tube de contention limitant ses mouvements et durera entre 15 et 30 minutes en fonction de la solution aérosolisée et du générateur d'aérosol utilisé. Enfin, un stress de quelques secondes pourra être induit lors de la préhention des animaux pour les mettre dans la boite d'induction pour l'anesthésie préalable à l'imagerie. Comme il y a trois imageries (J1, J3, J7), chaque souris recevra au total trois anesthésies.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements de tissus.

Remplacement

Des études préliminaires de nébulisation de composés à pouvoir transfectant sur des lignées cellulaires ont été réalisées afin de mettre en évidence l'impact du générateur d'aérosol sur l'efficacité de transfection. Cependant, la complexité pulmonaire (respiration, anatomie des poumons...) ne peut pas être obtenu in vitro et nécessite le passage à un modèle souris.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au maximum pour réaliser cette étude sans nuire aux objectifs initiaux et à l'obtention de tests statistiques robustes.

Raffinement

Une période d'habituation des animaux sera réalisée avec le tube de contention afin de familiariser l'animal à un système qui limite ses mouvements. L'objectif de cette habituation est de diminuer le stress de l'animal et ainsi limiter tout phénomène d'hyperventilation lors des aérosols qui pourrait impacter la qualité des résultats. L'anesthésie gazeuse sera privilégiée à l'anesthésie chimique car elle permet une récupération plus rapide des animaux. Les animaux seront anesthésiés le temps de réaliser l'image soit environ 10 minutes puis remis dans leur cage afin qu'ils puissent récupérer. Sur l'ensemble du projet, les animaux sont anesthésiés une quarantaine de minutes. Les animaux seront surveillés tout le long de la procédure à l'aide d'une grille de soin adaptée.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans cette étude sont des souris. Il s'agit d'une espèce de référence pour ce type d'étude. Les animaux seront receptionnés à l'âge de 6 semaines à l'animalerie. A la suite d'une semaine d'acclimatation, ils pourront intégrer le projet. Les animaux des études précédentes étaient agés de 7 semaines, afin de pouvoir comparer les études entre elles, nous devons garder le même âge pour les animaux.

2 200 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue et 275 non greffés réutilisés pour de la formation. Une tumeur leur est induite par injection dans le péritoine, parfois précédée d'une irradiation, puis ils reçoivent des composés à tester par voies multiples, avec prélèvements sanguins et imagerie répétés. Le porteur indique que les prélèvements de sang sont le geste le plus stressant et que les animaux greffés ne peuvent plus servir à autre chose. Il décrit les reconstructions de tumeurs en 3D comme marginales et difficilement transposables à l'Homme.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Parmi les cancers, le cancer colorectal est le deuxième plus mortels (plus de 900 000 décès en 2020 pour environ 1,93 million nouveaux cas). Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer coliques déjà mis en place dans notre établissement ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs viscérales coliques chez l’homme. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques sur des cancers de la cavité abdomino-pelvienne ou des métastases. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera ainsi possible d’étudier, dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, les mécanismes d’évolution des cancers ou de métastases dans la cavité abdomino-pelvienne. Grâce à ces études et dans un environnement adapté (ajout de cellules immunitaires humaines ou dans un système immunocompétent), il sera aussi possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Un système d’identification sera mis en place sur tous les animaux, sous anesthésie générale (moins de 1 minute, une seule fois). - Selon les modèles, les animaux seront transportés vers le site où ils seront irradiés (une seule fois, 2 heures). - Selon les modèles, un implant sous cutané sera posé sous anesthésie (une seule fois, 5 minutes) - Induction tumorale de tous les animaux sous anesthésie (moins de 1 minute, généralement unique, mais pourra être répétée pour vérifier que la thérapie administrée peut empêcher des récidives). - Test de composés chimiques, biologiques ou traitement par rayons ionisants administrés sous anesthésie générale (moins de 1 minute). Administration orale, intraveineuse, intrapéritonéale et sous cutanée sous contention avec ou sans anesthésie générale (moins de 1 minute). Ces administrations peuvent être uniques ou répétées, comme peut l’être la prise de médicament chez le patient. - Pesée des animaux (moins de 1 minute) - Prélèvements de sang potentiellement répétés en respectant les volumes maximum tolérés : Prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale (moins de 1 minute). Prélèvement par piqûre à la veine caudale et marginale de la patte sous anesthésie, possible sous contention (moins de 3 minutes). - Recueil d’urine en hébergement individuel (potentiellement répété, avec isolement (moins d’une heure)). - Techniques d’imagerie, potentiellement répétées : sous anesthésie générale entre 10 et 45 minutes (en fonction des techniques).

Impact sur les animaux

Les gestes techniques suivants induiront un stress léger à l’animal : -Identification des animaux : implantation d’un transpondeur, clips d’oreilles ou tatouage (1 minute) -Transport vers le site où est réalisée l’irradiation (2 heures) -Pose d’un implant Sous Cutané (5 minutes) -Induction tumorale par IP (1 minute) -Radiothérapie (1heure) -Traitements par voies orale, Intraveineuse, intrapéritonéale, sous cutanée (1 minute) -Suivi des animaux par imagerie (sous anesthésie, 1 heure) Les gestes suivants induiront une douleur plus marquée. -Les traitements par voie intramusculaire/intradermique (1 minute) Au début de l’étude, les animaux seront distribués dans des groupes de traitement. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger pendant 1 à 2 jours. La prise de mesure des animaux (poids) induira un stress pouvant être considéré comme faible qui diminuera avec l’habituation (30 minutes) Les prélèvements de sang en cours d’expérience induiront un stress plus important chez l’animal (5 minutes).

Devenir

Les animaux étant porteurs de tumeur et ayant fait l’objet de gestes techniques et reçu des traitements, aucune autre utilisation ne peut être envisagée. Tous les animaux greffés et inclus dans les groupes de traitement seront mis à mort à l’issue de chaque procédure (la méthode utilisée étant l’une de celles autorisées par la Directive 2010/63). Les animaux non greffés et surnuméraires peuvent être réutilisés pour formation.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est le plus faible possible en fonction des objectifs de l’étude et de la puissance statistique nécessaire. Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations des paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations interindividuelles. Entre 10 et 20 études sont réalisées chaque année, mais le nombre peut varier en fonction des demandes. Une étude peut être composée de 1 (dans le cas d’un développement d’un nouveau modèle ou d’amplification tumorale) à 15 groupes. Le nombre d’animaux par groupe peut varier généralement entre 3 et 15, ce nombre sera adapté en fonction de la connaissance interne du modèle ou en fonction des études réalisées dans la littérature. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal. Pour les modèles de cancer dont l’induction est réalisée en intrapéritonéale un nombre d’animaux surnuméraire de 5% pourra être utilisé (pour 100 animaux, 105 seront greffés).

Raffinement

De l’enrichissement sera utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations vétérinaires en termes d’anesthésie, de volume, fréquence et antalgie. Ces actes seront réalisés sous anesthésie (sauf pour les administrations orales) avec l’analgésie appropriée pour les injections en intramusculaire/intradermique (opiacés). Les traitements par radiothérapie seront faits sous anesthésie générale. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Les procédures techniques sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par le comité éthique. Toutes les procédures seront réalisées par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Chaque animal sera observé quotidiennement. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront suivis par la structure chargée du bien-être animal. Sous l’autorité du vétérinaire, des antalgiques pourront être prescrits. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître les signes de souffrances et les points limites. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. Un groupe contrôle d’animaux non porteur de tumeur sera utilisé pour monitorer la prise de poids moyen naturelle des animaux au cours de l’étude. La croissance tumorale de chaque animal sera suivie par la différence de prise de poids de l’animal de l’étude par rapport à la prise de poids moyenne d’animaux non porteur de tumeur. Un pourcentage de prise de poids supérieur à 10% constituera un point limite.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines (modèles xénogéniques) dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge de 6 semaines afin que leur morphologie facilite l’injection des cellules tumorales. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets secondaires des composés à tester et le développement de la tumeur.